PRMT1甲基化cGAS并抑制癌细胞中的cGAS/STING信号
我们推测PRMT1可能介导cGAS精氨酸甲基化来调节先天免疫。为了检验这一假设，我们在缺乏内源性cGAS和STING表达的HEK293T细胞中共转染HA-cGAS和GFP-PRMTs以避免下游炎症信号。值得注意的是，我们发现CGA只与PRMT1和PRMT2结合，而不与我们测试的其他PRM结合。此外，只有PRMT1触发了人和小鼠CGA的精氨酸残基(ADMA)的不对称二甲基化(图。1a，补充图。1a、b).与这一发现一致，PRMT1与内源性cGAS结合(图。1b)和体外甲基化cGAS(图。1c，补充图。1c).此外，PRMT1的三个催化死亡突变体，即G98R、E162Q和E171A37,38，不能结合或甲基化cGAS(图。1d，补充图。1d).同时，PRMT1抑制剂MS023可以完全消除PRMT1介导的cGAS精氨酸甲基化39和GSK336871540(图。1e)，表明PRMT1可能以催化依赖的方式促进cGAS的精氨酸甲基化。
图1: PRMT1甲基化cGAS并抑制cGAS/STING DNA感应信号。aPRMT1与cGAS相互作用并甲基化cGAS。ADMA:不对称二甲基精氨酸。来源于异位表达HA-cGAS和GFP-PRMTs构建体的HEK293T细胞的HA免疫沉淀和WCL的免疫印迹分析。b内源性PRMT1与cGAS结合。使用PRMT1抗体或对照IgG对来自HeLa细胞的免疫沉淀物进行免疫印迹分析。cPRMT1在体外甲基化cGAS。纯化的GST-cGAS蛋白与PRMT1蛋白和SAM一起孵育1.5小时，然后用指定的抗体进行免疫印迹分析。dPRMT1以酶活性依赖的方式甲基化cGAS。来源于异位表达HA-cGAS和GFP-PRMT1或指示突变构建体的HEK293T细胞的HA免疫沉淀和WCL的免疫印迹分析。e抑制PRMT1阻断cGAS甲基化。用MS023 (6 M)或GSK3368715 (6 M)处理24小时，对来源于HEK293T细胞的HA免疫沉淀和WCL进行免疫印迹分析。fPRMT1的稳定过表达抑制cGAS/STING DNA传感信号。稳定表达GFP或HA-PRMT1的HeLa细胞用HT-DNA(1×1μg/mL；2×: 2微克/毫升)或ISD (0.2微克/毫升)作用12小时，然后进行免疫印迹分析。g表达GFP、HA-PRMT1-WT或催化死亡突变体HA-PRMT1-E162Q的HeLa稳定细胞系的免疫印迹分析，用或不用HT-DNA (1 μg/mL)刺激12小时，然后进行免疫印迹分析。hPRMT1过表达减少DNA刺激的cGAMP产生。HeLa稳定细胞系f用1 μg/mL的HT-DNA刺激12小时，然后用ELISA分析来测量cGAMP水平。n= 3.iPRMT1过表达减少DNA刺激的I/II型干扰素应答基因的表达。HeLa稳定的细胞系f用1 μg/mL的HT-DNA刺激12小时，然后用qPCR分析来测量CCL5和CXCL10的mRNA水平。n= 4.数据以平均值±SD表示h和i。双尾不成对学生t测试用于h和i。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步探索PRMT1介导的cGAS甲基化是否以及如何影响癌细胞中cGAS依赖的DNA感应信号，我们建立了一个稳定过表达PRMT1的HeLa细胞系(补充图。1e)并发现PRMT1过表达强烈抑制细胞DNA感知，这反映在用DNA(包括HT-DNA和ISD45)刺激后STING和IRF3的磷酸化减少(图。1f，补充图。1f，g).相反，催化死亡的PRMT1-E162Q突变体的稳定过表达不能抑制DNA感应(图。第一代，补充图。1h-j)，表明观察到的PRMT1对cGAS/STING DNA传感途径的抑制作用可能是催化依赖性的。为了进一步支持PRMT1在直接抑制cGAS酶活性中的作用，而不是间接影响其下游STING/TBK1/IRF3信号传导成分的活性，我们发现PRMT1过表达减少了DNA刺激后cGAMP的产生(图。1h).根据这一发现，PRMT1过度表达随后抑制了STING和IRF3的磷酸化，并降低了I型干扰素应答基因的转录，包括CCL5和CXCL10(图。1i，补充图。1k).
