共培养促进PDAC细胞的炎症反应和初级巨噬细胞的极化
在缩小与最先进的蛋白质组学性能的差距并将Anl标记应用扩展到深入的细胞选择性分泌组学后，我们将我们的工具包应用于研究胰腺癌生物学。低丰度蛋白的覆盖范围和释放的信号蛋白的细胞类型解析信息对于理解细胞间通讯是非常宝贵的。在癌症中，转化细胞和肿瘤基质细胞之间的复杂相互作用塑造了彼此的表型和整体肿瘤生物学。例如，巨噬细胞是实体瘤的主要成分，并且是PDAC最早的肿瘤浸润免疫细胞之一43,44。为了评估基于MetRS*的细胞类型特异性蛋白质组学对这种细胞间串扰的分子解剖的潜力，我们在受控的体外环境中探索了PDAC细胞和巨噬细胞之间的双向相互作用。所有的原代PDAC细胞培养物都来自基因工程克拉斯G12D驱动本土小鼠PDAC模型45。它们是典型亚型的代表，表现出上皮形态学(“8661”和“8442”)，或基底样间充质亚型(“8513”和“9091”)，以致癌性增加为特征克拉斯基因剂量(克拉斯穆特iGD)和特别不利的预后。通过产生在骨髓区室中特异性表达MetRS*的LysM-Cre-MetRS*小鼠，我们能够获得表达MetRS*的骨髓源性巨噬细胞(BMMs)。然后我们培养了四个PDAC系，BMMs单独或共同培养(图。3a)和来自细胞和细胞上清液的细胞类型选择性分析的蛋白质。主成分分析(PCA)显示了癌细胞和骨髓基质细胞对共培养的相互适应，整体蛋白质组表达和蛋白质分泌都发生了变化，尽管对PDAC分泌组不太清楚(补充图。6).PCA进一步表明PDAC亚型和PDAC系特异性BMM反应之间的明显差异。
图3:癌细胞与原代巨噬细胞的共培养诱导了双向适应。aPDAC与原代巨噬细胞共培养方案。将野生型(WT)或MetRS*表达的间充质(8513和9091)或经典型(8442和8661) PDAC细胞和BMMs分离或共培养36小时，在最后8小时用Anl标记(n= 3，工作流复制)。星号表示MetRS*表达式。b–e与分离的每种细胞类型相比，PDAC-BMM共培养后上调蛋白中的高度富集的基因本体(GO)术语和UniProtKB关键词(双侧1D注释富集128(补充数据中的完整列表4)). fBMM蛋白质组和分泌组中与巨噬细胞极化状态相关的蛋白质强度热图。
我们首先研究了分离和共培养中每种细胞类型之间的蛋白质组和分泌组动力学的总体趋势和过程。基因本体论(GO)46富集分析显示抗原呈递和主要组织相容性复合体(MHC)I类相关蛋白在经典细胞中表达增加，在间充质PDAC细胞中表达程度较低(图。3b)，这是以前在transwell系统中与巨噬细胞共培养的乳腺癌细胞中观察到的47。与BMMs的相互作用也诱导经典和间充质PDAC细胞中趋化因子产生和干扰素应答信号的强烈上调，同时，特别是间充质细胞强烈增加结构基质蛋白沉积(图。3b，d).在单个蛋白质水平上的分泌组学分析揭示了复杂免疫调节信号的分泌，在PDAC亚型之间具有显著差异，在与巨噬细胞(68种具有细胞因子功能的信号蛋白和亚型和培养条件之间的显著丰度差异(ANOVA，FDR = 5%，S0 = 0.1)相互作用时具有显著变化，见补充图。7).例如，共培养诱导两种亚型的Il6释放增加，但在经典PDAC细胞中水平更高，而特别是间充质PDAC细胞强烈增加CCL8和9的分泌。此外，分泌体中表面暴露的质膜蛋白(包括MHCI蛋白)的显著富集表明癌细胞中脱落活性增加(图。三维（three dimension的缩写）).
