a下图:显示与亲代MDA-MB-231细胞相比，MDA-LM2中TER (logTER)变化分布的火山图。统计显著性(逻辑回归，P < 0.01) observations are highlighted in orange. Top: enrichment of the poly(U) motif in the mRNA 3′ UTRs as a function of logTER between MDA-LM2 and MDA-MB-231 cells. mRNAs are divided into equally populated bins based on their logTER (dashed vertical lines delineate the bins). Bins with significant enrichment (hypergeometric test, corrected P < 0.05; red) or depletion (blue) of poly(U) motifs are denoted with a bolded border. Also included are mutual information (MI) values and their associated z分数。b火山图显示了高转移性乳腺癌pdx与低转移性乳腺癌pdx中TE变化的分布，如所述a. c热图显示了与加扰序列(双核苷酸频率保持不变)相比，HNRNPC结合位点中poly(U)基序的富集(由CLIP-seq确定)。粗体边界表示统计上显著的富集(超几何检验，已修正P < 0.05; red). MI value and associated z-显示分数。dHNRNPC靶mRNAs的富集作为MDA-LM2和MDA-MB-231细胞之间logTER的函数。mRNAs被分类为a；这y轴显示了我们在每个仓中鉴定的HNRNPC靶(3’UTR结合)的频率(水平虚线表示所有转录物中HNRNPC靶的平均频率)。显著富集的箱(逻辑回归，FDR < 0.05红色)或耗尽(蓝色)的HNRNPC目标用黑色边框表示。e高转移性和低转移性乳腺癌pdx之间HNRNPC靶mRNAs的富集模式作为logTER的函数d.
为了证实HNRNPC在控制该调节子翻译中的因果作用，我们使用了CRISPR干扰26(CRISPRi)敲低MDA-MB-231细胞中的HNRNPC(0.34的倍数变化，P < 0.01, determined by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT–qPCR)), and used Ribo-seq to compare TEs in control and HNRNPC-deficient cells. HNRNPC knockdown (KD) affected the translational landscape in MDA-MB-231 cells and, specifically, caused translational repression of HNRNPC target mRNAs (Fig. 2a和扩展数据图。2a).我们发现，在大多数情况下，相同的HNRNPC调节子mRNAs在MDA-LM2和HNRNPC KD细胞中被翻译抑制，进一步强调了HNRNPC作为TE调节子的作用(扩展数据图。2b).我们分别验证了在高转移和HNRNPC KD细胞中翻译抑制的几个靶标(扩展数据图。2c，d).然而，HNRNPC是一种主要的核蛋白，也是一种已知的可变剪接调节因子27这一事实也反映在我们的CLIP-seq数据中，基于其与内含子序列的普遍结合(扩展数据图。1h).因此，尚不清楚HNRNPC作为一种核蛋白，如何影响细胞质中靶蛋白的翻译。因此，我们假设HNRNPC可能间接控制其靶蛋白的翻译。
a下图:显示与sgControl MDA-MB-231细胞相比，sgHNRNPC中TER (logTER)变化分布的火山图。统计显著性(逻辑回归，P < 0.01) observations are highlighted in orange. Top: enrichment of the HNRNPC targets as a function of logTER between sgHNRNPC and sgControl cells. mRNAs are divided into equally populated bins according to logTER (dashed vertical lines delineate the bins); the y轴显示了我们在每个仓中鉴定的HNRNPC靶的频率(水平虚线表示所有转录物中HNRNPC靶的平均频率)。显著富集的箱(逻辑回归，FDR < 0.05红色)或耗尽(蓝色)的HNRNPC目标用黑色边框表示。还包括互信息(MI)值及其相关联的z分数。b热图显示了在3’UTRs中HNRNPC结合峰附近(500 nt侧翼)典型poly(A)信号的富集(由CLIP-seq确定)。粗体边界表示统计上显著的富集(超几何检验，已修正P < 0.05; red). MI values and associated z-显示分数。c，维恩图显示了HNRNPC 3’UTR靶mrna和显示APA的mrna之间的重叠。P使用超几何测试计算的值。d下图:显示APA比率变化分布的火山图(logAPAR有关详细说明，请参见方法)与MDA-MB-231细胞相比。上图:作为MDA-LM2和亲代MDA-MB-231细胞之间APAR的函数，HNRNPC结合的3’UTRs的富集；统计数据a. e下图:火山图，显示了与sgControl单元相比，sgHNRNPC中APAR的变化分布。上图:作为sgHNRNPC和sgControl细胞之间APAR的函数，HNRNPC结合的3’UTRs的富集；统计数据a.