PRMT1的基因切除或药物抑制导致cGAS/STING信号的激活
为了进一步确定PRMT1在控制cGAS/STING信号中的作用，我们去除了内源性的PRMT1使用shRNA，发现PRMT1的基因缺失以时间依赖的方式激活了HeLa细胞中的cGAS/STING/IRF3信号(补充图。2a–c).排除…的潜在影响PRMT1消融对细胞增殖速率的影响，我们进一步生成了强力霉素(DOX)诱导的PRMT1敲除细胞并发现DOX诱发的短暂现象PRMT1消耗轻度影响细胞增殖(HeLa-tet-on-shPRMT1，图。2a，补充图。2d).类似于DOX诱导的持续shRNA敲低效应PRMT1敲除在基础和DNA刺激的情况下诱导cGAS依赖的DNA感应信号的激活(图。2b，补充图。2e，f).此外，删除PRMT1cGAMP产量增加(图。2c)和I型干扰素应答基因的转录(图。2d).与遗传学相呼应PRMT1消融，使用特定小分子抑制剂对PRMT1进行药物抑制，MS02339和GSK336871540，也导致DNA感应信号的类似激活，但不是以剂量和时间依赖的方式激活RNA感应信号(图。2e，f，补充图。2g–l).更重要的是，PRMT1抑制导致的DNA感应信号的激活可以通过耗尽内源性而完全消除cGAS(图。2g，补充图。2m).此外，PRMT1抑制也增加了cGAMP的产量。cGAS+/+，但不是cGAS−/−细胞(图2h，补充图。2n).这些数据共同表明，PRMT1通过cGAS的直接精氨酸甲基化抑制癌细胞中的cGAS/STING/IRF3 DNA感知信号(图。2i).
图PRMT1的基因切除或药物抑制导致cGAS/STING信号的激活。aHeLa-tet-on-sh的免疫印迹分析PRMT1稳定的细胞系。用tet诱导的sh感染HeLa细胞PRMT1并用多西环素(DOX)治疗3天，然后进行免疫印迹分析。b的遗传消融PRMT1激活cGAS/STING信号。稳定的HeLa细胞a用1 μg/mL的HT-DNA刺激12小时，然后进行免疫印迹分析。c的遗传消融PRMT1增加DNA刺激的cGAMP产生。稳定的HeLa细胞按b，随后进行ELISA分析以测量cGAMP水平。n= 4.d的遗传消融PRMT1增加DNA刺激的I型干扰素应答基因的表达。稳定的HeLa细胞按b，接着进行qPCR分析以测量CCL5和CXCL10的mRNA水平。n= 4.ePRMT1抑制激活cGAS/STING信号。用1或5微米的MS023处理HeLa细胞48小时，然后用HT-DNA(1×:1μg/mL；5×5μg/mL)或聚(I:C)12小时，然后进行免疫印迹分析。fPRMT1抑制以时间依赖的方式激活cGAS/STING信号。用5微米的MS023处理HeLa细胞48小时，然后用1 μg/mL的HT-DNA刺激指定的小时，然后进行免疫印迹分析。gPRMT1抑制以cGAS依赖的方式激活cGAS/STING信号。希拉-cGAS-WT或cGAS-KO细胞用2或6微米的MS023处理48小时，然后用1 μg/mL的HT-DNA刺激12小时，接着进行免疫印迹分析。hPRMT1抑制以cGAS依赖的方式增加DNA刺激的cGAMP产生。希拉-cGAS-WT或cGAS-KO细胞用2微米的MS023处理48小时，然后用1 μg/mL的HT-DNA刺激12小时，接着进行ELISA分析以测量cGAMP水平。n= 4.i示意图显示PRMT1甲基化并抑制cGAS功能。数据以平均值±SD表示c, d, h。双尾不成对学生t测试用于森林c, d, h。源数据作为源数据文件提供。
