摘要 嵌合抗原受体(CARs)和合成Notch (synNotch)受体是工程化的细胞表面受体，它们分别感应靶抗原并通过激活T细胞受体信号或定制的基因程序来应答。在这里，为了扩展这些受体的靶向能力，我们开发了“通用”受体系统，通过共价连接携带苄基鸟嘌呤(BG)基序的共同施用的抗体，可以在翻译后指导受体特异性。SNAPtag自标记酶在遗传上与受体融合，并与BG缀合的抗体反应进行共价组装，编程抗原识别。我们证明了SNAP-CAR和SNAP-synNotch受体的激活可以被临床相关的BG缀合抗体成功靶向，包括SNAP-CAR T细胞在人肿瘤异种移植小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。最后，我们开发了一个数学模型来更好地定义影响通用受体信号的参数。SNAP受体为翻译后重新编程工程细胞的靶向特异性提供了强有力的策略。
介绍 工程抗原受体正在彻底改变血癌的治疗，并在治疗多种其他疾病的细胞疗法中显示出前景 1 。这些技术中临床上最先进的是嵌合抗原受体(CARs)，合成T细胞受体通常由抗原特异性抗体单链可变片段(scFv)组成，通过间隔区和跨膜结构域与细胞内T细胞信号传导结构域融合 2 ,3 ,4 。当与靶抗原结合时，CARs刺激T细胞活化和效应子功能，包括细胞因子产生、细胞增殖和靶细胞裂解。靶向B细胞抗原CD19和BCMA的过继转移CAR T细胞现已获得FDA批准，并在治疗难治性急性淋巴细胞白血病、大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和多发性骨髓瘤方面取得了高度成功 5 ,6 ,7 ,8 。创造针对其他靶标的汽车来治疗其他类型的癌症和免疫相关疾病是一个主要的研究重点 9 ,10 。另一类高度通用的抗原受体是合成Notch (synNotch)受体，其由抗原结合结构域、来自Notch/Delta信号通路的Notch核心蛋白和转录因子组成 11 ,12 ,13 。Notch核心蛋白不是在与靶抗原结合时激活T细胞信号，而是被内源性细胞蛋白酶切割，从而从细胞膜释放转录因子。随后的核易位导致一个或多个靶基因的转录调控。这些受体是高度模块化的，因为它们可以通过改变scFv来靶向不同的细胞表面抗原，并且它们可以通过融合作为受体成分的不同转录因子或通过改变在其控制下的转基因来正向或负向调节任何感兴趣的基因。这种多用途的受体类型在免疫治疗和组织工程应用中具有重要的临床意义 14 ,15 ,16
为了获得对CAR功能的额外控制，我们和其他人开发了“通用”衔接CAR系统，其中CAR不是直接结合靶细胞上的抗原，而是结合与抗原特异性抗体融合或缀合的共同标签分子 17 ,18 ,19 ,20 ,21 ,22 ,23 。这些系统被设计成给患者输注标记的抗原特异性抗体衔接子和CAR T细胞，所述衔接子与靶细胞结合，所述CAR T细胞被靶细胞表面的标记抗体激活。衔接CARs被称为“通用CARs ”,因为它们具有通过顺序或同时施用不同抗体而允许一群T细胞靶向多种肿瘤抗原的潜力。此外，可以通过改变标记抗体的浓度、施用作为竞争性抑制剂的标记分子或停止施用抗体以更好地控制由过度活性的CAR T细胞引起的潜在毒性来调节衔接子CAR的活性。已经开发了识别与抗体结合的多种肽或小分子的衔接子CAR系统，包括生物素、荧光素、肽新表位(PNE)、Fc γ 、和亮氨酸拉链 17 ,18 ,19 ,20 ,21 ,22 ,23 ,24 。几种适配汽车系统目前正在临床试验中进行测试。
在这里，我们描述了抗原受体设计的关键进展-通用衔接子synNotch系统的创建和通用CAR系统的创建，这两个系统都通过自标记酶化学起作用。我们第一次尝试创建一个衔接子synNotch系统，通过受体与抗体的瞬时结合来发挥作用，但没有成功，我们推断更强的抗体-受体相互作用是必要的。为了创造一种具有更强相互作用的synNotch受体，我们产生了一种含有SNAPtag蛋白的synNotch受体，该SNAPtag蛋白被设计成与衔接抗体共价融合。SNAPtag是一种经修饰的人类O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT ),它被设计成与生物正交标签分子苄基鸟嘌呤反应，并且已知在细胞和动物中特异性和高效地进行自我标记(这意味着它将进行化学反应以与包含BG基序的分子共价融合)(图。 1a 25 ,26 ,27 。由于先前关于适配体CAR的报告显示了CAR功能和CAR-适配体结合亲和力之间的正相关性，我们还创建并表征了包含SNAPtag的CAR 17 ,20 1b–d
图1:通用接头SNAP-CAR和SNAP-synNotch受体功能。 a 使用苄基鸟嘌呤NHS酯将苄基鸟嘌呤基序(BG)化学结合到抗体上。然后，BG-抗体缀合物通过自标记反应共价结合胞外SNAPtag酶。 b SNAPtag受体通过将SNAP受体细胞与不同的BG缀合抗体结合，能够使用相同的受体靶向多种不同的抗原。 c SNAP-synNotch受体被BG-缀合的抗体靶向，并且在抗原识别后导致synNotch受体的切割，释放转录因子和靶基因的转录调节。 d SNAP-CAR被BG缀合抗体靶向，以在抗原识别后激活T细胞信号传导和效应子功能。
