一种基于mRNA的T细胞诱导抗原增强了抗新型冠状病毒变种的新冠肺炎疫苗

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(新型冠状病毒)是当前疫情冠状病毒疾病2019(新冠肺炎)的病原，该疾病已导致全球超过680万人死亡1。通过大规模疫苗接种获得群体免疫是预防传染病的最有效方法2,3。目前批准的疫苗基于新型冠状病毒刺突蛋白或其受体结合结构域(RBD)4,5，这可以引发有效的中和抗体来阻断刺突介导的病毒进入宿主细胞6。尽管如此，越来越多的证据表明，接种疫苗会引起短暂的体液反应7，而疫苗接种诱导的中和抗体可能会随着时间的推移而迅速减少8。此外，在刺突蛋白中具有频繁突变的新出现的新型冠状病毒变体可以逃避由疫苗接种或自然感染诱导的体液免疫9,10这些突变导致了最近新冠肺炎病毒爆发中的许多突破性感染11,12.

理想的疫苗有望诱导保护性体液免疫和细胞免疫，特别是长期记忆B/T细胞反应13。事实上，强大的T细胞反应提供了针对包括新型冠状病毒在内的许多冠状病毒感染的有效免疫保护14,15,16,17。冠状病毒特异性T细胞足以有效控制病毒致病性，即使在没有中和抗体的情况下18，表明产生有效的病毒特异性细胞反应对于冠状病毒清除是必不可少的19。此外，T细胞表位广泛分布在整个新型冠状病毒蛋白质组中20。由于中和抗体识别的表位集中在易突变的RBD中，新出现的变异体已被证明能有效逃避先前的体液免疫。然而，大量的新型冠状病毒反应性T细胞可能仍然对新出现的变异有保护作用21,22。因此，诱导广泛的保护性细胞反应应该是增强新冠肺炎疫苗效力的可行方法。在这项研究中，我们开发了一种基于mRNA的T细胞诱导抗原，它编码3种富含人类HLA-I表位的新型冠状病毒肽，从而能够诱导广泛而有效的细胞反应。在人源化HLA-转基因小鼠和非人灵长类动物中，用这些T-细胞诱导的和基于RBD的mRNA抗原双重免疫显示出比单独RBD疫苗接种更有效地预防新型冠状病毒感染。这些结果为双重免疫的必要性提供了有力的证据，以全面刺激体液和细胞反应来控制新冠肺炎疫情。

新型冠状病毒蛋白质组中人类HLA-I抗原表位富集区的鉴定

I类人类白细胞抗原(HLA-I)复合物表现出高度多态性，导致CD8的广泛多样性+人类个体中的t淋巴细胞表位23。我们的目的是在整个新型冠状病毒开放阅读框(ORFs)中识别具有不同HLA-I特异性表位的区域，从而能够开发一种重组抗原，通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导广泛而有效的病毒特异性反应(图。1a).为了解决这个问题，我们预测了78个HLA-I等位基因的表位，这些等位基因在人群中最常见(补充表1)，在新型冠状病毒蛋白质组中使用了NetMHCpan和IEDB生物信息学工具24,25,26,27。预测的HLA-I表位具有亲和力值(IC50)小于10 nM被定义为有效表位。因此，每100个氨基酸中有超过20个预测有效表位的4个片段(非结构蛋白(NSP)-31443–1605，NSP-4232–444，NSP-61–201和膜(M)1–113)被选为富含HLA-I表位的肽用于进一步研究(图。1b，c).尽管如此，一些研究已经确定了CD8+新型冠状病毒N蛋白中的t细胞表位28,29,30。尽管通过生物信息学预测的定义标准在新型冠状病毒核衣壳蛋白中鉴定了12个HLA-I表位(图。1b，c和补充数据1)，我们还是选择了N全长的作为一种潜在的HLA-I表位富集肽。包括NSP-1在内的三种预测HLA-I表位较少的肽1–180，NSP-31066–1278和NSP-14330–490，被选为阴性对照(图。1b，c).我们接下来评估了这些肽的异位表达是否可以通过基于报告细胞的表位表达系统激活新冠肺炎病恢复期患者的CTL26,31。来自新型冠状病毒蛋白质组的HLA亚型(HLA-A*02:01或HLA-A*11:01)和HLA-I表位富集肽或阴性对照肽在人类293报告细胞中异位表达。此外，报道细胞还表达含有颗粒酶B (GzB)切割序列的修饰的红外荧光蛋白(IFP ),导致在被GzB切割后立即出现荧光信号32。因此，将报告细胞(其中新型冠状病毒表位由特定的HLA-I亚型呈递)与CD8一起孵育+从康复期新冠肺炎患者中分离的t细胞(补充表2).呈现表位的报告细胞激活同源CD8+t细胞分泌GzB，诱导报道细胞凋亡。随后，报告细胞中修饰的IFP被切割产生荧光信号(图。1a).值得注意的是，位于非结构蛋白(NSP)3中的3个肽的异位表达1443–1605，NSP-4232–444和NSP-61-201在所有测试的表达特定HLA-I亚型的报告细胞中激发了更高的荧光(图。1d，e).相反，M。1–113或N全长的蛋白质不能强有力地激活CD8+来自康复期新冠肺炎患者的t细胞(图。1d，e).总的来说，我们在新型冠状病毒非结构蛋白中鉴定出3种特异性HLA-I表位富集肽，它们具有高度免疫原性，从而激活人类CTL反应。

