肺癌中与T细胞浸润、炎症和免疫编辑相关的免疫肽组景观

提高依赖于肿瘤抗原景观的个体化癌症免疫治疗的有效性的一个关键障碍仍然是患者分层。尽管CD3患者+CD8+t细胞炎性肿瘤通常对免疫检查点抑制剂表现出更好的反应，但仍不清楚高度炎性和非炎性肿瘤中存在的免疫肽组是否有本质上的不同。我们调查了8例肺癌患者的61个肿瘤区域和邻近的非恶性肺组织，结合免疫肽组学、基因组学、整体和空间转录组学进行了深度抗原发现，并探索了肿瘤(neo)抗原的异质性表达和呈递。在目前的研究中，我们将不同的免疫细胞群与免疫肽组相关联，并发现位于CD3中HLA-I呈递热点的预测新抗原的频率相对较高+CD8+排除t细胞的肿瘤。我们将这些新抗原与免疫识别联系起来，支持它们参与免疫编辑。这可能对选择适合患者变异体和免疫微环境的联合治疗有影响。

肿瘤由非恶性和恶性细胞的异质性群体组成，具有可变的遗传和表观遗传特征，这些特征决定了它们共存和共同进化的能力。这一进化过程使肿瘤抗原的表达、人类白细胞抗原(HLA)向细胞毒性T细胞的呈递以及有效抗肿瘤免疫的诱导和持续时间多样化。在肺癌患者中，已经表明肿瘤免疫微环境(TME)在患者之间和患者内部是高度可变的1。根据细胞毒性T细胞浸润的程度，肿瘤被分为两种主要亚型——浸润型和排除型2,3,4。患有浸润性肿瘤的患者通常对免疫检查点封闭(ICB)疗法反应更好5。从不吸烟的肺癌患者对ICB反应不佳6低反应性被认为与低肿瘤突变负荷(TMB)、低新抗原负荷和低程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)表达有关7,8。此外，非小细胞肺癌(NSCLCs)中高密度的组织驻留记忆T细胞与对ICB的反应相关9。然而，大多数患者都有被排除的肿瘤，甚至TMB高的患者也可能没有反应10。此外，T细胞浸润的肺癌肿瘤中存在的HLA结合肽库是否与排除的肿瘤中存在的肽库有本质上的不同，以及哪些免疫原性抗原介导肿瘤杀伤，仍然是未知的。当然，针对T细胞浸润和排斥肿瘤中肿瘤抗原的更有效免疫治疗的合理开发将受益于对肿瘤抗原景观的更完整理解。

抗原景观和TME的表征

在目前的研究中，我们分析了来自8例初治非小细胞肺癌患者的相同肿块和配对非恶性相邻肺组织(此处定义为宏观区域)的多个肺肿瘤区域。我们对来自5例肺腺癌(LUADs)、2例肺鳞癌(LUSCs)和1例大细胞神经内分泌癌(LCNEC)的总共61个宏观区域进行了深度蛋白质组学分析，包括产生全外显子组测序(WES)和大量RNA测序(RNA-seq)数据集，以及基于质谱的HLA-I和HLA-II免疫肽组学，应用了数据依赖和非数据依赖的采集方法(分别为DDA和DIA)14(图。1和补充表格1).我们总共准确鉴定了102，323个HLA-I和53，343个HLA-II肽，这得到了预测结合相应HLA等位基因的高比例肽(HLA-I从02289的90%到02672的96.2%，HLA-II从02287的75.3%到02288的84.2%)以及典型肽长度分布和结合特异性的证实(图。1扩展数据图。1a–e和补充表格2和3).样品02288-5和02288-6的肽回收率异常低，这可能是由于高度(95%)坏死组织(图。1和补充表格1).已鉴定的HLA-I和-II肽的数量与单个患者中可用于分析的组织数量相关(P= 0.027)，但不是跨患者(P= 0.845;扩展数据图。1f，g).在所有患者中，HLA-I和HLA-II结合肽的数量与通过批量RNA-seq评估的相应HLA表达相关(P= 0.0003和7.3 × 10−6，分别为；扩展数据图。1h，我)，提示重要的患者间变异性。这可能与免疫细胞的不同流行率有关，免疫细胞通常表达高水平的HLA分子，并可能对测量的免疫肽组有实质性贡献。

组织总结和对多区域组织进行的分析，以及影响蛋白质序列通过我们管道阈值的体细胞突变数量、突变负荷、肿瘤纯度、坏死水平、通过质谱鉴定的独特HLA-I和HLA-II肽的数量以及预测为相应HLA同种异型结合物的肽的百分比(等级< 2%)的信息。患者特征和处理信息也可以在补充表格中找到1和2.