结果 设计一种自标记SNAP通用接头synNotch受体 我们创建了一个含有SNAPtag自标记酶的synNotch受体，该酶通过半胱氨酸苄基化与BG标记的分子和与Gal4-VP64转录因子融合的Notch核心蛋白形成共价键(图。 2a 26 ,27 ,28 。该系统的目标是通过将SNAP-synNotch细胞与BG标记的抗体结合来指导抗原特异性受体的激活(图。 1b，c ).简而言之，synNotch受体激活的过程涉及抗原结合，这导致拉伸受体的机械拉力并暴露Notch核心蛋白中的蛋白水解切割位点，最终导致Gal4-VP64转录因子从膜上释放并转录激活Gal4靶基因，即我们系统中的TagBFP报告基因。我们产生了编码SNAP-synNotch受体的慢病毒载体和转导的Jurkat细胞(图。 2b ).myc表位标签的抗体标记，用荧光团缀合的BG试剂的标记，和通过流式细胞术的分析证实了受体的细胞表面表达和SNAP-BG细胞表面标记活性(图。 2c
图2:SNAP-syn notch受体可以通过苄基鸟嘌呤缀合的抗体靶向感兴趣的期望抗原。 a SNAP-synNotch受体示意图。 b SNAP-synNotch受体表达的慢病毒载体设计及相应的报告基因。SNAP- synNotch受体包含Gal4-VP64转录因子，激活后导致TagBFP报道基因的激活。 c 通过用抗-mycTag抗体和SNAP-Surface-AF647染料(任意单位，arb)染色，对转导与模拟(非转导)Jurkat细胞上SNAP-synNotch受体的表面表达和酶功能进行流式细胞术分析。单位)。 d 与所示靶细胞系共孵育的SNAP-synNotch Jurkat细胞的活化的流式细胞术分析和TagBFP输出基因表达的抗体浓度报道为在mCherry+细胞上门控的平均荧光强度(MFI)和 e 通过ELISA检测IL-7治疗性转基因的产生。为 d 和 e , n = 3个生物学上独立的实验s.e.m .源数据可作为源数据文件使用。
为了产生衔接抗体，我们使用合成的BG-NHS酯将BG与几种临床相关抗体的赖氨酸或N-末端结合(图。 1a ).这些抗体包括靶向CD20的利妥昔单抗、靶向CD19的FMC63、靶向HER2的赫赛汀和靶向EGFR的西妥昔单抗 29 ,30 ,31 ,32 。虽然缀合产物是异源的，但我们通过SNAPtag蛋白标记试验定量了与每种抗体缀合的BG分子的平均数量，在该试验中SNAPtag缀合导致抗体分子量的变化，可通过SDS-PAGE分辨(补充图。 S1 ).每个抗体的BG分子频率范围为2.0–2.8，如补充表中所述 S1 。我们通过流式细胞术表征了各种靶细胞系的抗原表达和BG抗体染色，其中抗体显示出预期的抗原特异性(补充图。 S2
接下来，我们测试了BG缀合的FMC63抗体(FMC63-BG)在应答CD19阳性肿瘤细胞时激活synNotch信号的能力(图。 2d &补充图 S3 ).我们在存在不同水平的FMC63-BG抗体缀合物的情况下，对SNAP-synNotch Jurkat细胞和CD19阳性和阴性肿瘤细胞进行了共孵育分析，48小时后，我们通过流式细胞术分析了TagBFP报告基因的表达。对于各种浓度的抗体，响应于CD19阳性肿瘤细胞，TagBFP表达显著上调。受体激活是敏感的，在衔接子浓度低至0.04 μg/mL时观察到显著的激活，并在0.25 μg/mL时增加到峰值。然后，报告基因的激活随着抗体量的增加而减少，在10 μg/mL的浓度下被完全抑制，这表明了“挂钩效应”。在这种情况下，抗体过量，以致不同的抗体分子使靶细胞和synNotch细胞都饱和，而没有形成三元复合物。这种行为通常在涉及三元复合物形成的化学和细胞过程中观察到，如受体/配体相互作用 33 。其机制是通过饱和量的配体结合两个表面受体来阻止三元复合物的形成 34 , 35 。总的来说，这些实验通过仔细的接头滴定证实了synNotch激活的可调性，甚至允许在高浓度下抑制活性。
我们发现靶向其他抗原的BG缀合抗体也能够以抗原特异性方式激活SNAP-synNotch受体(图。 2d ).我们对SNAP-synNotch Jurkat细胞和抗原阳性和阴性肿瘤细胞在不同水平的BG偶联西妥昔单抗、赫赛汀和利妥昔单抗抗体存在下进行了类似的共孵育分析，并通过流式细胞术分析了TagBFP基因表达。对于每种测试抗体，再次观察到TagBFP的显著上调，可通过增加抗体浓度来调节，并且是以靶抗原特异性的方式。观察到每种抗体的“挂钩效应”,显示活性随着抗体剂量的增加而增加，直到达到峰值活化水平，随后抗体剂量依赖性降低。受体激活也依赖于靶细胞的数量，在高靶细胞与SNAP-synNotch细胞比率时具有最佳活性(补充图。 第四心音
