摘要 癌细胞经历转录重编程以驱动肿瘤进展和转移。使用癌细胞系和患者来源的肿瘤器官样细胞，我们证明了负延伸因子(NELF)复合物的缺失通过下调上皮间质转化(EMT)和干细胞相关基因抑制乳腺癌的发展。内源性蛋白质的定量多重快速免疫沉淀质谱(qPLEX-RIME)进一步揭示了作为EMT功能的NELF-E相关染色质伴侣的显著重连，以及NELF-E与关键EMT转录因子SLUG的共选择。因此，NELF-E的缺失导致蛞蝓与染色质的结合受损。通过整合转录组和基因组分析，我们确定组蛋白乙酰转移酶KAT2B是NELF-E-SLUG的关键功能靶点。KAT2B的遗传和药理学失活改善EMT标记的表达，复制NELF消融。NELF-E和KAT2B的高表达与乳腺癌患者的不良预后相关，突出了我们研究结果的临床相关性。综上所述，我们揭示了NELF-E-SLUG-KAT2B表观遗传轴在乳腺癌发生中的关键作用。
介绍 转录调节的动态性质提供了基因表达的灵活性，这对于忠实地确定细胞身份和多细胞生物的适当发育是至关重要的 1 。然而，癌细胞可以利用这种固有的转录可塑性来驱动对肿瘤微环境的机会性适应。除了基因突变和拷贝数改变，转录和表观遗传变异已被证明有助于癌细胞的可塑性，从而提高生存适应性和对治疗压力的抵抗力。鉴于纠正遗传异常的相对挑战，表观遗传和转录变化的可逆性和环境特异性提供了有希望的治疗机会 2 ,3
转录调节因子被认为在所有组织中执行重要的体内平衡功能，其抑制可能导致正常细胞的无差别杀伤。然而，几项研究表明，许多转录调节因子实际上可以在健康组织中发挥环境特异性作用，并可以在恶性细胞中进一步被剥夺，以驱动选择性致癌基因表达程序，导致导致癌症的转录失调 4 ,5 ,6 ,7 ,8 。例如，致癌基因如 c-MYC 显示出对转录抑制的不成比例的反应，导致优先杀死恶性细胞 9 ,10 。这就产生了癌细胞中“转录成瘾”的概念 3 。因此，在过去几年中，靶向转录周期不同方面(从转录起始到延伸)的基于转录的疗法获得了关注 11 。值得注意的是，最近的一项研究将转录起始和延伸因子确定为体内癌症依赖性的重要因素，强调了转录失调如何导致肿瘤发生，这可以用于开发新的治疗候选物 12 。因此，靶向癌细胞转录依赖性可能是多种癌症的一种有吸引力的治疗策略，超过了靶向致癌信号和免疫相关途径的现有治疗。
NELF是一个四亚基转录复合体，由NELF-A、B、C/D和E组成 13 ,14 ,15 ,16 。NELF的生理重要性已经在不同的生物学背景下得到很好的描述，从在早期小鼠胚胎发育中发挥重要功能到调节人类细胞中的应激和炎症反应 17 ,18 ,19 ,20 ,21 ,22 ,23 。这些研究强调了NELF在响应细胞和外部线索时微调转录输出中的作用，从而将其定位于转录和信号反应之间的联系。然而，NELF发挥其基因调节功能的机制基础仍有待充分阐明。例如，尽管体外生物化学研究已经明确地确定了NELF在促进RNA聚合酶II (RNAPII)在靶基因的近端启动子区域停顿中的作用，这也在体内的选择基因座中观察到 21 其他报道表明，细胞中NELF功能的破坏导致启动子和基因体中RNAPII占据率的普遍下降 23 ,24 ,25 ,26 ,27 ,28 ,29 ,30 ,31 ,32 。最近发现，NELF的急性缺失不会导致RNAPII的全面释放，但可能会影响其他启动子附近的调节步骤，如5’mRNA帽的稳定性 30 。总之，这些结果强调了一个更复杂的情况，其中NELF的基因调节功能可能依赖于染色质环境及其与体内其他伴侣蛋白的相互作用。
许多研究表明，癌细胞通过选择核心转录机制来维持其致癌状态。值得注意的例子包括BRD4和CDK7，它们已成为癌症中有希望的治疗靶点 10 ,33 。相比之下，NELF在癌症中的作用还不完全清楚。考虑到其作为分子变阻器的功能，协调转录与环境输入 34 ，我们假设NELF也可能参与癌基因驱动事件下游的癌细胞适应性转录反应。因此，靶向NELF可以作为一种有吸引力的治疗策略来削弱致癌转录程序以阻止癌症进展。
在这里，我们表明NELF复合体的破坏抑制了不同分子亚型的多种乳腺癌细胞系的肿瘤发生和转移。我们揭示了NELF促进上皮间质转化(EMT)和干细胞相关基因表达的能力，这些基因与癌症转移和疾病复发有关。具体来说，我们表明NELF-E，NELF的一个关键亚单位，与EMT转录因子(TF)，SLUG相互作用，促进关键EMT靶基因的转录。基因组和转录组数据的整合使我们确定组蛋白乙酰转移酶KAT2B是NELF-E-SLUG的关键转录靶点。值得注意的是，KAT2B的遗传和药理学失活导致EMT受损和干细胞特性丧失，类似于NELF-E消融，从而确立了NELF-E-KAT2B调控轴在乳腺癌发生中的功能重要性。
结果 NELF的缺失导致体外和体内肿瘤发生受损
四个NELF亚基在蛋白质稳定性方面相互依赖，其中任何一个亚基的缺失都会影响其他亚基的稳定性。特别是，NELF-A和NELF-E是NELF复合体的两个关键功能亚单位，分别结合RNAPII和新生RNA 13 ,15 ,16 ，并且还可以在体内作为亚复合物存在 35 。为了确定NELF复合体是否在肿瘤发生中起作用，我们决定首先关注这两个关键亚单位。首先，我们检测了NELF-A和NELF-E在不同乳腺癌细胞系中的表达，发现与非致瘤性人乳腺上皮细胞系MCF10A和HMEC相比，两者在所有测试的乳腺癌细胞系中都高度上调(图。 1a ，补充图。 1a ).接下来，我们分别去除NELF-A和NELF-E，并评估其对不同乳腺癌细胞系中锚定非依赖性生长的影响。具体来说，siRNA/shRNA介导的NELF-A或NELF-E在不同亚型(雌激素受体)的乳腺癌细胞系中的敲低(KD) + ，HER2 + 和三阴性)导致体外非贴壁生长减少(图。 1b，c 和补充图。 1b，c ).相比之下，在NELF-E KD后，在非致瘤性MCF10A和HMEC细胞系中没有观察到细胞活力的明显下降(补充图。 1d )，突出了乳腺癌细胞对NELF的更大依赖性。