在与经典PDAC细胞相互作用时，BMMs表达较高水平的与外源性抗原呈递、T细胞调节和参与协调促和抗肿瘤反应的关键细胞因子调节相关的蛋白质48,49(图。3c).虽然在与间充质PDAC细胞共培养时也可以观察到这种趋势，但效果不太明显，没有达到统计学意义。然而，在与两种PDAC亚型共培养后，BMM分泌体显示出免疫调节蛋白、激素、生长因子和细胞外基质(ECM)修饰蛋白的强烈富集(图。3e).除了许多细胞因子之外，与癌细胞的相互作用广泛诱导ECM调节物，例如基质金属蛋白酶(MMPs)、解整合素和金属蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反应蛋白基序的ADAMs(Adam ts)，其在癌症中具有关键功能50,51(补充图7).
共培养的巨噬细胞获得了由癌细胞分泌和展示的信号蛋白的复杂混合物驱动的TAM样特征
为了进一步评估共培养中癌细胞诱导的巨噬细胞状态，我们使用一组通常与巨噬细胞极化相关的标记物对来自BMM选择性分泌组和细胞蛋白质组数据集的蛋白质进行了注释52。M1和M2国家是巨噬细胞状态谱系中广泛聚集的极端例子——M1与干扰素和Toll样受体信号以及有效产生效应分子和炎性细胞因子有关，M2巨噬细胞与解决炎症或肿瘤相关H2响应驱动的生理响应52,53。作为实验参考，我们用脂多糖(一种Toll样受体4 (TLR4)激动剂)刺激MetRS*表达的骨髓基质细胞，并获得它们的蛋白质组和分泌组谱。正如预期的那样，与未刺激的细胞相比，LPS刺激的BMMs显示出M1相关标记蛋白的专一性表达和强烈上调(图。3f).除了在与8661经典PDAC细胞相互作用时促炎细胞因子Il6和Tnf分泌增加外，PDAC共培养的巨噬细胞M1相关标记物的表达只是偶尔检测到，且大多是在基础水平。相反，共培养主要诱导M2相关标记如Arg1和Chil3的上调，同样经常对经典PDAC细胞有更强的反应。因此，癌细胞共培养物一起在BMMs中诱导快速和深刻的适应，使人想起肿瘤相关巨噬细胞(TAM)特征，其通常显示M2样分化，有助于免疫细胞募集和调节，以及肿瘤ECM的重塑54,55,56.
细胞选择性蛋白质组和分泌体也使我们能够研究塑造巨噬细胞极化的潜在活性细胞间信号通路。我们使用手机数据库中的配体-受体相互作用绘制了PDAC释放蛋白与相应巨噬细胞受体的图谱39。虽然PDAC细胞不释放标志性的M2极化因子IL-4和IL-13，但我们发现了与巨噬细胞极化相关的其他蛋白质的复杂混合物(图。4a):一些蛋白质的分泌在亚型之间没有显著差异，例如已知的M2启动子Tgfb157，或Tnf(丰度低得多，另见补充数据1)，一种重要的癌症M2抑制因子58。然而，其他Tgfb和Tnf-α家族成员、巨噬细胞存活必需集落刺激因子(Csfs)和许多其他信号蛋白在PDAC亚型之间表现出强烈和一致的差异表达。例如，经典的PDAC细胞分泌更多的Il6，Il6是一种多效性细胞因子，已被描述为增强M1样或M2样状态59和Tnfsf15(补充图。7)，其最近被证明促进巨噬细胞向M1表型分化并增加癌细胞吞噬作用60。间充质PDAC细胞分泌更高水平的Tgfb2和Tgfb3以及Mif、Ccl5和alarmin Hmgb1，已发现它们以上下文依赖的方式使巨噬细胞极化偏向M1和M2样状态61,62,63,64。此外，两种PDAC亚型表达的Cd47水平相似，Cd47是一种接触依赖性的抗吞噬信号，通常被癌细胞上调以逃避吞噬细胞的清除65,66。此外，越来越多的证据表明信号素对巨噬细胞募集和分化的贡献，这是一个在癌症中具有重要作用的专门分泌的(3类)或膜结合蛋白(可作为接触依赖性信号)家族67。例如，在PDAC，Sema3a增加与不良结局相关68和肿瘤相关巨噬细胞的吸引69，而Sema7a显示在脓毒症的情况下募集巨噬细胞并使其向M2状态极化70.