为了深入了解HNRNPC如何在亲代MDA-MB-231和MDA-LM2细胞中差异控制其靶RNA的聚腺苷酸化，我们在两种细胞系中免疫沉淀HNRNPC，并通过MS鉴定相互作用蛋白。我们特别寻找HNRNPC相互作用组在低转移性和高转移性细胞之间切换的方式。首先，根据HNRNPC作为剪接调节因子的典型作用，我们在HNRNPC相互作用子中检测到许多剪接因子(补充表1).然而，当比较低和高转移细胞之间的HNRNPC相互作用时，我们没有观察到HNRNPC和其他剪接因子之间相互作用的广泛变化。相比之下，我们发现MDA-LM2细胞的HNRNPC相互作用组中，一组涉及mRNA从细胞核转运的蛋白质明显减少(扩展数据图。3a).通过对这组蛋白质的进一步观察，我们注意到在mRNA核输出级联中起典型作用的多聚腺苷酸结合蛋白30。我们发现PABPC4和PABPN1是MDA-LM2细胞中耗尽的HNRNPC相互作用因子(图。3a和扩展数据图。3b).我们通过免疫共沉淀(co-IP)和蛋白质印迹分别证实了MDA-MB-231细胞中HNRNPC和PABPC4或PABPN1之间的RNA依赖性相互作用(图。3b).接下来，为了评估这些因素中的哪些(如果有的话)与HNRNPC协同作用来调节poly(A)位点选择，我们使用CRISPRi去除了MDA-MB-231细胞中的PABPC4和PABPN1(倍数变化分别为0.21和0.69，P < 0.05, as determined by RT–qPCR) and employed 3′-end RNA-seq to compare the APA landscapes in control and KD cells. We found that PABPC4 KD, but not PABPN1 KD, resulted in APA changes similar to those observed in HNRNPC-deficient cells (Extended Data Fig. 3c，d).重要的是，与亲代MDA-MB-231细胞相比，PABPC4在MDA-LM2细胞中的mRNA(对数倍数变化0.9，P= 0.02，由RNA-seq确定)和蛋白质水平(对数倍数变化-0.5，P < 0.002, determined by MS14).
a火山图，显示了与MDA-MB-231细胞相比，MDA-LM2中与HNRNPC(由HNRNPC或对照(同种型IgG)co-IP–MS测定)的相对蛋白质相互作用的变化分布。统计显著性(FDR调整P值< 0.25，控制输入丰度的广义线性模型)观察值以粉红色突出显示。b通过蛋白质印迹分析HNRNPC或对照IgG的共IPs。RNase A包含在裂解物中的指定位置。来自两个独立实验的代表性图像。c，维恩图显示了HNRNPC和PAB PC 4 3’UTR靶之间的重叠(分别由CLIP-seq和PAPER-CLIP确定)。P使用超几何测试计算的值。d下图:显示HNRNPC/PABPC4双KD与PABPC4 KD MDA-MB-231细胞中APA比率(logAPAR)变化分布的火山图。上图:作为sgHNRNPC/sgPABPC4和sgControl/sgPABPC4细胞之间APAR的函数，HNRNPC结合的3’UTRs的富集；统计如图。2a. e的维恩图显示了HNRNPC 3’UTR靶和AGO2结合的mrna(上图)或miRNA靶mrna(下图)之间的重叠，如CLIP-seq分析所确定的。P使用超几何测试计算的值。f下图:显示与sgControl MDA-MB-231细胞相比，sgAGO2中TER (logTER)变化分布的火山图。上图:AGO2靶的富集是sgAGO2和SG对照细胞之间logTER的函数；统计如图。2a. gHNRNPC靶的富集是sgAGO2和sgControl细胞之间logTER的函数。mRNAs根据其对数分布到相等填充的箱中(黑色背景上的红色条显示每个箱中的值的范围)。显著浓缩的容器(超几何检验，已修正P < 0.05; red) or depletion (blue) of HNRNPC targets (3′ UTR-bound) are denoted with a bolded border. Also included are mutual information (MI) value and its associated z得分。