源数据

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正如所料，我们在癌基因中发现了致病突变，包括KRAS和EGFR在LUAD样本中，在TP53在LUAD和LUSC样本中(图。2a)，并且在患者02671、03023、02672和02290(以下简称为‘吸烟者’)中发现了显著的吸烟突变签名；图。1).已知仅在LUSC或LUAD肿瘤中过度表达的基因的主成分分析(PCA)15确认了我们样品的分类(图。2b和补充表格4).我们计算了炎症分数16使用确定的免疫相关基因组从大量RNA-seq数据中17，显示出对肺癌转录组具有最佳性能1。我们根据癌症基因组图谱(TCGA)项目中的1012个LUADs和LUSCs，为每个宏观区域指定炎症状态(图。2c，d).在患者之间和单个患者中观察到大范围的炎症，而相邻的非恶性肺组织总体上被评分为炎症。

a检测到的突变的热图(n= 157个突变)，这些突变被COSMIC中的FATHMM预测注释为致病的。颜色代表不同的患者，每条线是一个宏观区域(n= 51个宏区域)。的突变KRAS, TP53和EGFR用红色突出显示。b与LUADs或LUSCs相关的基因的PCA，确认样品的分类。基因列表取自Reili等人。15并在补充表格中提供3 (n= 53个宏区域)。c如Danaher等人所述，使用免疫相关基因组的表达水平，计算每个宏观区域以及来自TCGA的LUAD和LUSC肿瘤的炎症评分。17。不同的宏区域(n= 53个宏观区域)叠加在TCGA数据(n= 1011名TCGA患者)。d，每个宏观区域的炎症分数。散点图表示8个不同患者的53个区域；红色表示健康样本，红色方框表示接受GeoMx分析的区域。在患者02287中，为GeoMx选择的组织未进行批量RNA-seq，因此未在该图中显示。

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T细胞浸润和炎症的空间分析

肺癌的免疫分类已被证明相当具有挑战性。事实上，通过详细的病理学评估确定的免疫浸润可能与通过基因表达谱推断的浸润状态不一致1。因此，我们测定了CD3+CD8+T细胞肿瘤浸润标记物(CD3、CD8、颗粒酶B (GrzB)、Ki67、细胞角蛋白(CK)和DAPI)的苏木精-伊红染色和mIF染色的病理学检查后的T细胞浸润(图。3a，b和扩展数据图。2)在每个患者的一个随机选择的宏观区域组织中。双阳性CD3水平+CD8+在样本03023、02290和02672中，肿瘤与间质区域中的t细胞和肿瘤区域中的GrzB水平相对较高。因此，这些样品被指定为CD3+CD8+渗透，剩余的样品指定为CD3+CD8+t细胞被排除(学生的t-测试P= 0.036)(图。3c).

a,b，03023-02的mIF图像(a)和02288-07(b)展示了定义CD3浸润的掩蔽方法+CD8+肿瘤和间质中表达GrzB的双阳性T细胞。c，每位患者的mIF量化(n= 8).渗透样本(n= 3)具有更高的GrzB表达(点大小和镶嵌图)和更多的CD3+CD8+肿瘤中的t细胞多于间质中的t细胞(单侧学生的t-测试，P= 0.036).d手动选择无独立重复的微区域，并分类为肿瘤、间质、TLSs、CD45+-丰富和“其他”。显示了代表95个微区的样品02671的五个微区。e从GeoMx转录组计算的肿瘤和基质微区域中的CD45表达。蓝-红线和色标表示区分免疫高和免疫低肿瘤的阈值。插图:CD45在免疫高(n= 44个基质和肿瘤微区域)或免疫低(n= 26个基质和肿瘤微区域)。f，我们相对分类的方案。g从GeoMx转录组计算的免疫激活标记在肿瘤微区中的表达(排除-高:n= 14;排除-低:n= 11;渗透-高:n= 11;渗透-低:n= 7).h所有微区的转录组(n= 95，GeoMx)与所有宏观区域(n= 53，批量RNA)。考虑到每个患者的肿瘤微区域，黑色方框突出了相关性。i在方框中，这些相关性的平均方差计算为每个患者相关系数的方差。j，与标记为浸润性低的肿瘤的差异增加(02290，n= 7个肿瘤微区域)，浸润-高(03023，02672，n= 11个肿瘤微区域)，排除-高(02289，02671和03421，n= 14个肿瘤微区域)和排除低(02287，02288，n= 11个肿瘤微区域)。k，LUSC肿瘤显示出较高的方差。l在排除的肿瘤中，肿瘤微区域之间的相关性变化在LUADs中显示为相似(02287，02671和03421，n= 14个肿瘤微区)和lusc(02288和02289，n= 11个肿瘤微区域)。m排除肿瘤中宏观和微观区域之间相关性的方差。n在排除的肿瘤中，LUADs显示出微观区域和宏观区域之间显著更高的差异(n= 14个微区域)而不是浸润肿瘤(n= 11个微区)。除了…外c，使用单侧Wilcoxon的非参数检验。所有箱线图分别显示中位数(直线)、第25和第75个百分位数之间的四分位数范围(IQR)(方框)和上下四分位数的1.5倍IQR。未对多次测试进行调整。