图4:参与BMM适应PDAC共培养的细胞间信号和信号受体。a骨髓间充质细胞或经典PDAC细胞表达的巨噬细胞极化相关细胞间信号蛋白，与BMM蛋白质组中检测到的相应受体共培养。PDAC亚型之间具有显著不同分泌的配体(双侧学生t-检验，基于排列的FDR = 0.05，S0 = 0.1)和在培养条件之间具有显著不同丰度水平的BMM受体(ANOVA，基于排列的FDR = 0.05，S0 = 1)以粗体显示。bPDAC细胞和骨髓基质细胞分泌的主要巨噬细胞和嗜中性粒细胞化学引诱物的热图。c通过流式细胞术分析，巨噬细胞和中性粒细胞计数为来自原位移植的经典和间叶癌细胞的肿瘤中CD45阳性细胞的百分比。生物重复数和双侧韦尔奇数t-测试p-显示了典型或间叶性肿瘤中细胞比率之间的值。源数据作为源数据文件提供。
BMMs上大多数检测到的PDAC信号对应受体显示稳定表达，但一些在与癌细胞共培养时受到调节(图。4a).值得注意的是，BMMs在与两种PDAC亚型相互作用后上调了Pvr(脊髓灰质炎病毒受体)的表达。巨噬细胞上的Pvr激活与抗炎表型有关71，并且正在探索以Pvr-Tigit轴为靶点的潜在癌症免疫治疗策略72.
PDAC癌细胞亚型特异性趋化因子分泌模式与体内免疫细胞募集相关
总的来说，巨噬细胞和PDAC细胞对共培养有反应，免疫调节信号蛋白的产生和释放增加。具体观察免疫细胞募集因子的表达差异，我们注意到PDAC亚型之间的明显趋势:间充质PDAC细胞分泌高水平的关键单核细胞募集和巨噬细胞存活信号，如Ccl5和Csf1(图。4b).在分离的情况下，所有四种PDAC细胞系以相似的水平分泌许多主要的嗜中性白细胞吸引蛋白。然而，有趣的是，在经典PDAC细胞中，与BMMs的相互作用强烈诱导中性粒细胞募集趋化因子，如Cxcl2、Cxcl3、Cxcl5和Cxcl15，而在间叶癌细胞中，释放保持不变(9091)或增加很少(8513)。BMM趋化因子分泌模式遵循相似的趋势。出于好奇，我们研究了原位移植入小鼠后由四种PDAC亚型系形成的肿瘤的TME组成。流式细胞仪的免疫分型揭示了免疫细胞群中的亚型特异性差异。在分析的细胞类型中，巨噬细胞和中性粒细胞募集之间的差异最显著，反映了我们的分泌组学实验中募集因子的表达模式(图。4c和补充图。8).
PDAC肿瘤显示间质性和经典癌症亚型之间基质体蛋白产生的系统性差异
为了进一步研究经典型和间叶型PDAC之间的亚型差异，我们将所有四种表达MetRS*的癌细胞系原位移植到同系小鼠体内，并比较体内复杂TME中癌细胞蛋白的表达。总的来说，我们鉴定了9415种特异性富集的癌细胞衍生蛋白，这使得这成为迄今为止最深的细胞类型特异性PDAC体内蛋白质组学数据集之一。基因本体富集分析表明上皮-间质转化(EMT)的标志性过程存在显著差异，如细胞骨架组织、ECM调节和细胞-细胞连接(图。5a).此外，间充质PDAC细胞表现出丰富的干扰素应答信号和升高的抗原呈递相关蛋白表达，使人想起我们在体外与巨噬细胞共培养中观察到的适应性，并与这些肿瘤中较高的巨噬细胞浸润相一致(图。3b和图。4c).