接下来，我们测试SNAP-synNotch受体是否能够调节IL-7反应基因的表达，IL-7反应基因是一种候选的治疗基因，因其促进T细胞增殖的能力而受到关注 36 。我们产生了IL-7应答基因表达构建体，其中TagBFP基因被IL-7编码区取代，并将其置于synNotch控制下 36 。受体激活后，该构建体再次被Gal4-VP64转录因子转录激活。我们用这种应答载体转导SNAP-synNotch Jurkat细胞，并将它们与几种不同的抗体和抗原阳性和阴性肿瘤细胞共孵育，用于通过ELISA评估IL-7应答基因表达(图。 2e ).与TagBFP反应基因激活类似，IL-7以抗原特异性和抗体剂量反应的方式显著上调，证明了SNAP-synNotch系统在控制不同输出基因中的模块化。
值得注意的是，我们首先使用单体生物素结合蛋白mSA2作为靶向域，创建并测试了一个假定的具有生物素-亲和素标签-受体相互作用的通用synNotch系统 19 。该系统的目标是通过将mSA2-synNotch细胞与生物素化抗体结合来靶向受体特异性，类似于我们先前报道的mSA2 CAR T细胞系统(补充图。 5a 19 。而我们发现该受体在细胞表面有效表达，并可被平板固定的生物素激活(补充图。 5b，c )该受体最终在检测细胞表面抗原时不起作用，因为当我们将细胞与生物素化抗体标记的肿瘤细胞一起孵育时，我们没有观察到激活(补充图。 5d ).我们假设，与mSA2 CAR T细胞的强信号传导相比，mSA2 synNotch受体信号传导的缺乏是Notch受体需要拉力的不同信号传导机制的结果。我们推断更强的受体-标签相互作用(ms a2-生物素K d = 5.5 × 10 −9 m ),例如SNAPtag与BG的共价键和永久键，以创建功能性的、普遍适用的synNotch系统 37 ,38
设计一种自贴标签的SNAP通用适配器车 我们接下来的目标是创建一个通用的衔接CAR系统，当与BG标记的抗体结合时，使用SNAPtag蛋白结构域靶向T细胞受体信号(图。 1d ).我们将SNAPtag结构域克隆到一个慢病毒载体中，该载体包含CD8α铰链区和跨膜结构域、4-1BB胞质结构域、cd3ζT细胞胞质结构域和一个通过T2A共翻译肽共表达的TagBFP报告基因(图。 3a，b ).我们将该载体包装入慢病毒颗粒并转导Jurkat细胞。我们发现受体被有效表达，并且SNAPtag蛋白是功能性的，如TagBFP表达和流式细胞仪用BG-AF647荧光团试剂染色所表明的(图。 3c
图3:SNAP-CAR可以通过苄基鸟嘌呤缀合的结合蛋白靶向感兴趣的期望抗原。 a 快餐车设计。 b SNAP-CAR慢病毒表达构建体。 c 通过用SNAP-Surface-AF647染料染色和记录TagBFP表达(任意单位，arb)来评估，流式细胞术分析转导的与模拟(非转导的)Jurkat细胞上SNAP-CAR受体的表达和酶功能。单位)。 d Jurkat SNAP-CAR效应细胞(通过TagBFP+表达门控)上CD25和CD62L T细胞活化标记物的流式细胞术分析与所示靶细胞系共孵育，抗体浓度报道为平均荧光强度(MFI)。随着活化，CD25增加而CD62L减少， n = 3个生物学上独立的实验；平均值s.e.m .源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们测试了BG结合抗体是否可以与SNAP-CAR Jurkat细胞结合，以靶向其T细胞活化信号。我们将SNAP-CAR细胞与各种抗原阳性或阴性的肿瘤细胞系和增加剂量的BG结合抗体共孵育。24小时后，我们通过用CD25和CD62L特异性抗体染色来分析T细胞活化，CD25在T细胞活化时上调，CD62L下调。我们通过对TagBFP CAR +细胞群进行特异性门控来评估这些标记在SNAP-CAR细胞中的表达水平。我们发现这些标记物的表达受BG结合抗体以抗原特异性和剂量反应的方式控制(图。 三维（three dimension的缩写） ).与SNAP-synNotch细胞类似，SNAP-CAR激活信号强度在抗体剂量水平为0.1-1.0μg/mL时达到峰值，然后稳定下降，再次表明了hook效应。
SNAP-CAR在原代人类T细胞中具有功能 然后，我们评估了SNAP-CAR在用SNAP-CAR慢病毒转导的原代人T细胞中的表达水平和体外功能活性。用BG-AF647荧光团缀合物染色并通过流式细胞仪测定，我们发现SNAP受体在约40%的细胞中有效表达，其表达方式与TagBFP标记基因的表达密切相关(图。 4a
图4:SNAP-CAR对原代人T细胞有效。 a 通过用SNAP-Surface-AF647染料染色并记录TagBFP表达(任意单位，arb ),流式细胞术分析SNAP-CAR在转导和模拟(未)转导的原代人T细胞上的表达和酶功能。单位)。 b 与指定靶细胞系和1.0 μg/mL指定抗体共孵育的原代人SNAP-CAR T效应细胞产生IFNγ的ELISA c 流式细胞术分析来自共孵育的SNAP-CAR (TagBFP +)群体的CD69、CD62L和CD107a T细胞活化标记物 b 报告为MFI。 d 通过共孵育的原代人SNAP-CAR T细胞和1.0 μg/mL所示BG-缀合抗体特异性裂解靶细胞系。 e 原代人SNAP-CAR T细胞和1.0 μg/mL所示BG-缀合抗体对单个细胞系(左)和混合细胞系(右)的特异性裂解。为b –e 进行了带有多重比较的双向ANOVA测试。由于数据不具有方差齐性(Levene检验)，Tukey的HSD用于抗体条件之间的事后分析。“*”表示的重要性 p < .0001, n = 3个生物学上独立的实验s.e.m .源数据可作为源数据文件使用。