图1:NELF复合体的消除削弱了致瘤性。 a 非致瘤性乳腺上皮细胞系MCF10A以及不同乳腺癌细胞系T-47D (ER)中NELF-A和NELF-E的蛋白质印迹分析 + ，公关 + )，SK-BR-3 (HER2 + )，MCF7 (ER + )，BT-474 (HER2 + )、BT-549(三阴性)、MDA-MB-231(三阴性)、SUM159(三阴性)。β-肌动蛋白用作加载对照。 b , c 左:MCF7单元格( n = 3)和BT-549细胞( n = 4)分别用非靶向siRNA(“scrambled，siSCR”)和靶向NELF-A和NELF-E的siRNA转染，随后进行蛋白质印迹分析。GAPDH用作加载对照。右图:软琼脂分析的代表性图像和量化。 d 左图:WT和NELF-A/NELF-E KO SUM159细胞中NELF-A、NELF-E、NELF-B和NELF-C/D的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作加载对照。右图:软琼脂分析的代表性图像和量化( n = 4). e 5 × 10 6 将WT、NELF-A KO和NELF-E KO SUM159细胞分别注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。肿瘤可触及后每3天测量一次肿瘤体积；平均SEM， n = 4/组。 f 左图:从野生型、NELF-A KO型和NELF-E KO型组收获的肿瘤；右图:肿瘤重量的量化；平均SEM， n = 4/组。印迹和图像代表至少三个独立的实验。数据输入( b –d )表示为平均值±标准差。 p -值由双尾学生的决定 t -测试。源数据作为源数据文件提供。
为了研究NELF在体内的致瘤作用，我们在高度侵袭性的SUM159乳腺癌细胞系(三阴性亚型)中产生了CRISPR介导的NELF-A和NELF-E的基因敲除(KOs)。我们首先证实了NELF-A或NELF-E的缺失导致了其他NELF亚单位蛋白表达的减少，这与以前的报道一致 23 ,30 (图。 1d ).与上述NELF KD乳腺癌细胞系相似，NELF-A和NELF-E KO SUM159细胞在软琼脂试验中也显示出集落形成减少(图。 1d ).接下来，我们将野生型(WT)、NELF-A KO和NELF-E KO SUM159细胞移植到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中，以评估这些细胞在体内的致瘤潜力。在这项异种移植研究中，我们观察到与野生型细胞相比，NELF-A和NELF-E KO细胞的肿瘤生长显著降低(图。 1e，f ).总之，我们的体外和体内结果证明了NELF复合体在乳腺癌肿瘤发生中的重要作用。
NELF缺失细胞中的EMT和干细胞相关通路下调 为了获得对NELF复合体如何调节恶性转化的机制性认识，我们进行了转录组分析。我们重点研究了NELF-E KO SUM159细胞，该细胞对NELF复合体的完整性有显著影响，显示所有NELF亚单位几乎完全丧失(图。 1d ).与野生型细胞相比，NELF-E KO细胞的RNA测序(RNA-seq)鉴定出388个上调(上调)和540个下调(下调)基因(图。 2a ).来自分子特征数据库(MSigDB)的基因组富集分析(GSEA) 36 ,37 确定了几种在NELF-E KO SUM159细胞中显著下调的致瘤途径(补充数据 1 )，包括上皮间质转化(EMT)和乳腺干细胞途径(图。 2b )，我们通过选择EMT和干细胞相关基因的qPCR进一步证实了这一点(补充图。 2a ).重要的是，NELF-E在另一个TNBC细胞系BT-549中的KD也导致EMT途径的抑制，突出了一种保守效应(补充图。 2b
图2: NELF缺失导致类干性状减少和EMT途径下调。 a 显示NELF-E KO和WT SUM159细胞之间基因表达变化的MA图。红色和蓝色点表示显著上调( n = 388)和下调( n = 540)个基因。 b NELF-E KO SUM159细胞干细胞和上皮-间质转化途径的GSEA富集图。 c WT，NELF-E KO和NELF-E拯救SUM159细胞中NELF-E和NELF-A的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作加载对照。 d WT、NELF-E KO和NELF-E rescue SUM159细胞中伤口愈合测定的定量。比例尺= 100 μm。 e WT、NELF-E KO和NELF-E rescue SUM159细胞中乳房球形成测定的定量( n = 4).比例尺= 100 μm。 f WT、NELF-E KO和NELF-E rescue SUM159细胞中侵袭试验的定量( n = 3).比例尺= 100 μm。 g 注射1.25 × 10的小鼠的体重(平均SEM) 6 WT和NELF-E KO SUM159细胞分别( n = 8，每组)。 h 肺膨胀并用来自WT中小鼠的10%中性缓冲福尔马林固定( n = 8)和NELF-E-KO集团( n = 8). i 三种放大倍数下肺组织H&E染色的代表性图像(mf:转移灶)。从上到下，Bar分别为2毫米、500微米和100微米。 j 肺转移的定量分析表示为转移所占百分比和每个肺的转移位点数目( n = 8/组)。 k 显示WT、NELF-E KO和NELF-E rescue MCF7细胞中的乳腺球在原代( n = 3)，次要( n = 4)，以及第三通道( n = 4). l 以每孔1000个细胞的密度接种来自三级球体的MCF7细胞，并孵育2周。然后将菌落固定并用结晶紫染色。 m CD24的流式细胞仪分析和定量 低的 /CD44 高的 MCF7第三纪哺乳动物圈的种群( n = 3).印迹和图像代表至少三个独立的实验。数据输入( d , e , f , j , k , m )表示为平均值±标准差。 p -值由双尾学生的决定 t -测试。源数据作为源数据文件提供。
为了验证NELF缺失对EMT和干细胞特性的功能性影响，我们进行了细胞迁移和乳腺球形成试验。除了NELF-E KO SUM159细胞，我们还产生了NELF-E KO拯救细胞系。我们证实了NELF-E的缺失阻碍了细胞迁移和乳腺球形成能力，重要的是，这两种特性在拯救细胞系中都得到了恢复(图。 2c–f ).为了评估NELF-E缺失对体内癌症转移的影响，我们在NSG小鼠中进行了SUM159 WT和NELF-E KO细胞的尾静脉注射。与NELF-E KO组相比，WT组的小鼠在实验期间表现出体重减轻(图。 2g ).更重要的是，与NELF-E-KO组相比，WT组的肺实质中出现了广泛的转移(转移部位的数量和它们所占的面积)(图。 2h–j ).因此，NELF的缺失导致致癌途径减弱，导致体内转移受损。
