内皮细胞中Dnmt1的条件性缺失损害肿瘤生长并降低血管密度
Dnmt1KO小鼠不能活过妊娠中期，部分原因是造血/卵黄囊血管生成失败34。因此，要确定的具体作用Dnmt1在肿瘤生长和免疫监视期间的脉管系统中，我们生成了条件性删除模型来消融Dnmt1在Cdh5+ECs(Dnmt1耶科老鼠)(补充图。1a–d).肿瘤生长在下列情况下受损Dnmt1在内皮细胞中是无效的，但在成纤维细胞中却不是邮政快递原位移植EO771和PyMT乳腺肿瘤细胞的小鼠(图。1a，补充图。2a，b).令人惊讶的是，尽管肿瘤生长受到强烈抑制，但这些肿瘤中的微血管密度适度降低；相反，当与对照小鼠的肿瘤相比时，来自小鼠的肿瘤中的脉管系统Dnmt1耶科小鼠更窄，侧支更少更短(图。1b，c，补充图。3).这伴随着内皮细胞到周细胞距离的减少，这是血管正常化的一个指标，尽管在肿瘤中具有周细胞覆盖的血管的总百分比没有变化Dnmt1耶科小鼠对对照组(图。1d，e).为了评估不同遗传背景中肿瘤血管的功能/灌注，我们在安乐死之前通过尾静脉注射TRITC-葡聚糖。结果显示对照小鼠肿瘤中TRITC-葡聚糖的特征性血管外渗漏在Dnmt1耶科老鼠；再次表明血管正常化(图。1f，补充图。4).在一个实验性转移模型中，肿瘤内血管分支减少伴随着肿瘤结节大小减少约20%,肿瘤结节/肺减少3.5倍Dnmt1耶科小鼠对对照组(图。第一代，补充图。5a).值得注意的是，正常肺组织区域的血管密度没有差异Dnmt1耶科小鼠与对照小鼠的对比表明Dnmt1在静止的、预先存在的脉管系统中不起作用，但在内皮细胞的增殖和迁移过程中可能是重要的，因为它们整合到新的血管结构中(图。1h，补充图。5b).综上所述，基因靶向Dnmt1在ECs中，尽管在血管形态上有细微的变化和血管分支长度的适度减少，但显著抑制了肿瘤的生长；因此，我们考虑了次要机制Dnmt1在ECs中可以抑制肿瘤的发展。
aEO771(上图)或PyMT(下图)乳腺肿瘤原位移植对照与Dnmt1耶科老鼠。每隔一天用卡尺(EO771n = 11，控制和n = 9, Dnmt1耶科:PyMTn = 8，控制和n = 8, Dnmt1耶科).对于EO771，从第15天开始，结果具有统计学意义；对于PyMT，从第16天开始，结果具有统计学意义。使用ANOVA和Sidak多重比较测试分析结果。bZsGreen+所示小鼠的肿瘤脉管系统。右边的方框区域放大5倍以显示细节，并转换为8位二进制图像，然后反转以显示侧支/丝状体。箭头指向对照中高度分支或更直和更窄的血管Dnmt1耶科分别是老鼠。比例尺= 100 μm。c血管分支长度的量化表示为点状图或直方图，以显示分支长度和分支数量的分布(n = 3单个肿瘤和每组九个组织切片)。使用学生的结果进行分析t测试。d用αSMA鉴别肿瘤周细胞。带方框的区域放大了5倍，显示在最右侧，以便查看细节。比例尺= 100 μm。e周细胞的定量:对照组的EC距离(左)和总周细胞覆盖率(右)与Dnmt1耶科老鼠(n = 3单个肿瘤和每组九个组织切片)。使用学生的结果进行分析t测试。f使用以下工具从冷冻切片中定量血管外TRITC-葡聚糖n = 3每组小鼠。使用学生的结果进行分析t测试。g肿瘤结节半径(左)和由mCherry形成的肿瘤结节总数+EO771癌细胞通过所示小鼠的尾静脉注射(n = 4每组小鼠)。使用学生的结果进行分析t测试。h正常肺区域与含mCherry区域的血管分支数量+所示小鼠中的肿瘤结节(n = 3单个肿瘤和每组九个组织切片)。所有学生的t测试是不成对的和双尾的。所有数据均以平均值±标准偏差表示。源数据作为源数据文件提供。
靶向内皮细胞培养物中的Dnmt1可增强细胞因子反应，从而增强血管细胞:T细胞的相互作用