PRMT1在其N-末端保守的Arg133残基甲基化cGAS
cGAS N-末端的两个保守精氨酸残基，即Arg-71 (R71)和Arg-75 (R75)，对于cGAS锚定在质膜上是至关重要的25。因此，我们通过体内甲基化分析测试了R71/75在PRMT1介导的甲基化中的潜在作用(图。3a，b).值得注意的是，甲基化不受R71/75突变为谷氨酸(E)的影响，但被cGAS的N-末端160个氨基酸的截短所消除(即cGAS-δ160，图。3a，b)，表明PRMT1在其N-末端甲基化cGAS。cGAS的N-末端对其功能和调节是必需的20,24，并包含多个保守的精氨酸残基，包括R60、R80、R124、R127和R133(图。3a，补充图。3a，b).通过将这些精氨酸残基突变为赖氨酸(K)，我们确定R133残基(小鼠中的R139)是PRMT1介导的cGAS甲基化的主要位点(图。3c，补充图。3c)，这通过体外甲基化分析和质谱分析得到了进一步验证(图。三维（three dimension的缩写），补充图。3d–f).
图3: PRMT1在保守的R133残基甲基化cGAS以抑制cGAS/STING信号。a示意图显示了cGAS N-末端保守的精氨酸残基。cGAS-δ160:缺少N端氨基酸1-160的cGAS。R71/75E:精氨酸71/51至谷氨酸突变体。bPRMT1在其N-末端甲基化CGA。来源于异位表达Flag-PRMT1和HA-cGAS的HEK293T细胞的HA免疫沉淀和WCL的免疫印迹分析。ccGAS中保守的R133是PRMT1介导的不对称二甲基化的主要位点。d在体外甲基化检测中，R133残基的突变大大降低了PRMT1介导的CGA甲基化。eR133残基的突变抑制cGAS二聚化。来自异位表达GST-cGAS和HA-cGAS-WT或R133F突变构建体的HEK293T细胞的GST下拉产物和WCL的免疫印迹分析。R133F:精氨酸133变为苯丙氨酸突变体。fcGAS-R133甲基化的破坏激活cGAS/STING信号。希拉-cGAS−/−表达HA-cGAS-WT或R133K的细胞被HT-DNA刺激，然后进行免疫印迹分析。gcGAS精氨酸甲基化的破坏以时间依赖的方式激活cGAS/STING信号。稳定的HeLa细胞系f用HT-DNA刺激指定的时间，然后进行免疫印迹分析。h破坏cGAS精氨酸甲基化增加I型干扰素应答基因的DNA刺激表达。稳定的HeLa细胞系f用HT-DNA刺激，然后进行qPCR分析。双尾不成对学生t测试，n= 4.数据以平均值±SD表示。icGAS-R133突变消除了PRMT1介导的cGAS/STING信号调节。稳定的HeLa细胞系f被tet诱导的sh感染PRMT1慢病毒，用DOX处理，用HT-DNA刺激，然后进行免疫印迹分析。jPRMT1抑制激活cGAS-WT表达细胞中的cGAS/STING信号，但不激活cGAS-R133K突变体表达细胞中的cGAS/STING信号。稳定的HeLa细胞系f用MS023 (6 M)或GSK3368715 (6 M)处理48小时，用HT-DNA刺激，然后进行免疫印迹分析。源数据作为源数据文件提供。