乳腺癌是一种高度复杂的疾病，已被分为几种亚型。为了评估我们的发现超越三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的普遍性，我们还在er中产生了NELF-E KO和拯救细胞 + 细胞系MCF7(补充图。 2c ).我们首先证实MCF7 NELF-E KO细胞显示出减少的非贴壁生长，这在拯救细胞中得以恢复(补充图。 2c ).重要的是，GSEA分析同样确定了乳腺干细胞基因标记在MCF7 NELF-E KO细胞中显著下调(补充图。 2d )，这与我们在SUM159中的早期发现一致(图。 2b ).原代乳腺球的连续传代证实MCF7 NELF-E KO细胞的自我更新能力受损，但在拯救细胞中恢复(图。 2k 和补充图。 2e ).我们还使用来自第三层球的细胞进行额外的集落形成试验，得到了类似的结果(图。 2l ).为了说明MCF7 NELF-E KO细胞自我更新能力的降低是否可能是由于肿瘤干细胞(CSCs)或肿瘤起始细胞(TICs)的丢失，我们使用CD44和CD24表面标记物进行了流式细胞术分析。与我们的预期一致，我们发现CD24 低的 /CD44 高的 CSC样群体从WT MCF7球状体的41.9%减少到NELF-E KO球状体的5.4%，在NELF-E救援球状体中部分恢复到13.8%(图。 2m 和补充图。 2f ).在粘附的MCF7、T-47D和SUM159细胞中观察到类似的结果(补充图。 2g–I ).总之，我们在不同亚型的多种乳腺癌细胞系中的数据证明了NELF通过激活EMT和干细胞特性在促进乳腺癌肿瘤发生中的关键作用。
为了评估我们发现的临床相关性，我们使用代谢和B扫描乳腺癌数据集检测了NELF-E的表达及其与临床病理特征的关系 38 ,39 。与我们的实验结果一致，我们观察到NELF-E的表达与肿瘤分级正相关:与1级和2级肿瘤相比，NELF-E的表达在3级肿瘤中最高(补充图。 3a ).此外，我们注意到，在代谢组和B型扫描组中，尤其是在急诊室，较高的NELF-E表达与较差的患者总生存率相关 + /HER2 − 还有呃 − /HER2 − 亚型(补充图。 3b ).在控制雌激素受体和雌激素受体状态后，多变量分析也揭示了代谢组和b超组中NELF-E表达和患者生存率之间的显著负相关(代谢组:HR = 1.13， p = 3.45 × 10 − 06 ；扫描b超:HR = 1.67， p = 2.15 × 10 − 04 )，表明较高的NELF-E表达通常与较差的总体患者存活率相关。此外，我们通过免疫组织化学在商业乳腺癌组织微阵列上分析了NELF-E的表达，并证实了与正常乳腺组织(0级)相比，肿瘤组织(1至3级)中NELF-E的蛋白表达更高(补充图。 3c ).总的来说，这些独立的数据集表明NELF-E作为乳腺癌的推定生物标志物的效用，其中NELF-E的高表达可能与增加的干细胞样特征相关，导致更大的肿瘤侵袭性和更差的临床结果。
NELF的缺失抑制可诱导转移性乳腺癌细胞系中的EMT 为了更好地检测NELF-E在EMT诱导和发展过程中的需求，以及它与EMT转录因子(TFs)的相互作用，我们利用了多西环素(Dox)诱导的SLUG和SOX9 MCF7ras乳腺癌细胞系(以下简称为MCF7ras+SS) 40 ,41 。SLUG(或SNAI2)和SOX9是调节乳腺细胞干细胞的两种关键TF，它们促进人乳腺癌细胞的致瘤和转移种植能力 40 。使用该细胞系，我们首先验证了SLUG和SOX9的过表达激活了EMT和干细胞程序(图。 3a ).除了SLUG和SOX9，值得注意的CSC标记(例如 CD44 )和间质标记物(如 FN1 和 CXCL6 )显著上调，而上皮标记物(如 CDH1 和 KRT18 )明显下调(图。 3b ，补充图。 4a )，概括了EMT的关键分子基石。
图3:在SOX9-SLUG过表达MCF7细胞系模型中，NELF-E的缺失抑制了EMT。 a 柱状图显示了与载体对照相比，强力霉素(Dox)处理的MCF7ras+SS细胞中来自分子特征数据库(MSigDB)的顶部扰动途径。 b 火山图描绘了显著上调的基因( n = 1750)和下调基因( n = 2223).选定的间充质/干细胞相关基因标记为红色，而上皮基因标记为蓝色。形容词（adjective的缩写） p -值≤0.05；|倍数变化| ≥ 1.5。 p -使用DESeq2软件包计算值(详见“方法”) c 蛋白印迹分析Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中的不同标记物，所述细胞用靶向NELF e . GAPDH的混杂的或两种独立的shRNAs转导。 d shNELF-E+Dox与SCR+Dox细胞的GSEA图。 p -值通过基因集合富集分析计算得出。(详见“方法”)。 e 迁移和侵袭试验的代表性图像和量化。MCF7ras+SS细胞用混杂的或NELF-E shRNA转导，并在分析前用Dox处理72小时以诱导SOX9和SLUG表达( n = 3).比例尺= 100 μm。 f 成球试验的代表性图像和量化。用混乱的或NELF-E shRNA转导MCF7ras+SS细胞，然后用72小时Dox处理。以每孔10K的密度接种细胞，并在5-7天后计算球体的数量( n = 4).比例尺= 100 μm。 g SCR+Dox和shNELF-E+Dox细胞的软琼脂试验的代表性图像和量化( n = 3). h CD24的流式细胞仪分析和定量 低的 /CD44 高的 NELF-E KD+Dox细胞与SCR+Dox细胞相比的群体( n = 3).印迹和图像代表至少三个独立的实验。 p -值在( e –h )是由一个双尾学生的 t -测试。平均值±标准差由条形图表示。源数据作为源数据文件提供。
我们继续在MCF7ras+SS细胞中使用两种独立的shrna(shn elf-E # 1和shNELF-E#2)去除NELF-E，并显示FN1和CD44蛋白表达在两种情况下都显著降低(图。 3c ).RNA-seq证实，与SCR (scrambled)+Dox细胞相比，在shNELF-E+Dox中EMT和相关通路(如NFκB和IL2-STAT5)下调(图。 三维（three dimension的缩写） 和补充图。 4b ).同样，stemness途径在shNELF-E+Dox细胞中也显示负富集(补充图。 4b ).我们通过qPCR验证了关键的间充质和干细胞相关基因在NELF-E KD中下调(补充图。 4c ).我们还检测到在三种不同的细胞系中NELF-E缺失后持续下调的一组基因(观察值与预期值之比= 5.77， p -值= 5.05 × 10 − 52 ；超级测试 42 )(补充图。 4d 上图)，特别是EMT和stemness通路(补充图。 4d ，底部)。一个代表性的例子是 CAPG (补充数据 2 )，这与患者预后不良有关 43
