摘要 恶性肿瘤的生存高度依赖于其内在的自我防御途径，如癌症治疗过程中的热休克蛋白(HSP)。然而，精确地拆除自我防御来增强抗肿瘤的能力仍然是未知的。在这里，我们证明了纳米颗粒介导的瞬时受体电位香草素成员1 (TRPV1)通道阻断通过抑制热休克因子1 (HSF1)介导的双重自我防御途径加强了热免疫疗法。TRPV1阻断抑制高温诱导的钙内流和随后的HSF1核转位，这选择性地抑制应激过度表达的HSP70，以增强针对各种原发性、转移性和复发性肿瘤模型的热疗疗效。特别地，HSF1易位的抑制进一步抑制转化生长因子β (TGFβ)途径来降解肿瘤基质，这改善了抗肿瘤治疗剂(例如，抗PD-L1抗体)和免疫细胞向高度纤维化和免疫抑制性胰腺癌的渗透。结果，TRPV1阻断恢复了具有可根除肿瘤和免疫记忆效应的热免疫疗法。纳米粒子介导的TRPV1阻断代表了一种有效的方法来拆除有效的癌症治疗的自我防御。
介绍 肿瘤细胞固有的自我防御途径严重削弱了治疗效果 1 ,2 ,3 ，导致肿瘤复发转移频繁。例如，肿瘤细胞中的热休克蛋白(HSPs)在异常高温下被应激上调以修复细胞损伤，所述异常高温通常可由光热转换剂如硫化铜(CuS)基纳米粒子在光照射下提供 4 ,5 ,6 ,7 、或非热因素如氧化剂和自由基 8 ,9 ,10 ，而肿瘤中的转化生长因子β (TGFβ)途径通过肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的级联增殖和激活，诱导肿瘤中细胞外基质(ECM)的过度富集，导致抗肿瘤治疗的不可及性 11 ,12 进一步严重损害了常规治疗化合物对纤维化肿瘤如胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤的抗肿瘤功效，以及不可避免的肿瘤复发和转移 11 ,13 。尽管已经广泛研究了相关的小分子抑制剂来消除肿瘤的自我防御以提高治疗效果 14 ,15 ,16 这种化合物仍然具有严重的剂量限制性脱靶毒性，因为它们不加选择地抑制肿瘤中应激过度表达的蛋白质和健康组织中正常表达的蛋白质，这些蛋白质必然参与重要的细胞内事件，如HSPs辅助的蛋白质折叠校正和TGFβ介导的组织修复 3 ,8 。因此，探索一种特异性和有效的工具来选择性地消除肿瘤的自我防御对于安全地扩大癌症治疗仍然是迫切需要的。
瞬时受体电位香草素成员1 (TRPV1)通道作为一种钙渗透通道，参与多种病理生理过程(如温度和痛觉)，并可被多种物理化学刺激激活，如热(> 42℃)、低pH、刺激性化学物质和内源性伤害感受介质17 ,18 ,19 。此外，发现TRPV1通道在多种侵袭性肿瘤中过表达，包括乳腺、肺、肝细胞、结肠直肠和胰腺肿瘤，并且与肿瘤细胞的体外增殖、迁移和存活密切相关 20 ,21 ,22 。受观察到TRPV1通道与HSP70和TGFβ蛋白的表达相关的启发 18 ,23 ,24 我们推测TRPV1通道可能参与肿瘤治疗过程中肿瘤细胞自我防御行为的调节。
在这项工作中，我们表明纳米颗粒介导的TRPV1阻断通过有效调节热休克因子1 (HSF1)选择性抑制应激HSP70和TGFβ1，用于增强对高度恶性肿瘤的热免疫治疗。通过应用A549-TRPV1敲除(A549-TRPV1 KD)肿瘤模型和转录组分析，发现TRPV1阻断特异性阻断肿瘤高温时的钙内流，并导致HSF1核转位的明显抑制，从而选择性抑制应激过度表达的HSP70以逆转耐热性。此外，使用掺入吲哚菁绿(ICG)和TRPV1拮抗剂的聚合物胶束的肿瘤选择性TRPV1阻断产生了针对多种原发性肿瘤(例如，乳腺、肝脏、结肠直肠和胰腺肿瘤)、转移性肿瘤和光照下的复发性肿瘤的相当大的抗肿瘤效力，同时具有优异的安全性。更重要的是，这种TRPV1阻断对HSF1核转位的抑制明显减弱了TGFβ1对ECM的有效分解，从而改善了抗肿瘤治疗剂(例如抗PD-L1抗体、aPD-L1)和免疫细胞对高度纤维化和免疫抑制肿瘤(例如PDAC模型)的渗透，最终通过重新激活的免疫应答和减轻的免疫抑制实现了对皮下和原位肿瘤模型的协同热免疫治疗。这种纳米粒子介导的TRPV1阻断提供了一种新兴的范例，以消除肿瘤的自我防御，从而安全地扩大针对高度难治性肿瘤的癌症治疗。
TRPV1阻断或敲除增强热细胞毒性 为了产生用于癌症热疗的有效热疗，如前所述，构建了包裹硫化铜纳米晶体的白蛋白纳米颗粒(CuS-NCs)作为光热源 25 ,26 ，其具有7.8纳米的核尺寸和25.4纳米的流体动力学直径(补充图。 1a ).这些CuS-NCs表现出浓度依赖性的温度升高 ∼ 在近红外光照射下，在1.0 mM Cu的浓度下，在300 s内达到30 ℃,由于显著的近红外吸收，显示出引起高热的明显的光热转换能力(补充图。 1b，c ).为了评价TRPV1阻断对高温介导的CuS-NCs细胞毒性的影响，特异性TRPV1拮抗剂SB705498 27 ，应用于同时也用CuS-NCs处理的野生型A549 (A549-WT)细胞，随后在1.5 W cm下曝光5分钟 −2 以及随后使用MTT试验评估对A549-WT细胞的光细胞毒性。A549-WT细胞在与SB705498或CuS-NCs一起孵育后，在没有光照的情况下，其存活力保持相对不变(补充图。 2a，b ).然而，在CuS-NCs (0.2 mM)的高温下，sb 705498(0–20nm)显示出细胞毒性的浓度依赖性改善，与20 nM SB705498相比，40 nM SB705498没有引起细胞毒性的明显增加(补充图。 2c ).在随后的实验中，20 nM SB705498用于阻断TRPV1离子通道以增强热细胞毒性。在SB705498存在的情况下，CuS-NCs的高温具有IC 50 在光照下为0.25 mM，而IC明显增加 50 (0.39毫米)是在没有SB705498的情况下在光照下观察到的(图。 1a ).同时，还发现SB705498通过提高细胞培养温度来放大高温介导的细胞损伤(补充图。 2d ).这些结果表明SB705498介导的TRPV1阻断解释了热细胞毒性的显著改善。此外，5-乙炔基-20-脱氧尿苷(EdU)染色，其经常用于通过监测绿色荧光来检测处于S期的增殖细胞 28 以验证SB705498介导的TRPV1阻断改善CuS-NCs的热细胞毒性的能力。在无光照条件下，无论是否联合SB705498，CuS-NCs对A549-WT细胞增殖均无损伤(补充图。 3 ).相反，在光暴露后，SB705498明显促进了基于高温的细胞毒性，这由最低的绿色荧光强度所证明，揭示了在S期较少增殖的细胞(补充图。 3 ).因此，SB705498介导的TRPV1阻断显著改善了高温时的热细胞毒性。
图1: TRPV1的阻断或敲除通过阻断Ca来增强热疗效果 2+ 流入和抑制HSF1核转位抑制应激HSP70上调。 a 在SB705498存在或不存在的情况下，CuS-NCs的高温对A549-WT细胞的热细胞毒性( n = 3个生物重复)。 b 稳定转染的A549-TRPV1敲除细胞(A549-TRPV1 KD)的荧光图像和TRPV1表达。比例尺，100 μm c 光照射下CuS-NCs热疗对A549-WT和A549-TRPV1 KD细胞的热毒性作用( n = 3个生物重复)。 d TRPV1阻断与肿瘤部位热疗的协同机制示意图。TRPV1阻断有效地抑制钙内流，该钙内流在高温时诱导热休克因子1 (HSF1)转移到细胞核中，导致选择性抑制应激HSP70，以解除肿瘤细胞的自我防御，从而获得更好的热疗效果。虚线表示下游信号转导的失败。钙 2+ 流入成像(红色) ( e )、CLSM HSF1(红色) ( f )和HSP70(红色) ( g )在存在或不存在SB705498或EGTA的情况下，经或不经来自CuS-NCs的高温处理的A549-WT和A549-TRPV1 KD细胞中。比例尺，100 μm h 在光暴露下，在注射CuS-NCs后24小时，携带皮下A549-WT和A549-TRPV1 KD肿瘤的小鼠的肿瘤部位的温度升高。插图是照射期间5分钟时小鼠的红外热像图(颜色条，低表示15°C，高表示50°C)。 i 携带皮下A549-WT和A549-TRPV1 KD肿瘤的小鼠的肿瘤体积，所述肿瘤经来自CuS-NCs的高温治疗以及瘤内注射SB705498或不注射sb 705498( n =每组5只小鼠)。 j 来自A549-WT或A549-TRPV1 KD荷瘤小鼠的肿瘤切片中的HSP70(红色)和TUNEL染色(红色)的CLSM图像，所述荷瘤小鼠用来自CuS-NCs的高温以及瘤内注射SB705498或不注射sb 705498进行治疗。比例尺，50 μm。数据表示为平均值±SD( a , c , i ).用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。的实验 b , e , f , g ，以及 j 独立重复了三次，结果相似。源数据作为源数据文件提供。
