气体纳米助剂的制备与表征 作为一类聚集诱导发射(AIE)发光体(AIEgens)，2，2’-(2-((5’-(4-(二苯基氨基)苯基)-[2，2-联噻吩-5-基)亚甲基)-1H-茚-1，3(2H)-二亚苯基)二丙二腈(TSSI)具有优异的ROS和产热能力，并在我们以前的光动力和光热治疗工作中得到充分讨论 27 。以80-85%的显著产率纯化TSSI，并使用 1 核磁共振氢谱 13 核磁共振和高分辨率质谱(HRMS)(补充图。 1 –3 ).在这里，我们合成了四硫化物功能化的病毒样中空介孔二氧化硅(tvHMS)纳米粒子用于TSSI和羰基锰(Mn 2 (一氧化碳) 10 缩写为MnCO)封装(MTHMS)(图。 2a ，补充表 1 ).tvHMS是通过固体二氧化硅表面上的化学同源性原理，通过双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物(TESPT，四硫化物官能化的二氧化硅前体)与四乙基原硅酸酯(TEOS) (v/v，1:3)的后共缩合而制备的。首先，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为结构导向剂，通过TESPT和TEOS (v/v，1:3)在固体二氧化硅表面的后缩合反应，制备了四硫化物功能化的介孔二氧化硅包裹的固体二氧化硅(固体二氧化硅@tMS)纳米粒子 28 。然后，使用氢氧化钠(NaOH)作为去除固体二氧化硅模板和产生tvHMS的表面形貌导向剂和蚀刻剂。tvHMS的孔径约为8.65 nm，由氮气吸附-解吸等温线确定，表明货物装载的多孔骨架(补充图。 4 , 5 )29 。通过NaOH蚀刻将核-壳结构转化为病毒模拟的中空介孔结构的基本机理如下:(1) NaOH快速蚀刻固体二氧化硅以产生溶解的硅酸盐物质，从而移除核以产生中空结构；(2) NaOH缓慢蚀刻一部分中孔二氧化硅以产生溶解的硅酸盐物种，留下无序的、有凹坑的表面层，同时产生尖峰结构。为了进一步确定tvHMS的成分，使用能量色散X射线光谱(EDX)进行元素图谱研究。如图2所示。 2b 硅、氧、硫、碳和氮元素存在于壳层上。通过透射电子显微镜(TEM)证实了MTHMS的形态(图。 2c )，其显示了具有尖状表面的特定病毒样中空核-多孔壳结构，其中尖状径向距离为~20 nm。动态光散射(DLS)分析表明，tvHMS和MTHMS的平均流体直径分别为124.9±5.2nm和128.1±5.9nm。tvHMS和MTHMS的ζ电位分别为17.8±2.3mV和19.3±3.2mV(图。 2d ).此外，MTHMS在紫外-可见吸收光谱中显示出MnCO和TSSI的特征峰(图。 2e )，确认装药成功。根据紫外-可见光谱吸光度的校正曲线计算包封率分别为27.4±2.8%和32.6±4.6%。此外，光致发光(PL)光谱和光声信号进一步表明了体内NIR-II FLI和PAI的MTHMS的可能性(图。 2f，g 30 ,31 。然后将MTHMS溶液在PBS或PBS + 10% FBS中孵育。在指定的时间点，取等分溶液，并通过DLS进行监测。如补充图所示。 6 在环境条件下储存24小时后，在PBS或10% FBS溶液中的MTHMS的平均直径显示出可忽略的变化，表明MTHMS具有良好的体外稳定性。
图MTHMS的制备和表征。 a MTHMS的合成路线。 b tvHMS的代表性EDS元素映射( n = 3个独立实验)。比例尺，100纳米。 c (I)固体二氧化硅、(ii)固体二氧化硅@tMS、(iii) tvHMS和(iv) MTHMS的代表性透射电子显微镜(TEM)图像( n = 3个独立实验)。比例尺，100纳米。 d 通过DLS的tvHMS和MTHMS的直径分布和ζ电位( n = 3个独立实验)。数据代表平均值±标准差。 e tvHMS、MnCO、TSSI和MTHMS的代表性紫外-可见光谱( n = 3个独立实验)。 f 具有代表性的MTHMS (1 × 10 −5 米TSSI)( n = 3个独立实验)。 g MTHMS的代表性光声图像( n = 3个独立实验)。 h 用于检测tvHMS的GSH消耗能力的DTNB的代表性紫外-可见光谱( n = 3个独立实验)。 i H2 从分散在GSH溶液中的tvHMS生产硫( n = 3个独立实验)。 