为了测试CAR功能，我们将SNAP-CAR T细胞与各种抗原阳性或阴性的靶肿瘤细胞系和1.0μg/mL BG缀合抗体共孵育24小时。靶抗原包括CD20、EGFR和HER2。通过ELISA分析共孵育细胞的上清液，我们发现SNAP-CAR T细胞可以被共价连接的BG抗体引导产生大量的IFN γ 针对抗原阳性靶细胞(图。 4b ).我们通过流式细胞仪对共孵育细胞的分析显示，抗体还导致T细胞活化标记物的诱导、CD69和CD107a的上调以及CD62L的下调(图。 4c ).还将CAR T细胞和靶细胞共培养，并通过流式细胞术评估靶细胞裂解，观察到高水平的靶细胞特异性裂解(图。 4d ).通过在CellTrace阳性(靶细胞)群体上用幽灵染料荧光染料门控染色来鉴定裂解的靶细胞。同样，仅当共同施用的抗体靶向由共同施用的细胞表达的抗原时，T细胞标记物活化和靶细胞裂解显著更高，表明抗体特异性。除了全长IgG抗体，我们还测试了利妥昔单抗的BG结合Fab片段。这种分子，更类似于在传统CARs中发现的scFv抗体片段，也显示出每个效应子功能等于或大于全长利妥昔单抗的有效活性。
为了探索进一步调节SNAP-CAR活性的潜在方法，我们测试了衔接子标签分子O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)单独是否可以作为竞争性抑制剂。O6-BG被开发为一种抗肿瘤剂，作为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶DNA修复蛋白的自杀抑制剂 39 。重要的是，当在针对神经胶质瘤的临床试验中测试时，发现即使在测试的最高剂量下也不会导致毒性。共同孵育SNAP-CAR T细胞、靶细胞和抗体接头，用O6-BG滴定显示O6-BG可以与抗体接头竞争，并以剂量依赖的方式抑制SNAP-CAR活性。SNAP-CAR系统的杀伤能力在O6-BG的0.1 M被完全废除。此外，T细胞活化标记物如CD69和CD107a随着CD62L标记物的增加而减少，证明了O6-BG竞争性抑制SNAP-CAR功能的能力(补充图。 6 ).
接下来，我们试图测试SNAP-CAR T细胞是否可以同时靶向不同细胞群上的多种抗原，从而证明了预防由于抗原异质性或抗原丢失导致的癌症复发的潜力。我们将SNAP-CAR T细胞与CD20的混合物共同培养 + 还有EGFR + 靶细胞，并用BG修饰的利妥昔单抗、西妥昔单抗或两种抗体的组合进行细胞裂解分析。使用单一抗体，我们观察到混合细胞群中每个单独靶向细胞系的特异性裂解。当两种抗体结合时，SNAP-CAR T细胞介导了两种靶细胞系的显著、同时的裂解(图。4e
BG-抗体预加载实验询问受体信号机制 为了进一步研究SNAP-synNotch受体激活的机制，我们进行了共孵育试验，其中我们用BG缀合抗体预标记靶细胞或SNAP-synNotch Jurkat细胞。我们将CD19阳性和阴性肿瘤细胞与BG-缀合抗体一起孵育，洗去残留的未结合抗体，并将这些细胞与SNAP-synNotch细胞共孵育48小时。评估反应基因激活，我们发现CD19阳性肿瘤细胞显著上调TagBFP基因表达至与先前剂量-反应分析中观察到的峰值激活水平相当的水平(图。 5 一个和 2c ).当我们用BG结合的抗体预标记SNAP-synNotch细胞并进行类似的共孵育试验时，没有观察到显著的应答基因激活(图。 5b
图5:表征预组装或预标记靶细胞时SNAP受体的活性。 a SNAP-synNotch和SNAP-CAR细胞的SNAP受体活化的流式细胞术分析，所述SNAP-syn notch和SNAP-CAR细胞与用所示抗体预标记的靶细胞共孵育。 b SNAP-synNotch和SNAP-CAR细胞的SNAP受体活化的流式细胞术分析，所述SNAP-syn notch和SNAP-CAR细胞用所示抗体预标记并与靶细胞共孵育。通过流式细胞术评估TagBFP输出基因表达和CD25标记表达。 c 与用1.0 μg/mL可溶性衔接子或阳性对照抗CD20 CAR孵育的SNAP-CAR T细胞相比，用指定细胞浓度的衔接子预孵育的共孵育原代人SNAP-CAR T细胞特异性裂解靶细胞。为 a 和 b ，进行带有多重比较的双向ANOVA测试。由于数据不具有方差齐性(Levene检验)，Tukey的HSD用于抗体条件之间的事后分析。“*”表示的重要性 p < 0.0001, n = 3个生物学上独立的实验 c 进行了具有Dunnet多重比较测试的单向ANOVA，并且所有值显著不同( p < 0.0001) from the no adaptor control (white bar). Source data are available as a Source Data file.