为了验证TRPV1阻断与高温的协同作用，我们使用带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的TRPV1 shRNA建立了稳定的A549-TRPV1敲除(A549-TRPV1 KD)细胞。如图所示。 1b 和补充图。 4 超过90%的细胞是GFP阳性的，并且在A549-TRPV1 KD细胞中TRPV1的表达水平明显低于A549-WT细胞，证实了TRPV1的有效敲低。然后，MTT分析显示来自CuS-NCs的高温具有1.7倍高的IC 50 A549-WT细胞中的值为0.35 mM，而A549-TRPV1 KD细胞中的值为0.20 mM(图。 1c ).然而，在A549细胞中TRPV1离子通道的过度表达大大降低了CuS-NCs与IC的热细胞毒性 50 值为0.45毫米(补充图 5a、b ).这些结果表明，肿瘤细胞中TRPV1的敲低明显促进了热细胞毒性。因为A549-WT和A549-TRPV1 KD细胞对CuS-NCs的细胞摄取相似(补充图。 5c )，肿瘤细胞中TRPV1通道的敲除合理地参与了增强高温介导的热细胞毒性。
TRPV1阻断通过阻断Ca而增强热细胞毒性 2+ 流入和抑制随后的HSF1核转位介导的应激HSP70上调 由于TRPV1阻断有效地协同热疗效，我们进一步探索了SB705498作为TRPV1拮抗剂逃避热耐受性的机制。TRPV1通道作为一种温度敏感的钙离子通道，控制钙内流，参与细胞内信号转导 17 ,18 。因此，我们假设Ca 2+ 内流可能在热疗中起重要作用，这可能与HSF1核移位和随后的应激性HSP70上调有关(图。 1d 29 ,30 ,31 。为了清楚地观察Ca的流入 2+ 经过各种处理后，红色荧光Ca 2+ -结合染料(钙氟 铥 Rhod-4，AM)。来自CuS-NCs的高温引起细胞内钙的急剧增加 2+ 在A549-WT细胞中，如显着提高的红色荧光强度(是PBS组的7.9倍)所示，而发现SB705498阻断TRPV1或TRPV1敲除明显抑制这种细胞内Ca 2+ 增加(图。 1e 和补充图。 6a ).为了进一步验证Ca是否 2+ 内流依赖于细胞外钙 2+ 我们利用了细胞外Ca 2+ 螯合剂，乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，用于清除细胞外钙 2+ 在介质中。显然，清除细胞外钙 2+ 导致可忽略的红色荧光的增加，表明Ca的特异性依赖性 2+ 细胞外钙内流 2+ (图。 1e 和补充图。 6a ).此外，流式细胞仪分析细胞内钙离子的红色荧光 2+ 使用钙氟磷 铥 Rhod-4，AM探针进一步证实了TRPV1阻断或敲除抑制Ca的能力 2+ 流入量(补充图。 6b，c ).因此，高温敏感地激活TRPV1通道介导的Ca 2+ 流入量(图。 1d )，这明显不利于热细胞毒性，而这Ca 2+ TRPV1阻断也能有效抑制内流。
我们进一步证明了Ca的影响 2+ 使用MTT测定法研究CuS-NCs的热细胞毒性，其中作为钙清除剂的无毒EGTA在2.0 mM的剂量下引起ic 50 CuS-NCs在高温下的直径约为0.24毫米(补充图。 7 )，优于单独热疗的细胞毒性(~0.35 mM)。因此，清除细胞外钙 2+ 使用EGTA表现出与无毒SB705498相似的行为，如图所示。 1a 。之后，EdU染色进一步揭示，与光暴露下单独的高温相比，在EGTA存在下的高温对细胞增殖产生了更好的抑制作用(补充图。 8 )，确认阻止Ca 2+ 通过TRPV1通道的流入能够增强热细胞毒性。
然后用流式细胞仪检测不同处理下A549-WT细胞的凋亡情况。CuS-NCs介导的高温单独引起62.3%的凋亡水平，而有效抑制Ca 2+ 通过TRPV1拮抗剂SB705498或钙螯合剂EGTA的流入导致高温下CuS-NCs在光照下的凋亡明显增加(75.2%)(补充图。 9 )，表明高温激活的Ca 2+ 内流明显损害热疗效率。此外，western blot还用于验证凋亡行为，与单独高温下相比，在CuS-NCs介导的高温下，当与SB705498、EGTA或TPRV1敲除组合时，A549-WT细胞观察到裂解的胱天蛋白酶-3的表达增强(补充图。 10 ).值得注意的是，TRPV1阻断协同热细胞毒性并促进肿瘤细胞凋亡 通过 有效阻断Ca 2+ 涌入。
为了进一步阐明由抑制Ca引起的协同机制 2+ 高热时的内流，其中Ca 2+ 推测与细胞热休克反应有关，包括热休克转录因子1 (HSF1)转位入核，以及应激HSP70的随后转录和最终翻译 29 ,32 。因此，我们应用免疫荧光染色来评估TRPV1阻断在CuS-NCs引起的高温下干扰肿瘤细胞的核内HSF1易位和细胞内HSP70表达的作用。单独的高温导致HSF1明显的核易位，HSF1和核的共定位率为84.6%(图。 1f 和补充图。 11a )，以及随后A549-WT细胞中HSP70的过表达(图。 第一代 和补充 11b )，表明高温特异性激活应激HSP70表达。同时，发现SB705498共孵育或TRPV1敲除明显阻断HSF1核易位，共定位率为24.4%和35.6%(图。 1f 和补充图。 11a )，并抑制高温下应激性HSP70上调，这由与核内HSF1和细胞内HSP70水平相关的几乎不变的荧光信号所证明(图。 第一代 和补充图。 11b )，分别为。特别是验证是否封锁了Ca 2+ 内流抑制了HSF1的转移和热休克蛋白70的上调，EGTA (2.0 mM)也用于清除钙 2+ 在介质中。EGTA明显抑制了高温下光照射下CuS-NCs引起的A549-WT细胞中HSF1的核内转运和应激HSP70的上调(图。 1f，g 和补充图。 11 )，类似SB705498的行为。此外，TRPV1阻断抑制HSF1核内转运的能力和随后高温下应激性HSP70上调也用western blot进行了验证。TRPV1阻断和敲除都导致了核内HSF1表达的有效减少，与单独接受高温的来自CuS-NCs的A549-WT细胞相比(补充图。 12 )，解释了应激HSP70的有效下调(补充图。 13 ).这些结果证明了TRPV1阻断或敲除抑制HSF1核内转运的能力，从而下调应激HSP70，最终协同热疗。
TRPV1的阻断或敲除有效地增强了体内的热疗效果 为了研究SB705498介导的TRPV1阻断对体内热疗效力的协同效应，将A549-WT细胞或A549-TRPV1 KD细胞皮下注射到裸鼠中，以分别建立A549-WT肿瘤或A549-TRPV1 KD肿瘤模型。值得注意的是，具有大约7.2% ID g的相似肿瘤累积 −1 在携带A549-WT或A549-TRPV1 KD肿瘤的小鼠中注射后24小时(补充图。 14 )，剂量为30.0摩尔千克的CuS-NCs −1 注射后24小时，在光照下，铜导致A549-WT和A549-TRPV1 KD肿瘤在5分钟内温度升高(δT)约12.8°C和约12.6°C(图。 1h 和补充图。 15 )，表明CuS-NCs在两种肿瘤模型中引起相似的高温。
为了触发体内热疗，将CuS-NCs以30.0 mol kg的剂量静脉注射到带有皮下A549-WT和A549-TRPV1 KD肿瘤的小鼠中 −1 ，然后将小鼠暴露于785 nm光照射下(5分钟，1.5 W cm −2 )在注射后24小时。同时，SB705498 (1.0毫克千克 −1 )在照射前30分钟进行肿瘤内注射，用于在A549-WT肿瘤模型中诱导TRPV1阻断，随后在注射后30天内监测肿瘤体积(补充图。 16 ).PBS组中携带A549-WT肿瘤和A549-TRPV1 KD肿瘤的小鼠表现出相似的肿瘤生长曲线，在30天内增加了约15.0倍(图。 1i 和补充图。 17a )，证明TRPV1通道本身在非高温条件下对肿瘤生长没有影响。很可能，TRPV1敲除对肿瘤生长的可忽略的影响可能源于相对较短的监测期 33 。有趣的是，在CuS-NCs的高温下，A549-WT肿瘤被迅速消融，但随后在照射后14天显示明显的复发(图。 1i 和补充图。 17a )，表明由于肿瘤细胞对热疗的抗性，单独热疗难以根除肿瘤 34 。重要的是，在TRPV1阻断或敲除后，CuS-NCs的高温完全消除了肿瘤，没有任何复发和可忽略的体重变化(图。 1i 和补充图。 17 )，这通过针对肿瘤的严重组织学损伤和通过苏木精-伊红(H&E)染色和Ki67染色对细胞增殖的有效抑制得到进一步证实(补充图。 18 ).特别地，TRPV1阻断和敲除都引起了相似的协同能力，证实了TRPV1阻断在对抗癌症热疗中的耐热性中起着至关重要的作用。此外，在没有光照的情况下，CuS-NCs对两种肿瘤模型中的肿瘤生长也没有影响(图。 1i 和补充图。 17a–c )，表明来自光活化CuS-NCs的热疗确保了针对肿瘤细胞的选择性热疗。