j H的代表性检测结果 2 铅(NO)在谷胱甘肽溶液中从tvHMS产生硫 3 )2 浸湿的圆形纸( n = 3个独立实验)。 k 谷胱甘肽溶液中MTHMS释放TSSI的时间依赖性( n = 3个独立实验)。 l 谷胱甘肽刺激下MTHMS的代表性TEM图像( n = 3个独立实验)。比例尺，100纳米。 m MTHMS (1 × 10)活性氧生成的代表性测量值 −6 TSSI)在近红外辐射下( n = 3个独立实验)。 n 代表性的温度记录图像和( o )H的温度变化曲线 2 o、MHMS、THMS和MTHMS (1 × 10 −4 米TSSI)在近红外辐射(660纳米，0.3 W厘米 −2 n = 3个独立实验)。 p 在各种处理之后，在37℃下对一氧化碳生成的代表性测量( n = 3个独立实验)。基础源数据 d –f , h , i , k , m , o , p 作为源数据文件提供。
H的评估 2 s的产生和药物释放 因为四硫键对还原微环境敏感，所以它通过消耗GSH从而诱导更多活性氧(ROS)的产生和积累而增强TSSI的PDT 32 ,33 。为了确定GSH的消耗能力，用5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)研究了GSH水平，DTNB可与游离巯基相互作用 34 。如图2所示。 2h 紫外-可见吸收光谱显示在tvHMS中412 nm处的吸光度随时间而减少，表明GSH的清除是基于四硫化物的裂解。假设四硫键和GSH之间的反应可以生成H 2 对于气体疗法，我们评估了H 2 来自tvHMS。如图2所示。 2i , 144.5 × 10 −6 H的m 2 从1毫克毫升的混合物中可以检测到硫 −1 在48 h时，tvHMS和GSH增加到199 × 10 −6 当tvHMS浓度达到2毫克/毫升时 −1 。而且，Pb(没有 3 )2 浸湿的圆形纸使H的生产可视化 2 来自tvHMS。具体反应过程如下:
$ $ { { { { { RM { si } } } }-{({ { { { { RM { ch } } } } } _ { 2 })} _ { 3 }-{ { { { { RM { s } } } } }-{ { { { { { RM { s } } } }-{ { { { { { RM { s } } } } }-{ { { { { { { RM { s } } } }-{ { { { { RM { s } } } }-{ { { { { { { { { ch } } } } _ { 3 }。$$
如图所示。 2j 随着时间的推移，试纸的颜色变黑并变深，表明H 2 南相比之下，二硫键结合的铅(dvHMS)不会改变铅的颜色(NO 3 )2 浸湿的圆形纸(补充图。 7 )35
随后，研究了MTHMS的药物释放曲线。如图所示。 2k 不含谷胱甘肽时，TSSI的累积释放量为14.6±4.6%，而当谷胱甘肽浓度为5.0 mM和10.0 mM时，累积释放量分别增加到57.2±7.4%和88.6±7.6%。此外，TEM图像显示，当与含有10 mM GSH的pH 7.4的PBS孵育时，发现MTHMS的明显变化(图。 2l ).颗粒出现膨胀甚至塌陷，表明MTHMS在肿瘤微环境中实现了快速分解(TME)。
光热性能与活性氧和一氧化碳的产生 用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)进一步评估MTHMS的ROS产生能力，所述2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯响应于ROS被转化为DCF以发射绿色荧光 36 。如图所示。 2m 在近红外辐射下，DCF在525 nm处的荧光信号随着MTHMS快速增加，证明了高ROS产生效率。随后在NIR照射(660 nm，0.3 W cm)下评估MTHMS的产热 −2 ).如图所示。 2n，o ，观察到温度快速上升，在5分钟内达到54℃的平台期，这归因于TSSI的活跃分子内运动。产热能力使MTHMS成为PTT的理想候选物。同时，温度的升高有利于Mn-CO配位键的断裂，释放出多余的CO。