用SNAP-CAR细胞进行相同的预染色实验，我们发现当SNAP-CAR细胞或肿瘤细胞用BG缀合的抗体预标记时，SNAP-CAR都是有功能的。抗原阳性或阴性肿瘤细胞用BG-缀合抗体标记，洗涤，并与Jurkat SNAP-CAR细胞共孵育24小时。通过流式细胞术分析，我们看到标记的肿瘤细胞诱导CD25表达显著上调至与先前剂量-反应分析中的激活峰值水平相当的水平(图。 5a ).当用BG标记的抗体预标记SNAP-CAR细胞时，观察到T细胞活化的显著上调(图。 5b ).最后，我们还测试了接头预加载的原代人SNAP-CAR T细胞的杀伤能力。我们用不同浓度的利妥昔单抗-BG接头和不同的细胞浓度预标记SNAP-CAR T细胞。我们通过用荧光标记的抗人IgG抗体染色来分析这些细胞的亚群的衔接子加载，并且我们通过流式细胞术观察到抗体的浓度依赖性标记(补充图。 7 ).然后，我们将这些细胞与CD20阳性靶细胞一起孵育24小时，并分析靶细胞的裂解情况(图。 5c ).我们发现，预先标记的SNAP-CAR T细胞以抗体剂量依赖的方式显著诱导特异性裂解。该水平较低，但与用可溶性衔接子和常规抗CD20 CAR孵育的细胞的水平相当。t细胞活化标记物也与接头剂量相关(补充图。 8a、b
SNAP-CAR可以在体内被抗体接头标记 为了测试SNAP-CAR T细胞方法的治疗可行性，我们评估了SNAP-CAR T细胞是否可以在小鼠体内用抗体接头标记。首先，为了产生一个更适合临床的表达系统，我们构建了一个包含SNAP-CAR基因的γ病毒表达载体，通过T2A共翻译肽与LNGFR标记基因共表达(图。 6a 40 。LNGFR染色证明，用该构建体转导的原代人T细胞显示高水平的CAR表达(图。 6b ).接下来，为了测试抗体衔接子对SNAP-CAR的体内加载，我们通过眶后(r.o .)注射给NOD-SCID-ɣchain-deficient (NSG)小鼠施用这些细胞，然后通过腹膜内(i.p .)注射施用PBS或抗体衔接子。24小时后，我们通过颌下静脉收集血液并分离淋巴细胞，使用抗LNGFR抗体对SNAP-CAR表达进行染色，并通过用荧光标记的抗人IgG抗体染色进行接头标记。注射了抗体衔接子的小鼠表现出明显更高的抗人IgG染色，这与LNGFR表达水平相关(图。 6c，d
图6:用抗体接头体内加载SNAP-CAR T细胞。 a SNAP-CAR-LNGFR受体示意图。 b SNAP-CAR gammar病毒表达结构的设计。 c 流式细胞术分析来自NSG小鼠血液中的SNAP-CAR T细胞，所述小鼠在含有或不含有利妥昔单抗抗体衔接子的情况下预先注射SNAP-CAR T细胞24小时(任意单位，arb。单位)。 d LNGFR +细胞上抗人IgG-AF647的平均MFI。为 d 进行了不成对的双尾学生t检验，并且“*”表示显著性为 p = 0.012, n = 3 mice s.e.m .源数据可作为源数据文件使用。
SNAP-CAR T细胞在人肿瘤异种移植小鼠模型中显示体内抗肿瘤功能 为了测试我们的SNAP-CAR方法的治疗潜力，我们评估了SNAP-CAR T细胞在人类肿瘤异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性。为了建立一个系统来比较SNAP-CAR与传统CAR在体内的活性，我们产生了抗HER2 CAR T细胞(来自mAb 2C4的scFv ),并在体外证实了抗HER2功能(补充图 S9 7a ).在第4天静脉注射CAR T细胞，每3天腹膜内施用衔接子。注射前，评估CAR T细胞的CAR表达，以及T细胞表型标记CD4、CD8和CD62L(补充图。 10 ).值得注意的是，静脉注射免疫球蛋白(IVIG)在第4天与CAR T细胞一起进行腹膜内给药，并且每次注射衔接子以增强SNAP-CAR T细胞的植入 41 。在以前的测试中，缺乏IVIG导致小鼠血液中的SNAP-CAR T细胞仅在24小时后减少了约50%(图。 6c 和补充图。 11 ).我们假设IVIG保护SNAP-CAR细胞免受Fc受体与先天免疫细胞或基质细胞相互作用的影响，这种相互作用是由于NSG小鼠模型中缺乏循环抗体而发生的。小鼠每5天进行一次IVIS成像，直到第40天，然后在第60天进行肿瘤负荷成像。虽然只有衔接子和只有SNAP-CAR T细胞的对照显示出快速的肿瘤生长，但是具有衔接子的SNAP-CAR T细胞和抗HER2传统CAR T细胞治疗组在所有小鼠中都显示出肿瘤生长的显著抑制，并且在第60天有4/5的小鼠没有显示出肿瘤生长的迹象。为了进一步证明这些结果的可重复性，使用从不同供体分离的细胞产生的SNAP-CAR T细胞重复了该实验(补充图。 12 ).与对照组相比，具有衔接子的SNAP-CAR T细胞再次显示出对肿瘤生长的显著抑制，其中5/5的小鼠没有显示出肿瘤生长的迹象。值得注意的是，在第35天，我们观察到小鼠血液中存在SNAP-CAR T细胞，显示CAR阳性(LNGFR +)接近于注射的细胞群体，表明这些细胞至少持续到第35天(补充图。 S13