从机理上讲，甲基化模拟突变体cGAS-R133F抑制了cGAS的二聚化(图。3e)，但对其DNA结合能力或亚细胞定位的影响相对较小(补充图。3g–I)，表明R133上的甲基化可能干扰cGAS同型二聚化。在功能上，表达甲基化缺陷突变体cGAS-R133K的稳定HeLa细胞系具有相对较高的基础水平和DNA刺激水平的p-STING和p-IRF3，呈剂量和时间依赖性(图。3f，g，补充图。3j-m)，从而提高I型干扰素应答基因、CCL5和CXCL10的表达(图。3h).相反，表达甲基化模拟cGAS-R133F突变体的稳定细胞系的p-IRF3水平比野生型细胞相对较低(补充图。3n，o).与此同时，进一步消耗PRMT1仅在表达WT-cGAS的HeLa细胞中激活cGAS/STING DNA感应信号，而在表达cGAS-R133K突变体的HeLa细胞中不激活(图。3i).一致地，MS023和GSK3368715对PRMT1的药物抑制仅在表达野生型(WT)-cGAS的HeLa细胞中提高了IRF3的磷酸化，而在表达cGAS-R133K突变体的HeLa细胞中没有(图。3j).总之，这些数据表明，在cGAS保守的R133残基上PRMT1介导的甲基化抑制了cGAS/STING DNA传感信号。
PRMT1以cGAS依赖的方式抑制肿瘤免疫
因为cGAS/STING途径对于抗肿瘤免疫是必需的11,12，我们进一步确定PRMT1是否是免疫治疗的合理靶点。通过分析PRMT1在TCGA患者肿瘤发生和免疫细胞浸润中的作用(详见方法)，我们发现PRMT1在大多数癌症类型中高表达，包括乳腺癌(BRCA，补充图。4a).更重要的是，PRMT1的表达与CD8的浸润呈负相关+BRCA、皮肤黑素瘤(SKCM)和头颈部鳞状细胞癌中的t细胞和巨噬细胞(图。4a，补充图。4b，c).此外，PRMT1表达与效应T细胞信号呈负相关41在BRCA和肺腺癌(补充图。4d).
图4: PRMT1抑制人肿瘤样品和小鼠肿瘤细胞中的肿瘤免疫细胞浸润。a在TCGA多种癌症类型中，PRMT1表达与CD8+ T细胞浸润呈负相关。SKCM:皮肤黑色素瘤，HNSC:头颈部鳞状细胞癌，BRCA:乳腺浸润癌。斯皮尔曼相关ρ和p呈现值。误差带代表95%的置信区间。bCT26-tet-on-sh的免疫印迹分析Prmt用多西环素处理48小时后的1个细胞。用tet诱导型sh感染CT26小鼠肿瘤细胞Prmt1慢病毒并用5 μg/mL嘌呤霉素选择7天。稳定的CT26-tet-on-shPrmt1用指定剂量的DOX处理细胞系3天，收获用于免疫印迹分析。c的遗传消融Prmt1激活I型和II型干扰素基因的表达。稳定的CT26-tet-on-shPrmt1用DOX处理细胞系3天以诱导内源基因的缺失Prmt1，然后进行RNA测序和基因组富集分析(GSEA)。d基因切除后IFN-α反应特征的基因集合富集图Prmt1在CT26细胞中b。NES = 2.55，q < 0.001. e基因切除后IFN-γ反应特征的基因集合富集图Prmt1在CT26细胞中b。NES = 2.51，q < 0.001. f基因切除后IFN-α应答基因的热图Prmt1在CT26细胞中d. g基因切除后IFN-γ应答基因的热图Prmt1在CT26细胞中e. h耗尽Prmt1在CT26小鼠中，肿瘤细胞诱导干扰素α和IFN-γ应答基因的转录。双尾不成对学生t测试，n= 4.数据以平均值±SD表示。i, jfrom GSE9893来源的PRMT1表达与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润和存活的相关性分析(i)和GSE24450(j)在PRECOG by潮汐。k, lTCGA转移性黑色素瘤PRMT1表达与CTL浸润和生存的相关性分析(k)和GSE8401(l)乘潮。i–l斯皮尔曼相关ρ和p呈现值。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们确定了PRMT1在体外和体内肿瘤免疫监测中的因果效应。