a实验设计示意图。78个HLA-I等位基因的表位由NetMHCpan和IEDB生物信息学工具预测。富集HLA-I表位的肽异位表达以评估激活CD8的能力+通过基于报告细胞的表位表达系统从恢复期新冠肺炎患者中分离t淋巴细胞。b, c新型冠状病毒蛋白质组中富集人细胞毒性T淋巴细胞表位片段的鉴定。通过对NetMHCpan(b)和IEDB(c).四个地区，NSP-31443–1605，NSP-4232–444，NSP-61–201，和M1–113，每100个氨基酸具有超过20个有效表位(亲和浓度> 10 nM ),被选作富含HLA-I表位的肽用于进一步研究，并且三个区域，NSP-11–180，NSP-31066-1278，和NSP-14330–490将最少的预测有效表位设定为对照。N蛋白包括在进一步的研究中。水平线表示选择HLA-I表位富集区的阈值。d, eCD8的激活+新冠肺炎病恢复期患者的t淋巴细胞。转染HEK293T细胞以稳定表达噬菌体_EF1a_ICADCR、噬菌体_EF1a_IFPGZB和噬菌体_EF1aHLA载体。HLA-A*02:01(d)或HLA-A*11:01(e)用编码NSP-1的基因转染过表达的HEK293T细胞1–180，NSP-31066–1278，NSP-14330–490，N全长的，M1–113，NSP-31443–1605，NSP-4232–444，或NSP-61–201，分别为。转染后36小时，1 × 106HEK293T细胞与2 × 105HLA基因型匹配记忆CD8+来自康复期新冠肺炎患者的t细胞(nHLA-a* 02:01 = 10，以及nHLA-A * 11:01 = 9)持续12小时，并激活CD8+使用流式细胞仪测量，通过共培养的HEK293T细胞中的相对IFP信号强度来表征t细胞。所有数据均以所示生物重复次数的平均值±标准差表示。源数据作为源数据文件提供。实验独立重复了两次，结果相似。两个独立的实验都包含两个技术重复(d, e).调整过的p用Tukey的多重比较事后双侧检验通过单向ANOVA确定值。

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人源化HLA-I表位富集肽在转基因小鼠中的免疫原性评价

我们接下来研究了已鉴定的富含HLA-I表位的抗原的免疫原性，这些抗原在动物体内激活了针对新型冠状病毒的CTL反应。基因mRNA形式允许原位产生富含表位的肽，其可以有效地进入抗原呈递细胞的HLA区室33。因此，我们产生了一个重组mRNA转录本，编码3个HLA-I表位富集肽(HLA-EPs)，代表NSP-31443–1605，NSP-4232–444，和NSP-61-201区域串联。包括NSP-1在内的具有一些HLA-I表位的三种肽1–180，NSP-31066–1278和NSP-14330–490，用于构建重组mRNA (HLA-NC)作为阴性对照。一个编码泛素(Ub)的序列，带有G76A氨基酸修饰，位于HLA-EPs和HLA-NC序列。在HLA-EPs或HLA-NC的三个肽之间插入一个A-A-Y间隔区34(图。2a).mRNA用脂质纳米粒(LNP)配制的核苷修饰的mRNA技术(LNP-HLA-EPs还有LNP-数控).用荧光素酶mRNA序列表征LNPs的物理特征和组织分布(补充图。1).基于这种设计，泛素化抗原可以在蛋白酶体中立即被降解，用于HLA呈递35。在用或不用蛋白酶体抑制剂MG132处理的mRNA转染的HEK293T细胞中，通过流式细胞术测定HLA-EPs降解的效率(图。2b，c).