作为一种一氧化碳释放分子(CORM), MnCO被广泛研究 37 。为了验证光疗触发的来自MTHMS的CO爆发，通过血红蛋白(Hb)测定进一步量化CO释放。值得注意的是，过氧化氢(H 2 O2 )和近红外辐射(0.3 W厘米 −2 10分钟)导致在MTHMS溶液中明显放大的CO产生(图。 2p ).这归因于MTHMS在激光照射下优异的ROS和产热。
细胞摄取 在4T1细胞中研究了病毒样MTHMS的细胞摄取行为，并选择具有相似表面电荷和平均流体动力学直径的球形MTHMS作为对照(图。 3a，b ，补充图。 8 ).从共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察，具有类似病毒的粗糙表面的MTHMS的摄取效率远高于球形表面的mth ms(图。 3c，d ，补充图。 9 )，证实了病毒样MTHMS进入4T1细胞的增加。流式细胞仪用于进一步的定量分析。如图2所示。 三维（three dimension的缩写） ，补充图。 9 培养4 h后，病毒样MTHMS的摄取效率是球形MTHMS的2.8倍，这表明模拟病毒的表面赋予了mth ms优越的细胞粘附和内化能力 38 ,39 。与球形MTHMS的光滑表面相比，粗糙的表面赋予了病毒样MTHMS更多的接触机会，并增加了与细胞膜的粘附相互作用，从而提高了细胞内化效率 39 ,40
图MTHMS的体外评估。 a 制造示意图和 b 病毒样和球形MTHMS的TEM和扫描电子显微镜(SEM)成像(比例尺= 50纳米)。4T1细胞与病毒样和球形MTHMS孵育1 h后的CLSM观察和流式细胞仪分析 c 和4小时 d (比例尺= 15微米)。 e WSP一号 2 s)， f FL-CO-1 (CO)， g JC-1(红色代表骨料，绿色代表单体)，以及 h 采用各种处理的DCFH-DA (ROS)荧光成像(比例尺= 15微米)。为 b –h 实验独立地重复了三次，结果相似。
细胞内H 2 硫/一氧化碳生成与线粒体功能障碍 细胞内GSH的消耗和H的产生 2 用硫醇示踪剂紫和华盛顿州探针-1 (WSP-1，H 2 s探头)。如硫醇示踪剂紫荧光图像所示(补充图。 10 )，TVH ms-孵育的4T1细胞由于GSH耗尽而显示出减弱的绿色荧光。如图2所示。 3e ，从与PBS和二硫键掺入的病毒样中空介孔二氧化硅(dvHMS)一起孵育的细胞中没有观察到WSP-1的明显绿色荧光。然而，tvHMS处理组显示绿色荧光显著增强，表明四硫键的引入可以启动GSH诱导的细胞内H 2 南
通过一氧化碳检测系统(FL-CO-1 + PdCl)进一步估计细胞内一氧化碳的生成 2 )24 ,37 ,41 ,42 。如图2所示。 3f 与游离的MnCO处理的细胞相比，MnCO包裹的tvHMS (MHMS)处理的细胞显示出更高的荧光强度，这可能归因于促进H 2 O2 -介导的MnCO活化。相比之下，激光照射后MTHMS处理的细胞发出更显著的绿色荧光，证实TSSI的光动力和光热效应可以加速MnCO中配位键的断裂以释放更多的CO
H2 据报道，S/CO对细胞造成严重损害，同时伴有线粒体膜电位(MMP)降低。因此，我们用JC-1试验监测mmP 43 。JC-1在高mmP下聚合产生红色荧光，但在低mmP下分解成产生绿色荧光的单体。与用TSSI+L(“+L”代表NIR激光照射)处理的细胞相比，TSSI包封的tvHMS (THMS) + L处理的细胞显示明显增加的绿色荧光和明显减少的红色荧光，表明在H 2 南此外，MTHMS + L处理产生最高的绿色荧光强度，这归因于H 2 硫和一氧化碳(图。 3g
DCFH-DA被用作细胞内氧化剂探针来测量ROS的产生 44 。如图所示。 3h 与TSSI + L相比，THMS + L组表现出显著增强的绿色荧光，这意味着tvHMS中的四硫化物键有助于GSH的消耗，从而在近红外辐射下提高PDT效率，同时增加ROS积累。此外，MTHMS + L组的荧光强度进一步增强，这归因于协同介导的气体治疗激活了线粒体ROS信号通路 45 ,46