图7:SNAP-CAR T细胞在人肿瘤异种移植小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。 a 体内实验设计。 b 肿瘤负荷随时间变化的IVIS成像。 c 通过小鼠图像的荧光素酶强度定量肿瘤生长 b 。“PR”表示部分缓解，其由超过基线但< 10的最终肿瘤大小来定义 9 在第33天(相对光单位，RLU)。 d 经治疗的小鼠随时间的存活率。为 d 使用Bonferroni校正对多重比较进行Mantel-Cox对数秩检验，并且“*”表示显著性为 p < 0.01667 for three comparisons, n = 5只老鼠。确切的 p -值为 p = 0.0135，仅适用于适配器，并且 p = 0.0031，仅适用于SNAP-CAR T细胞。源数据以源数据文件的形式提供。
为了进一步证明SNAP-CAR系统在体内的靶向多功能性，我们研究了通过利妥昔单抗-BG接头介导针对额外抗原CD20的抗肿瘤活性的能力。我们构建了表达CD20的NALM6细胞系，NALM6 + CD20，我们产生并证实了抗CD20 CAR T细胞(来自mAb leu16的scFv)的体外活性(图。 5c 和补充图。 S8 42 。在体内实验之前，通过LNGFR的抗体染色，以及T细胞亚群和记忆表型标记CD4、CD8、CD62L和CD45RA，评估CAR T细胞的CAR表达。该分析显示了SNAP-CAR T细胞和传统抗CD20 CAR T细胞之间在CAR表达和记忆T细胞表型方面的高度相似性(补充图。 S14 ).用NALM6 + CD20肿瘤细胞接种NSG小鼠。施用CAR T细胞和含IVIG的利妥昔单抗-BG衔接子，并使用与上述抗HER2实验相同的剂量和时间范围对小鼠成像。虽然只有衔接子和只有SNAP-CAR T细胞的对照显示出快速的肿瘤生长，但是具有衔接子的SNAP-CAR T细胞和传统的抗-CD20 CAR T细胞治疗组在所有小鼠中都显示出显著的肿瘤生长抑制(补充图。 S15 ).虽然用SNAP-CAR T细胞+利妥昔单抗衔接子治疗的5/5小鼠以及3/5抗CD20 CAR小鼠最终仅显示出对肿瘤复发的部分反应(PR ),但在研究血液中肿瘤细胞的CD20抗原表达时，我们观察到NALM6细胞(通过人CD19表达在小鼠血液中鉴定)已经丧失了CD20抗原表达，这表明肿瘤细胞的最终生长不是由于CD20靶向的缺陷(补充图。 S16 ).观察注射的NALM6 + CD20细胞的CD20表达，我们观察到CD20(-)细胞的小起始群体，我们假设这些细胞能够避免CAR靶向并在小鼠中随时间扩增(补充图。 S16 ).类似于针对HER2的实验，CAR阳性细胞在较晚的时间点(第40天)出现在小鼠中(补充图。 S17
通用衔接子复合物形成的数学模型 为了更好地理解通用衔接子受体信号和观察到的hook效应，我们建立了T细胞、衔接子抗体和靶细胞之间三元复合物形成的连续数学模型。使用Python Jupyter Notebook，我们创建了一个描述结合反应的常微分方程(ODEs)的概化模型。定义一个方程组来描述模型中六种物质的累积和浓度:T细胞、抗体、肿瘤细胞、与抗体结合的T细胞、与抗体结合的肿瘤细胞和T细胞-抗体-肿瘤细胞三元复合物(图。 8a ，方法)。
图8:在抗体介导的T细胞靶向的情况下三体结合的数学模型。 a SNAP受体三体形成的ODE模型示意图。 b 使用文献和参数估计中的参数进行模型模拟，并与SNAP-CAR和SNAP-synNotch受体的四种不同抗体和抗原对的实验结果进行比较。 c k的参数扫描 第一子代 (T细胞与抗体的结合率)，K D1 (T细胞和抗体之间的平衡解离常数)，以及肿瘤表面的靶抗原的数量。对于中的实验数据 c (绿色)， n = 3个生物学上独立的实验s.e.m .源数据可作为源数据文件使用。