DNA低甲基化试剂如抑制DNMT1的5-氮杂胞苷(5-Aza)先前显示可增强Th1趋化因子的表达，Th1趋化因子对CTL进入肿瘤很重要4。由于肿瘤血管系统是抗肿瘤免疫细胞的进入点，我们通过在存在或不存在促炎细胞因子TNFα或IFNγ的情况下，用5-Aza处理小鼠乳腺ECs (MGECs)的原代培养物后，集中于细胞粘附分子(CAMs)和趋化因子的EC表达，扩展了这一观察。5-氮杂本身会导致内皮细胞形态的改变，这是“活化”内皮细胞的典型特征；此外，增加剂量的5-氮杂强烈增强了表达Vcam1, 埃塞尔, Cxcl9，以及Cxcl10当加入TNFα时(补充图。6a、b).相比之下，表达Icam2, Vcam1，以及Cxcl9当5-Aza与IFNγ一起加入时增强(补充图。6b).因为较高剂量的5-Aza似乎是细胞毒性的，这降低了其对CAM/趋化因子表达的增强作用，我们在TNFα或IFNγ存在下测定了GSK 3484862(dnm t1的非共价抑制剂)的活性，发现它产生了与5-Aza相当的结果(补充图。6b).这些结果表明，ECs中DNMT1的最佳抑制启动了细胞因子诱导的CAMs和趋化因子的上调，它们通过不同的机制发出信号。
5-氮杂能够抑制所有三种DNMT1蛋白的活性。尽管我们发现非常低水平的Dnmt3a/Dnmt3b在ECs中，当与Dnmt1我们使用了siRNA方法来专门消融Dnmt1在EC培养物中的表达(补充图。7a).噪声抑制Dnmt1不影响的表达Dnmt3a/3b，但接近5-氮杂的作用，导致TNFα刺激增加约2-4倍Icam1, Vcam1，以及埃塞尔和大约25-100倍的增长Cxcl9/10/11它们是引导CXCR3的重要化学吸引剂+t细胞朝向肿瘤微环境(补充图。7b，图。2a，b).值得注意的是，沉默HDAC2，已知其与DNMT1物理相关，表观遗传调节转录，阻断了hda C2的增强。Cxcl9/Cxcl10与关联的表达式Dnmt1损失；这些结果表明，一旦DNMT1不再存在，HDAC2正调节这些趋化因子的表达(补充图。7c)35。尽管T细胞吸引趋化因子Ccl5也适度增强了Dnmt1随着TNFα的加入而沉默Dnmt1沉默对CXCR3结合趋化因子(Cxcl9/10/11)作为条件培养基的无偏见的高通量筛选Dnmt1与其他分泌因子相比，沉默/TNFα处理的ECs表现出丰富的CXCL9/10/11蛋白分泌(补充图。8a、b).
aMGECs用混乱的对照或Dnmt1用TNFα攻击前的siRNA。通过qPCR分析选择的cam。b与中的相同"a除了通过qPCR分析选择的趋化因子。c与中的相同"a, b除了在TNFα攻击前用p65抑制剂预处理细胞。dMGECs用混乱的对照或Dnmt1用IFNγ激发前的siRNA。通过qPCR分析选择的cam。e与中的相同"d除了通过qPCR分析选择的趋化因子。f与中的相同"d, e除了在IFNγ攻击前用JAK2抑制剂预处理细胞。qPCR图上的每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。所有qPCR数据用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。g在加扰对照或之后，对浓缩MGEC条件培养基中的CXCL9/CXCL10进行Luminex分析Dnmt1siRNA肿瘤坏死因子α挑战。每个数据点都是n = 3生物复制一式两份。数据分析采用方差分析，随后采用Dunnett多重比较检验。h使用活化CD8的粘附试验+t细胞在指定条件下与MGECs一起孵育。每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。数据分析采用方差分析，随后采用Tukey多重比较检验。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