接下来，我们使用免疫荧光染色研究了高温下A549-WT和A549-TRPV1 KD肿瘤模型中应激HSP70的体内表达。对于单独的CuS-NCs介导的高温，观察到来自肿瘤切片的HSP70表达的明显红色荧光，其明显高于没有高温时的荧光，表明高温后在肿瘤处体内产生了应激HSP70(图。 1j ).重要的是，使用SB705498或TRPV1敲除的TRPV1阻断有效地抑制了肿瘤切片的体内应激HSP70表达，同时对正常表达的HSP70没有明显影响(图。 1j ).这表明TRPV1阻断特异性抑制肿瘤部位应激HSP70的体内表达。TUNEL染色也用于评估热疗中TRPV1阻断对A549-WT和A549-TRPV1 KD肿瘤模型的体内损伤的影响。在没有高温的情况下，观察到TRPV1敲低的可忽略的红色荧光，表明TRPV1通道本身对肿瘤细胞凋亡无毒性(图。 1j ).有趣的是，如增强的红色荧光所证实的，单独的高温在肿瘤切片处引起明显的凋亡行为，而SB705498或TRPV1敲低进一步放大了由高温引起的肿瘤切片处的凋亡水平(图。 1j ).SB705498介导的TRPV1阻断通过阻断Ca而增强热疗损伤 2+ 限制HSF1核转位和应激HSP70过表达的流入(图。 1d
转录组分析揭示了TRPV1阻断和热疗之间的潜在协同作用 为了彻底研究TRPV1阻断对热疗的影响，在用CuS-NCs介导的热疗和SB705498治疗后，对A549-WT细胞进行转录组分析。根据主成分分析和聚类分析，与PBS相比，发现高温和TRPV1阻断的组合有23个上调基因和30个下调基因(图。 2a P < 0.05 and fold change ≥ 2). As shown in Fig. 2b 与PBS相比，对于TRPV1与高温的协同作用，观察到负责调节下游基因表达的4932个初级转录物的明显差异。此外，基因本体论(GO)分析显示，这53个明显可变的基因与生物过程、分子功能和细胞组成密切相关(图。 2c ).其中，那些与结合相关的基因可能负责癌细胞凋亡和迁移，揭示了TRPV1阻断协同热疗的强大能力。在图。 2d ，使用检索相互作用基因/蛋白质(STRING)网络分析的搜索工具来确定不同的蛋白质-蛋白质相互作用，发现六种类型的功能蛋白质主要涉及细胞钙离子稳态、细胞热响应、细胞分化、蛋白质代谢过程和凋亡过程的调节。此外，京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径分析表明，这些可变基因与几种特定的细胞内途径特别相关，包括与外部高温刺激相关的Nrf2介导的氧化应激反应 35 p53信号传导 36 上皮-间质转化(EMT)途径的调节和与肿瘤迁移密切相关的基质金属蛋白酶的抑制 37 ,38 ，表明TRPV1阻断有效调节细胞凋亡并潜在地抑制肿瘤转移(图。 2e ).因此，转录组分析表明TRPV1阻断和热疗之间的协同作用与凋亡、迁移和转移高度相关。
图TRPV1阻断与热疗协同作用的转录组分析。 a 在剂量为20.0 nM SB705498( n = 3，倍数变化≥ 2，且 p < 0.05). b PBS和TRPV1阻断协同热疗之间的可变初级转录物的数量。 c 基因本体(GO)分析与PBS和TRPV1阻断协同热疗之间的生物过程(红色字体)、细胞成分(蓝色字体)和分子功能(紫色字体)相关的可变基因。 d 检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具(STRING)PBS和TRPV1阻断协同热疗之间功能性相互作用网络的算法分析。 e 经TRPV1阻断协同热疗处理的A549-WT细胞中可变基因的京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径分析。测量重复3次。统计显著性由双尾学生的 t 测试( a )和双尾费雪精确检验( e ).原始RNA测序数据已经以登录号GSE199299保存在基因表达综合数据库中。
用于选择性TRPV1阻断协同热细胞毒性的TRPV1拮抗剂的纳米颗粒介导的靶向递送 如上所述，通过肿瘤内TRPV1拮抗剂(SB705498)与CuS-NCs触发的热疗的组合，TRPV1阻断被鉴定为诱导增强的癌症热疗。为了实现TRPV1拮抗剂与热疗的合理协同作用，我们因此使用聚乙二醇构建了装载ICG/SB705498的聚合物胶束(IS-胶束，药物装载效率分别为7.5% ICG和5.0% SB705498) 114 -b 聚己内酯 60 (PEG 114 -PCL 60 )作为载体 39 ,40 ，预期其通过静脉注射将TRPV1拮抗剂和光热ICG同步共递送到肿瘤中(图。 3a ).IS-胶束的透射电子显微镜(TEM)直径约为42.8纳米，流体动力学直径约为75.6纳米(图。 3b )，分别为。载有ICG的聚合物胶束(在TEM中直径为43.2 nm的I-胶束，补充图。 19 )作为对照组，只进行热疗。为了证实IS-胶束产生高温的能力，在光照(785 nm，1.5 W cm)下监测温度升高5分钟 −2 ).这些胶束表现出明显的浓度依赖性温度升高(图。 3c )，合理地归因于其22.7%的高光热转换效率(补充图。 20 ).此外，IS-胶束在pH 7.4时表现出相对低的SB705498释放，而在pH 6.5和5.5时观察到SB705498从IS-胶束中的释放增加，这是由于SB705498在酸性pH下的溶解度增加(图。 三维（three dimension的缩写） )，从而有助于肿瘤微环境可激活的释放以有效阻断TRPV1。
图3:使用聚合物胶束共递送TRPV1拮抗剂和光热剂实现了TRPV1阻断协同的热细胞毒性。 a 使用IS-胶束靶向递送TRPV1拮抗剂(SB705498)和光热剂(ICG)的示意图，随后是pH响应性药物释放和ROS介导的TRPV1拮抗剂的胞质移位，以促进TRPV1阻断，用于协同热疗。虚线表示阻断高温激活的TRPV1通道后下游信号转导的失败。 b 动态光散射法测定IS-胶束的粒径分布。插图是is胶束的透射电子显微镜(TEM)图像。比例尺，100纳米。 c 浓度为2.0、5.0、10.0和25.0克/毫升的IS胶束的升温曲线 −1 曝光下的ICG。 d SB705498在pH 7.4、6.5和5.0下从IS-胶束中的释放曲线( n = 3个独立实验)。 e 在光照(+) (n = 3个生物重复)下，IS-胶束和I-胶束对4T1-Luc细胞的热细胞毒性。CLSM图像( f )和相应的荧光强度分析( g )在用I-胶束或IS-胶束处理的4T1-Luc肿瘤细胞中的EdU(绿色)在光照射或不光照射下( n = 3个独立实验)。比例尺，50 μm h 在有或没有光照射的情况下，用I-胶束或IS-胶束处理的4T1-Luc肿瘤细胞中的HSF1(红色)的CLSM图像。比例尺，50 μm。CLSM图像( i )和相应的荧光强度分析( j )的HSP70(红色)在用I-胶束或IS-胶束处理的4T1-Luc肿瘤细胞中的表达( n = 3个独立实验)。比例尺，100 μm。代表性流式细胞仪点图( k )和凋亡水平( l )在光照射下或不使用膜联蛋白V-FITC/PI染色用I-胶束或IS-胶束处理的4T1-Luc肿瘤细胞中( n = 3个生物重复)。数据表示为平均值±标准差( d , e , g , j , l ).用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。的实验 b , c , f , h ，以及 i 独立重复了三次，结果相似。源数据作为源数据文件提供。
然后，我们评估了4T1-Luc三阴性乳腺癌(TNBC)细胞对IS-胶束的细胞摄取，这些细胞具有与A549-WT细胞相似的TRPV1通道表达水平(补充图。 21 ).IS-胶束通过网格蛋白介导的内吞途径表现出对ICG的时间依赖性摄取，如氯丙嗪治疗后细胞对ICG的摄取减少所证明(补充图。 22 ).特别是，我们使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步评估了IS-胶束的细胞内分布。观察到IS-胶束与溶酶体的共定位率为94.8%，但在光照下，由于溶酶体膜破裂和随后的细胞质易位，共定位率降至18.9%(补充图。 23 ).合理地说，活性氧物种(ROS)从IS-胶束中的有效产生是溶酶体膜破裂的原因，这可以通过IS-胶束在光照下孵育后二氢乙锭(DHE)染色清晰的红色荧光来证实(补充图。 24a ).此外，使用吖啶橙(AO)染色进一步证实了IS-胶束破坏溶酶体膜的能力，在光照下溶酶体中的红色荧光完全消失(补充图。 24b ).为了验证IS-胶束阻断TRPV1的能力，我们首先使用Fluo-8来监测细胞内Ca 2+ 使用CLSM累计。显然，在光照射下，由于Ca的抑制，IS-胶束显示出比I-胶束低得多的绿色荧光信号 2+ 通过TRPV1阻断的流入(补充图。 25 ).因此，有效的细胞摄取、细胞质转移和pH响应性释放潜在地促进了SB705498从IS-胶束进入TRPV1通道以有效阻断TRPV1。