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各种免疫细胞的存在预计会通过潜在的免疫编辑影响肿瘤抗原景观，而免疫细胞预计会直接对免疫肽组作出贡献。为了探索后者，我们使用GeoMx癌症转录组图谱(CTA)平台，通过空间转录组分析评估了整体炎症水平(在高与低的范围内)。使用CD45、CK和DAPI(分别用于捕获免疫细胞、肿瘤和上皮细胞，并用于分割)，我们为每个患者选择了确定的感兴趣的微区域，进行空间蛋白质组学和转录分析。根据形态学差异和上述标记，所选择的微区域被标注为:(1)肿瘤胰岛，(2)坏死的，(3)基质(具有可变的肿瘤细胞和免疫细胞的贡献)，(4) CD45+(免疫)细胞丰富，(5)三级淋巴结构(TLSs)和(6)其他(包括血管和非恶性肺)(图。三维（three dimension的缩写），补充图。1和补充表格5).与03023和02672相比，样品02290中肿瘤和基质微区的CD45表达相对较低，与02289、02671和03421相比，样品02287和02288中的CD45表达相对较低。因此，我们将样本02290、02287和02288指定为相对低炎症，而将其余样本指定为高炎症(图。3e).

基于上述结果，我们在二维(2D)空间中对患者进行了分组。在水平轴上，我们按照CD3的等级对患者进行排序+CD8+t细胞浸润(排除对浸润)和基于总体炎症水平的纵轴(低对高，Wilcoxon检验P= 0.00022;图。3f).特别是在肿瘤微区域，免疫相关基因的表达18 CCL5, CD27(PD-L1)，CD8A, CMKLR1, CXCL9, CXCR6, IDO1, LAG3, NKG7, PDCD1LG2(PD-L2)，PSMB10和STAT1遵循CD45的轮廓，支持我们的分类(图。3g和扩展数据图。3a，b).这种相当不规则的分类与CD3介导的免疫编辑的下游评估相关+CD8+并用于评估免疫细胞对免疫肽组的整体贡献。此外，免疫浸润肿瘤中的肿瘤微区预期更好地“反映”大块组织，因为这些微区包含免疫区室的成分，与免疫排斥肿瘤的肿瘤微区相反。事实上，将每个肿瘤微区域的GeoMx基因表达谱与相应患者宏观区域的大量RNA-seq数据相关联，揭示了标记为CD3的肿瘤的增加的变异(计算为相关系数的变异)+CD8+t细胞浸润-低(02290，更好的镜像)，CD3+CD8+t细胞浸润-高(03023和02672)，CD3+CD8+t细胞排除-高(02289、02671和03421)和CD3+CD8+t细胞-排除-低(02287和02288，差镜)(学生的t-测试P= 0.082;图。3h–j)，支持我们上面的分类。有趣的是，与LUADs相比，LUSC肿瘤据报道更加异质性，这是由于肿瘤内在因素(例如，驱动基因突变，拷贝数变异，基因表达谱)和TME的异质性组成，并且这些通常是相关的19。事实上，上述相关性的变化揭示了两个LUSC肿瘤比LUADs更易变(P= 0.0019;图。3k).接下来，我们通过计算排除肿瘤中肿瘤微区之间的差异，将免疫区室成分引入的偏差降至最低。LUAD (02287、02671和03421)和LUSC (02288和02289)肿瘤的差异相似(P= 0.43;图。3l).然后，我们类似地比较了宏观和微观区域之间的相关性方差，仅对于排除的肿瘤，并且发现与LUADs相比，LUSCs的变化更大(P= 0.11;图。3m)，证实了这两种LUSC肿瘤确实更加异质性，免疫区室可能起着重要作用。此外，仅考虑五个LUAD病例，我们发现在排除的肿瘤中微观和宏观区域之间的相关性的显著更高的方差(P=1.8 × 10−6；图。3n)，支持我们关于此补充方法的结论，以验证我们的分类。

HLA-II肽组中免疫浸润的生物标志物

HLA-II复合物通常在TME的各种免疫细胞上大量组成性表达。此外，肿瘤内在和外在因素可能影响它们在恶性细胞上的表达。为了研究这些因素如何影响HLA-II免疫肽组，我们首先评估了HLA-II呈递机制在不同微区的表达。与其他组相比，在浸润性高的肿瘤微区中HLA-II机械表达较高，但与间质微区相似(除了样品03421，如下所述；图。4a).在CD3中+CD8+t细胞浸润-低样品中，该机制在肿瘤微区的表达高于基质微区，而在排除-高和排除-低样品中，如所预期的，II类机制在基质中比在肿瘤微区更丰富(图。4a).接下来，我们构建了一组源基因，它们沿着浸润(浸润对排斥)和炎症(高对低)的轴专门出现，属于丰富的免疫相关术语(扩展数据图)。4和补充表格6).例如，toll样受体9 (TLR9)存在于浸润样本的HLA-II肽体中(03023和02672)。已知TLR9主要由浆细胞样树突细胞和B细胞表达20并且可以重新激活免疫监视以识别肿瘤特异性抗原21。这些结果表明，HLA-II肽组受TME的影响，并且是捕获关于TME信息的生物标记的来源。