a的原理图HLA-EPsmRNA结构。b, cHLA-EPs在HEK293T细胞中的表达结果由HLA-EPs阳性细胞的平均荧光强度(MFI)显示(b)和代表性的流式细胞仪图(c)的3个生物复本，包含3个技术复本。d–f用肽库刺激后产生IFN-γ的表位特异性脾细胞的增殖。通过ELISpot测量表位特异性的产生IFN-γ的脾细胞的增殖。每个点代表3次技术复制的平均值，检测限(LOD) = 2，代表性点显示为(d).IFN-γ阳性CD8频率+t细胞通过ICS(e, f).给出了代表性的流式细胞仪图，符号代表单个小鼠。g–jCD8+LNP的t细胞依赖性保护HLA-EPs对抗新型冠状病毒。接种了HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠(有或没有CD8)+t细胞耗竭，感染新型冠状病毒B.1.351变异体(1.4 × 105PFU/老鼠)。HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠肺组织中的病毒滴度，有和没有CD8+接种后4天t细胞耗竭(n= 5)，通过具有两次技术复制的噬菌斑测定来确定(g, h).LOD为每克组织10 PFU。通过H&E染色评价受攻击小鼠肺的组织病理学变化(i, j).呈现了来自每组中一只代表性动物的图像，其具有炎性细胞浸润(黑色箭头)、血凝块(蓝色箭头)和肺泡变形(红色箭头)的部位。比例尺为50 μm。所有数据(b, d–j)表示为指定生物重复次数的平均值±标准差，并通过单向ANOVA和Tukey的多重比较事后双侧检验计算统计显著性(b, d–f, i, j)或带有Bonferroni多重比较的双向ANOVA(g, h). P数值根据多重比较进行了调整。源数据作为源数据文件提供。数据代表一个(i, j)，两个(d–h)，或者三个(a, b)结果相似的独立实验。

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随后，我们采用了两种人源化H-2 I类/II类基因敲除的C57BL/6 J菌株，它们表达人类HLA-A*02:01/DR1或HLA-A*11:01/DR1，以评估LNP的免疫原性HLA-EPs在活生物体内36,37。要么是LNP-HLA-EPs(0.5微克/剂量或10微克/剂量)或LNP-网络计算机(10μg/剂量)接种到HLA转基因小鼠的两个品系中。接受加强疫苗21天后，LNP-HLA-EPs免疫的HLA转基因小鼠显示CD8频率显著增加+但不是CD4+T细胞与总T淋巴细胞之比，与LNP相比-数控(补充图2a，b).抗原特异性记忆免疫反应提供长期保护38。值得注意的是，免疫显著增加了CD44的数量+CD62L-CD8+效应记忆T细胞(Tem)和CD44+CD62L+CD8+两个HLA转基因小鼠品系中的中枢记忆T细胞(Tcm )(补充图。2c，d)，提示HLA-EPs介导的细胞免疫激活。我们接下来检查了这些免疫小鼠中细胞毒性淋巴细胞的表位特异性反应。用HLA-EPs肽库刺激后，在LNP中产生γ干扰素(IFN-γ)的表位特异性脾细胞的比例显著增加HLA-EPs免疫小鼠与对照小鼠的比较(图。2d–f).CD8不同方面的增加+t细胞反应是剂量依赖性的。

先前的研究表明，病毒特异性T细胞提供了针对许多冠状病毒的有效保护17,39。我们接下来评估了LNP的保护效力HLA-EPsCD8拮抗HLA转基因小鼠的新型冠状病毒感染+t细胞减少和活新型冠状病毒挑战。给HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠接种低(0.5微克)或高(10微克)剂量的LNP-HLA-EPs或者LNP-数控(10微克)。加强免疫接种后20天，将所有接种方案下的小鼠随机分成两个亚组，然后用抗CD8-α抗体或同种型IgG2b对照接种两次。在接种抗CD8-α抗体后的第一天，CD8+t细胞从外周血中完全耗尽(补充图。2a).接受同种型对照抗体的小鼠显示正常比例的CD8+外周血中的t细胞。CD8的比例+LNP外周血和脾脏中的t细胞HLA-EPs-免疫动物高于LNP-数控免疫小鼠(补充图。2a，b)，表明LNP激活了T细胞反应HLA-EPs免疫接种。随后，免疫的HLA转基因小鼠用1.4 × 105经鼻滴注的新型冠状病毒PFU b . 1.351(β)变异体。在感染后4天，通过噬菌斑测定和qRT-PCR对肺中的病毒载量进行定量，并通过苏木精-伊红(H&E)染色评估组织病理学损伤。有趣的是，LNP的免疫接种HLA-EPs显著降低了新型冠状病毒负载(图2g，h和补充图。9a)和病理损伤(图。2i，j)以剂量依赖性方式在HLA-A*02:01/DR1(左图)和HLA-A*11:01/DR1(右图)转基因小鼠的肺中。尽管如此，LNP的这种保护功效-HLA-EPs在18世纪被大量废除+t细胞减少的小鼠，表明LNP引起的抗新型冠状病毒反应HLA-EPs是CD8+t细胞依赖型(图。2g–j).