我们推断延伸的3′UTRs携带更多的翻译抑制独联体-调控元件，如miRNA结合位点。与这一假设一致，我们观察到HNRNPC结合的延伸3’UTRs和miRNA/argonaute (AGO2)靶之间有显著的重叠32(图。3e).已知miRNAs抑制mRNA的稳定性和翻译33。因此，我们观察到，mrna既与HNRNPC结合，又含有功能性miRNA结合位点32与亲代MDA-MB-231相比，MDA-LM2中的TE显著低于非靶mRNAs，与对照细胞相比，HNRNPC缺陷细胞中的TE显著低于非靶mRNAs(扩展数据图。4a、b).此外，MDA-LM2和HNRNPC缺陷细胞中翻译抑制的mRNAs在AGO2靶中富集(图。3f和扩展数据图。4c).为了验证miRNAs通过AGO2介导的机制有助于HNRNPC靶的翻译抑制，我们在对照和AGO2 KD背景下，在对照和HNRNPC缺失的MDA-MB-231细胞中进行了Ribo-seq(ago 2倍数变化为0.55，P < 0.05, as determined by RT–qPCR). We found that HNRNPC-dependent translational repression was contingent on AGO2 expression (Extended Data Fig. 4d).类似地，当我们比较对照和AGO2 KD细胞中的TEs时，我们发现AGO2缺失细胞中TEs较高的mRNAs富含HNRNPC结合的转录物(图。3g).
与我们的核糖体分析和TMT-MS数据一致(扩展数据图。5d)，与对照MDA-MB-231细胞相比，我们在MDA-LM2和HNRNPC缺陷细胞中检测到较低水平的PDLIM5蛋白(图。5b).相比之下，PDLIM5 mRNA丰度在这些条件下相似，这与PDLIM5蛋白水平在翻译水平上受到调节一致(扩展数据图。5e).我们还通过同种型特异性RT–qPCR证实了PDLIM5 mRNA从近端到远端的聚腺苷酸位点转换(图。5c).为了进一步证实PDLIM5 mRNA中3’调控序列所赋予的调控，我们构建了一系列报告基因，其中我们将N-末端FLAG标签与PDLIM5 CDS和PDL im 5 3’UTR的几个遗传编码变体融合(扩展数据图。5f).我们发现，与全长3’UTR相比，PDL im 53’UTR中近端poly(A)位点下游的序列是报告蛋白数量减少的原因(图。5d).
为了评估PDLIM5在乳腺癌进展中的作用，我们用对照和PDLIM5缺陷的MDA-MB-231和HCC1806细胞进行了体内肺定殖试验。如图所示。5e和扩展数据图。5g，PDL im 5 KD(0.18的倍数变化，P < 0.01, as determined by RT–qPCR) led to a significant increase in metastatic lung colonization of xenografted mice. In our model, PDLIM5 depletion impacts breast cancer progression due to HNRNPC deficiency. Indeed, an ectopic PDLIM5 expression in HNRNPC-deficient cells was sufficient to reduce the lung metastatic burden to the levels similar to control cells with intact HNRNPC expression (Fig. 5f)，与HNRNPC作用于PDLIM5上游控制乳腺癌转移一致。
癌细胞利用多种表型途径转移，包括调节它们的增殖活性、侵袭性、迁移以及在隔离状态下存活的能力。为了测试HNRNPC和PDLIM5是否有助于这些表型中的任何一种，我们用对照和HNRNPC-或PDL im 5-扰动的细胞进行了增殖、集落形成、迁移和侵袭测定。与我们的体内肺定殖试验一致(图。4和5)，HNRNPC和PDLIM5 KDs导致细胞迁移和体外侵袭能力增加，而HNRNPC过表达(OE)导致细胞迁移和侵袭能力降低(扩展数据图。5h，我).这些观察结果与HNRNPC干扰细胞的增殖和集落形成减少形成对比(扩展数据图。5j–l)，与体内HNRNPC KD细胞的原发肿瘤生长率一致(图。4c).类似于我们的体内数据(图。5f)，异位PDLIM5表达挽救了HNRNPC KD细胞的增殖和集落形成缺陷(扩展数据图。5m).