aHLA-II呈递机制基因的表达(HLA-DRA, HLA-DRB, 人类白细胞抗原-DRB-2005年4月3日, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQA-1/2, 人类白细胞抗原DQB 1/2, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, CTSS和CD74)跨越所有测量的GeoMx区域(n= 95个微区域)。b，量化HLA-DRBmIF在间质和肿瘤区域的表达。c只在03421和02672样品中检测到在癌细胞表面表达的HLA-DR分子，这些肿瘤被称为HLA-II+，代表n= 2名患者。样本02288显示为HLA-II的一个实例−肿瘤，代表n= 6名患者。d转录因子NKX2-1在基质中的表达(LUADs:n= 28;LUSCs:n= 9;LCNECs:n= 5)和肿瘤微区域(LUADs:n= 25;LUSCs:n= 11;LCNECs:n= 7)在LCNEC、LUAD和LUSC肿瘤中。eNKX2-1在间质、TLS和CD45中的表达+微区(此处描绘的是间质)和HLA-II中的肿瘤微区+(肿瘤:n= 12;基质:n= 16)，HLA-II−(肿瘤:n= 16，基质:n= 9)和LUAD肿瘤。f,g来源基因的HLA-II取样分数未发现存在于任何健康组织中，但发现仅存在于HLA-II中+肿瘤(f)和他们的围棋浓缩分析(g).TOR，雷帕霉素的靶标。h，GO分析HLA-II中高表达的基因+ (n= 12个肿瘤微区；n= 16基质、TLS和CD45+微区)相对于HLA-II− (n= 16个肿瘤微区；n= 19基质、TLS和CD45+微区域)。ER，内质网；NMDA，N甲基D-天冬氨酸盐；紫外线。顶级条款，根据P值(费希尔精确检验)，被显示。所有的统计检验都是按照单侧Wilcoxon非参数检验进行的。所有箱线图分别显示中位数(直线)、第25和第75个百分位数之间的IQR(方框)和上下四分位数的1.5倍IQR。未对多次测试进行调整。

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为了进一步探索这一点，我们评估了HLA-DRB发现肿瘤区域的表达高于间质区域，特别是在LUAD患者03421和02672中(图。4b)，其中HLA-II分子确实免疫定位于肿瘤细胞膜(命名为HLA-II+肿瘤；图。4c).LUAD主要来源于已知组成型表达HLA-II的肺泡2型(AT2)细胞亚群22,23。小鼠模型表明，AT2细胞去分化为LUAD状态是由谱系转录因子NKX2-1的缺失启动的，该转录因子是肺分化的主要调节因子24。在肿瘤微区，NKX2-1在LUADs中的表达显著高于LUCSs和LCNECs，在LUADs HLA-II中的表达稍高，但不显著。+肿瘤(样本03421和02672；图。4d，e).来源于来源基因的HLA-II肽，只存在于HLA-II中+肿瘤而非任何健康组织中的肿瘤与各种细胞过程相关(补充表7).一个有趣的例子是被称为参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性激活的类别，包括诸如CASP4的蛋白质，casp 4是一种炎症性caspase，作为炎症小体的基本效应物25，以及人类生长和转化依赖蛋白(HGTD-P)，其促进对缺氧反应的内在凋亡26(图。4f，g).因此，HLA-II在LUAD癌细胞上的表达可能反映了癌症的内在和去分化状态，但也可能涉及其他因素。过表达基因的基因本体(GO)富集分析(z-得分> 2)在HLA-II以上的两个肿瘤微区中+相对于所有其他患者，病例(患者03421和02672)显示与HLA-II和HLA-I上外源性抗原的加工和呈递相关的基因显著富集，而与细胞周期、转录调节和细胞对DNA损伤的反应相关的术语主要富集在HLA-II上−肿瘤(图4h);然而，当基质、CD45+和TLS微区进行了分析(图。4h).总的来说，肿瘤03421和02672被归类为CD3+CD8+t细胞浸润和排斥的肿瘤，表明与HLA-II免疫肽组相关的更复杂的潜在生物学。

TME中与免疫细胞相关的HLA-II肽体

接下来，我们研究了免疫细胞标记在不同肿瘤组中被免疫肽组捕获的程度。我们利用了以前发表的体外激活前后分离的人类免疫细胞的免疫肽组学数据集，包括CD14+前体细胞、未成熟和成熟树突细胞和CD19+b细胞，CD4+，CD8+和它们相应的激活细胞27。对于每种细胞类型，对于HLA-I和HLA-II免疫肽组，我们获得了来源基因标记的列表，这些标记分别位于所有基因的总体取样分数分布的> 99%和> 80%的百分位数(补充表8)，并评估了我们队列中这些免疫细胞标记物的表达水平。值得注意的是，