mtDNA释放和cGAS-STING通路刺激 调查H 2 S/CO可诱导线粒体DNA (mtDNA)释放，并协同促进cGAS-STING通路的激活。通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究了胞质和胞外mtDNA 47 。如图所示。 4a ，THMS + L组显示了比TSSI + L组更高水平的胞质和细胞外mtDNA，证实了H 2 s介导的mtDNA释放。值得注意的是，由于释放的一氧化碳协同诱导线粒体功能障碍，MTHMS + L组表现出更多的mtDNA释放。此外，cGAS-STING通路存在于树突状细胞(DCs)和癌细胞中。因此，测量了不同处理后的癌细胞和与预处理的癌细胞一起孵育的骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)中IFN-β、C-X-C基序趋化因子10 (CXCL10)和IL-6的水平。如图所示。 4b，c MTHMS + L组的IFN-β、CXCL10和IL-6表达在癌细胞和BMDCs中均显著升高，证明了cGAS-STING通路的有效激活。由于cGAS-STING激活，评估了用不同处理的肿瘤细胞诱导的成熟树突状细胞的频率。将不同处理的4T1细胞裂解并与BMDCs共培养。正如所料，MTHMS + L处理的癌细胞显著促进了DC的成熟(图。 4d，e ，补充图。 11 )，这是由cGAS-STING途径激活后显著的IFN-β释放所驱动的。为了进一步证实cGAS-STING激活诱导的DC成熟，当将BMDCs与MTHMS + L处理的癌细胞一起孵育时，分别加入cGAS-STING途径的高效和选择性抑制剂(RU.521、C-178或C-176) 48 ,49 ,50 。如补充图所示。 12 cGAS-STING途径抑制显著降低了IFN-β、CXCL10和IL-6的表达，并降低了成熟树突状细胞的频率，证明了cGAS-STING途径依赖的DC成熟。
图4:通过cGAS-STING激活评价gas纳米佐剂诱导的mtDNA释放和抗肿瘤免疫反应。 a RT-PCR检测不同处理后4T1癌细胞的胞质溶胶和上清液中的相对mtDNA拷贝数( n = 3个独立实验)。在培养上清液中检测细胞因子(IFN-β、CXCL10和IL-6) b 4T1细胞按照指示的处理和 c 与预处理的癌细胞一起孵育的BMDCs( n = 3个独立实验)。 b 这 p 在IFN-β、CXCL10和IL-6的检测中，MTHMS + L与THMS + L的比值分别为0.0052、0.0143和< 0.0001。和 p IFN-β、CXCL10、IL-6检测中THMS + L与TSSI + L的比值分别为0.0133、0.0307、0.0015。 d 流式细胞术评估图像和 e DC成熟的相对定量(CD11c + CD80 + CD86 +) 由不同处理的癌细胞触发( n = 3英寸 n 凹痕实验)。 f 通过CCK-8试验研究制剂对4T1癌细胞增殖的抑制作用( n = 3英寸 n 凹痕实验)。 h 流式细胞术评估图像和 g 4T1癌细胞凋亡的相对定量在接受指定的处理后，用膜联蛋白V-FITC/PI( n = 3个独立实验)。 g 这 p MTHMS + L与THMS + L的比值以及MTHMS + L与MnCO+TSSI + L的比值分别为0.0002和< 0.0001。 i 钙黄绿素-AM/PI染剂 i 不同处理的4T1细胞的ng(比例尺= 40微米)。实验独立重复三次，结果相似。数据代表平均值±标准差。使用Tukey事后检验通过单向ANOVA计算统计显著性。基础源数据 a –c , e –g 作为源数据文件提供。
体外细胞毒性和凋亡试验 我们首先利用Chou-Talalay方法来分析这种结合。组合指数(CI)是参照以下等式确定的:CI n = (D) a /(Dn) a + (D) b /(Dn) b ，其中(Dn) a 和(Dn) b 是抑制细胞生长n%的药物a和b的剂量。和(D) a 和(D) b 表示a和b各自的药物浓度，其中药物组合抑制细胞生长n%。CI > 1、CI = 1和CI < 1分别代表拮抗、叠加和协同效应。生长抑制效应(受影响的分数，Fa)参照以下等式确定:Fa = 1-(%生长/100)。构建了不同Fa水平的CI图。如补充图所示。 13 在激光照射下，TSSI与MnCO的质量比为1:3时，协同效应最好。然后通过CCK-8试验评估各种处理的细胞毒性。如图所示。 4f 和补充表格 2 MHMS表现出有限的毒性，即使在120μg·mL的高浓度MnCO下，细胞杀伤率也接近44.76±5.66% −1 。而MnCO+TSSI + L和THMS + L对4T1细胞的杀伤作用明显增强，存活率分别为31.17±3.02%和21.35±2.09%。