为了证实从IS-胶束中阻断TRPV1以协同热疗的能力，通过MTT试验用IC评估了热细胞毒性 50 关于 ∼ 6.8克毫升 −1 和 ∼ 8.4克毫升 −1 对于IS-胶束和I-胶束(图。 3e 和补充图。 26 )，分别为。EdU染色进一步表明，在光照下，与I-胶束相比，IS-胶束对细胞增殖具有更好的抑制作用(图。 3f，g ).此外，我们应用HSF1和热休克蛋白表达的免疫荧光染色来验证靶向共递送策略是否能有效克服热疗过程中的耐热性。显然，对于在光照射下来自I-胶束的高热，观察到核中HSF1的可忽略的红色荧光，而作为对照的I-胶束显示了由于缺乏TRPV1阻断，HSF1明显的细胞质易位到核中(图。 3h )，从而导致应激HSP70的明显上调(图。 3i，j ).相比之下，通过TRPV1拮抗剂的有效共递送，IS-胶束组中的肿瘤细胞与PBS相比，在辐射后没有显示出HSP70表达的明显变化(图。 3i，j )，表明IS-胶束能够通过有效的TRPV1阻断来阻断应激HSP70的过度表达，从而克服耐热性。此外，流式细胞仪通过膜联蛋白V-FITC/PI染色评估细胞凋亡行为。IS-胶束导致约71.7%的细胞凋亡，与单独使用高温的I-胶束(59.4%)相比，显示出更好的热细胞毒性(图。 3k升 )，这也通过HSP70表达降低和蛋白质印迹中裂解的胱冬酶-3明显上调得到证实(补充图。 27 ).这些数据清楚地表明，IS-胶束的共递送策略成功地促进TRPV1阻断，以克服耐热性，从而通过改善SB705498对TRPV1通道的可及性来增强其热细胞毒性。
TRPV1阻断协同热疗通过靶向递送IS-胶束产生对原发性、转移性和复发性TNBC肿瘤的体内抑制 为了证明IS-胶束对TNBC的协同抗肿瘤功效，我们首先通过静脉注射7.5 mg kg剂量的IS-胶束来评估它们在带有原位4T1-Luc乳腺肿瘤的小鼠中的生物分布 −1 ICG和5.0毫克千克 −1 SB705498。IS-胶束和I-胶束都表现出有效的肿瘤生物分布 ∼ 2.6%内径g −1 注射后24小时在肿瘤部位(图 4a )，说明在光照下大约13.0°C的可比高温(图。 4b 和补充图。 28 ).然后，我们通过肿瘤细胞膜染色，使用一级抗评估了IS-胶束在体内肿瘤中的微分布 N -钙粘蛋白第一抗体和Alexa Fluor 488缀合的第二抗体。观察到IS-胶束在肿瘤基质和细胞内空间的均匀分布(补充图。 29 )，证实TRPV1拮抗剂和光热剂深入且均匀地渗透到肿瘤中。此外，我们使用血小板和内皮细胞粘附分子1 (PECAM-1)第一抗体和Alexa Fluor 488缀合的第二抗体通过免疫荧光染色研究了IS-胶束的渗透深度。在小的4T1肿瘤(~75 mm)中，IS-胶束表现出相当大的外渗和~100微米的深穿透深度 3 )由于它们合适的尺寸分布(补充图。 30 ).由于高渗透性4T1肿瘤中有丰富的血管 41 在大的4T1肿瘤(~250 mm)中，IS-胶束仍然表现出均匀且深的渗透 3 )，与小4T1肿瘤中的IS-胶束相当(补充图。 30 ).
图4: TRPV1阻断协同热疗使用IS-胶束有效抑制原发性、转移性和复发性TNBC肿瘤。 a 注射后24小时I-胶束和IS-胶束在原位4T1-Luc肿瘤中的生物分布( n =每组3只小鼠)。 b 在光照射下注射I-胶束或IS-胶束后24小时，携带原位4T1-Luc肿瘤的小鼠的肿瘤部位的温度升高。生物发光图像( c )，相对肿瘤体积( d )和肿瘤重量( e )在21天期间，在光照(+)或不光照的情况下用IS-胶束或I-胶束治疗的带有原位4T1-Luc肿瘤的小鼠( n =每组5只小鼠，颜色条，低代表1000 a.u .，高代表30000 a.u .)。生物发光图像(上)，健康和环境图像(下) ( f )和相对生物发光强度( g )如中所示，在实验结束时具有原位4T1-Luc肿瘤的小鼠的肺转移 c (n =每组5只小鼠，颜色条，低代表100 a.u .，高代表800 a.u .)。黑色虚线标记的区域表示转移区域。比例尺，2毫米 h 手术失败的复发性TNBC肿瘤模型的治疗时间表。生物发光图像( i )和肿瘤重量( j )对患有原位4T1-Luc乳腺肿瘤的小鼠进行初始手术治疗，随后分别用光照(+)下的IS-胶束、光照(+)下的I-胶束和DOX( n =每组5只小鼠，颜色条，低代表1000 a.u .，高代表30000 a.u .)。生物发光图像(左)，H&E图像(右) ( k )和相对生物发光强度( l )在实验结束时小鼠的肺转移，如中所示 i (n =每组5只小鼠，颜色条，低代表100 a.u .，高代表800 a.u .)。黑色虚线标记的区域表示转移区域。刻度条，2 mm。数据表示为平均值±SD( a , d , e , g , j , l ).用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。源数据作为源数据文件提供。
为了探索TRPV1阻断与热疗的体内协同作用，将IS-胶束以7.5mg/kg的单剂量施用到原位4T1-Luc乳腺肿瘤携带小鼠中 −1 ICG和5.0毫克千克 −1 SB705498，随后曝光(785 nm，1.5 W cm −2 )5分钟，随后在注射后21天内测量肿瘤体积。无论光照与否，观察到PBS的肿瘤体积增加了约47.5倍，并且未经照射的IS-胶束和I-胶束组中的小鼠也显示出与PBS相似的肿瘤生长，这通过它们的生物发光图像得到了验证(图。 4c，d ).重要的是，IS-胶束导致肿瘤完全根除，并且在照射后没有任何再生长，而单独使用高温的I-胶束显示肿瘤体积增加了约14.9倍，这是因为在注射后7天肿瘤快速复发(图。 4c，d ).此外，实验结束时小鼠的肿瘤重量进一步证实了与I-胶束相比，IS-胶束具有更好的抗肿瘤功效(图。 4e ).值得注意的是，TRPV1阻断策略显示了在肿瘤处照射IS-胶束时根除高温存活的肿瘤细胞的明显优势。为了进一步证实由TRPV1阻断与热疗的协同作用引起的肿瘤损伤，在照射后6小时收集遭受不同治疗的4T1-Luc乳腺肿瘤，用于随后的组织学、Ki67和TUNEL染色。在光照下，与I-胶束相比，IS-胶束表现出更严重的组织学损伤、更少的细胞增殖和更好的细胞凋亡(补充图。 31 ).
特别地，在该实验结束时，同时观察到肺中4T1-Luc转移结节的生物发光。由于有效根除了原发性肿瘤，IS-胶束完全根除了肺中的转移性结节，而I-胶束导致了肺中源自原位4T1-Luc肿瘤的显著转移性结节(图。 4f，g ).此外，进一步应用H&E染色来验证其通过I-胶束治疗对肺中转移结节的有效抑制，而对于I-胶束仍观察到少量转移结节(图。 4f，g ).显然，TRPV1阻断在产生对远端转移结节的有效抑制中起着至关重要的作用，所述远端转移结节源于它们参与EMT途径的调节(图。 2e )，尽管IS-胶束仅在原发肿瘤处发挥局部热疗作用。
受IS-胶束显著的热疗效果的启发，我们进一步评估了它们对患有术后失败的原位TNBCs的抗肿瘤效果。简而言之，应用外科切除来消融原位4T1-Luc乳腺肿瘤以提供最初的外科治疗。然后，在手术后7天，以7.5 mg kg的单剂量释放游离阿霉素(DOX)、I-胶束和IS-胶束 −1 DOX，7.5毫克千克 −1 ICG，或5.0毫克千克 −1 SB705498通过静脉注射给药，以提供针对复发肿瘤的术后化疗或热疗(图。 4h )，分别为。手术切除后，除了作为对照的PBS之外，在所有治疗组中观察到可忽略的生物发光，证明原位肿瘤的成功手术切除(图。 4i )，但在术后7天有明显的肿瘤复发。与单独手术切除相比，发现来自DOX的化疗抑制了复发肿瘤的生长，然而，肿瘤生长仍然具有侵袭性。重要的是，与单独来自I-胶束的热疗相比，来自I-胶束的TRPV1阻断协同热疗导致了对复发肿瘤的有效抑制，这由实验结束时生物发光信号和肿瘤重量的降低所证明(图。 4i，j )，进一步验证了TRPV1阻断和热疗之间的明显协同作用。使用组织学、Ki67和TUNEL染色，还在化疗后或辐射后6小时评估了IS-胶束对复发肿瘤的光热损伤。与I-胶束和DOX相比，IS-胶束在光照下显示出更严重的肿瘤细胞损伤、更少的细胞增殖和增强的肿瘤细胞凋亡(补充图。 32 ).