我们进一步进行了肿瘤发生试验，以评估细胞迁移、自我更新和非贴壁生长的变化。在所有检查的病例中，NELF-E KD导致EMT和stemness特性受损(图。 3e–g )，与我们之前的发现一致(图。 2 ).作为一个恰当的例子，与导致CD24大量增加的SOX9和SLUG的诱导相反 低的 /CD44 高的 人群(57.5%)，这种效应在NELF-E KD细胞(6.9%)中严重减弱(图。 3h ).总之，这些数据表明由SLUG和SOX9介导的EMT诱导活性依赖于NELF。
NELF的缺失主要影响EMT期间上调的基因 从我们的qPCR分析中，我们注意到在NELF-E KD Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中，选择的间充质和干细胞相关基因的表达显著减弱。然而，上皮基因，尤其是众所周知的标记 CDH1 ，仍然在很大程度上受到抑制(补充图。 4e ).为了以公正的方式对此进行评估，我们根据SCR+Dox细胞与SCR-Con细胞相比的基因活性变化，将RNA-seq数据中的基因分为三组:1750个基因上调(adj。 p -值< 0.05；折叠变化≥1.5；被称为“上调基因”)，2223个基因被下调(adj。 p -值< 0.05；折叠变化≤- 1.5；称为“下调基因”)和表达没有显著变化的基因(称为“未改变的”)(图。 3b ).与我们早期的发现一致，NELF-E的缺失对上调基因( p = 4.4 × 10 − 21 )，包括间充质和CSC标记，以及对下调基因的边际影响( p = 3.1 × 10 − 05 )(图。 4a ).对于未改变的基因，没有观察到整体效应(图。 4a ).这个结果强调了NELF-E KD对EMT转录反应的偏向性作用，主要影响SLUG/SOX9激活的靶基因。
图4:NELF-E的缺失减弱了基因激活和RNAPII结合。 a 原木 2 上调基因的倍数变化( n = 1750)、下调基因( n = 2223)，而未改变的基因( n = 1581)在两种不同的条件下。基因分类基于SCR+Dox的条件 相对 SCR-Con与adj的切断。 p -值≤ 0.05且|倍数变化| ≥ 1.5。中心线显示中值，方框界限代表上四分位数和下四分位数，触须显示1.5倍的四分位数间距。双尾学生的 t -测试用于所有比较。 p -未对多个测试的值进行调整，以及 t -统计数据在源数据中提供。 b Dox处理的MCF7ras+SS细胞中NELF E结合位点的基因组分布。 c SCR-Con和SCR+Dox细胞中上调基因(上图)和下调基因(下图)的NELF-E ChIP-seq信号的元基因图。 d SCR-Con、SCR+Dox和shNELF-E+Dox细胞中上调基因和下调基因的RNAPII ChIP-seq信号的元基因图。 e 基因组浏览器追踪显示NELF-E和RNAPII在间充质基因启动子上的占据 FN1 (左)和干细胞相关基因 CD44 (对)。源数据作为源数据文件提供。
为了确定NELF如何促进EMT和癌症干细胞基因的表达，我们在对照和Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中进行了NELF-E ChIP-seq。在DMSO处理的对照细胞(SCR-Con)中鉴定了总共14，206个NELF-E峰，在Dox处理的细胞(SCR+Dox)中鉴定了13，966个峰(图。 4b 和补充图。 5a ).总的来说，NELF-E在SCR-Con和SCR+Dox细胞中表现出相似的基因组分布，如预期的那样大量占据启动子近端区域(约占其总占据位点的80%)(图。 4b 和补充图。 5a ).值得注意的是，SCR+Dox细胞显示了从头NELF-E结合位点的子集( n = 1909)(补充图 5b )在SCR+Dox和SCR-Con细胞之间具有统计学差异(补充图。 5c ).接下来，我们进行了途径分析的功能富集，发现从头NELF-E峰也富集了EMT途径(HALLMARK_EMT，adj p -值= 0.0136)，由已知的EMT标记表示 TIMP3 , CALD1 , federation of american scientists 美国科学家联合会 ，以及 IL6 (补充图 5d
接下来，我们整合了NELF-E芯片-序列和RNA-序列数据。总的来说，上调基因显示NELF-E结合增加，而下调基因显示启动子近端区域NELF-E结合丧失，表明NELF-E占据与基因表达水平相关(图。 4c ).RNAPII占用率也反映了NELF-E结合的占用率(图。 4d )，例如癌症干细胞标记 CD44 和间充质基因 FN1 ，两者在对照细胞中Dox诱导时上调，但在NELF-E KD细胞中减少(图。 4e ).这些结果强调了NELF-E-RNAPII伙伴关系在基因激活中的积极作用，并与越来越多的研究一致，这些研究表明NELF的缺失对体内暂停的RNAPII有适度的影响，但对靶基因上的RNAPII占据有深远的影响 23 ,24 ,25 ,26 ,27 ,28 ,29 ,30 ,31 ,32 。总之，我们的数据强调了NELF-E在EMT诱导过程中促进基因上调的需要。
NELF-E与蛞蝓相互作用，并调节其在选定位点上的目标占有率 为了深入了解NELF-E促进EMT的机制，我们采用了蛋白质组学方法来鉴定NELF-E的相互作用因子。具体来说，我们利用了内源性蛋白质的定量多重快速免疫沉淀质谱(qPLEX-RIME)，这是一种最近开发的方法，以定量的方式研究染色质相关复合物的组成 44 。我们将NELF-E qPLEX-RIME应用于未治疗的和Dox治疗的MCF7ras+SS细胞，分别与IgG对照(补充图。 6a ).对未处理的MCF7ras+SS细胞的分析揭示，NELF-E相互作用组包含总共89种蛋白质，显示出比IgG对照显著富集(log 2 [倍数变化]≥0.5；形容词（adjective的缩写） p -值< 0.05)(补充图) 6b，c 和补充数据 3 ).