图5:原发性肿瘤中癌细胞衍生的基质体蛋白的PDAC亚型特异性表达。a在原位移植入完全免疫活性的同系小鼠后，经典和间叶癌细胞蛋白质组中显著富集的基因本体论术语(1D注释富集，Benjamini–hoch Berg FDR = 0.05)(8442，8513，8661:n= 3, 9091:n= 2，生物复制)(补充数据中的完整列表)4). b左:癌细胞衍生的基质蛋白按照那巴等人的注释。75右图:每个母体类别的总LFQ强度和相对强度的总和。c间质性和经典PDAC肿瘤中癌细胞衍生蛋白的火山图。显著调节的核心基质蛋白以蓝色突出显示(双面学生的t-测试，基于排列的FDR = 0.05，S0 = 0.1)。箱线图显示了PDAC亚型之间核心基质体、基质体相关蛋白和所有已鉴定的非基质体蛋白的定量分布。P-价值由双面韦尔奇决定t-测试:***p≤ 0.001 (1:p= 1.7 × 10−5, 2: p= 5.9 × 10−6). d经典和间充质PDAC细胞体内表达差异显著的基质体蛋白的热图(双侧学生的t-测试，基于排列的FDR = 0.05，S0 = 0.1)。e通过Fisher精确检验发现的基因本体术语和UniProtKB关键字在每个聚类中被过度表示(Benjamini–hoch Berg FDR = 0.05，补充数据中的完整列表4).源数据作为源数据文件提供。
值得注意的是，体内间充质细胞和经典PDAC细胞蛋白表达之间的许多最显著的差异都与ECM相关。在癌症发展的各种功能中，肿瘤中失调的ECM强烈地促成了耐药性、免疫抑制和转移51。最近的研究表明，特别是胰腺癌细胞来源的基质蛋白，而不是基质细胞来源的基质蛋白，虽然只占总ECM质量的一小部分，但与患者的低存活率相关73,74。这介绍了肿瘤中细胞外基质的细胞类型解析谱，作为治疗靶点和生物标志物发现的有希望的资源。与先前使用异种移植物表征癌细胞衍生基质的研究相反73,74，Anl标记允许在同基因免疫活性小鼠中进行细胞类型分辨分析。因此，我们的PDAC模型整合了与浸润性免疫细胞的相互作用，浸润性免疫细胞直接调节肿瘤ECM并改变其他细胞类型如癌细胞的ECM相关蛋白表达50,51(另见补充图。7).受此以及先前证明的Anl富集用于细胞外蛋白质表征的优势的激励(图。2e)，我们在数据中进一步研究了ECM相关蛋白。
我们使用那巴等人的计算机定义的基质体图谱对构成ECM的蛋白质进行了注释。75，其指定“核心基质体”蛋白质，如胶原和蛋白聚糖，或“基质体相关”的蛋白质，如ECM重塑酶或已知与ECM结合的分泌生长因子和细胞因子。癌细胞表达了每个类别的不同表现，涵盖405种基质蛋白，在整体识别号上仅有微小差异，在经典和间充质亚型之间的类别分布非常相似(图。5b).间充质PDAC癌细胞已经显示出抑制癌症相关成纤维细胞(caf ),其是PDAC肿瘤基质中ECM蛋白的最主要生产者，导致肿瘤的基质和胶原蛋白总含量低于经典PDAC76。然而，癌细胞衍生蛋白的定量分析显示，间质衍生基质体蛋白丰度更高，核心基质体和ECM调节因子的表达比例过高(图。5b)，表明对肿瘤ECM的相对贡献增加。间充质细胞中核心基质体表达丰度的增加是一个广泛的具有统计学意义的主题，而不是由一些高度丰富的异常值驱动的(图。5c).
在单个蛋白质水平上，超过100个基质体蛋白质组在两种PDAC亚型之间有显著的表达差异(图。5d).这包括最近被确定为有希望的治疗靶点的蛋白质，如主要由癌细胞而不是基质细胞表达的PDAC转移启动子Agrn、Serpinb5和Cstb74。在我们的实验中检测到了所有三种蛋白，经典的PDAC癌细胞产生了明显更多的Agrn和SerpinB5，表明对抑制的潜在亚型特异性反应。然而，间充质癌细胞持续产生较高量的促进EMT的基质体成分，例如，I型和V型纤维胶原、纤连蛋白、Fgf2、Tgfb家族蛋白如Tgfb3和Bmp2，以及参与Tgfb信号调节的蛋白，表明具有持续局部EMT信号的前馈环路(图。5d，e)。此外，我们在间叶癌细胞中检测到赖氨酰氧化酶Lox、Loxl1和Loxl3的高表达。赖氨酰氧化酶家族成员介导胶原蛋白和弹性蛋白的交联，并调节细胞过程，如粘附、运动和侵袭77。在包括PDAC在内的许多癌症中，它们与不利的患者预后相关，并已被证明促进了化学抗性、EMT和转移78.