我们还观察到在该实验结束时，IS-胶束对源自这些复发性乳腺肿瘤模型的转移性肺结节的影响(图。 4k，l ).IS-胶束明显抑制肺中的转移结节，而单独来自I-胶束的高温显示更明显的肺转移。相反，与PBS组相比，来自DOX的额外化疗未能产生任何抗转移效果(图。 4k，l ).此外，H&E染色进一步证实，与额外的热疗或化疗相比，在肺中具有检测不到的转移结节的IS-胶束具有更好的和有效的抗转移作用(图。 4k ).这些结果表明TRPV1阻断协同热疗预防肿瘤转移的有效性。
为了进一步阐明IS-胶束防止肿瘤转移和光暴露后复发的机制，应用细胞创伤划痕试验来评价不同处理后肿瘤细胞的转移能力，其中作为对照的PBS组中的4T1肿瘤细胞在两个分离的细胞群之间表现出最小的距离，这意味着内在的转移能力。照射后，与I-胶束相比，IS-胶束导致肿瘤细胞的迁移减少，揭示了来自IS-胶束的TRPV1阻断和高温协同地有助于明显减少细胞转移的发生(补充图。 33 )，可能是由于TRPV1阻断协同热疗参与了转移相关的EMT途径(图。 2e ).因此，IS-胶束通过TRPV1阻断介导的对HSP70上调和光暴露下细胞迁移的抑制，产生针对原发性、转移性和复发性肿瘤的优选热疗效力。
TRPV1阻断通过选择性抑制应激过度表达的HSP70而不损伤正常组织，从而具有优异的安全性 正常表达的HSP70作为一种重要的、不可或缺的分子伴侣，确保蛋白质的准确折叠，从而维持细胞内的稳态以抵御外界刺激 1 。为了研究TRPV1阻断的安全性，使用抗HSP70第一抗体和Alexa Fluor 594缀合的第二抗体，应用免疫荧光染色来评估健康组织中HSP70的表达，并应用常规HSP70抑制剂MKT-077和ICG共包封胶束(IM-胶束)作为对照 42 。简而言之，将IS-胶束和IM-胶束以5.0mg/kg的单剂量静脉注射到健康小鼠体内 −1 SB705498或MKT-077，随后CLSM观察HSP70在不同组织中的表达。显然，在注射后24小时，由于使用MKT-077对HSP70的非选择性抑制，IM-胶束引起多种健康组织中HSP70表达的显著降低，而与PBS组相比，IS-胶束对所有健康组织中正常表达的HSP70表现出可忽略的影响，这是由于通过TRPV1阻断介导的HSF1核转位的抑制，选择性下调了应激HSP70(图。 5a–e )，这也通过荧光强度分析进行了验证(图。 5f ).因此，由于对正常表达的HSP70的影响可以忽略不计，IS-胶束可能比IM-胶束具有更好的安全性，显示了安全和选择性抑制应激过度表达的HSP70的新兴潜力。
图5: TRPV1阻断提供了优异的安全性，而不干扰健康组织中正常表达的HSP70。 HSP70 (Alexa Fluor 594标记的抗HSP70抗体，红色)在非癌组织的不同切片中的CLSM图像，包括心脏( a )，肝脏( b )，脾脏( c )，肺( d )，肾( e )，以及相应的荧光强度分析( f )在以5.0毫克千克的剂量注射IS-胶束或IM-胶束后24小时 −1 SB705498或5.0毫克千克 −1 MKT-077(等于7.5毫克千克 −1 ICG)使用免疫荧光染色( n = 3个独立实验)。比例尺，100 μm g 心脏功能标记(CK和乳酸脱氢酶)、肝功能标记(碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶)和肾功能标记(尿素和肌酸酐)的血液水平用5.0毫克/千克处理 −1 sb 705498(IS-胶束)或MKT-077(IM-胶束)在注射后3天( n = 3个生物重复)。 h 静脉注射5.0毫克/千克后3天小鼠正常组织的H&E图像 −1 sb 705498(IS-胶束)或MKT-077(IM-胶束)。黄色箭头表示组织学损伤，例如不同组织中的纤维化和肾脏中的肾小管稀释。比例尺，200 μm i 静脉注射5.0毫克/千克后小鼠的体重 −1 sb 705498(IS-胶束)或MKT-077(IM-胶束)在22天内( n =每组5只小鼠)。 j 与导致正常表达的HSP70不可避免的降解并伴有严重毒性的IM-胶束(左)相比，使用IS-胶束(右)的TRPV1阻断介导的对健康细胞正常表达的HSP70无干扰的优越安全性的示意图。数据表示为平均值±标准差( f , g , i ).用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。的实验 a –e ，以及 h 独立重复了三次，结果相似。源数据作为源数据文件提供。
为了确认安全性，我们进一步评估了IS-胶束和IM-胶束在注射后3天对心脏、肝脏和肾脏功能的影响。因此，与PBS处理的小鼠相比，IS-胶束对典型的心脏功能标记物(乳酸脱氢酶、LDH和肌酸激酶、CK)、肝功能标记物(丙氨酸转氨酶、ALT、碱性磷酸酶、ALP和天冬氨酸转氨酶、AST)和肾功能标记物(尿素和肌酸酐)的影响可以忽略不计，而作为对照的IM-胶束引起明显的心脏、肝脏和肾脏功能标记物变异，从而由于不可避免地抑制健康组织中正常表达的HSP70而导致严重的毒性(图。 5g )，进一步证明了TRPV1阻断介导的选择性抑制癌细胞内应激HSP70的良好安全性。为了进一步验证由HSP70抑制引起的并发毒性，应用H&E染色来评估组织学损伤。明显地，在IM-胶束处理的小鼠中观察到严重的心肌纤维化、肝纤维化和出血、脾中的核收缩、肺纤维化和严重的肾小管损伤如肾小管扩张，而与PBS对照相比，IS-胶束对组织形态学变化表现出可忽略的影响，证实了IS-胶束在同时提高热疗效力和最小化脱靶毒性方面的良好安全性(图。 5h ).此外，由于严重的多器官组织学损伤，IM-胶束给药也导致体重持续下降，而IS-胶束对体重变化的影响可忽略不计(图。 5i )，进一步证实了IS-胶束用于体内癌症治疗的独特优势。值得注意的是，TRPV1阻断，而不是HSP70抑制剂，代表了一种革命性的策略，以最小的脱靶毒性增强热疗效果，这源于其对健康组织中正常表达的HSP70的干扰可以忽略不计(图。 5j MDA-MB-231和HCT-116肿瘤模型中，单独的I-胶束或IS-胶束对肿瘤生长显示出可忽略的影响，类似于没有光暴露的PBS，证明了I-胶束和IS-胶束的无毒性质。由于化疗剂的细胞毒性，临床使用的制剂延缓了肿瘤的发展并延长了带有小HepG2、MDA-MB-231和HCT-116肿瘤的小鼠的存活时间(图。 6b，c 和补充图。 35b–e )，分别为。单独来自I-胶束的高温只能提供对肿瘤生长的明显抑制和略微延长它们的存活，但是由于癌细胞固有的耐热性，会发生明显的肿瘤复发。相比之下，在光照下，无论肿瘤模型如何，单次注射IS-胶束完全根除了这些恶性肿瘤，在注射后90天内没有任何复发，导致监测期内100%的存活率(图。 6b，c 和补充图。 35b–e ).然后，我们研究了IS-胶束对大型HCT-116肿瘤模型(250-300mm)的协同治疗效果 3 ).由于TRPV1阻断选择性抑制应激HSP70的能力，暴露于光下的IS-胶束明显延迟了大型HCT-116肿瘤模型的肿瘤生长，这由最小的肿瘤体积和延长的生存期所证明(图。 6d，e ).此外，进一步研究了TRPV1阻断协同热疗对原位HCT-116-Luc肿瘤模型的抗肿瘤功效(图。 6a ).显然，在光照下接受IS-胶束的小鼠显示出最低的生物发光信号和延长的存活时间(图。 6f–h )，验证了较好的抗肿瘤效力。这些结果证实了从IS-胶束阻断TRPV1的能力，以加强针对大的和原位肿瘤模型的热疗。
图6: TRPV1阻断协同热疗对多种恶性肿瘤产生优选的治疗效果。 a 小型、大型和原位HCT-116结肠肿瘤模型的治疗时间表。肿瘤生长曲线( b )和生存曲线( c )带有小HCT-116肿瘤模型(50-75毫米 3 )用PBS、伊立替康、I-胶束和IS-胶束在光照(+)或不光照下处理( n =每组7只小鼠)。肿瘤生长曲线( d )和生存曲线( e )携带大HCT-116肿瘤模型(250-300毫米 3 )用PBS、伊立替康、I-胶束和IS-胶束在光照(+)或不光照下处理( n =每组7只小鼠)。生物发光图像( f )，相应的生物发光强度( g )和生存曲线( h )具有用PBS、伊立替康、I-胶束和IS-胶束处理的原位HCT 116-Luc肿瘤模型的小鼠在光照(+)或不光照( n =每组7只小鼠，颜色条，低代表1000 a.u .，高代表50000 a.u .)。 i 皮下PANC1胰腺肿瘤模型的治疗时间表。肿瘤生长曲线( j )和肿瘤重量( k )携带小PANC1肿瘤模型(50-75mm 3 )用PBS、Abraxane/吉西他滨(GEM)、I-胶束和IS-胶束在光照(+)或不光照下处理( n =每组7只小鼠)。数据表示为平均值±标准差( b , d , j , k ).为 b , d , j 和 k ，用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。为 c , e 和 h 用对数秩检验计算统计显著性。源数据作为源数据文件提供。