由于中和抗体识别的表位的连续突变，新出现的新型冠状病毒变异体极大地损害了目前基于刺突的疫苗的效力40。发现三种富含HLA-I表位的肽序列在相关新型冠状病毒变异体(VOCs)中高度保守。尽管如此，在新型冠状病毒NSP-4飞机上还是出现了几个替代品232-444和NSP-61-201肽和取代不影响通过生物信息学分析预测的表位的免疫原性(补充表3).我们评估了这些替换是否影响新型冠状病毒特异性CD8+采用HLA类四聚体分析的t细胞反应。值得注意的是，这些肽中的大多数取代并不位于由确定的标准预测的有效表位中(图。1b，c).合成了含有新型冠状病毒VOC取代的HLA-A*02:01或HLA-A*11:01特异性表位(补充表4).野生型菌株的相应表位用作对照。接下来，我们构建了HLA-A*02:01和HLA-A*11:01 HLA-I四聚体，并用它们对CD8进行染色+来自LNP的t细胞-HLA-EPs-免疫转基因小鼠。原始表位和突变表位之间的四聚体阳性比例没有显著差异(补充图。3)，表明HLA-EPs的免疫原性可能不受新型冠状病毒变异体突变的影响。因此，用HLA-EPs免疫可以诱导针对已知新型冠状病毒VOCs的广泛保护性细胞免疫应答，包括最近出现的Omicron变异体。

用HLA-EPs和新型冠状病毒RBD抗原双重免疫保护人源化HLA转基因小鼠免受新型冠状病毒变异体的感染

新出现的新型冠状病毒挥发性有机化合物经常逃避先前的体液免疫，从而大大降低了当前新冠肺炎疫苗的效力9。鉴于HLA-EPs的免疫原性没有被新型冠状病毒VOCs的突变所削弱，我们提出用HLA-EPs和新型冠状病毒RBD抗原进行双重免疫可能对目前流行的新型冠状病毒变异体更有效。新型冠状病毒B.1.351变异体具有很强的逃避由疫苗接种或自然感染诱导的中和免疫的能力41,42。因此，我们选择了新型冠状病毒B.1.351菌株的RBD在LNP配方系统(定义为LNP)中产生基于mRNA的抗原RBD贝塔)(补充图。4a).LNP的表情RBD贝塔通过蛋白质印迹和流式细胞术进行验证(补充图。4b，c).接下来，我们利用HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠作为实验模型来评估双重免疫在预防新型冠状病毒感染中的功效。用0.5 μg LNP组合免疫HLA转基因小鼠RBD贝塔和0.5微克LNP-HLA-EPs。用0.5 μg LNP免疫的小鼠RBD贝塔只有或PBS作为对照。动物被给予两剂双抗原，间隔3周(图。3a).我们首先研究了C-X-C趋化因子配体13 (CXCL13)的信号轴，它指导动态生发中心反应和B细胞选择43,44。事实上，CXCL13及其受体CXCR5的表达在用LNP免疫的动物的淋巴结中显著增加RBD贝塔而LNP-RBD贝塔+ LNP-HLA-EPs(补充图5a、b).一直以来，生发中心B (GC B)细胞(B220+CD95+GL-7+)和T滤泡辅助(Tfh)细胞(CD4+CD185+PD-1+)在接受LNP的老鼠中更高RBD贝塔单独或双重疫苗比在PBS对照小鼠中(图。3b).加强剂量后21天，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测量免疫小鼠血清中的RBD特异性IgG滴度。来自LNP的抗血清-RBD贝塔-免疫动物广泛识别多个新型冠状病毒循环毒株的rbd，包括Wuhan-Hu-1(野生型)、b . 1 . 1 . 7(α)、b . 1.351(β)、p . 1(γ)、b . 1 . 617 . 2(δ)和B.1.1.529 (Omicron BA.1)。LNP之间的RBD特异性IgG滴度没有显著差异RBD贝塔-而LNP-RBD贝塔+ LNP-HLA-EPs-免疫动物(图。3c).尽管如此，反RBD的特殊性贝塔RBD b . 1 . 1 . 529(Omicron ba . 1)的血清显著低于RBD贝塔以及其他变体的rbd(图。3c).我们接下来研究了免疫动物血清抗体对野生型或变异型新型冠状病毒毒株的中和作用。值得注意的是，尽管LNP的血清-RBD贝塔-而LNP-RBD贝塔+ LNP-HLA-EPs-接种的动物能够中和几种新型冠状病毒变体，但针对Omicron BA.1变体的中和抗体滴度显著低于针对其他菌株的中和抗体滴度(图三维（three dimension的缩写）).这些数据表明LNP-RBD贝塔-诱导的抗体显示出对一些新型冠状病毒变异体的中和活性。我们接下来评估了用LNP免疫的小鼠的细胞免疫反应HLA-EPs而LNP-RBD贝塔mRNA抗原。在加强剂量后21天，从免疫或对照处理的HLA转基因小鼠中分离脾细胞。LNP-HLA-EPs+ LNP-RBD贝塔-免疫的HLA-转基因动物显示CD8比率的显著增加+t细胞和CD4+T细胞与总T淋巴细胞之比(补充图。6a、b).随后，我们评估了这些免疫小鼠中细胞毒性淋巴细胞的表位特异性反应。在用HLA-EPs和RBD的肽库刺激后贝塔，用ELISpot试验测定，在双重免疫的小鼠中，产生干扰素-γ(IFN-γ)的表位特异性脾细胞的数量显著增加(图。3e)，但单次和双重免疫的小鼠在产生白细胞介素-4 (IL-4)的脾细胞数量上是相当的(图。3f)，表明由HLA-EPs引起的Th1-偏向性反应。此外，双重免疫小鼠的表位特异性脾细胞释放细胞因子IFN-γ和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的频率高于LNP小鼠RBD贝塔免疫或PBS接种的转基因小鼠，通过细胞内细胞因子染色确定(图。3g，h).这些结果表明，HLA-EPs和新型冠状病毒RBD抗原的双重免疫在HLA转基因动物中诱导了强烈的抗原特异性免疫应答。