CD8的HLA-II呈递水平显著升高+和CD4+在浸润性肿瘤和吸烟者中发现了t细胞及其活化的对应细胞，但在标记为免疫高的肿瘤中没有发现(图。5a–c).相比之下，CD14+、未成熟和成熟树突细胞以及CD19+和活化的CD19+细胞，仅在免疫高的肿瘤中明显更多地出现(图。5a–c).不足为奇的是，HLA-I免疫肽组没有显示出这么多，可能是因为HLA-I分子无处不在地表达(扩展数据图。5).我们得出结论，活化的CD8+和CD4+T细胞存在于HLA-II免疫肽组中，甚至更多地存在于它们的活化状态中，特别是在标记为T细胞浸润的肿瘤和吸烟者中，而B细胞和树突细胞的存在与总体高度炎症相关。

a–c免疫细胞对HLA-II免疫肽组的贡献，基于标记为排除的肿瘤中免疫细胞标记的取样分数(n= 29个肿瘤宏观区域) (a)和渗透(n= 15个肿瘤宏观区域)、不吸烟者(n= 21个肿瘤宏观区域)和吸烟者(n= 23个肿瘤宏观区域) (b)和免疫高(n= 27个肿瘤宏观区域)和免疫低(n= 17个肿瘤宏观区域) (c)每种细胞类型。P使用单侧Wilcoxon检验计算数值。箱线图分别显示了中位数(直线)、第25和第75个百分位数之间的IQR(方框)和1.5倍IQR(上四分位数和下四分位数)。未对多次测试进行调整。d，的z肿瘤与间质+ TLS + CD45的基因表达比较的得分分布+渗透高样品中的微区。上四分位数中的基因在肿瘤微区域中更高表达，而下四分位数中的基因在基质微区域中高表达。eCD79B表达与浸润性高样本中B细胞丰度的相关性的实例(n= 26基质+ TLS + CD45+和肿瘤微区域)。误差带代表95%置信区间。f，的z肿瘤与间质+ TLS + CD45的基因表达比较的得分分布+排除高样品中的微区。g排除高肿瘤中CD14表达和巨噬细胞丰度相关性的例子(n= 34基质+ TLS + CD45+和肿瘤微区域)。误差带代表95%置信区间。h,i，归因于基质+ TLS + CD45的所有基因的相关性+微区(下四分位数)或肿瘤微区(上四分位数)在浸润性高(h)和排除-高(i)样品。树突状细胞；NK细胞，自然杀伤细胞；T车辆注册号细胞，调节性T细胞。j,k基因的取样分数总和与不同的免疫细胞类型相关(皮尔逊相关r> 0.5)在渗透-高(n= 2名患者和n= 163个基因) (j)和排除-高(n= 3名患者和n= 168个基因) (k).

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通过GeoMx转录组数据指导下的独立方法，我们进一步探索了不同微区中特定免疫细胞类型的存在是否会影响和促进所呈递的HLA-II免疫肽组。我们计算了每个微区域中免疫细胞的相对数量17(扩展数据图。6a).正如所预料的，免疫细胞被发现在基质微区中比在排除高和排除低肿瘤的肿瘤微区中更丰富，反之亦然。接下来，我们关注所有发现存在于HLA-II肽组中的来源基因，并将这些来源基因进一步分组为肿瘤相关(上四分位数)或间质、TLS和CD45+相关(下四分位数)(图。5d–I)，基于它们在微区域中的表达。我们将它们的表达与免疫细胞的相对数量相关联(皮尔逊相关系数；图。5d–I和扩展数据图。6)分别放在四组中的每一组。例如，基质-、TLS-和CD45的表达+-相关CD79B基因与T细胞浸润高的患者样本(02672和03023)的所有微区的B细胞丰度以及基质-、TLS-和CD45的表达高度相关+-相关CD14基因与高排斥患者的巨噬细胞高度相关(03421、02289和02671)(图。5h，我，分别为)。最后，为了评估哪些免疫细胞类型与HLA-II肽组最相关，我们总结了每种细胞类型的所有Pearson相关系数> 0.5(方法，图。5j，k和扩展数据图。6).有趣的是，浸润性高样本的HLA-II肽体(由这些源基因的存在所代表)与CD8的存在相关+T细胞、细胞毒性T细胞和耗尽的CD8+肿瘤微区中的t细胞，以及基质中的大多数其他免疫细胞类型，TLS和CD45+微区(图5j).相比之下，在排除性高肿瘤中，大多数免疫细胞类型几乎只起作用，因为它们存在于间质、TLS和CD45中+微区(图5k).这些结果强调了CD3的影响+CD8+t细胞浸润对HLA-II免疫肽组有影响。