此外，还研究了IS-胶束对难治性PANC1胰腺肿瘤的热疗效力(图。 6i ).与PBS处理的小鼠相比，在没有光照的情况下，I-胶束和IS-胶束给药对肿瘤生长的影响可以忽略不计，这进一步证明了这种制剂的安全性，而临床使用的Abraxane/吉西他滨(GEM)制剂部分抑制了PANC1胰腺肿瘤的进展，但仍显示出侵袭性肿瘤生长，这通过实验结束时的肿瘤重量测量进一步验证(图。 6j，k ).重要的是，在光照条件下，与I-胶束相比，IS-胶束对肿瘤生长的抑制作用更强，但仍受到不完全消融的影响，这可能是因为它们在渗透性差的胰腺癌中的积聚和渗透不足(图。 6j，k 43 。这些结果表明TRPV1阻断表现为使用IS-胶束协同热疗的有效方法。
阻断TRPV1通过HSF1调节PDAC肿瘤模型TGFβ介导的纤维化间质 致密的ECM如I型胶原和纤连蛋白构成了难治性肿瘤如PDAC模型的病理屏障，其通常阻碍抗肿瘤化合物的渗透 44 ,45 。有趣的是，HSF1作为一个重要的转录子也被报道与TGFβ1的调节有关 46 ，它在CAFs增殖、分化和随后的ECM产生中起着至关重要的作用 11 。为了证明TRPV1阻断可能通过抑制HSF1介导的TGFβ1上调来操纵肿瘤基质，我们首先使用免疫荧光染色研究了TRPV1阻断对高温下PANC02肿瘤细胞中HSF1分布的影响。显然，在光照射下，在用I-胶束处理的细胞中观察到来自细胞核中HSF1的可忽略的绿色荧光，而作为对照的I-胶束在光暴露下显示出明显的HSF1细胞核分布，这通过绿色和蓝色荧光的高共定位得到证实(图。 7a，b )，表明在高表达TRPV1离子通道的PANC02肿瘤细胞中，TRPV1阻断在高温下抑制HSF1核易位的有效性(补充图。 36 ).然后，进行免疫荧光染色以研究来自接受不同治疗的小鼠的PANC02肿瘤切片中HSP70的表达。与光照射下用I-胶束处理的相比，IS-胶束导致抗HSP70抗体的红色荧光明显下调，证实了TRPV1阻断抑制应激HSP70上调的能力(补充图。 37 ).然后，进一步利用免疫荧光染色评估照射后24小时用IS-胶束处理的小鼠的PANC02肿瘤切片的体内TGFβ1水平。显然，与PBS组相比，单独的IS-胶束对TGFβ1表达的影响可以忽略不计(图。 7c，d )，由于TRPV1拮抗剂的溶酶体截留。重要的是，在光照下，与来自I-胶束的高温处理小鼠相比，IS-胶束导致明显减少的绿色荧光，这合理地归因于SB705498的相当大的胞质移位，用于有效的TRPV1阻断。显然，TRPV1阻断在热疗中下调TGFβ1表达中起重要作用。
图7: TRPV1阻断协同热疗降解PANC02肿瘤的高度纤维化肿瘤基质，并通过抑制HSF1核易位介导的TGFβ1上调促进aPD-L1浸润。 HSF1的CLSM形象(绿色) ( a )和相应的HSF1与细胞核(蓝色) ( b )在用I-胶束或IS-胶束处理的PANC02肿瘤细胞中，在光照(+)或不光照( n = 3个独立实验)。比例尺，50 μm。TGFβ1的CLSM图像(绿色) ( c )和相应的荧光强度分析( d )来自用不同制剂治疗的小鼠的PANC02肿瘤切片( n = 3个独立实验)。比例尺，50 μm。α-SMA的CLSM图像(绿色) ( e )和相应的荧光强度分析( f )来自用不同制剂治疗的小鼠的PANC02肿瘤切片( n = 3个独立实验)。标尺，50 μm。马森三色染色法(MTS)( g )和相应的纤维化分析( h )来自用不同制剂治疗的小鼠的PANC02肿瘤切片( n = 3个独立实验)。比例尺，50 μm i 在光照射(+)下用IS-胶束和HSF1A处理的PANC02肿瘤细胞中HSF1(绿色)易位的CLSM图像，以及在光照射(+)()下用IS-胶束和HSF1A处理的小鼠的PANC02肿瘤切片的TGFβ1(绿色)、α-SMA(绿色)和Masson三色染色(MTS)的CLSM图像 n = 3个独立实验)。比例尺，50 μm。Cy5标记的aPD-L1(红色)的CLSM图像( j )和相应的荧光强度分析( k )在来自用不同制剂治疗的小鼠的aPD-L1注射后24小时的PANC02肿瘤切片中。标尺，100 μm。该实验独立重复三次，结果相似。在…里 c , e , g ，以及 j ，分别用PBS、IS-胶束、光照射(+)下的I-胶束和光照射(+)下的IS-胶束处理小鼠。数据表示为平均值±标准差( b , d , f , h ).用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步研究TGFβ1衰减对CAFs的影响，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白α (FAPα)的水平作为量化CAFs的两个代表性标志 47 ,48 ，在照射后24小时使用免疫荧光染色进行评估。在光照射下，IS-胶束仅导致少数α-SMA-和FAPα-阳性成纤维细胞，如绿色荧光消失所示(图。 7e，f 和补充图。 38 )，而I-胶束的高温则表现出明显的α-SMA和FAPα的绿色荧光。这表明TRPV1阻断通过减弱高温下TGFβ1的表达而有效抑制CAFs的增殖和分化。因为成肌纤维细胞caf是高度纤维化肿瘤基质的原因 49 两种典型的ECM蛋白(胶原I和纤连蛋白)的免疫组织化学染色进一步用于评估照射后24小时用IS-胶束处理的小鼠中ECM蛋白的沉积。因此，在光照射下，在用IS-胶束处理的小鼠的肿瘤切片中观察到较少的I型胶原和纤连蛋白，这通过与仅接受IS-胶束和暴露于光下的I-胶束的小鼠的肿瘤切片相比，棕色明显减少来表明(补充图。 39 ).因此，TRPV1阻断在预防高温时细胞外基质沉积中起着关键作用。此外，经常用于评估肿瘤纤维化的Masson三色染色(MTS) 50 ，还揭示了在光照下用IS-胶束处理后明显减少的结缔组织增生(图。 7g高 ).这些结果证实了TRPV1阻断通过降低TGFβ1水平来调节胰腺肿瘤纤维化间质的能力。
TRPV1阻断协同热疗对多种恶性肿瘤产生不同的治疗效果 在TNBC模型中，通过TRPV1阻断协同热疗，IS-胶束具有更好的抗肿瘤功效和安全性，受此启发，我们进一步评估了其对高侵袭性人类肿瘤模型的治疗能力，这些肿瘤模型也高度表达TRPV1通道，包括HepG2肝肿瘤、MDA-MB-231乳腺肿瘤、HCT-116结肠直肠肿瘤和PNAC1胰腺肿瘤 18 。首先，使用抗TRPV1第一抗体和Alexa Fluor 594标记的第二抗体，应用免疫荧光染色来验证TRPV1在这些恶性肿瘤细胞中的表达。在包括HepG2、MAD-MB-231、HCT-116和PANC1癌细胞在内的不同癌细胞系中观察到来自TRPV1通道的显著红色荧光(补充图。 34 )，表明TRPV1通道在这些细胞上大量表达。在所有这些类型的肿瘤细胞中，TRPV1通道主要分布在细胞膜中，如从抗TRPV1抗体(红色)和细胞膜探针(DiO，绿色)融合的明显黄色荧光所示(补充图。 34 ).然后，将IS-胶束和I-胶束以7.5mg/kg的单剂量静脉注射到带有不同肿瘤模型的小鼠中 −1 ICG，或5.0毫克千克 −1 SB705498，随后曝光(785 nm，1.5 W cm −2 )注射后24小时5分钟，并测量肿瘤体积以及随后90天的存活分析(图 6a 和补充图。 35a ).还将作为对照的临床使用的制剂静脉内给药到带有各种肿瘤模型的小鼠中，包括5.0 mg kg −1 奥沙利铂加7.5毫克千克 −1 DOX，5.0毫克千克 −1 多柔比星和7.5毫克千克 −1 伊立替康。在HepG2、
为了进一步证明胰腺肿瘤中阻断HSF1核转位和TGFβ1衰减之间的相关性，一种有效的HSF1激动剂HSF1A 51 ，在光照前30分钟瘤内注射入PANC02肿瘤。很明显，当与HSF1A联合使用时，IS-胶束处理导致HSF1在光照下重新转位到细胞核中，并导致TGFβ1表达水平与单独使用高温的I-胶束相似(图。 7i )，从而降低对成纤维细胞增殖的抑制并改善纤维化。因此，TRPV1阻断介导的HSF1核转位的抑制是减轻PDAC模型中肿瘤基质的关键过程。