注意，MTHMS + L处理的细胞显示最低的存活率为12.06±2.46%，这是由于光疗和CO/H的协同抗肿瘤效果 2 气体疗法。CI 50 mth ms+1对4T1癌细胞的值为0.32，表明了强的协同作用和良好的顺序MnCO活化。此外，预处理后的4T1细胞进一步孵育12小时，采用流式细胞仪检测膜联蛋白V-FITC/PI染色后的细胞凋亡率(补充图。 14 ).高达97.50±0.91%的PBS处理的细胞位于存活区域(图。 4g，h ).然而，在MHMS和THMS+1处理组中，凋亡和坏死细胞的比例增加到20.79±2.99%和39.83±4.43%。更明显的是，在MTHMS + L处理的4T1细胞中可以检测到广泛的细胞凋亡和坏死率(58.91±3.36%)，证实了令人满意的治疗效果。此外，评估激光照射后不同时间点(0、1、3、6和12小时)的细胞凋亡和活/死染色，以提供mth ms+1处理后细胞死亡的时间过程。如补充图所示。 15a，b 激光照射后，随着孵育时间的延长，细胞凋亡率和细胞死亡逐渐增加。同时，活/死染色进一步表明mth ms+1的优异抗肿瘤潜力(图。 4i
多模式成像 TSSI拥有多模式成像能力，包括NIR-II FLI、PAI和PTI，能够获取丰富而准确的肿瘤数据 51 。如补充图所示。 16 ，与游离TSSI处理的小鼠相比，在MTHMS处理的小鼠的肿瘤部位观察到明显的NIR-II荧光信号。信号强度逐渐增加，并在注射后12小时达到峰值。为了进一步探索MTHMS的生物分布，在注射后24小时对小鼠实施安乐死以收获肿瘤和主要器官用于荧光成像和定量分析。如补充图所示。 17a，b ，肿瘤显示出比正常器官更高的荧光强度，这可能是由增强的渗透性和保留(EPR)效应和良好的肿瘤粘附以及基于独特的病毒样结构的内化所驱动的。受MTHMS将光转化为热的卓越效率的启发，将相同的肿瘤模型应用于PAI。如补充图所示。 18a 肿瘤区域的光声信号随时间显著增强，并在12小时达到最大值，这与NIR-II FLI结果一致。之后，通过用红外热像仪监测实时温度来评估PTI。如补充图所示。 18b 在660 nm激光照射10分钟后，温度从37.2℃迅速上升到55.7℃，反映了MTHMS在PTT应用中的良好潜力。
体内抗癌研究 我们进一步评估了四硫化物掺杂的病毒模拟和GSH/NIR顺序引发的gas纳米佐剂的体内抗癌功效。通过将4T1细胞接种到BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中来建立4T1肿瘤模型。在第10天，静脉注射4T1细胞( 静脉注射 。)注射以模拟恶性肿瘤侵袭和血源性转移(图。 5a 52 。附加的 静脉注射 。将4T1肿瘤细胞注射到荷瘤小鼠中以模拟血行转移已经作为人工全身扩散肿瘤模型被广泛应用 53 ,54 ,55 ,56 。与自发性肺转移相比，全身转移模型更具攻击性和挑战性，适合于专门的抗转移评价。循环的癌细胞可以侵入各种器官，尤其是肺。原位肿瘤的治疗在术前进行了两次 静脉注射 。接种肿瘤细胞。每两天记录肿瘤生长和体重变化。如图所示。 5b–d 生理盐水组的肿瘤体积明显增大，达到约1550 mm 3 在第20天。相比之下，MHMS显示了肿瘤生长的轻微延迟(~1160 mm 3 ).此外，与盐水对照相比，THMS + L和MnCO+TSSI + L治疗显示出对肿瘤进展的明显抑制，但仍达到约720 mm 3 和～910毫米 3 ，分别为。值得注意的是，在MTHMS + L治疗(~260 mm)后，肿瘤生长被完全抑制 3 ).为了评估MTHMS + L处理后的ROS水平，进行了肿瘤载玻片的DCFH-DA染色。如补充图所示。 19 ，MTHMS + L处理在肿瘤组织中诱导了强的DCF荧光强度，暗示了肿瘤内ROS爆发。然后我们用FL-CO-1荧光探针研究了肿瘤内的CO水平。如补充图所示。 20 ，MTHMS + L治疗在肿瘤部位引起相当多的一氧化碳生成。还记录了存活曲线(图。 5e ).正如预期的那样，MTHMS + L组的小鼠寿命显著延长，在40天内显示出最高的存活率(83%)。此外，在MTHMS + L组中没有检测到体重的显著减少(补充图。 21 )，这意味着没有严重的全身毒性。同时，通过主要器官的苏木精-伊红(H&E)染色和肝肾功能测定进一步验证了MTHMS + L治疗的生物安全性。