HLA-I抗原景观和TAA呈递效率

从大量肿瘤组织中洗脱的全部HLA-I肽库预计不会揭示免疫编辑过程，因为肽主要来源于正常蛋白质，而HLA-I分子在非肿瘤细胞上普遍表达。因此，我们关注潜在的免疫原性来源抗原，并将质谱数据与定制的参考数据库进行匹配，参考数据库包括患者特异性基因组变异(SNPs和体细胞突变)，以及表达的非匿名基因，包括长非编码(lnc)RNAs、转座因子和公开可用的ribo-seq衍生的新开放阅读框和假基因(nuROFs)数据库28(参见方法有关更多信息和补充表格9).尽管我们预测不同样本中有812–3，399个HLA-I和2，570–10，674个HLA-II突变的新抗原(MixMHCpred结合等级≤2%)，但在手动检查串联质谱(MS–MS)谱图后，我们无法通过质谱检测到任何新抗原。同样，来自非匿名来源的HLA-II肽也不能确定。我们分别鉴定了18，342和12，856种HLA-I和HLA-II肽，这些肽来源于在HLA图谱重新分析后，在邻近健康宏区和其他良性组织的免疫肽组中未检测到的标准蛋白29(补充表格2和3).然而，发现它们几乎都在邻近的健康组织中表达。我们检测到218个来自转座因子来源的独特肽和773个来自其他非基因组来源的独特肽，如lncRNAs和假基因，但这些肽在所有肿瘤宏观区域和邻近健康组织中均一致表达，表明没有肿瘤特异性(扩展数据图。7和8和补充表格9).此外，1409个nuORF衍生肽中的大部分也存在于健康的宏区组织中，其中一小部分在HLA图谱中检测到29(扩展数据图。9和补充表格9).上述非抗原肽的检测与结合基序羧基端具有碱性氨基酸的HLA同种异型相关，因此，在这个小群体中，将这类新肽的呈递水平与T细胞浸润相关联是不可行的。

或者，我们定义了一组893个肿瘤相关基因，这些基因来源于规范和非规范来源，统称为TAAs，它们在至少一个肿瘤宏区中表达(> 1个百万分之一转录本(TPM))，但不在基因型-组织表达(GTEx)数据库中的任何非恶性组织中表达(保留GTEx表达≤1 TPM的基因，睾丸除外)，也不在任何邻近的健康宏区中表达(保留表达≤1 TPM的基因)(图)。6a扩展数据图。10和补充表格10).其中，在任何患者的至少1个宏观区域中，发现31个来源TAA由HLA-I呈递。呈递来源的TAA被定义为在各自的HLA-I免疫肽组中检测到的TAA，而非呈递来源的TAA是未被检测到的TAA，可能是由于表达过低或免疫肽组学分析的灵敏度有限而导致的不呈递。在所有患者中，肿瘤宏观区域中呈递源TAAs的表达高于邻近的健康宏观区域(图。6b)且高于非来源TAAs的表达(图。6c，d).此外，呈递源TAAs在CD3上表达更丰富+CD8+排除t细胞的肿瘤(图。6d)和来源TAA主要通过HLA-I复合物(Wilcoxon试验P= 1.7 × 10−8；图。6e).为了推断肿瘤呈递TAAs的倾向，我们通过用TAA基因表达和HLA-I表达水平(方法).值得注意的是，平均呈递效率在被分类为免疫低或CD3的肿瘤的宏观区域中更高+CD8+t细胞排除在外，而非吸烟者相对于炎症-高，CD3+CD8+t细胞浸润的样本和吸烟者(Wilcoxon试验P值分别为0.0041、0.045和0.27)(图。6f–h).这表明有限的免疫监测可能导致队列非吸烟者和CD3细胞中更具抗原性的免疫肽组景观+CD8+t细胞排除肿瘤，反之亦然，在吸烟者和浸润肿瘤。

a来自规范和非规范来源的肿瘤相关来源基因(n= 893个基因)，统称为TAAs，在任何肿瘤宏观区域中表达，但不在GTEx数据库(GTEx ≤ 1 TPM，睾丸除外)中表达，也不在Wilcoxon单侧检验定义的任何相邻健康宏观区域(≤ 1 TPM)中表达P= 2.22 × 10−16。多重比较未作任何调整。b,c在所有患者中，肿瘤宏观区域中呈递源TAAs的表达高于邻近的健康宏观区域(n= 29 TAAs)(b)和更高表达的非表达源TAAs(n= 31 TAAs)(c). d,e，呈现源TAA(n= 31个TAAs)在CD3上表达更丰富+CD8+t细胞排除的宏观区域(非呈现_排除:n= 148;已呈现_已排除:n= 45;非呈现_渗透:n= 86;呈现_渗透:n= 22;n指每个宏区域的聚集TAAs表达) (d)并主要由HLA-I复合物呈递(平均跨越n= 41 HLA-I对n= 43个HLA-II宏区；P= 1.7 × 10−8) (e). f–h在被指定为免疫低的肿瘤的宏观区域中，TAAs的呈递效率较高(n= 12个宏区域)对免疫高(n= 22个宏区域) (f)、不吸烟者(n= 17个宏观区域)与吸烟者(n= 17个宏区域) (g)和CD3+CD8+排除t细胞(n= 20个宏观区域)与渗透(n= 14个宏区域) (h)，与P值分别为0.0041、0.045和0.27。i来源TAA的热图仅出现在肿瘤宏观区域。非标准化测井2显示了DIA分析的(肽强度值)。所有统计检验均采用单侧Wilcoxon非参数检验。