当我们发现HNRNPC在转移抑制翻译程序的上游起作用时，我们鉴定了一组HNRNPC mRNA靶，在MDA-LM2细胞中翻译抑制并经历近端到远端的poly(A)位点转换，以定义翻译HNRNPC靶信号。我们观察到，在乳腺癌患者(CPTAC)的蛋白质组数据中，HNRNPC信号的较低蛋白水平总体上与较低的总生存率和无进展生存率显著相关(扩展数据图)。6f，g).与PABPC4和HNRNPC共同作用一致，在乳腺癌患者队列中，PABPC4的低表达与更差的预后指标和疾病进展相关(图。6f，g和扩展数据图。6小时).此外，PDLIM5是hnr NPC–PAB PC 4轴下游的功能性效应子，PDLIM5的表达也与乳腺癌患者的存活率相关(图。6小时和扩展数据图。6i，j).
最后，我们询问hnr NPC–PAB PC 4缺陷对高转移细胞的影响是否可以逆转，作为一种潜在的预防转移的治疗策略。最近，靶不可知的化学筛选被用于鉴定影响APA或转录终止的小分子35。我们选择测试T4，一种据报道能诱导远端-近端聚腺苷酸位点转换的药物35这与在MDA-LM2细胞中观察到的HNRNPC靶的3’UTR延长相反。我们首先证实，用5 M T4处理MDA-MB-231细胞6小时主要诱导远端到近端的poly(A)位点转换，这通过3’端RNA-seq评估(扩展数据图。6k).重要的是，我们观察到T4治疗可以逆转HNRNPC KD对APA位点选择的影响。6l，m).这些结果表明，T4可以潜在地抵消HNRNPC靶的3′UTR延长，并损害HNRNPC缺陷引发的促转移方案。为了测试这种可能性，我们首先在MDA-LM2细胞中进行了T4的剂量反应测量(扩展数据图)。6n)，并用20%的最大抑制浓度(IC20)的药物(3 M)或赋形剂对照处理这些细胞6小时。T4处理对APA的影响在24小时内保持稳定，并且在停药后的72小时内保持显著(扩展数据图。6o).然后，我们进行了肺定殖试验，以测量用T4体外处理的细胞的转移能力的变化。如图所示。6i与载体处理的细胞相比，T4处理的MDA-LM2细胞显示出显著降低的转移能力。最后，我们评估了T4全身治疗是否可以预防肺转移。事实上，与赋形剂对照治疗相比，T4的腹膜内注射显著损害了MDA-LM2细胞的肺建群(图。6j).这些观察表明，逆转HNRNPC缺陷的调节结果可以恢复其靶调节子的转移抑制活性。
我们还发现PABPC4在体内与HNRNPC靶结合，并与HNRNPC相互作用控制APA。PABPC4是一种细胞核-细胞质穿梭因子，已知具有上下文依赖性功能，与其他聚腺苷酸结合蛋白重叠30。PABPC4通过靶mrna 3’UTR的富金元素和poly(A)尾的缩短之间的相互作用，对红系细胞的分化至关重要36。Poly(A)尾缩短是促进mRNA衰减和下调翻译的众所周知的机制37。高转移细胞中PABPC4表达的减少可能通过poly(A)尾缩短导致HNRNPC–PAB PC 4联合靶的TE降低。