a免疫、样本收集和攻击时间表的示意图。b–d免疫后的体液免疫激活和抗体产生。收集的淋巴结(n= 5)进行GC B细胞和Tfh细胞(b).用ELISA检测加强接种后21天收集的血清中的新型冠状病毒RBD特异性IgG抗体(c).用基于活病毒的中和试验检测针对新型冠状病毒变体的中和抗体(d).虚线表示ELISA的LOD为100，活病毒中和的定量下限为8。e–h细胞免疫反应。免疫的HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠的脾细胞(n= 5)离体再刺激并进行IFN-γ ELISpot(e)(LOD = 5)和IL-4 ELISpot(f)(LOD = 2)。CD8产生干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α+t细胞(g)和CD4+t细胞通过ICS(h). i, j疫苗对新型冠状病毒b . 1.351(β)和B.1.1.529 (Omicron BA.1)变异体的保护效力。接种HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠(n= 5)用新型冠状病毒B.1.351变体或B.1.1.529变体攻击，并且在肺中接种后4天的病毒滴度(i-上面板)和气管(i-下图)组织通过噬菌斑测定来确定，LOD为20和100。接种B.1.351后4天肺的组织病理学变化(j-上面板)或B.1.1.529(j-下图)变体在H&E染色后进行评估。呈现了来自每组中一只代表性动物的图像，其具有炎性细胞浸润(黑色箭头)、血凝块(蓝色箭头)和肺泡变形(红色箭头)的部位。比例尺为50 μm。数据(b–j)显示为单个小鼠的平均值±标准差。源数据作为源数据文件提供。一个(b, j)或者两个(c–i)用2个技术重复进行独立实验。调整过的p用于统计分析的值通过单向ANOVA和Tukey的多重比较事后双侧检验(b, e–j)或带有Bonferroni多重比较的双向ANOVA(c, d).

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我们进一步研究了这种双重免疫对新型冠状病毒感染的保护效力。免疫小鼠用新型冠状病毒B.1.351变异体(1.4 × 105PFU/小鼠)在加强接种后21天。在病毒攻击后4天评估肺和气管中的病毒载量。与模拟免疫和单一免疫相比，双重免疫方案进一步预防了HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠中的新型冠状病毒感染(图。3i和补充图。9b).攻击后4天的组织学检查揭示了病毒性间质性肺炎的典型病理学，例如对照组小鼠中广泛的炎性细胞浸润、渗出性胸腔积液和增生的肺泡上皮(图。3j上部面板)。用LNP免疫的小鼠仍有轻微的病理变化RBD贝塔单独(图。3j上部面板)。值得注意的是，用LNP双重免疫的小鼠RBD贝塔而LNP-HLA-EPs仅显示出非常轻微的肺部病变迹象(图。3j).