用26种独特的肽和65%的蛋白质序列覆盖范围对NELF-E蛋白进行了稳健的鉴定(补充图。 6d ).其余三个亚单位——NELF-A、NELF-B和NELF-C/D——也与大量独特的肽一起被鉴定，以及NELF的其他已知伴侣，包括RNAPII亚单位和NCBP1/2 45 (补充图 6d ).重要的是，许多已确认的NELF-E互动者在NELF-E相关职能中发挥作用(补充图一)。 6e ；另见讨论)，进一步增强了我们对收购NELF-E interactome的信心。
接下来，我们试图描述EMT诱导后NELF-E相互作用组的变化。我们在Dox处理的细胞上分析了NELF-E复合物，并将结果与亲代MCF7ras+SS细胞进行了比较。NELF-E的表达在EMT诱导期间保持不变(图。 3c )，为比较EMT诱导时鉴定的相互作用子的蛋白量提供了基础。我们总共获得了27个NELF-E相互作用子，它们在EMT状态下表现出显著的富集(log 2 [倍数变化]≥0.5；形容词（adjective的缩写） p -值< 0.05)(图 5a、b ，补充图。 6f )，以及32个在EMT状态下显示富集减少的NELF-E相互作用子(log 2 [倍数变化]≤0.5；形容词（adjective的缩写） p -值< 0.05)(补充图) 6f，g )，表明在EMT期间NELF-E相互作用发生了重新布线(补充数据 3 ).我们在免疫共沉淀实验中验证了其中一些相互作用因子，特别是SLUG和SOX9，它们是差异富集程度最高的候选蛋白(补充图。 7a ，图。 5c ).重要的是，我们还概括了另一种乳腺癌细胞系BT-549中SLUG/SOX9和NELF-E之间的相互作用，该细胞系表达SOX9和SLUG的内源性水平，突出了我们发现的普遍性(补充图。 7b ).据我们所知，SLUG和SOX9尚未被报道为NELF-E相互作用因子，因此这一发现可能为NELF如何通过调节关键EMT TFs的活性发挥致癌作用提供了一个机制解释。总之，我们的结果构成了染色质上NELF-E相互作用组的第一个广泛特征，并作为EMT的一个功能，提供了对疾病机制的见解。
图5: NELF-E与蛞蝓相互作用并改变蛞蝓的基因组占有率。 a 满足|log显著性阈值的WT+Dox对WT-Con蛋白质的NELF-E复合物-主要分析的火山图 2 (倍数变化)| ≥0.5且可调。 p -值< 0.05用它们的基因名称标记并涂成红色。这 p -值通过Benjamin I–hoch Berg多重假设校正进行调整。 b 通过qPLEX-RIME富集Dox诱导的蛋白质的相互作用网络图，叠加在串相互作用网络上。qPLEX-RIME检测到的交互用蓝色表示，而字符串数据库中的交互用灰色表示。蛋白质/节点基于对数着色 2 (折叠变化)值。 c 在NELF-E免疫沉淀(IP)后，对Dox处理的MCF7ras+SS细胞的核提取物进行SOX9、SLUG和NELF-E的蛋白质印迹分析。印迹是三个独立实验的代表。 d 用混杂shRNA转导并用Dox (SCR+Dox)处理的MCF7ras+SS细胞中SLUG结合位点的基因组分布。 e SCR+Dox和shNELF-E+Dox MCF7ras+SS细胞中三种不同类别的SLUG结合的元图。 f , g TSS和远端区域段塞流和NELF-E共结合峰的饼图和热图描述。源数据作为源数据文件提供。
在MCF7ras+SS细胞系模型中，SLUG在EMT诱导过程中起主导作用 40 。在我们qPLEX-RIME结果的指导下，我们接下来检查了Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中SLUG的基因组占有率，以及NELF-E KD的函数。在亲代细胞中进行Dox诱导后，我们检测到总共17，595个SLUG结合的基因组位点，其中大部分对应于调控元件，如远端基因间区域和启动子(图。 5d
为了进一步探究NELF-E和蛞蝓之间的机制关系，我们比较了SCR+Dox细胞中NELF-E和蛞蝓的基因组结合谱，并鉴定了NELF-E-蛞蝓重叠峰的子集( n = 2165).有趣的是，段塞流占有率在NELF-东边界区域最高，在NELF-东枯竭后下降(图。 5e )，例如 PHTF1和MANBA 基因组位点(补充图。 7c ) 。重要的是，这种减少的占用率不是由于NELF-E KD上蛞蝓蛋白表达的变化(图。 3c ).此外，我们还通过差异峰分析以及随后的统计测试确定，与未被NELF-E共同结合的段塞峰群组相比，这些共同结合的峰更有可能在NELF-E耗尽时失去段塞结合(卡方检验；观察到的与预期的比率:3.4， p -值= 1.77 × 10 − 261 ).此外，大部分(78.4%)的NELF-E-蛞蝓共结合峰位于启动子处，与远端区域(43.9%对7.0%)相比，NELF-E缺失导致蛞蝓共结合峰在启动子处损失更大(图。 5f，g ).重要的是，NELF-东部新生区域的段塞流结合在NELF-东部KD也有所减少(补充图。 7d ).总之，这些数据强调了NELF-E在调节蛞蝓基因组占据中的重要作用，部分是通过其与蛞蝓在染色质上的相互作用。值得注意的是，我们还在另一种乳腺癌细胞系BT-549中验证了NELF-E的缺失导致大量蛞蝓结合位点的减少(补充图。 7e ) 。接下来，我们绘制了“段塞未改变”和“段塞丢失”类别中的NELF-E和段塞信号(SCR vs shNELF-E BT-549细胞)。有趣的是，我们发现，尽管这两个类别的NELF-E结合强度相当，但强度较高的段塞区域对NELF-E损失更敏感(补充图。 7f )，支持我们的机械论模型。