如补充图所示。 22 , 23 H&E染色未见明显的器官损伤，肝肾功能未见明显异常。为了证实由MTHMS + L处理引发的免疫记忆，2 × 10 5 在第40天，将4T1细胞注射到MTHMS + L组存活小鼠的左侧乳腺脂肪垫中。同时，将4T1细胞接种到未受感染的小鼠中作为对照。如图所示。 5f，g MTHMS + L组存活小鼠表现出对癌症再攻击的有效抵抗，且存活时间显著延长，证实gas纳米佐剂可产生持久的抗肿瘤免疫以抑制癌症复发。此外，H&E染色的MTHMS + L处理的小鼠的肿瘤切片显示了严重的损伤。肿瘤切片的Ki67和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)染色也证实了MTHMS + L治疗诱导的广泛凋亡(图。 5h ).接下来我们切除肺，用布因氏液染色评估转移的程度。与盐水组相比，在MTHMS + L组中未观察到可见的肺转移结节(图。 5i ，补充图。 24 )，证明了对肺转移的有效抑制。此外，用H&E染色评估肿瘤细胞的肺和肝转移。如图所示。 5i MTHMS + L治疗有效地抑制了肿瘤转移的进程。
图MTHMS治疗效果的评估。 a 示意图描绘了4T1肿瘤模型，4T1细胞被静脉注射( 静脉注射 。)施用到第10天的荷瘤小鼠中以模拟血源性转移(WB:蛋白质印迹试验；FC:流式细胞仪分析；IF:免疫荧光；ELISA:酶联免疫吸附试验；TUNEL:末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记；H&E:苏木精和曙红)。 b 肿瘤生长曲线( n = 5只老鼠)，( c )肿瘤重量变化( n = 5只老鼠)，( d )肿瘤照片( n = 5只小鼠)，以及 e 生存曲线( n = 6只小鼠)。对于( c )，在 p MTHMS + L与THMS + L的比值小于0.0001。 f 肿瘤生长曲线和( g )用4T1癌细胞再次攻击的小鼠的存活曲线( n = 5只小鼠)。 h 从接受各种治疗的小鼠收集的肿瘤切片的H&E、TUNEL和Ki67染色的代表性图像( n = 3只老鼠)。 i 用Bouin氏液染色的肺的代表性照片和不同处理后肺和肝的H&E染色的代表性图像( n = 3只老鼠)。虚线轮廓表示H&E染色中的肺和肝转移。比例尺= 100 μm。数据代表平均值±SD。使用Tukey事后检验通过单向ANOVA计算统计显著性( b )、对数秩(Mantel–Cox)检验( e , g )，还是双尾学生的 t 测试( f ).基础源数据 b , c , 例如 作为源数据文件提供。
为了研究所观察到的抗肿瘤作用是否依赖于免疫系统(对CD8 T细胞)，将抗CD8α抗体腹膜内注射入小鼠体内淋巴细胞去除。结果显示CD8 + t细胞去除显著削弱了肿瘤抑制，导致严重的肺转移，并缩短了用MTHMS + L治疗的小鼠的存活时间(补充图。 25 阿–英， 26 , 27 )，证实了免疫系统在gas纳米佐剂辅助光免疫治疗中的核心作用。同时，MTHMS + L组存活的小鼠也用含/不含CD8的4T1细胞再次攻击 + t细胞衰竭。如补充图所示。 25f ，肿瘤体积CD8 + t细胞减少的小鼠表现出明显的增加，达到约780 mm 3 在第20天，验证免疫系统在抵抗肿瘤复发中的作用。
我们还评估了MTHMS在没有激光照射的情况下对肿瘤生长和肺转移的作用。激光照射的缺乏导致PDT/PTT治疗的失败和MnCO激活的不足，这阻碍了gas纳米佐剂的顺序启动的刺激。如补充图所示。 25 阿–英， 26 , 27 ，MTHMS治疗显示了肿瘤进展的轻微延迟(~1060 mm 3 )和大量肺转移结节，表明治疗效果明显减弱。
cGAS-STING通路激活与抗肿瘤免疫反应 释放的锰 2+ 胞质溶胶中可刺激cGAS并使cGAS对GAS纳米佐剂诱导的mtDNA泄漏敏感，促进STING通路的激活和树突状细胞的成熟(图。 6a 57 ,58 。我们进一步通过免疫印迹法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤组织中cGAS-STING通路相关蛋白的表达和细胞因子的分泌 59 ,60 。如图所示。 