上述结果表明，HLA-EPs的免疫原性不受新型冠状病毒VOCs突变的影响(补充图。3).因此，我们评估了LNP双重免疫的保护效力RBD贝塔而LNP-HLA-EPs针对HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠中的Omicron BA.1变体。免疫小鼠用2.0 × 105PFU新型冠状病毒B.1.1.529变体，在加强剂量后21天经鼻滴注。在感染后4天，通过噬斑试验和qRT-PCR试验测量肺和气管中的新型冠状病毒负荷，并评估肺中的病理损伤。LNP-RBD贝塔就病毒载量而言，未能使小鼠获得针对B.1.1.529变体的保护，而在用LNP免疫的小鼠中几乎检测不到传染性病毒RBD贝塔而LNP-HLA-EPs(图。3i和补充图。9b).肺组织病理损伤的评估表明，在双重免疫小鼠的肺中没有观察到显著的病理特征，而在用LNP免疫的小鼠的肺泡空间中观察到免疫浸润RBD贝塔单独或安慰剂对照(图。3j下图)，表明用HLA-EPs和新型冠状病毒RBD进行双重免疫贝塔提供了有效的保护免受新型冠状病毒变种的感染。值得注意的是，CD8的消耗+在LNP，通过接种抗CD8-α抗体的t细胞消除了对新型冠状病毒B.1.351或B.1.1.529感染的保护作用HLA-EPs+ LNP-RBD贝塔免疫的转基因小鼠(图。3i和补充图。9b)，进一步证实了双重疫苗设计的保护优势依赖于细胞免疫。总的来说，在用低mRNA-LNP剂量免疫的小鼠中，双重疫苗接种显示出比单一RBD更有效的保护作用贝塔免疫接种。

用HLA-EPs和新型冠状病毒RBD双重免疫在非人灵长类动物中产生最佳的抗新型冠状病毒保护

我们接下来评估了LNP双重免疫的免疫原性和保护效力HLA-EPs而LNP-RBD贝塔在恒河猴(猕猴).猕猴用两种剂量的100 μg LNP进行肌肉免疫RBD贝塔和100微克LNP-HLA-EPs间隔3周(图。4a).用100 μg LNP免疫的猕猴组RBD贝塔单独或PBS作为对照。第一次给药后14天，RBD结合IgG易于检测，第二次给药后14天，水平进一步增加(图。4b).接下来，我们评估了免疫动物的血清抗体是否能够中和这些新型冠状病毒挥发性有机化合物。用假病毒评估加强剂量后出现的广泛中和抗体(图。4c)或传染性新型冠状病毒挥发性有机化合物(图。4d).值得注意的是，猕猴血清中针对Omicron BA.1变体的中和抗体滴度显著低于针对其他菌株的中和抗体滴度(图。4c，d).我们进一步研究了用LNP免疫的猕猴的抗原特异性T细胞反应RBD贝塔一个人还是LNP-HLA-EPs+ LNP-RBD贝塔。在加强免疫后14天，从免疫和对照猴中分离PBMCs，随后用用于免疫的肽再次刺激。双重免疫猕猴体内产生IFN-γ的T细胞数量显著高于LNP猕猴RBD贝塔-免疫和对照动物(图。4e和补充图。7a).然而，在所有实验组中，产生IL-4的T细胞的数量是相同的(图。4f和补充图。7a).在双重免疫的猕猴中，IFN-γ和TNF-α的表达也上调，但IL-4和IL-5的表达不上调(补充图。7b)，从而表明在这些非人灵长类动物中由HLA-EPs引发的Th1-偏向性反应(图。4e，f和补充图。7).

a免疫、样本收集和攻击时间表的示意图。b–d针对新型冠状病毒的体液免疫反应。使用新型冠状病毒B.1.351变体的RBD(b).当收集血清时，将来自5个生物重复的RBD特异性IgG滴度的平均值±标准差对初始免疫后的天数作图。虚线表示LOD。中和抗体用基于假病毒的(c)和基于活病毒(d)中和试验。在试验中利用了六种代表性变体的假病毒，武汉-Hu-1(野生型)、b . 1 . 1 . 7(α)、b . 1.351(β)、p . 1(γ)、b . 1.617 . 2(δ)和B.1.1.529 (Omicron BA.1)，以及这六种变体的感染性病毒。虚线分别代表定量下限50和8。e, fTh1-偏向的细胞免疫反应。在加强免疫后14天收集的PBMCs在体外再次刺激，并进行IFN-γ ELISpot (LOD = 5)(e)和IL-4 ELISpot (LOD = 2)(f)，并显示了代表性的点(右图)。g, h这种疫苗对新型冠状病毒病毒的保护效力。猕猴(n= 3)用7.0 × 105新型冠状病毒PFU(GD PCC-ncov 84，β变体)加强免疫后3周。通过qRT-PCR在接种后第0、1、3、5和7天获得的咽拭子(左图)和肛门拭子(右图)中确定新型冠状病毒sgRNA的拷贝数(g).LOD是基于每拭子100个拷贝的标准曲线建立的。通过qRT-PCR(h).数据(c–h)显示为单只猕猴的平均标准差。源数据作为源数据文件提供。实验独立重复了两次，结果相似。两个独立实验都包含3个技术重复(b–h).使用Tukey的多重比较事后双侧检验(e, f, h)或带有Bonferroni多重比较的双向ANOVA(b–d, g). P数值根据多重比较进行了调整。