KAT2B是NELF-E-SLUG在EMT过程中的一个关键功能靶点 为了阐明NELF-E和蛞蝓对间充质/干细胞基因表达程序诱导的直接作用，我们在10 kb线性距离内将NELF-E-蛞蝓共结合峰与它们最近的基因进行了注释。为了鉴定SLUG/SOX9过表达时NELF-E缺失影响最深的基因，我们通过减去标准化对数定义了NELF-E KD影响评分(IS) 2 阴性IS表明NELF-E KD通过SLUG/SOX9过表达减弱基因激活或增强基因抑制，而阳性IS表明NELF-E KD响应SLUG/SOX9过表达增强基因激活或减弱基因抑制。然后，我们筛选并保留了在NELF-E KD中由于SLUG过度表达而激活受损的基因，采用的标准是这些基因在Dox诱导的MCF7+SS细胞中显著上调(倍数变化≥ 1.5且可调) p -值< 0.05)，并且它们的NELF-E KD不大于log 2 (1.5)(相当于活化减少1.5倍)。通过重叠这两组基因，我们得到了41个NELF-E和蛞蝓的直接靶基因，它们的表达在NELF-E KD中显著减弱(图。 6a 和补充数据 4 ).从这一分析中，我们确定了先前与乳腺癌转移有关的基因，如CITED2和DUSP6 46 ,47 。尽管SLUG是众所周知的转录阻遏物 48 ,49 我们的发现强调了它也可以对与NELF-E相关的靶基因子集发挥激活功能
图6: KAT2B是NELF-E和SLUG响应EMT的关键靶点。 a 显示KAT2B为顶级基因之一的点状图( n = 41)，其鼻涕虫介导的激活被NELF-E KD最显著地减弱。两次比较中相应基因的表达用灰线连接。 b 基因组浏览器跟踪显示NELF-E，蛞蝓和RNAPII在 KAT2B 轨迹。 c 用Dox处理不同时间点的MCF7ras+SS细胞中KAT2B的RT-qPCR分析(左)和蛋白质印迹分析(右( n = 3). d 用混杂的shRNA或两种独立的NELF-E shRNA转导并用或不用Dox处理的MCF7ras+SS细胞中KAT2B的蛋白质印迹分析。GAPDH用作加载对照。 e 段塞流/NELF-E/KAT2B/RNAPII信号在NELF-E单独区域、段塞流单独区域和NELF-E/段塞流联合区域的热图描述。 f 不同的蛞蝓结合区组群的KAT2B ChIP-Seq信号的元图。 g 文氏图显示了蛞蝓结合的上调基因和NELF-E/KAT2B靶标之间的重叠。还显示了与其他类别相比，蛞蝓结合的上调基因的重叠百分比。 h 基因组浏览器跟踪显示NELF-E，蛞蝓和KAT2B的占有率 LAMC1 和 ZEB1 loci。印迹是三个独立实验的代表。 p -值由双尾学生的决定 t -测试。平均值±标准差由条形图表示。源数据作为源数据文件提供。
在41个NELF弹头激活的目标中，我们发现 KAT2B 成为最高度上调的基因(图。 6a ).KAT2B是一种赖氨酸乙酰转移酶，催化组蛋白
和非组蛋白的赖氨酸乙酰化 50 。它涉及多种细胞功能，包括肿瘤发生 51 。值得注意的是，EMT的诱导伴随着广泛的染色质变化，特别是获得常色特征 52 ,53 ,54 。此外，在独立的单细胞RNA-seq数据集中 55 ，我们观察到 KAT2B 在EMT诱导时，mRNA与特征间充质基因正相关(补充图。 8a ).因此，我们决定关注KAT2B，并确定它如何促进乳腺癌的进展。
我们首先确认NELF-E和鼻涕虫被招募到 KAT2B Dox诱导后的启动子(图。 6b )并伴随着KAT2B表达的增加(图。 6c 和补充图。 8b ).重要的是，KD的NELF-E导致KAT2B表达减少，以及鼻涕虫和RNAPII在细胞中的占有率减少 KAT2B 启动子，表明NELF-E有助于蛞蝓和RNAPII结合的稳定性 KAT2B 启动子(图 6b，d 和补充图。 8b ).而上调 KAT2B 在缺乏NELF-E的情况下，其旁系同源物的表达受损 KAT2A 未受到显著影响(补充图 8c ).这些结果确定KAT2B是NELF-E和蛞蝓的直接转录靶标。
KAT2B协同NELF-E-SLUG促进EMT和stemness 已经证明KAT2B的表达依赖于NELF-E和SLUG，我们继续评估在EMT期间KAT2B和NELF-E-SLUG之间的相互作用机制。我们通过在对照和Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中进行KAT2B ChIP-seq来表征KAT2B的基因组定位，这揭示了在Dox诱导时KAT2B在启动子处的主要占据(补充图。 8d ).通路分析表明，KAT2B靶向的基因参与了与EMT相关的过程，如MYC、E2F和TGFβ信号传导，从而支持KAT2B的促肿瘤作用(补充图。 8e ).有趣的是，我们还发现KAT2B的整体占用率与NELF E全基因组的占用率密切相关(图。 6e )，只有在NELF-E共同结合的情况下，KAT2B在蛞蝓结合位点的占据率才显著增加(图。 6f ).这些观察强调了NELF-E和KAT2B在基因激活中的潜在协同关系，包括选择蛞蝓靶基因。
为了进一步探索蛞蝓的激活功能，我们根据它们的转录状态对蛞蝓靶基因进行了分层。我们总共获得了1207个SLUG抑制基因和436个SLUG激活基因(补充图。 8f ).着眼于后者，我们证实了鼻涕虫激活的基因富集于EMT途径(补充图。 8g )，以及约65.6%( n = 286)的基因被NELF-E和KAT2B共同占据(图。 6g ).值得注意的例子包括 ZEB1 ，EMT的主要诱导剂，以及 LAMC1 ，一种与肿瘤侵袭和转移相关的细胞外基质蛋白(图。 6小时 ).除了它们的基因组共占，我们还检测到KAT2B和蛞蝓之间的生化相互作用(补充图。 8h ).综上所述，我们的数据揭示了KAT2B如何驱动乳腺癌转移和促进与NELF相关的SLUG介导的基因激活的机制。