在体内，分泌组学根据循环中1000多种癌细胞衍生的蛋白质反映肿瘤亚型和发病机理
除了局部效应，肿瘤细胞衍生的蛋白质在通过淋巴或渗漏的血管进入循环后，可以在远处的组织中起作用。与细胞表达数据的推断相反，血流中这种蛋白质的分布图将提供对肿瘤进展的许多关键方面的空间特异性见解，这些方面涉及长距离信号和效应物，并且对于生物标志物的发现也是非常宝贵的。然而，缺乏细胞类型选择性和高动态范围，具有极其丰富的功能性血液蛋白和相对低丰度的组织渗漏蛋白79，使传统方法面临挑战。
为了评估Anl标记是否可以用于直接从体液中富集癌细胞衍生的蛋白质，我们在原位PDAC移植和表达MetRS*的癌细胞的Anl标记后收集了小鼠血清(图。6a).特别地，来自携带8661(经典)和8513(间充质)PDAC亚型肿瘤的小鼠的血清样品显示出良好的信噪比，在主成分分析中，所有重复明显地从阴性对照和彼此聚类(补充图。9).在这些样本中，1614种蛋白质通过了特定富集的筛选标准，包括64种CellPhoneDB注释的细胞间信号蛋白配体，如23种细胞因子(图。6b)，亚型之间有大约42%的识别重叠(图。6c).
图6:循环中癌细胞衍生蛋白的PDAC亚型特异性检测。a从血清中捕获癌细胞衍生蛋白的方案:在原位移植表达MetRS*或WT (Ctrl) PDAC细胞和ANL标记后，收集荷瘤小鼠血清，并富集和分析肿瘤衍生蛋白。b根据强度排列的特定富集的癌细胞衍生的血清蛋白质组。指出了具有细胞因子功能的蛋白质。c特异性富集的8513和8661癌细胞衍生蛋白(8661:n= 4, 8513:n= 3，生物复制)。d癌细胞衍生的基质体蛋白质计数，每个基质体类别的总的和相对的LFQ强度。ePDAC亚型之间非基质体和基质体类蛋白的分布倍数变化。P-价值由双边韦尔奇决定t-测试。f血清中8661和8513癌细胞衍生蛋白的火山图。GOCC注释的层粘连蛋白复合物蛋白(蓝色)、纤维胶原蛋白(红色)和具有显著折叠变化的蛋白(深灰色)被突出显示(双面学生的t-测试，基于排列的FDR = 0.05，S0 = 0.1)。g转移前小生境形成相关蛋白的折叠变化。具有显著折叠变化的蛋白质(双面学生的t-test，基于置换的FDR = 0.05，S0 = 0.1)用粗体表示。源数据作为源数据文件提供。
在发现原发性肿瘤中两种PDAC亚型间基质蛋白表达的显著差异后，我们感兴趣的是这些是否会反映在循环中。总之，我们在血清中检测到199种核心基质或基质相关的癌细胞衍生蛋白。虽然鉴定的蛋白质具有与原发性肿瘤非常相似的定性基质体类分布，但在血清中的定量分布是不同的，最高的两个总强度类从分泌因子和ECM相关蛋白转移到ECM糖蛋白和ECM调节因子(图。6d和5b).然而，亚型之间的差异遵循了在原发性肿瘤中观察到的趋势:间充质来源的基质蛋白更丰富，并且在核心基质蛋白中所占比例过高，特别是胶原蛋白和蛋白聚糖(图。6d，e).在单个蛋白质水平，我们再次发现在间充质PDAC样本的经典和纤维胶原中有更高丰度的层粘连蛋白复合物蛋白(图。6f).此外，在我们以前的实验中确定的免疫调节和基质修饰蛋白释放的关键亚型差异可以在血清中捕获，例如间叶癌细胞的Loxl1和Csf1高分泌，为潜在的长期影响提供了直接证据(图。6g).这两种蛋白确实被描述为预先调节未来的转移部位，并且，令人惊讶的是，我们发现了许多其他先前描述的转移前小生境调节因子80,81,82,83(图。6g).一个支持性的转移前小生境对转移定居是至关重要的，这被认为是侵袭-转移级联反应的限速步骤84,85。循环中癌细胞衍生蛋白的预转移小生境促进信号可能有助于先前观察到的增加克拉斯G12D基因剂量(Kras mut-iGD)促进间质性PDAC亚型的EMT和转移45.