为此，我们建立了一种小鼠癌细胞系CT26，它能稳定表达DOX诱导的shPrmt1施工(以下简称CT26-tet-on-shPrmt1)，进行RNA测序以分析PRMT1应答基因(图。4b).值得注意的是，Prmt1耗尽提高了I型和II型干扰素反应基因的表达(图。4c–g)，以及其他炎症相关基因信号，包括炎症反应和IL6-JAK-STAT3信号(补充图。4e–g).基因缺失后，通过RT-qPCR进一步证实了I型和II型干扰素应答基因的高表达PRMT1(图。4h).与PRMT1在抑制肿瘤免疫监视中的关键作用相一致，相对较高的PRMT1表达水平预示着BRCA患者较低的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润和较差的预后(图。4i，j)，转移性黑色素瘤(图。4k，l)，以及其他几种癌症类型，包括多发性骨髓瘤(MM，补充图。4h)和神经母细胞瘤(注意，补充图。4i).此外，PRMT1表达和CTL浸润之间的反向相关性也发生在其他癌症类型中，包括急性髓细胞白血病(AML)、卵巢癌(OVCA)、肺癌(LUCA)、膀胱癌(BLCA)、肝癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC，补充图。4h–o)，支持PRMT1作为肿瘤免疫监视抑制因子的观点。
PRMT1的药物抑制在体外和体内以cGAS依赖的方式触发肿瘤免疫
为了进一步探索PRMT1作为免疫治疗靶点的潜力，我们进一步用PRMT1抑制剂MS023和GSK3368715处理CT26细胞，并对这些样品进行RNA测序(图。5a).与基因切除数据一致，PRMT1的药物抑制表现出相同的表型，包括I型和II型干扰素反应基因和其他炎症相关基因标记的表达增加(图。5b–f，补充图。5a–k).有趣的是，MYC靶基因的表达水平在基因和药物去除后显著降低。PRMT1(图。5b，补充图。5c、d、h)，这与以前的报道描述MYC为抗肿瘤免疫抑制剂一致42,43。类似地，CDK4和E2F1也被报道为PRMT1的下游底物44,45因此，E2F靶基因标记的减少可能是由于CDK4/E2F信号的失活(图。5b，补充图。5d).I型和II型干扰素应答基因的高表达在药物抑制PRMT1(图。5g).更重要的是，PRMT1抑制诱导的I型和II型干扰素应答基因的升高，包括Cxcl10, Ifnb，和其他的，被完全废除的内源性枯竭cGAS(图。5h，我，补充图。5l–u).这些数据表明，基因或药物消融PRMT1以cGAS依赖性方式增加I型和II型干扰素应答基因的表达，这可能预示着对癌症免疫疗法的更好应答。
图5: PRMT1抑制激活I型和II型干扰素应答基因表达，并以cGAS依赖性方式促进免疫细胞浸润。a用6 M的MS023或GSK3368715处理48小时后CT26小鼠肿瘤细胞的免疫印迹分析。bPRMT1抑制激活I型和II型干扰素基因的表达。用MS023 (6 M)或GSK3368715 (6 M)处理CT26细胞48小时，然后进行RNA测序和GSEA分析。PRMT1i代表用MS023或GSK3368715处理的总共6个样品。n= 3.c, dIFN-α的基因集合富集图(c)和IFN-γ反应(d)在CT26细胞中用PRMT1抑制剂治疗后的特征。e, f干扰素-α的热图(e)和IFN-γ反应(f)CT26细胞中用MS023或GSK3368715处理后CT26细胞的基因，如c和d，分别为。