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免疫后的猕猴用7.0 × 105新型冠状病毒的PFU(b . 1.351变异体)通过鼻内和气管内途径45。在接种后0至7天的病毒攻击后，所有动物的体温和体重在正常范围内波动(补充图。8a).喉咙和肛门拭子的病毒载量在LNP要低得多HLA-EPs+ LNP-RBD贝塔-在病毒攻击后的整个评估期间，免疫的动物比对照猕猴中的免疫的动物多(图。第四代移动通信技术).值得注意的是，尽管取自双重免疫动物的这些拭子的病毒sgRNA载量低，并且在感染的早期可检测到，但是在感染后3或5天完全检测不到。随后，在感染后7天，通过qRT-PCR分析评估了感染猕猴肺部多个部位的病毒载量(图。4h).与对照治疗相比，用LNP免疫RBD贝塔减轻所有肺叶的新型冠状病毒感染(图。4h).对照和LNP的肺组织RBD贝塔免疫的猴子表现出典型的间质性肺炎，这是新冠肺炎的一个关键特征46例如肺泡壁明显增厚、可识别结构丧失、弥漫性出血和大量免疫浸润。8b).相比之下，LNP双重免疫HLA-EPs而LNP-RBD贝塔完全防止了除右叶外所有测试叶的新型冠状病毒感染(图。4h).一贯地，双重免疫动物的肺组织没有显示任何显著的组织病理学损伤(补充图。8b).总的来说，双重疫苗接种策略有效地预防了非人灵长类动物的新型冠状病毒感染。

目前的新冠肺炎疫苗诱导针对新型冠状病毒刺突蛋白的中和抗体；然而，它们对新出现的变异体，特别是Omicron谱系的效力显著降低。除了中和抗体，强大和广泛的细胞反应提供了针对新冠肺炎的有效免疫保护45,46。T淋巴细胞的丰度与新冠肺炎患者的临床表现密切相关，因此可作为新冠肺炎预后不良的临床预测指标47。在大多数感染患者中检测到冠状病毒特异性细胞反应，包括抗体反应检测不到的无症状患者22这表明冠状病毒特异性T细胞可能足以在缺乏中和抗体的情况下清除病毒。一些无症状或轻度新冠肺炎患者表现出细胞免疫反应，但没有血清转化48,49。此外，一些研究表明，尽管一些新型冠状病毒变异体，特别是Omicron谱系，对当前疫苗或先前感染引发的中和抗体有抗性，但它们仍然普遍对CD8敏感+当前疫苗或先前感染诱导的t细胞反应50,51。因此，越来越多的证据表明，病毒特异性T细胞反应在预防新冠肺炎中起着至关重要的作用。在这项研究中，我们首先开发了一种LNP制定的mRNA抗原，编码一种富含人类HLA-I表位的肽，命名为HLA-EPs，它诱导强T细胞免疫。LNP免疫接种-HLA-EPs在人源化HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠中基本上防止了新型冠状病毒感染。值得注意的是，HLA-EPs的免疫原性不受所有新型冠状病毒变异体的多重突变的影响。用LNP配制的编码新型冠状病毒mRNA的mRNA进行双重免疫贝塔与LNP相比，HLA-EPs提高了对新型冠状病毒β和Omicron BA.1变异的保护RBD贝塔单独免疫，表明抗原特异性CD8的重要作用+病毒清除中的t细胞。事实上，CD8的作用+通过基于腺病毒载体的疫苗Ad26.COV2. S来评估疫苗保护中的t细胞+通过CD8-消耗和病毒攻击试验，t细胞对疫苗保护新型冠状病毒病毒复制有实质性贡献17。此外，通过不同的疫苗策略，特别是对于Omicron变体，分析并证实了体液和细胞免疫应答的组合保护效应52。越来越多的证据表明，针对细胞免疫反应或联合激活体液和细胞免疫反应的抗原设计是开发下一代新型冠状病毒疫苗的有前途的策略。