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我们进一步保留了未发现存在于任何相邻健康宏区的TAA源，产生了14个HLA-I和4个HLA-II肽(图。6i).来自黑色素瘤相关基因家族来源MAGE-A1和MAGE-A4的10种HLA-I结合肽，已知在许多肿瘤类型中表达，但在除睾丸和胎盘之外的正常组织中不表达，主要在CD3中表达和呈递+CD8+排除t细胞的LUSC肿瘤(即02288和02289)，支持了之前的研究，该研究显示与LUADs相比，lusc中MAGE-A4的表达存在相关性30。MAGE-A4是最丰富表达和呈递的TAA，在4名患者中发现总共6种肽，主要在患者02288中。此外，我们在CD3的肿瘤宏区发现了一种新的肿瘤特异性非克隆肽+CD8+t细胞排除和非吸烟患者02287，来自LINC02261 lncRNA。

从HLA-I呈递热点中剔除新抗原

我们通过计算克隆突变(在所有宏观区域观察到)和亚克隆突变(在宏观区域的子集观察到)的患病率来定义肿瘤内异质性，并推断每个肿瘤的系统发育(图。7a)31。我们发现TMB、肿瘤中GrzB的表达和吸烟突变信号的检测呈正相关t-测试P值1.3 × 10−6和0.13；图。7b–d).此外，我们发现CD3+CD8+t细胞浸润(在患者03023、02672和02290中)以及吸烟突变特征(在患者02671、03023、02672和02290中)与较高比例的躯干突变显著相关(学生的t-测试P值分别为0.0066和0.019；图。7b、e、f).事实上，uksza等人最近证明了罕见的长期胰腺癌幸存者，他们在原发肿瘤中具有更强的T细胞活性，发展为具有更少遗传异质性和更少高质量免疫原性新抗原的复发性肿瘤，尽管有更多时间积累突变32。他们通过新抗原与其野生型肽相比区别结合HLA或激活T细胞所需的抗原距离以及与已知抗原的相似性来模拟新抗原的质量(图。7g).在我们的队列中，我们发现在两个浸润性高的患者03023和02672的躯干和私人突变中发现了新抗原质量的最显著差异，其中躯干突变的质量较低(图。7h–j和补充表格11).这些是新抗原介导的免疫编辑导致吸烟者躯干肿瘤的证据，与早期的结果一致33.

a系统发生树基于在每个患者的所有区域发现的所有高可信度突变。b标绘了每个患者的私有、共享和躯干突变的数量，并计算了每个患者的躯干突变比例(白色数字)。对于每个患者，基于mIF分析和确定的CD3的肿瘤亚区GrzB表达+CD8+显示t细胞浸润状态。根据八种不同突变信号的解卷积以及与Alexandrov等人已知突变信号的比较，确定吸烟状态。62吸烟签名的阈值大于50%。c,d，发现TMB和吸烟状况(吸烟者n= 24个宏观区域；不吸烟者:n= 26个宏观区域；片面学生的t-测试P= 1.3 × 10−6) (c)，以及肿瘤亚区域(吸烟者:n= 4名患者；不吸烟者:n= 4名患者；mIF，片面学生的t-测试P= 0.13) (d). e,f，发现更高比例的躯干(克隆)突变与吸烟状态显著相关(吸烟者:n= 4名患者；不吸烟者:n= 4名患者；片面学生的t-测试P= 0.019) (e)和CD3+CD8+t细胞浸润(浸润:n= 3名患者；排除:n= 5名患者；片面学生的t-测试P= 0.0066) (f). g，uksza等人预测的新抗原质量模型的示意图。32. h，每位患者的私有和躯干突变的新抗原质量评分分布(02287:n= 99/121;02288:n= 26/92;02289:n= 79/130;03421:n= 68/24;02290:n= 21/225;02671:n= 59/187;02672:n= 489中的38；03023:n= 32/191(私人新抗原/躯干新抗原)。i,j在排除的和浸润的肿瘤中，躯干的新抗原质量与私人突变之间的比率(排除:n= 5名患者；渗透:n= 3名患者；箱线图显示平均值) (i)，以及不吸烟者(n= 4名患者)和吸烟者(n= 4名患者) (j).除非另有说明，所有的统计检验都是按照单侧Wilcoxon非参数检验进行的，箱线图分别显示中位数(直线)、第25和第75个百分位数之间的IQR(箱线图)和1.5×上下四分位数的IQR。未对多次测试进行调整。