为了研究KAT2B切除对EMT和癌症干细胞的功能影响，我们在Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中去除了KAT2B。KAT2B KD细胞的RNA-seq随后的途径分析显示，EMT和相关途径(例如，NF-κB)受到最显著的影响(图。 7a ).蛋白质印迹分析进一步证实了干细胞相关标记CD44的丢失(补充图。 9a ).重要的是，我们还验证了KAT2B的缺失导致不同转移性乳腺癌细胞系BT-549中乳腺癌干细胞的受损(补充图。 9b
图7: KAT2B激活EMT进展。 a GSEA图显示siKAT2B+Dox与siSCR+Dox MCF7ras+SS细胞中显著富集的途径。 p -数值通过基因集合富集分析计算得出(详见“方法”)。 b 用或不用GA和AA处理的MCF7ras+SS细胞中ECM1和CD44的蛋白质印迹分析。GAPDH用作加载对照。图像和印迹是三个独立实验的代表。 c qRT-PCR分析 FN1 和 ECM1 在GA和AA处理的Dox诱导的MCF7ras+SS细胞中( n = 3). d CD24的流式细胞仪分析和定量 低的 /CD44 高的 载体对照、GA-和AA-处理的MCF7ras+SS细胞中的群体，作为Dox诱导的函数。 e CD24的流式细胞仪分析和定量 低的 /CD44 高的 MCF7ras+SS细胞中KAT2B过表达后的群体。矢量控制(仅GFPpCAGIG)和KAT2B-过表达(KAT2B+GFP；pCAGIG-KAT2B)质粒分别转染入MCF7ras+SS细胞。绿色和平组织 − 和绿色荧光蛋白 + 分离群体并分析CD24 低的 /CD44 高的 人口( n = 3). f , g 用混杂的shRNA或两种独立的KAT2B或NELF-E shRNA转导患者来源的乳腺癌类器官，随后进行蛋白质印迹和球体形成试验( n = 3).β-肌动蛋白用作加载对照。 h 用载体对照或KAT2B过表达质粒转导患者来源的乳腺癌类器官，随后进行蛋白质印迹和球体形成试验( n = 4).GAPDH用作加载对照。印迹和图像代表至少三个独立的实验。 p -值在( c –h )是由一个双尾学生的 t -测试。平均值±标准差由条形图表示。源数据作为源数据文件提供。
除了基因功能丧失实验，我们还试图使用药物抑制剂Garcinol (GA)和漆树酸(AA)来破坏KAT2B的活性 56 ,57 。我们首先确定了在MCF7ras+SS细胞中不诱导毒性的GA和AA的最佳工作浓度(补充图。 9c ).重要的是，用GA或AA处理的Dox诱导的MCF7ras+SS细胞显示间充质标记物如CD44、FN1和ECM1以及CSC细胞表面标记物CD24的表达减少 低的 CD44 高的 (图。 7b–d )，模仿我们的KAT2B KD结果。我们随后对GA处理的细胞进行RNA-seq，观察到EMT途径下调(补充图。 9d )并且KAT2B抑制细胞中大量下调的基因对NELF-E KD有类似的影响，这与两种因子的广泛基因组共占相一致(补充图。 9e ).比较GA处理和NELF-E KD细胞的整个转录组的相关性分析进一步支持了这一点，其显示了显著的正相关性(ρ= 0.15， p < 2.2 × 10− 16 ).当使用HALLMARK_EMT基因标记时观察到更强的正相关性(rho = 0.33， p = 7.1 × 10 − 7 )(补充图。 9f ).引人注目的是，GA处理后NELF-E基因组占用率降低，包括EMT相关基因，与它们的转录下调一致(补充图。 9g高 ).总之，我们的发现揭示了NELF-E和KAT2B在调节EMT基因中的协同作用。
为了明确说明KAT2B在促进EMT/CSC样状态中的作用，除了上述功能丧失研究外，我们还进行了功能获得实验。与我们目前的发现一致，对照MCF7ras+SS细胞中KAT2B的过表达导致CD24的增加。 低的 /CD44 高的 CSC群体(图 7e 和补充图。 9i ).因此，我们的数据强烈证明KAT2B的上调导致恶性肿瘤样病变。
为了证实KAT2B作为乳腺肿瘤发生的关键效应器的作用，我们评估了KAT2B的表达。 KAT2B 并且观察到与ZEB1/2一致的正相关(补充图。 9j ).此外，KAT2B较高的蛋白表达也与乳腺癌患者较差的生存结果相关(补充图。 9k
最后但并非最不重要的是，除了癌细胞系，我们还在TNBC患者来源的器官样细胞系中敲除了KAT2B，并观察到受损的乳腺球形成能力，这由NELF-E KD概括(图。 7f，g ).相反，KAT2B的过度表达促进了乳腺球的形成(图。 7h ).总之，我们的工作阐明了NELF-KAT2B表观遗传轴在乳腺癌发生中的关键作用，特别是在EMT和癌症干细胞的背景下。
讨论 染色质相关蛋白正成为多种疾病，尤其是癌症的新治疗靶点。在这里，我们证明了NELF复合物的缺失消除了乳腺癌细胞的致瘤性，无论其组织学亚型如何，揭示了NELF在乳腺癌发生中的关键作用。具体来说，我们发现NELF激活了乳腺癌中的EMT和乳腺干细胞转录程序，并定义了一种表观遗传机制，通过这种机制，NELF协同EMT TF，SLUG和组蛋白乙酰转移酶KAT2B来协调EMT期间的基因表达重编程。