在这项研究中，我们构建了一种mRNA格式，允许原位串联产生3种富含表位的肽(HLA-EPs)。一个编码泛素(Ub)并经过G76A氨基酸修饰的序列被直接置于HLA-EPs序列的上游，这有助于免疫肽组的快速形成和有效进入抗原呈递细胞的HLA区室。事实上，基于mRNA的疫苗的主要益处之一是编码蛋白的内源性合成，因此允许通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递外源抗原53。尽管如此，内质网中降解肽的浓度经常限制MHC复合体的成熟54，因此蛋白酶体在表位生成中的重要性已被广泛接受35。在我们的mRNA格式设计中，泛素化肽在蛋白酶体中立即被加工降解，产生表位和抗原呈递，通过MHC促进细胞毒性T淋巴细胞的成熟55。事实上，这种利用蛋白酶体靶向肽的策略已经被广泛用于构建针对许多人类病毒的基于T细胞应答的疫苗55,56,57。此外，还有其他MHC-I贩运域，如BioNTech使用的MHC类贩运域(MITD)58，用于增强对mRNA疫苗的细胞反应。事实上，MITD是位于MHC类分子胞质区域的序列，控制它们在不同的溶酶体内区室之间的再循环59。MITD运输信号与抗原肽的融合可以增强抗原呈递到树突细胞(DCs)的效率。总的来说，这些具有重组抗原的融合肽可以改善表位的产生和呈递，从而能够通过基因疫苗诱导细胞免疫反应。

先前的研究表明，先前感染和接种过疫苗的个体中的T细胞反应在很大程度上保留了Omicron刺突蛋白和几种非刺突蛋白。尽管如此，一部分个体对奥米克隆峰的T细胞反应性降低了50%以上22。主要在CD8中观察到对ω-1峰的识别减少+t细胞区室可能是由于脱离了HLA结合22,60。在我们的研究中，我们利用来自NSPs的3种富含HLA-I表位的肽构建了一种mRNA抗原(HLA-EPs)来刺激有效的细胞免疫反应。NSPs中的3个选择的肽包括在以前的研究中鉴定的许多表位，并且在新型冠状病毒VOCs中高度保守61,62,63,64,65。HLA-EPs中相当多的表位在Omicron亚系中发生了突变；然而，基于生物信息学分析，表位中的取代不影响表位的免疫原性，这表明了针对新型冠状病毒NSPs的抗原设计开发基于T细胞的疫苗的优势。因此，我们的发现支持评估第二代疫苗方法，该方法诱导针对刺突和非刺突抗原的强有力的T细胞应答，以优化新冠肺炎疫苗的未来设计。

HLA是人类基因组中最具多态性的基因。在IMGT/HLA数据库中已经报道了超过26，000个HLA等位基因(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)，有19586个I类等位基因66。鉴于HLA基因表现出广泛的多态性，T细胞表位在个体中是非常多样和异质的。为了确保广泛的T细胞免疫可以通过新型冠状病毒抗原的免疫有效地激活，我们选择了富含人类HLA-I表位的新型冠状病毒蛋白质组的3个区域来构建T细胞诱导的、基于mRNA的抗原。预测这些表位对应于78个最常见的HLA-I等位基因，克服了由于HLA在个体间的异质性而导致的疫苗接种效力的大量可变性。与使用来自康复期新冠肺炎患者的外周血单核细胞(PBMCs)的几项研究相反29,67，我们用生物信息学工具只鉴定了新型冠状病毒N蛋白中的几个表位。值得注意的是，在我们的实验系统中，来源于非结构蛋白的三种肽比M1–113和N全长的肽。因此，我们选择了来源于非结构蛋白的3种肽，而不是来源于M和N蛋白的肽，来构建基于mRNA的疫苗，以诱导CTL反应来预防新型冠状病毒感染。

辉瑞和Moderna公司生产的商业化新冠肺炎疫苗使用了膜展示形式的刺突蛋白。尽管如此，越来越多的证据表明，新型冠状病毒RBD已经成为疫苗设计中有前途的抗原候选物之一，这是由于其确切的靶标和刺激抗体的效力5。几种基于RBD的新冠肺炎疫苗已经被批准使用或进入临床试验68。然而，LNP免疫接种-RBD贝塔mRNA减少，但没有消除呼吸道组织中的新型冠状病毒感染猕猴属我们实验环境中的猴子。值得注意的是，LNP双重免疫HLA-EPs而LNP-RBD贝塔提供了比LNP更好的保护-RBD贝塔HLA转基因小鼠和非人灵长类动物单独接种疫苗。在未来的研究中，我们建议开发一种结合HLA-EPs和新型冠状病毒全长刺突的mRNA疫苗，从而为优化当前新冠肺炎mRNA疫苗的设计提供一种策略。总的来说，我们的研究表明，最佳的新冠肺炎疫苗应该包括广泛的CTL诱导和高度保守的新型冠状病毒非结构蛋白片段，以及中和抗体诱导抗原。