6b 与有/无激光照射的盐水组相比，磷酸化STING的表达水平( P 斯汀)、TBK1( p TBK1)，以及IRF-3( P IRF-3)在MHMS组明显增加，提示肿瘤微环境驱动的H 2 硫/钴/锰 2+ 释放可以在一定程度上增加叮咬介导的I型干扰素的产生。值得注意的是，与THMS + L相比，MTHMS + L诱导了STING通路相关磷酸化蛋白的更高表达，表明光疗放大的MnCO激活为cGAS-STING通路激活提供了巨大的潜力。同时，与其他组相比，MTHMS + L组的cGAS-STING相关细胞因子(如IFN-β、CXCL10)和促炎细胞因子(包括TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12)的分泌显著增加(补充图。 28 )，支持cGAS-STING途径激活和将“冷”肿瘤转换为更敏感的“热”肿瘤的潜力。我们推测，MTHMS + L诱导的与IFN-β分泌相关的cGAS-STING通路激活可能有助于DC成熟，从而诱导肿瘤引流淋巴结(TDLNs)中T细胞的激活。为了测试上述假设，我们研究了各种治疗引发的免疫反应。如图所示。 6c ，补充图。 29 成熟树突状细胞(CD11c)的表达 + CD80 + CD86 + 与其他组相比，MTHMS + L治疗后TDLNs中的。成熟树突状细胞可向T淋巴细胞呈递抗原，启动肿瘤特异性获得性免疫。令人鼓舞的是，肿瘤浸润性CD8 + t细胞在MTHMS + L组中显著增加(图。 6d ，补充图。 30 ).肿瘤浸润性免疫抑制调节性T细胞(Tregs，CD4 + Foxp3 + 与其他组相比，MTHMS + L组明显下降(图。 6e ，补充图。 30 ).此外，MTHMS + L治疗对抗炎M2样肿瘤相关巨噬细胞(TAMs，CD206 你好 CD11b + F4/80 + )，而促炎性M1样TAMs (CD80 你好 CD11b + F4/80 + )明显增加(图。 6f，g ，补充图。 31 , 32 ).免疫荧光染色显示CD8明显增加 + MTHMS + L治疗后肿瘤组织中的t细胞和巨噬细胞浸润(补充图。 33 )，证实了强免疫反应的诱导。此外，我们监测了CD8的水平 + 效应记忆T细胞(T 东地中海(Eastern Mediterranean) ，CD3 + CD8 + CD62L 低的 CD44 你好 )不同处理后的小鼠。如图所示。 6小时 ，补充图。 34 ，T 东地中海(Eastern Mediterranean) 用MTHMS + L治疗后，脾脏中的比例显著增加，表明gas纳米佐剂建立了持久的免疫记忆。为了评估由gas纳米佐剂辅助的光免疫疗法触发的肿瘤特异性T细胞反应，gp70四聚体特异性CD8 + 通过流式细胞术分析监测脾脏中的t细胞。MTHMS + L治疗后，肿瘤反应性gp70四聚体特异性CD8 + t细胞上升到约4.5%的高水平(补充图。 35 , 36 )，说明诱导了肿瘤特异性T细胞免疫。
图6:治疗后cGAS-STING途径激活和抗肿瘤免疫。 G1:生理盐水，G2:生理盐水+L，G3: MHMS，G4: MnCO+TSSI + L，G5: THMS + L，G6: MTHMS + L a gas纳米佐剂介导的cGAS-STING促进的示意图。 b 斯汀，TBK1，IRF-3和肿瘤蛋白磷酸化的蛋白质印迹分析。平行处理来自相同实验和凝胶/印迹的样品。实验独立重复两次，结果相似。 c 成熟DC (CD11c)的流式细胞分析 + CD80 + CD86 + )在TDLNs( n = 4只老鼠)。这 p G6至G5和G6至G4的值分别为0.0003和< 0.0001。 d 肿瘤浸润性CD8的流式细胞分析 + 在CD3中 + t细胞( n = 4只老鼠)。这 p G6到G5和G6到G4的值是0.0001和< 0.0001。 e 肿瘤浸润性CD4的流式细胞分析 + Foxp3 + 特雷格斯( n = 4只老鼠)。这 p G6到G5和G6到G4的值都< 0.0001。肿瘤浸润的流式细胞分析 f M2样巨噬细胞(CD206 你好 CD11b + F4/80 + )和 g M1样巨噬细胞(CD80 你好 CD11b + F4/80 + ) (n = 4只老鼠)。 f p G6至G5和G6至G4的值分别为0.0006和0.0001。 g p G6至G5和G6至G4的值分别为0.0002和< 0.0001。 h CD3的流式细胞分析 + CD8 + CD62L 低的 CD44 你好 东地中海(Eastern Mediterranean) 在脾脏( n = 4只老鼠)。这 p G6到G5和G6到G4的值是0.0001和< 0.0001。数据代表平均值±标准差。使用Tukey事后检验，通过单向ANOVA对数据进行比较。基础源数据 b –h 作为源数据文件提供。