为了验证该模型，我们使用直接取自文献的动力学参数进行模拟，然后通过有界参数拟合(补充表 S2 43 ,44 ,45 ,46 。使用直接的文献值，该模型能够概括我们的实验数据的一般特征，包括观察到的钩子效应和在预期产生最大受体信号的每个抗体剂量的数量级内的准确预测(图。 8b ).我们使用误差平方和(SSE)计算来衡量模型模拟相对于实验结果的误差。除利妥昔单抗外，仅使用文献值的模型模拟对实验数据进行了良好的概括(文献值的平均= 1.03)(补充表 S3 ).接下来，使用SciPy，我们最小化误差平方和以优化动力学参数，并使模型更好地符合每个抗体对的实验数据 47 。在参数估计过程中，文献值被用作初始估计值，并限制在一个数量级内。有了这些限制，我们能够将七个实验结果中的模型误差最小化到(拟合后的平均= 0.09)(补充表 S3
有了经验证的模型，我们下一步的目标是使用该模型来预测不同的系统参数将如何影响受体信号，并用该模型进行参数扫描。我们首先改变k 第一子代 抗体与T细胞受体结合的正向反应速率，以模拟增加on-速率的效果，这也可以通过改变与抗体偶联的BG基序的数量来进行实验改变。我们发现，该模型预测，在抗体浓度较高时，增加每个抗体的BGs数量将导致更多的三体形成。一旦k 第一子代 速率大于阈值10 −3 纳米 −1 一秒钟 −1 这种影响预计会趋于平稳。(图。 8c ).接下来，我们扫描了抗体与T细胞亲和力的不同值，该参数通过使用共价SNAPtag标记而最大化。我们发现，更强的亲和力预计会导致在更宽的抗体浓度范围内形成三体，并导致三体形成的总体水平更高。最后，由于靶抗原浓度可以根据被靶向的抗原而变化，并且对于癌症，表达水平也可以在患者之间和同一患者体内的细胞上显著变化，我们进行了改变肿瘤抗原表达水平的参数扫描。我们发现，较高的抗原浓度有望拓宽成功形成三元复合物的有效抗体剂量窗口，而较低的抗原水平预计需要较高量的抗体来诱导信号传导，并预计更容易受到hook效应的抑制。
讨论 通用衔接子SNAP-synNotch系统进一步增加了synNotch受体框架的多功能性，通过控制共同施用的抗体剂量导致受体信号的翻译后控制，以及使用单一遗传编码受体靶向多种抗原的能力。我们最初使用非共价相互作用(mSA2和生物素之间)创建衔接子synNotch受体的不成功尝试表明，衔接子系统发挥作用需要synNotch受体和标签之间非常高亲和力的相互作用(如共价键);大概是因为缺口的信号机制是基于拉力 37 。SNAP酶和苄基鸟嘌呤部分产生的共价键提供了最紧密的键-共价键-从而最大化了这一关键参数。事实上，当SNAP-synNotch受体以溶液形式加入到细胞共培养物中时，或者当预先装载到靶细胞上时，其能够被抗体接头激活，并且能够激活治疗相关的细胞因子应答基因。虽然多种衔接子能够诱导synNotch反应基因激活，但抗体衔接子之间的激活动力学略有不同，并且受衔接子剂量以及靶细胞与synNotch细胞比例的影响，这表明对于特定的临床适应症可能需要一些优化。我们最初感到惊讶的是，预先组装的SNAP-synNotch受体没有功能，而是需要接头预先靶向癌细胞。然而，这一结果可以通过再次考虑信号传导机制来解释，其中受体被蛋白水解切割，因此在激活后被破坏，不允许来自再循环受体的多重信号传导事件。观察到的反应基因激活的缺乏表明，随着时间的推移，可能需要来自不同受体的受体激活的多次爆发来充分触发synNotch信号。通用SNAP系统将为使用synNotch受体框架的多抗原靶向提供许多机会。
SNAP-CAR在实验测试中显示了多种多样和有效的活性，并且具有优于非共价衔接CAR技术的几个有益特征 17 ,18 ,19 ,20 ,21 ,22 ,23 。在Jurkat细胞和原代人T细胞中的体外测试显示了用几种不同的衔接子有效的抗原靶向和效应子功能的激活，包括肿瘤细胞裂解和细胞因子产生。值得注意的是，与我们以前开发的mSA2-CAR系统相比，受体在较低的抗体接头浓度下更具反应性(SNAP-CAR的峰值活性在0.1-1μg/mL之间，而非共价mSA2-CAR的峰值活性为25 μg/mL)。我们的结果，由我们的建模分析和其他人的结果支持，表明CAR和衔接分子之间相互作用的亲和力是生产性受体信号传导的关键参数 17 ,20 。虽然许多抗体与非共价的、亲和力较低的衔接子CAR一起发挥作用，但我们的模型预测共价键的形成可以使抗体和其他配体的使用成为可能，否则这些抗体和配体对靶抗原的结合亲和力太弱而不能产生效果。通过预加载SNAP受体，然后去除过量的BG抗体来产生功能性car的能力，提供了独特的机会来测试作为传统car组成部分的候选抗原结合区。