随后，对与血管通透性密切相关的血管内皮生长因子A (VEGF-A)进行了免疫荧光染色 52 ，用于验证IS-胶束介导的热疗调节肿瘤血管通透性的能力。与单独的PBS或IS-胶束相比，I-胶束和IS-胶束在光照下导致VEGF-A表达的明显增加(补充图。 40 )，证实了高温能够增强肿瘤的血管通透性 53 ,54
免疫检查点阻断(例如aPD-L1)成为治疗癌症的有效策略 55 ,56 ,57 ,58 但是在治疗高度纤维化和免疫抑制肿瘤方面的临床结果不佳 59 。我们证明了TRPV1阻断能够改善aPD-L1向PANC02肿瘤的浸润，所述肿瘤在光照下用IS-胶束治疗。简而言之，在照射后24小时，将Cy5标记的aPD-L1静脉注射到带有PANC02肿瘤的小鼠中，随后在注射aPD-L1后24小时，对肿瘤切片进行免疫荧光染色(图 7j，k ).显然，aPD-L1在接受光照射的IS-胶束的小鼠的肿瘤中表现出相当大的外渗和大约100微米的深穿透，而在光照射下用PBS或I-胶束处理的小鼠中仅观察到aPD-L1在肿瘤中的浅穿透。因此，TRPV1阻断介导的TGFβ1下调和高温诱导的血管通透性增加协同增强了光触发热疗后低通透性PDAC模型中大分子aPD-L1的浸润。
TRPV1阻断通过减轻免疫抑制和激活免疫反应来增强针对小PDAC模型的热免疫疗法 受aPD-L1在PANC02肿瘤中大量浸润的启发，我们进一步研究了aPD-L1与IS-胶束对难治性PANC02肿瘤模型的体内协同抗肿瘤功效。简而言之，将IS-胶束和I-胶束静脉注射到带有PANC02肿瘤(50-75mm 3 )的剂量为7.5毫克/千克 −1 ICG或5.0毫克千克 −1 SB705498，然后在注射后24小时进行光照5分钟，随后静脉注射3.0 mg kg −1 另一个24小时后的aPD-L1，以及随后90天的肿瘤体积和存活率的测量(补充图。 41a ).8.0毫克千克的组合 −1 Abraxane和35.0毫克千克 −1 还施用GEM作为临床使用的对照。IS-胶束/aPD-L1组合完全根除了肿瘤，在光照下没有任何复发，并且所有的小鼠都存活了90天(补充图。 41b，c )，而单独的IS-胶束不能完全消融肿瘤，因为它不能防止光照下的免疫逃避。同时，光暴露下的I-胶束/aPD-L1组合治疗也导致不完全的肿瘤消融，这合理地归因于aPD-L1的耐热性和有限的渗透。相反，Abraxane/GEM组合仍然导致肿瘤快速生长，并且所有小鼠在注射后55天死亡，表明临床标准方案具有非常有限的功效(补充图。 41b，c ).IS-胶束介导的TRPV1阻断确保了对难治性PDAC模型的有效热免疫治疗效果，而没有任何复发。
鉴于PDAC模型的高度免疫抑制微环境通常抑制持久的免疫反应 43 ,60 ，我们研究了IS-胶束/aPD-L1组合缓解PANC02肿瘤体内免疫抑制的能力，方法是使用流式细胞仪监测免疫抑制性髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(tam)在PANC02肿瘤中的体内浸润 61 。如补充图所示。 42a PANC02肿瘤本身具有高比例的MDSCs，而aPD-L1治疗只是由于aPD-L1不能进入PDAC模型而引起MDSCs频率的轻微下降。重要的是，IS-胶束/aPD-L1组合导致PANC02肿瘤中MDSCs频率的明显降低，这也优于光暴露下单独的IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合。此外，由于免疫抑制细胞因子TGFβ1的抑制作用，单独的IS-胶束与I-胶束相比，在光照条件下MDSCs的频率也明显降低，TGFβ1可以促进免疫抑制细胞的增殖 2 ,11 。因此，TRPV1阻断在肿瘤中通过aPD-L1浸润和TGFβ1调节抑制MDSCs中起重要作用。同时，发现PANC02肿瘤含有大量CD11b + F4/80 + CD206 + TAMs (M2样特征)，而IS-胶束/aPD-L1组合导致巨噬细胞从M2样TAMs到CD11b的更有效复极 + F4/80 + CD80 + 与不考虑光照射的单独的IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合相比，光照射时PANC02肿瘤中的TAMs (M1样特征)(补充图。 42b–d )，表明巨噬细胞从肿瘤表型向抗肿瘤表型的转变 62 。相比之下，Abraxane/GEM组合未能有效地将巨噬细胞复极为抗肿瘤表型(补充图。 42d ).因此，IS-胶束介导的TRPV1阻断有效地解除了体内免疫抑制，解释了针对PDAC模型的协同热免疫疗法。
为了进一步探索来自IS-胶束协同的aPD-L1的免疫反应，我们首先评估了肿瘤引流淋巴结中树突状细胞(DCs)的成熟，这是抗原特异性T淋巴细胞引发和扩增的先决条件 63 ,64 。IS-胶束/aPD-L1组合导致显著的DCs成熟(CD11c + CD80 + CD86 + DCs ),也优于单独的IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合(补充图。 42e ).然后，我们使用流式细胞仪进一步监测肿瘤处浸润的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。IS-胶束/aPD-L1组合导致CTL频率明显提高(CD45 + CD3 + CD8 + t细胞)(补充图。 42f )，与单独的I-胶束或I-胶束/aPD-L1组合相比，在光照下分别显示1.15倍和1.2倍的增加。显然，TRPV1阻断协同的热免疫疗法诱导CTL的引发、扩增和浸润，用于激活T细胞免疫。
另一方面，肿瘤浸润性自然杀伤(NK)细胞也使用流式细胞术分析进行定量。与单独的IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合相比，IS-胶束/aPD-L1组合在光照射下导致NK细胞明显增加，而与光照射无关(补充图。 42g )，表明由于TRPV1阻断介导的ECM调节、高温介导的温热疗法和aPD-L1介导的免疫疗法的协同作用，IS-胶束/aPD-L1组合也引起先天免疫激活。因此，在PDAC模型中，TRPV1阻断协同热免疫疗法通过肿瘤攻击免疫细胞的浸润有效地触发了免疫反应。
我们进一步证明了TRPV1阻断协同热免疫疗法是否引起长期记忆效应以预防肿瘤复发。简而言之，携带PANC02肿瘤的小鼠最初在光照射下用IS-胶束/aPD-L1组合治疗，然后在给药后60天用PANC02肿瘤细胞进一步接种没有任何复发的存活小鼠，随后在接下来的45天测量肿瘤体积。如补充图所示。 43a 的情况下，IS-胶束/aPD-L1组合导致对小鼠肿瘤生长的完全抑制，显示出明显的长期记忆效应，而幼稚小鼠的肿瘤生长仍然具有攻击性。为了阐明这种长期记忆效应的机制，我们评估了给药后60天小鼠脾脏中记忆性T细胞的频率，这是抵抗肿瘤复发的原因 65 。IS-胶束/aPD-L1组合导致CD44增加约2.2倍 高的 CD62L 低的 暴露于光下的效应记忆T细胞与未受感染的小鼠相比(补充图。 43b，c )，从而证实了TRPV1阻断协同热免疫疗法的长期免疫记忆效应。
TRPV1阻断通过调节肿瘤微环境增强针对大型和原位PDAC模型的热免疫疗法 为了进一步评估对大PANC02胰腺肿瘤模型的协同抗肿瘤作用，该肿瘤模型通常具有高度严重的纤维化和免疫抑制 43 我们建立了体积为250-300mm的大PANC02肿瘤模型 3 。与在4T1肿瘤模型和小PANC02肿瘤模型中的穿透相比，IS-胶束在具有较少血管和纤维化基质的大PANC02肿瘤中的穿透相对受损(补充图。 30 )43 ,66 ，并在大PANC02肿瘤中中度分布。这表明IS-胶束甚至能够渗透到相对较大的纤维化肿瘤中，确保随后TRPV1阻断与热疗的体内协同作用。如图所示。 8b，c 接受临床标准方案(Abraxane/GEM组合)的小鼠表现出快速肿瘤生长，并且所有小鼠在治疗后38天死亡。有趣的是，通过TRPV1阻断协同热疗，IS-胶束明显延迟了辐射后的肿瘤生长。更重要的是，IS-胶束/aPD-L1组合明显增强了抗肿瘤效力，在7只小鼠中有3只在照射后实现了肿瘤根除，这表明选择性抑制应激HSP70和调节TGFβ途径共同促成了较好的治疗效力。同时，作为对照的I-胶束/aPD-L1组合显示出降低的抗肿瘤效力，这合理地归因于耐热性和由致密ECM导致的aPD-L1渗透不足(图。 8b，c ).然后，应用流式细胞术研究接受不同治疗的携带大PANC02肿瘤的小鼠的体内免疫应答。由于TGFβ通路的有效调节，光照下的IS-胶束导致大PANC02肿瘤中免疫抑制MDSCs明显下调，M2样TAMs明显复极为M1样TAMs 11 和aPD-L1的组合进一步提高了缓解由ECM降解介导的aPD-L1浸润引起的免疫抑制的效率(图。 8d–g 和补充图。 44 ).此外，在光照下，接受IS-胶束/aPD-L1组合的小鼠也表现出明显的树突状细胞成熟，肿瘤浸润性CTLs和NK细胞明显改善，优于其他对照组(图。 8h–j 和补充图。 45 ).这些结果证明了TRPV1阻断协同热免疫疗法引发强烈免疫反应的能力，从而说明了对大胰腺肿瘤模型的优选治疗效果。