gCT26小鼠肿瘤细胞中PRMT1的抑制诱导IFN-α和IFN-γ应答基因的转录。h, iPRMT1抑制增加Cxcl10(h)和干扰素β(i)在CT26细胞中以cGAS依赖的方式表达。j示意图说明了用于肿瘤浸润性免疫细胞分析的动物实验设计。将CT26-cGAS-WT和cGAS-KO细胞注射到BALB/c小鼠中，并在肿瘤植入后14天收获肿瘤，随后分离并染色肿瘤浸润性免疫细胞。k, lPRMT1抑制诱导巨噬细胞浸润(k)和激活(l)以cGAS依赖性方式在CT26细胞衍生的同系肿瘤中。m, nPRMT1抑制诱导细胞毒性Gran B+CD8+t细胞(m)和CD8+PD-1+t细胞(n)以cGAS依赖性方式在CT26细胞衍生的同系肿瘤中。oPRMT1抑制增加肿瘤浸润的巨噬细胞mPD-L1的表达。数据以平均值±SD表示g–i, n= 3.数据以平均值表示，带有散点k–o, n= 8.双尾不成对学生t测试用于g–o。年的动物实验k–o被复制两次，并且代表性的数据被呈现。源数据作为源数据文件提供。
为了证明PRMT1通过体内cGAS的甲基化在癌症免疫监测中的抑制作用，我们测量了移植CT26-的同系小鼠模型中的免疫细胞浸润。cGAS-WT或CT26-cGAS-用PRMT1抑制剂MS023处理后的KO细胞(图。5j，补充图。5v).我们发现PRMT1抑制剂治疗仅在CT26-中刺激巨噬细胞浸润。cGAS-WT细胞移植肿瘤，但不是CT26-cGAS-KO细胞移植肿瘤(图。5k).此外，PRMT1抑制增加了巨噬细胞中的CD80 MFI，表明CD80活化和细胞毒性T细胞(GranB+CD8+)在CT26-cGAS-WT，但不是CT26-cGAS-KO细胞移植肿瘤(图。5l，m).值得注意的是，PRMT1抑制也导致CT26-细胞中CD8+ PD-1+ T细胞数量增加。cGAS-WT，但不是CT26-cGAS-KO细胞移植肿瘤(图。5n).该观察结果与癌症患者中PRMT1水平和巨噬细胞或效应T细胞浸润之间的反向相关性一致(图。4a，补充图。4b–d).值得注意的是，我们还观察到在CT26移植肿瘤中PRMT1抑制后，浸润的巨噬细胞中PD-L1的丰度增加(图。5o)，这促使我们进一步确定PRMT1是否以及如何调节PD-L1表达。
PRMT1消融以cGAS依赖的方式增加PD-L1的表达
为了研究PRMT1如何调节PD-L1表达，我们接下来产生了多种小鼠肿瘤细胞，包括CT26、MC38、4T1和B16，它们稳定表达tet诱导的shPrmt1(补充图6a–d)，并发现在多西环素诱导敲低mPD-L1表达后，mPD-表达显著增加Prmt1在这些小鼠肿瘤细胞中(图。6a，补充图。6b–d).类似地，PRMT1的药物抑制也增加了这些肿瘤细胞中mPD-L1的表达(图。6b，补充图。6e–g).为了进一步确定PRMT1介导的PD-L1表达的改变是否是cGAS依赖性的，我们去除了内源性的cGAS在CT26、MC38和4T1小鼠肿瘤细胞中，发现mPD-L1在这些细胞中的表达显著降低(图。6c，补充图。6h–j).更重要的是，基因消融或药物抑制PRMT1mPD-L1表达增加仅见于cGAS-WT细胞，但不在cGAS-KO细胞(图6d，e，补充图。6k–m).此外，在用PRMT1特异性抑制剂MS023和GSK3368715治疗的小鼠中，mPD-L1表达也在多个小鼠器官/组织中升高(图。6f–I).根据这一发现，在人类BRCA样本和BRCA细胞系中，PD-L1表达与cGAS水平呈正相关(图。6j，补充图。6n，o).