与通过瞬时相互作用与衔接子结合的CAR相比，共价组装的受体将更类似于传统的CAR。由于预组装的CAR能够发出信号，预标记SNAP-CAR T细胞可能是一种潜在的临床方法，然而，在T细胞活化时，细胞将被诱导扩增，从而稀释组装的受体，需要补充额外的抗体。通过预加载SNAP-CAR T细胞和额外的接头输注观察到的肿瘤清除支持这种潜在的治疗性给药方案。此外，与生物正交苄基鸟嘌呤反应的SNAPtag酶赋予了CAR精致的特异性，并且，作为一种人源的酶，SNAP蛋白可能在人类宿主中具有良好的耐受性。这一特性满足了对过继转移的治疗性细胞的持久性的关键要求，并最小化了由它们的免疫排斥导致的毒性的可能性 48 ,49 ,50 。SNAP-CAR通过组合多个衔接子同时进行抗原靶向的能力将有可能避免由于抗原丢失而导致的癌症复发，这是衔接子CAR技术的一个标志。最后，临床相关O6-BG分子对SNAP-CAR活性的抑制活性可以提供一种方便的方法来调节或关闭SNAP-CAR T细胞的活性，作为一种安全措施，而不需要基因自杀开关 51
SNAP-CAR系统的体内功能是共价酶治疗领域的显著进步。循环衔接子显示了小鼠血液中SNAP-CAR T细胞的有效标记，其受体装配与LNGFR标记表达相关。与传统CAR相比，用衔接子施用的SNAP-CAR T细胞也能够介导有效的抗肿瘤活性。虽然以前的报道已经利用SNAP/BG相互作用进行共价细胞标记和体内成像 52 ,53 ,54 我们的数据进一步支持了它在治疗上的应用。
在临床前动物模型中进行活性演示后，SNAP适配器系统在临床应用中的未来发展将在几个关键领域发挥重要作用。开发位点特异性标记方法将有助于产生更均一的抗体-BG缀合物，并有可能识别最佳BG缀合位点，从而进一步最大化受体信号输出。对于任何特定的疾病指征，需要确定最佳的一种或多种抗体，以与衔接T细胞结合，提供疾病特异性或至少疾病相关的受体信号传导诱导。根据我们的结果，额外的自我标记或共价蛋白质组装系统也可以为通用衔接车提供良好的架构。事实上，最近使用Spytag/SpyCatcher结构域开发衔接车的工作显示了强大的靶向能力 55 。其他潜在的系统包括候选系统，如:CLIPtag、Halotag、SnoopTag、Isopeptag、Sortase或split inteins 26 ,56 ,57 ,58 ,59 。用具有不同结合动力学/解离速率、分子大小和表达水平变化的其它自标记酶制成的CARs可能会根据被靶向的抗原的特征提供更强的信号传导。此外，其他合成受体平台可通过创建具有SNAPtag蛋白结构域的受体来顺应通用衔接子格式 60 ,61
我们的通用受体系统的分子模型为我们观察到的信号行为提供了关键的见解，并产生了关于如何潜在地优化受体功能的预测。模型结果表明，CAR和衔接子之间的结合强度是信号传导的关键参数，我们的SNAP受体通过共价键使这种相互作用强度最大化，这是期望的。此外，该模型表明，提高活性的一种方法是增加CAR与衔接子结合的正向反应速率，这可能通过增加每个抗体的BG分子数量或通过SNAP结构域的进一步突变来实现。最后，该模型预测使用衔接子CARs靶向高水平表达的抗原是优选的，因为这些抗原预期在较低抗体浓度下诱导受体信号传导，并且在较高抗体剂量下对钩效应不太敏感。
通用受体工程领域进展迅速，包括增强靶向特异性和接头多功能性的创新，以及早期临床试验 24 ,62 。为了提高特异性，研究人员开发了组合抗原靶向方法，包括基于“与”逻辑的靶向表面有两种抗原的细胞 17 ,63 。此外，新兴的方法包括通过小分子药物和紫外光等刺激对通用CAR T细胞进行条件性的空间和时间控制 64 ,65 。进一步扩大通用汽车的多功能性，研究人员已经证明了通过由IgG抗体以外的分子构建的适配器进行靶向，包括纳米抗体、DARPins和小分子药物 55 ,66 ,67 ,68 。通用CARs在血液和实体肿瘤环境中的几个正在进行和计划进行的临床试验的结果将为进一步开发和技术改进提供关键信息 62 ,69 。最后，将adaptor CARs的通用靶向能力与同种异体细胞方法和基因编辑相结合，有望提供理想的现成细胞疗法 69
SNAP-synNotch和SNAP-CAR T细胞提供了一种强大的衔接策略，利用共价化学将工程细胞完全可编程地靶向多种抗原。这些系统通过为研究人员提供快速筛选CAR和synNotch抗体候选物以及响应高度特异性抗体-抗原相互作用而重新布线和激活细胞程序的能力，具有临床应用和生物技术效用的潜力。