图8:使用IS-胶束/aPD-L1组合，TRPV1阻断放大了针对皮下PANC02胰腺肿瘤的热免疫治疗功效和免疫反应。 a 皮下PANC02肿瘤模型的治疗时间表。肿瘤生长曲线( b )和生存曲线( c )的具有大PANC02肿瘤模型(250-300mm 3 )用各种制剂处理( n =每组7只小鼠)。CD45的定量 + CD11b + gr 1 + MDSCs( d )，CD11b + F4/80 + CD206 + 塔姆( e )和CD11b + F4/80 + CD80 + 塔姆( f )在用各种制剂( n =每组5只小鼠)。 g CD11b比率 + F4/80 + CD80 + tam至CD11b + F4/80 + CD206 + 用各种制剂治疗后72小时大PANC02肿瘤内的tam( n =每组5只小鼠)。 h 成熟树突细胞(CD11c)的定量 + CD80 + CD86 + DCs)在用各种制剂( n =每组5只小鼠)。肿瘤浸润性CD45的定量 + CD3 + CD8 + CTLs( i )和CD45 + CD3 - CD335 + NK细胞( j )在用各种制剂治疗后72小时的PANC02肿瘤中( n =每组5只小鼠)。 k 通过TRPV1阻断协同热疗促进aPD-L1浸润诱导持久免疫反应的ECM重塑示意图。TRPV1阻断后，HSF1的核转位被有效阻断，随后抑制TGFβ1的上调和分泌，从而导致CAFs增殖和活化介导的ECM蛋白沉积的抑制，最终促进aPD-L1和免疫细胞(如NK细胞和T淋巴细胞)的浸润以获得持久的免疫应答。虚线表示阻断高温激活的TRPV1通道后下游信号转导的失败。老鼠在 b–j 分别用PBS (G1)、aPD-L1 (G2)、Abraxane/GEM (G3)、光照射下的I-胶束(+) (G4)、光照射下的I-胶束/aPD-L1(+)(G5)、IS-胶束(G6)、IS-胶束/aPD-L1 (G7)、光照射下的IS-胶束(+) (G8)和光照射下的IS-胶束/aPD-L1(G9)处理。数据表示为平均值±标准差( b , d –j ).为 b 和 d –j ，用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。为 c 用对数秩检验计算统计显著性。源数据作为源数据文件提供。
受皮下PANC02胰腺肿瘤模型中免疫抑制的有效缓解和抗肿瘤免疫反应的强烈激活的启发，我们进一步探索了TRPV1阻断协同热免疫疗法对高侵袭性原位PANC02-Luc胰腺肿瘤模型的效力(图。 9a ).如图所示。 9b–d 接受aPD-L1治疗的小鼠显示出侵袭性肿瘤生长，而IS-胶束/aPD-L1组合有效地抑制了光照射下的原位PANC02-Luc肿瘤的生长，这通过仅几个生物发光信号和明显延长的生存期来证明，优于IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合。这些结果表明TRPV1阻断通过抑制HSP70和TGFβ自我防御途径来加强对原位PDAC模型的热免疫治疗的有效性。随后，进一步应用流式细胞术研究接受不同治疗方案的小鼠的体内免疫反应。与皮下PANC02肿瘤模型相比，在原位PANC02-Luc肿瘤模型中发现了更高数量的免疫抑制MDSCs和M2样tam(补充图。 44a ，b和 46a，b ).单用aPD-L1对免疫抑制性骨髓间充质干细胞和M2样肿瘤的发生率的影响可以忽略不计(补充图。 46a，b )，而光暴露下的IS-胶束/aPD-L1导致免疫抑制MDSCs减少2.2倍，M1样TAMs与M2样TAMs的比率增加5.7倍，这比光暴露下用I-胶束/aPD-L1或IS-胶束处理的小鼠更有效(图。 9e，f 和补充图。 46 ).显然，TRPV1阻断协同的热免疫疗法通过TGFβ自我防御途径调节和显著的aPD-L1浸润导致严重免疫抑制的有效缓解。此外，aPD-L1本身对树突状细胞成熟的影响可以忽略不计，而IS-胶束/aPD-L1在光照下导致树突状细胞成熟的增加，分别是接受I-胶束/aPD-L1或IS-胶束的小鼠的1.6倍和1.5倍(图。 9g 和补充图。 47a )，因此解释了CTL的引发和随后的浸润以杀死肿瘤细胞(图。 9h 和补充图。 47b ).此外，光暴露下的IS-胶束/aPD-L1也导致NK细胞的最高渗透率(图。 9i 和补充图。 47c )，证实了TRPV1阻断协同热免疫疗法激活先天免疫的能力。这些结果进一步验证了TRPV1阻断协同热免疫疗法通过再训练HSP70和TGFβ自我防御途径激活强大抗肿瘤免疫的能力，最终产生针对原位PDACs的较好抗肿瘤效力。
图9:使用IS-胶束/aPD-L1组合，TRPV1阻断放大了针对原位PANC02-Luc胰腺肿瘤的热免疫治疗功效和免疫反应。 a 原位PANC02-Luc肿瘤模型的治疗时间表。生物发光图像( b )，相应的生物发光强度( c )和生存曲线( d )用不同制剂治疗的带有原位PANC02-Luc肿瘤模型的小鼠( n =每组7只小鼠，颜色条，低代表800 a.u .，高代表30000 a.u .)。CD45的定量 + CD11b + gr 1 + MDSCs( e )和CD11b的比率 + F4/80 + CD80 + tam至CD11b + F4/80 + CD206 + 塔姆( f )用各种制剂治疗后72小时的原位pan CO2-Luc肿瘤内( n =每组5只小鼠)。 g 成熟树突细胞(CD11c)的定量 + CD80 + CD86 + 用各种制剂治疗后72小时肿瘤引流淋巴结内的DCs)( n =每组5只小鼠)。肿瘤浸润性CD45的定量 + CD3 + CD8 + CTLs( h )和CD45 + CD3 − CD335 + NK细胞( i )用各种制剂治疗后72小时的原位pan CO2-Luc肿瘤内( n =每组5只小鼠)。老鼠在 b –i 分别用PBS (G1)、aPD-L1 (G2)、Abraxane/GEM (G3)、光照射下的I-胶束/aPD-L1(+)(G4)、光照射下的IS-胶束(+) (G5)和光照射下的IS-胶束/aPD-L1(+)(G6)处理。数据表示为平均值±标准差( 电子信息 ).为 d 用对数秩检验计算统计显著性。为 电子信息 ，用Tukey事后检验的单因素方差分析确定统计显著性。源数据作为源数据文件提供。
讨论 我们已经开发了纳米颗粒介导的TRPV1阻断作为调节HSF1核易位的高效方法，其选择性抑制肿瘤中的HSP和TGFβ自我防御途径，以实现针对高度恶性肿瘤(如难治性胰腺癌)的有效热免疫疗法。我们构建了TRPV1-KD肿瘤模型来阐明TRPV1阻断能够抑制Ca 2+ 流入和随后的HSF1核移位，并因此在高温时抑制应激过度表达的HSP70，通过减轻耐热性导致增强的癌症热疗。为了实现TRPV1阻断和热疗的有效协同作用，探索了聚合物IS-胶束作为基于纳米颗粒的载体，以实现肿瘤选择性TRPV1阻断协同热疗的肿瘤靶向同步递送TRPV1拮抗剂和热疗剂。这些IS-胶束对原发性、转移性和复发性TNBCs，各种TRPV1阳性的恶性人类肿瘤，包括HepG2、MDA-MB-231和PANC1肿瘤，以及小、大和原位HCT-116肿瘤模型显示出明显的热疗功效。同时，这种TRPV1阻断提供了优于常规HSP70抑制剂的安全性，这是由于通过从正常表达的HSPs中有效识别应激过度表达的HSPs而避免脱靶毒性的能力。特别地，我们进一步认识到TRPV1阻断介导的HSF1核转位的抑制能够抑制TGFβ途径，以促进肿瘤基质的有效分解，从而改善抗肿瘤治疗剂(例如aPD-L1)和免疫细胞(例如CTL和NK细胞)向肿瘤中的渗透(图。 8k ).结果，IS-胶束/aPD-L1组合产生了TRPV1阻断协同热免疫疗法，以通过重振免疫反应和解除免疫抑制来有效抑制高度难治的皮下和原位PDAC肿瘤模型的肿瘤进展。我们认为TRPV1阻断代表了一种有效的方法来消除肿瘤中的自身防御，用于增强针对各种高度恶性肿瘤的热免疫疗法，并提供了一种针对有效癌症治疗的离子通道阻断的有见地的途径。