有趣的是，TNBC细胞主要是cGAS阳性和PD-L1阳性，而大多数HER2阳性或ER2阳性的BRCA细胞既没有cGAS也没有PD-L1表达(图。6j–l，补充图。6o).此外，这些cGAS阳性的TNBC细胞，包括MDA-MB-231，具有完整的cGAS/STING DNA传感信号(图。6m，补充图。6p–r).与在HeLa细胞中的结果相似，DOX诱导的PRMT1在MDA-MB-231细胞中，也激活DNA感应信号，但不激活RNA感应信号(图。6n，补充图。6s).这些结果表明PRMT1以cGAS依赖的方式调节PD-L1的表达，这可能解释了PRMT1在癌症免疫监测中的抑制作用。
图6: PRMT1抑制以cGAS依赖性方式增加PD-L1。a的遗传消融Prmt1提升mPD-L1的表达。稳定的CT26-tet-on-shPrmt1用DOX处理细胞3天以诱导内源缺失Prmt1，随后进行免疫印迹分析。bPRMT1抑制提高mPD-L1的表达。用指定剂量的MS023或GSK3368715处理CT26细胞48小时，然后进行免疫印迹分析。c内源性消耗cGAS减少mPD-L1的表达。d的遗传消融Prmt1以cGAS依赖的方式提高mPD-L1的表达。CT26-泰什河畔Prmt1细胞就像a被sg感染了cGAS慢病毒并用DOX处理，然后进行免疫印迹分析。ePRMT1抑制以cGAS依赖方式提高mPD-L1表达。稳定的细胞系c用MS023处理，然后进行免疫印迹分析。f, gmPD-L1的免疫印迹分析(f)和量化(g)腹腔注射50毫克/千克MS023或赋形剂14天后，在小鼠的不同器官/组织中。h, imPD-L1的免疫印迹分析(h)和量化(i)在灌胃80 mg/kg GSK3368715或赋形剂14天后在小鼠的不同器官/组织中。j人BRCA细胞系中cGAS和PD-L1蛋白表达的相关性分析。从DepMap检索蛋白质水平。ER+:雌激素受体阳性；HER2+:人表皮生长因子受体2阳性；ER+，HER2+: ER和HER2双阳性；ER、HER2:ER和her 2阴性。k, lBRCA人群中PD-L1和cGAS的免疫印迹分析(k)和TNBC细胞系(l). m用指定剂量的HT-DNA刺激12小时后MDA-MB-231细胞的免疫印迹分析。n的遗传消融PRMT1增加MBA-MD-231细胞中cGAS/STING DNA感应信号。用tet-on-sh感染MDA-MB-231细胞PRMT1慢病毒并用1 μg/mL嘌呤霉素选择7天。稳定的细胞系用DOX处理3天，用HT-DNA刺激12小时，然后收获用于免疫印迹分析。数据以平均值±标准差和双尾不成对学生表示t测试用于森林6g和i, n= 5.
PRMT1抑制剂与抗PD-1抗体协同增强抗肿瘤免疫
鉴于PRMT1在人和小鼠肿瘤细胞中cGAS依赖性DNA传感信号传导和免疫抑制中的关键作用(图。4和5)，我们接下来研究了PRMT1作为癌症免疫治疗靶点的潜力。我们注意到PRMT1抑制强烈刺激巨噬细胞浸润(图。5k升)以及体外和体内PD-L1表达的增加(图。6，补充图。6)，这为使用PRMT1抑制剂和ICB(如抗PD-1抗体)的联合治疗提供了理论基础。因此，我们用PRMT1抑制剂MS023或抗PD-1抗体或其组合治疗CT26-和MC38-衍生的同系肿瘤模型，并监测肿瘤生长和小鼠存活达90天(图。7a，补充图。7a).值得注意的是，单独的PRMT1抑制既不限制肿瘤生长，也不限制CT26或MC38的总存活率，而PRMT1抑制和抗PD-1抗体的组合在CT26和MC38肿瘤移植小鼠模型中显著减缓了肿瘤生长并增加了存活率(图。6n–e，补充图。6b–e).