我们目前对NELF功能的了解大多来自体外生物化学研究。然而，体内遗传研究揭示了NELF独立于转录暂停的额外功能，以及在基因调控中更复杂的作用，这可能受NELF发挥作用的染色质环境的影响。为了能够深入探索NELF在染色质上的功能，我们应用qPLEX-RIME方法来定义EMT进展期间的NELF-E‘染色体组’,这揭示了一个全面的相互作用网络。重要的是，我们不仅如预期的那样恢复了暂停转录复合物(RNA pii-DSIF-NELF)的成员，而且我们还鉴定了许多新的伙伴，这些伙伴可能揭示NELF在体内功能的新见解。许多已确认的NELF-E互动者可能在与NELF-E有关的职能中发挥作用。例如，89种已鉴定的NELF-E相互作用因子包括参与RNA转录和辅因子(TAF15，DDX21，SUB1)、mRNA剪接(DHX15，SRSF7，SRSF8，PUF60)、mRNA甲基化(CMTR1)和端粒酶RNA加工(TRIR)的蛋白质，表明NELF在转录调节中具有更广泛的功能(补充数据 3 ).参与DNA修复的蛋白质(PCNA，RUVBL1)也被鉴定为NELF-E相互作用因子，与最近鉴定NELF为DNA损伤反应的新成员的报道一致 58 ,59 。此外，染色质结合蛋白(CBX3，HMGB1)和参与组蛋白翻译后修饰的蛋白(PRMT1，KMT5A)也被发现是NELF-E相互作用因子，这些可能与NELF复合体的基因调节功能有关。值得注意的是，还鉴定了与NELF功能没有明显联系或先前联系的其他蛋白质。例如，所有三种烯醇化酶同功酶——ENO1-3——主要因其在葡萄糖代谢中的作用而为人所知——都被下调了，这暗示了这些代谢酶在细胞核中与NELF相关的可能的兼职功能。有趣的是，ENO1先前被报道与染色质结合，并可能作为转录调节子发挥作用 60 。虽然这些相互作用的功能重要性仍有待研究，但我们的工作为研究NELF的功能及其在癌症中的作用机制提供了重要的资源和框架。
从我们的研究中出现的另一个关键观察结果是，在EMT诱导后，NELF-E相互作用体发生了显著的重新连接。SLUG和SOX9被鉴定为在NELF-E相互作用组中的EMT诱导后富集，连同其他因子如IBTK和组蛋白。在我们的EMT细胞系模型中，NELF-E水平在EMT诱导后保持不变，这表明NELF被致癌的TF劫持，以促进转录可塑性，这是驱动细胞重编程以获得转移特性所必需的。值得注意的是，EMT是一个高度动态的过程，包含了广泛的中间状态。这种可塑性赋予癌细胞更大的癌症发展、扩散和适应选择性压力的潜力 61 ,62 。SNAIL、SLUG、TWIST1、ZEB1和ZEB2被广泛认为是核心EMT TFs。有趣的是，已知这些因子在肿瘤中表现出不同的时空表达模式，并以非冗余的方式激活EMT程序 63 。根据肿瘤类型，存在环境特异性的细微差别，可以利用不同组的EMT TFs。需要强调的是，在我们的细胞系模型中，我们主要关注NELF-E与SLUG的合作关系。NELF-E也有可能与SOX9合作，实现EMT项目的强力激活。我们进一步假设，在不同的EMT阶段，NELF可能被不同的EMT TFs异常地增选，以驱动基因表达的重新编程，如果是这样，可能代表了一般转移性癌症的一个重要的治疗弱点。事实上，除了我们对乳腺癌的研究，NELF还被证明能促进其他癌症如胰腺癌的转移 64 ，肝癌 65 ，和胃癌 66
虽然SLUG是众所周知的转录阻遏物，但我们的研究也引起了人们对它在基因激活中的作用的关注。在这里，通过整合转录组和ChIP-seq数据集，我们发现了许多NELF-E-SLUG激活的靶点，其中许多与EMT直接相关，例如 ZEB1 和 KAT2B 。观察到的KAT2B在NELF-E-SLUG结合的染色质区域的基因组共居，以及我们的生化相互作用研究，进一步提示了一个模型，其中这些因素广泛合作，建立了转移基因表达的转录活性染色质状态。先前的一项研究证实了这一点，该研究报道蛞蝓过表达与EMT基因启动子上组蛋白乙酰化增加有关 67 。此外，KAT2B可以与ZEB1形成激活复合物，通过组蛋白乙酰化来刺激EMT靶的转录 68 。从机理上讲，我们设想，作为一种TF，SLUG主要通过DNA序列指导的方式被募集到它的靶启动子上，NELF可能有助于稳定SLUG与染色质在共结合位点上的结合，很可能是通过募集转录机制，正如我们的qPLEX-RIME所建议的那样。NELF进一步与KAT2B合作，以促进蛞蝓介导的EMT基因的激活。
虽然我们的研究主要集中在NELF-E-蛞蝓共结合基因上，但我们希望强调NELF-E的缺失会对蛞蝓全基因组结合产生更广泛的影响。已知蛞蝓与其结合和转录活性的各种辅因子合作 69 ,70 。从我们的转录组分析中，我们注意到一些辅助因子，如 JUNB 和 TCF3 ，在NELF-E KD上下调(补充数据 2 )，这可能解释了在NELF-东共结区之外观察到的段塞流占用率降低的原因。因此，我们的发现引起了人们对NELF影响段塞流靶向性的不同调节机制的注意，也可能引起了其他EMT TFs的注意。在未来的研究中，我们旨在阐明NELF调节不同EMT TFs的基因组占据率的变化以控制其各自的EMT程序的机制基础。
总之，我们的结果强调了NELF-E-SLUG-KAT2B调控轴如何被乳腺癌细胞利用来驱动表型可塑性，最终导致癌症进展和转移。我们的发现与越来越多的证据一致，这些证据表明癌细胞利用机制来支持维持其致癌程序所需的增强的转录活性，使它们对基于转录的抑制敏感。虽然我们的研究专门检测了NELF在乳腺癌发生中的转录作用，但先前的研究报道，NELF-E也可能通过调节肝癌致癌转录物的mRNA稳定性发挥转录后功能 71 。尽管NELF促进肿瘤发生的机制不同，但这些发现清楚地强调了NELF在不同癌症中的关键促癌能力。
乳腺癌是世界范围内女性最常见的癌症之一，转移是治疗失败的主要原因，占乳腺癌相关死亡率的大部分。不幸的是，目前可用的系统性疗法对晚期乳腺癌和复发疾病的疗效仍然有限。从治疗的角度来看，有可能针对乳腺癌中的NELF-E-SLUG-KAT2B依赖性。重要的是，以前的遗传学KO研究表明，缺乏功能性NELF复合体的成年小鼠是可以存活的，尽管在成年后期对心脏应激的反应受损 72 。这表明NELF在正常组织中对于基础基因表达是不可或缺的，与转录调节因子在功能上是“管家”的流行观点相反。因此，可能有足够的治疗窗口来靶向癌症中的NELF。同样的， Kat2b KO小鼠是存活的，没有明显的有害表型 73 ，使其能够作为潜在的临床可行的治疗靶点。KAT2B和NELF对正常发育的明显非必要性，以及它们在侵袭性乳腺癌中的获得性依赖性，突出了开发针对癌症中NELF-E-KAT2B的治疗候选物的令人兴奋的前景。