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通过挖掘ipMSDB(我们近年来在各种肿瘤和健康样本中获得的大量免疫肽组学数据库),我们以前观察到免疫原性突变新抗原在HLA-I呈递热点中积累34即，在免疫肽组学数据集中更频繁检测到的源蛋白质中的区域。因此，这些区域的体细胞突变比其他区域的突变或很少天然存在的蛋白质更有可能出现。我们的理论是，由于肿瘤进化过程中发生的免疫压力，在HLA-I呈递热点表达突变的细胞将更频繁地被清除。我们在计算机上预测了HLA-I新抗原与每个患者各自HLA-I同种异型的结合(等级< 2%)，并检查了每个预测的突变肽在ipMSDB中的HLA-I呈递热点中是否包含其确切的野生型对应肽(补充表11).我们在图2中举例说明了这个概念。8a。预测的新抗原覆盖EXOSC8E178K是一个“精确的”HLA-I呈递热点突变，而预测的新抗原IDH1K236N和IGFBP1H148YipMSDB中没有匹配的“精确”野生型肽。作为对照，我们对每个患者计算了涵盖同义变异的“精确”匹配的存在，因为这些变异预计不会受到免疫压力的影响(图。8a).CD3的“精确”非同义预测新抗原的比例更高+CD8+排除t细胞的肿瘤相对于浸润的肿瘤，而同义突变的比例没有差异(P分别= 0.001和0.8；图。8b，c).我们用每位患者的同义突变比例来标准化非同义突变比例，以消除与ipMSDB中患者HLA等位基因总体表现相关的任何固有偏差。“精确”匹配的标准化分数几乎达到显著性(图。8d).在吸烟者(患者02671、02290和03023，而不是02672)的肿瘤中检测到的“精确”非同义预测新抗原的比例明显低于不吸烟者(P= 2.3 × 10−8，图。8e)，而同义突变的比例没有发现差异(P= 0.14，图。8f).吸烟者中“精确”匹配的标准化分数仍然显著较低(P= 9.6 × 10−5，图。8g).这些结果表明，T细胞浸润肿瘤和吸烟者的过度免疫压力可能导致肿瘤在HLA-I呈递热点表达相对较少的新抗原。

a，EXOSC8E178K，一个“确切的”HLA-I呈递热点新抗原的例子。IDH1K236N和IGFBP1H148Y都是“非执行”的例子。b在ipMSDB中，具有非同义突变的预测新抗原与‘精确’野生型肽匹配的比例显著高于排除的(n= 31个宏观区域)n= 17个宏观区域)肿瘤(P= 0.001).c，当考虑具有同义突变的预测新抗原时，没有发现差异(P= 0.8,n就像b). d每个患者排除的非同义突变肿瘤与同义突变肿瘤中“确切”新抗原的富集(P= 0.054).e，非同义“确切”新抗原的比例在不吸烟者中明显较高(n= 24个宏观区域)比吸烟者(n= 24个宏观区域；由于缺乏新抗原，排除了两个宏观区域) (P =3.1 × 10−8). f，当考虑同义突变时没有发现差异(P= 0.2,n同上)。g吸烟者与不吸烟者相比，每位患者的显著富集(P= 4.3 × 10−6, n同上)。h，类似的富集在免疫-高(n= 38个样本)，-低(n= 52个样本)和混合(n= 46个样本)肿瘤1. i免疫标记的平均表达17在按吸烟状况分组的TRACERx队列中1(从不吸烟者:n= 11;戒烟者:n= 73;最近戒烟者:n= 48;当前吸烟者:n= 10;n指样品)。j，每个吸烟状态的富集度1. k，TRACERx群组重新分类(轻:n= 39;中级:n= 76;重度吸烟者:n= 21;n指样本)，考虑吸烟和包年的突变特征1. l，细化分类中的浓缩。m，诱导自发CD8的概率+t细胞对“精确”和“非精确”新抗原的反应使用Gartner等人的经验证的免疫原性突变队列计算35. n，用于计算每个宏观区域的相对免疫原性的参数。o我们八个病人的相对免疫原性。p,q不吸烟者的相对免疫原性较高(n= 24)对吸烟者(n= 24) (p)和在排除(n= 31)对浸润肿瘤(n= 17) (q), P= 2.3 × 10−8和0.001(n指宏观区域)。单侧Wilcoxon非参数检验用于b–g, p和q和片面学生的t-测试h–j和l。箱线图显示了中间值(直线)、第25和第75百分位之间的IQR(方框)和1.5倍IQR的上下四分位。没有进行多次测试调整。

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为了验证这些结果，我们首先分析了来自TRACERx肺癌队列的63名患者的样本，Rosenthal等人发表了WES和RNA-seq数据。1 (方法).最初，我们直接使用Rosenthal等人报告的免疫评分分类。1他也使用了Danaher等人的方法17来估计免疫细胞的数量。通过这个更大的数据集，我们再次发现，与高免疫评分肿瘤相比，被归类为低免疫评分肿瘤的新抗原“精确”匹配(非同义/同义的富集)比例更高(学生的t-测试P= 0.026;图。8h和补充表格12).此外，正如所料，T细胞耗尽了CD8+t细胞和细胞毒性细胞与这些患者的吸烟状况呈正相关(图。8i).值得注意的是，与吸烟者(学生)相比，不吸烟者的非同义/同义“精确”匹配更丰富t-测试P= 0.054;图。8j).此外，当我们根据累积吸烟严重程度将患者重新分类为“轻度吸烟者”、“中度吸烟者”和“重度吸烟者”时，考虑到吸烟的突变特征水平和吸烟包年数，我们发现在“轻度吸烟者”组(学生组)中非同义/同义“精确”匹配的富集程度明显更高t-测试P= 0.02;图。8k，l).