图7: PRMT1抑制以cGAS依赖性方式增强体内抗PD-1免疫疗法的功效。a示意图说明了用PRMT1抑制剂和抗PD-1抗体治疗的CT26同源肿瘤模型的动物实验设计。bCT26同系肿瘤模型中每个治疗组的Kaplan-Meier存活曲线(对照，n= 12;PD-1单克隆抗体(mAb)，n= 15;MS023，n= 11;结合起来，n= 14).双侧韩歌-布雷斯洛-威尔科克森试验。cMC38同系肿瘤模型中每个治疗组的Kaplan-Meier存活曲线(对照，n= 14;PD-1单克隆抗体，n= 15;MS023，n= 13;结合起来，n= 15).双侧韩歌-布雷斯洛-威尔科克森试验。d用载体+对照抗体治疗的CT26同源肿瘤的体积(黑线，n= 12)，或载体+抗PD-1单克隆抗体(蓝线，n= 15)，或PRMT1抑制剂MS023+对照抗体(橙色线，n= 11)，或联合治疗(红线、n= 14)分别绘制。e用载体+对照抗体处理的MC38同源肿瘤的体积(黑线，n= 14)，载体+抗PD-1单克隆抗体(蓝线，n= 15)、PRMT1抑制剂MS023 +对照抗体(橙色线，n= 13)或联合治疗(红线，n= 15)分别绘制。fCT26卷-cGAS-WT和cGAS用载体+对照抗体或MS023 +抗PD-1单克隆抗体处理的-KO同源肿瘤被单独标绘。cGAS-WT +载体和对照抗体，n= 12，黑线；cGAS-WT + MS023和抗PD-1单克隆抗体，n= 14，红线；cGAS-KO +载体和对照抗体，n= 12，蓝线；cGAS-KO + MS023和抗PD-1单克隆抗体，n= 13，紫色线条。gCT26-中每个治疗组的Kaplan-Meier生存曲线cGAS-WT和cGAS-KO同源肿瘤模型(cGAS-WT +载体和对照抗体，n= 12;cGAS-WT + MS023和抗PD-1单克隆抗体，n= 14;cGAS-KO +载体和对照抗体，n= 12;cGAS-KO + MS023和抗PD-1单克隆抗体，n= 13).双侧韩歌-布雷斯洛-威尔科克森试验。h示意图显示，PRMT1抑制cGAS/STING信号传导以促进肿瘤免疫逃避，而PRM t1和ICB的联合治疗增强免疫反应以促进肿瘤消退。年的动物实验a–g被复制两次，并且代表性的数据被呈现。源数据作为源数据文件提供。
与同系肿瘤模型的结果一致，只有当PRMT1表达水平在人类癌症患者(包括COAD、AML、淋巴瘤和神经胶质瘤)中较低时，较高的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润才预示较好的预后(补充图。6f–j).值得注意的是，PRMT1的高表达也损害了抗PD-L1抗体治疗在人膀胱癌中的疗效46(补充图6k，l)，可能是由于肿瘤中PRMT1表达和CTLs浸润水平之间的反比关系(图。4，补充图。4).最后，我们比较了PRMT1抑制剂和抗PD-1抗体联合治疗的反应性cGAS-WT和CT26-cGAS-KO同源肿瘤模型(图。7m).我们发现联合治疗仅在CT26-中显著减缓了肿瘤生长并增加了存活率cGAS-WT肿瘤模型，而cGAS-KO肿瘤移植小鼠对联合治疗没有反应(图。7f，g，补充图。7n，o)，支持了在同系肿瘤模型中PRMT1抑制的治疗益处在很大程度上依赖于cGAS的观点(图。7h，补充图。7p).