双侧肿瘤模型中的离斑效应 然后，我们构建了一个双侧肿瘤模型，并研究了gas纳米佐剂是否可以诱导系统免疫并抑制远处肿瘤 61 ,62 。通过在第0天将4T1细胞注射到右侧乳房脂肪垫中作为原发性肿瘤来建立双侧肿瘤模型。在第6天，将4T1细胞接种到与远处肿瘤相同的小鼠的左侧乳房脂肪垫中。在第7天，当原发肿瘤达到 ∼ 80毫米 3 ，小鼠被随机分为两组。在第7天和第14天静脉注射盐水和MTHMS。只有原发肿瘤在注射后12小时被直接照射，而远处的肿瘤保持自然生长(图。 7a ).令人鼓舞的是，MTHMS + L治疗显示出对原发性和未照射的远处肿瘤的有效抑制(图。 7b–d )，揭示了gas纳米佐剂辅助的光免疫疗法的离焦效应。探讨CD8是否影响肿瘤的生长 + t细胞，将抗CD8a抗体腹膜内注射到小鼠体内，用于体内淋巴细胞去除。结果显示CD8 + t细胞去除削弱了MTHMS + L治疗后对继发性肿瘤的抑制(补充图。 37 )，证实了CD8的关键作用 + t细胞在减少继发性肿瘤的生长。为了排除在脓肿实验中注射纳米颗粒的直接影响，我们评估了没有激光照射的MTHMS的治疗结果。如补充图所示。 37 在没有激光照射的情况下施用MTHMS后，继发性肿瘤的体积显著增加，而mth ms+1治疗有效地抑制了继发性肿瘤，证实了gas纳米佐剂辅助的光免疫疗法的脓肿效应。
图7: Gas纳米佐剂诱导的全身抗肿瘤免疫。 a 双侧肿瘤模型示意图。右侧的肿瘤代表经激光照射的“原发性肿瘤”，而左侧的肿瘤被定义为未经任何治疗的“远处肿瘤”(FC:流式细胞术分析；ELISA:酶联免疫吸附试验)。 b 肿瘤照片， c 肿瘤生长曲线， d 指定治疗后的肿瘤重量变化( n = 5只小鼠)。 e 肿瘤浸润性CD8的流式细胞分析和相对定量 + 在CD3中 + t细胞( n = 4只老鼠)。 f 肿瘤浸润性CD4的流式细胞分析和相对定量 + Foxp3 + 特雷格斯( n = 4只老鼠)。 c –f 这 p MTHMS + L(右)对盐水+ L(右)和MTHMS + L(左)对盐水+L(左)的值都< 0.0001。 g 流式细胞分析和CD3的相对定量 + CD8 + CD62L 低的 CD44 你好 东地中海(Eastern Mediterranean) 在脾脏( n = 4只老鼠)。 g 这 p MTHMS + L与盐水+ L的比值< 0.0001。 h 血清中细胞因子(IL-6、TNF-α和IFN-γ)的分泌( n = 4只老鼠)。 h 这 p IL-6、TNF-α、IFN-γ分泌中MTHMS + L与盐水+ L的比值分别< 0.0001、0.0019、< 0.0001。数据代表平均值±标准差。使用Tukey事后检验通过单向ANOVA计算统计显著性( c –f )还是双尾学生的 t 测试( g , h ).基础源数据 c –h 作为源数据文件提供。
免疫抑制TME有助于肿瘤发展和免疫逃逸，这严重阻碍了抗肿瘤活性。未受照射的远处肿瘤的抑制可以证明抗肿瘤免疫反应的激活，这提高了细胞毒性T淋巴细胞的募集，并将免疫学上“冷”的TME转变为“热”的TME。CD8的肿瘤内浸润 + t细胞是定义“热”和“冷”TME的关键标志。如图所示。 7e MTHMS + L处理引起更多的CD8 + 原发性和远处肿瘤中的t细胞浸润，证实了免疫抑制性TME的缓解。同时，在原发和远处肿瘤中Tregs的显著减少，以及T。 东地中海(Eastern Mediterranean) 在脾脏中，发现在MTHMS + L组(图。 7f，g ).我们还评估了在abscopal模型中肿瘤特异性T细胞反应的激活。如补充图所示。 38 MTHMS + L诱发约4.1% gp70四聚体特异性CD8的峰频率 + T细胞，表现出强大的肿瘤特异性T细胞免疫的激发。此外，MTHMS + L治疗导致血清中促炎细胞因子的高表达，包括TNF-α、IFN-γ和IL-6(图。 7h ).此外，在MTHMS + L组中没有监测到显著的体重变化(补充图。 39 ).