由于众所周知TNFα通过NFκβ上调ECs中CAM/趋化因子的表达，我们研究了NFκβ的抑制是否会逆转CAM/趋化因子表达的增强Dnmt1沉默。阻断NFκβ亚单位p65部分抑制了NFκβ的表达。Vcam1, Ccl5, Cxcl9，以及Cxcl10在…情况下Dnmt1沉默和TNFα刺激(图。2c).使用与IFNγ刺激相同的策略，我们发现Dnmt1在这种情况下，沉默增强了Icam2, Vcam1，以及Cxcl9；的表达Cxcl10/11呈上升趋势Dnmt1在IFNγ刺激下沉默，但没有达到统计学显著性，可能是由于多个实验之间表达量的变化(图。2d，e).因为众所周知IFNγ需要JAK2进行信号转导，我们用药物抑制剂AG490阻断了JAK2。如前所述，JAK2抑制部分减少了Vcam1, Cxcl9，以及Cxcl10(图。2f).可能由于这些体外实验的短期持续时间，尽管现在已经很好地确定了DNA甲基化在抑制由内源性转座因子(TEs)驱动的IFN应答基因中的作用，但我们没有发现TNFα或IFNγ刺激的内皮细胞中几种候选TEs的一致上调Dnmt1消音(补充图。9a、b)8,36。综上所述，这些结果表明Dnmt1沉默部分通过TNFα和IFNγ下游典型信号通路的过度激活发挥作用。
Dnmt1沉默也增加了TNFα诱导的E-选择素和IFNγ诱导的VCAM-1的表面表达，但这些增加是适度的，可能是因为细胞因子刺激本身导致这些因子表达的大量增加(补充图。10a–d);相比之下，Dnmt1沉默导致分泌的CXCL9/CXCL10增加几倍，通过Luminex试验测量，这远远高于TNFα本身的刺激作用(图。2g).引入全长鼠Dnmt1抑制TNFα和IFNγ驱动的肿瘤坏死因子的表达。Cxcl9和Cxcl10正如所料，TNFα或IFNγ减少了DNMT1的富集或总甲基化(5mC)Cxcl9和Cxcl10使用染色质免疫沉淀(芯片)的启动子(补充图。11a–c).值得注意的是，在人类乳腺癌中CXCL9/10/11显示出与...的强烈正相关CD8表达(用作肿瘤内T细胞含量的替代物)，这与最近的一项研究一致(补充图。12a，b)1。在人类乳腺癌患者中，大量的CD8+t细胞或CXCR3+t细胞也与总存活率的提高相关(补充图。12c，d).这些数据与进一步增强血管细胞和CD8之间的串扰的策略的建议非常一致+t细胞可以通过克服否则不允许的肿瘤脉管系统来提高抗肿瘤免疫37。然而，应该注意的是，关于CXCR3的表达和人乳腺癌患者的存活也报道了矛盾的结果，这可能是由于报道的CXCR3在乳腺癌细胞上的表达可以促进CXCL9/10介导的运动性38,39。因此，我们分析了以下因素的直接功能影响Dnmt1MGECs相对于CD8的沉默+t细胞粘附。我们发现Dnmt1沉默增强TNFα和IFNγ刺激的细胞黏附铥绿色标记的CD3/CD28激活的脾脏CD8+相对于单独的细胞因子刺激，t细胞对MGEC单层(图。2h).包含CXCR3中和抗体减少了CD8+细胞因子刺激下t细胞与MGEC单层的粘附Dnmt1沉默。值得注意的是，从MGEC收集的条件培养基用Dnmt1siRNA和肿瘤坏死因子α足以促进T细胞粘附到次级MGEC单层，表明旁分泌介导的机制(补充图。13a，b).这些结果与已报道的肿瘤中驱动T细胞:血管细胞粘附的CXCL9/CXCL10/CXCR3轴相一致，表明EC衍生的CXCL9/CXCL10表达的增强与肿瘤细胞粘附之间的功能性联系。Dnmt1沉默和增强的CD8+t细胞贩运40.
ECs中Dnmt1的条件性缺失使肿瘤血管重新编程，导致肿瘤内和血管周围CD8数量增加+t细胞和增加的GzB+细胞
接下来，我们使用FACS通过门控CD45来分离肿瘤相关内皮细胞(tec)-/CD31+来自胶原酶分散的原位移植的EO771乳腺肿瘤的细胞。我们证实上调了Vcam1, 埃塞尔, Cxcl9，以及Cxcl10在tec中使用RT-qPCRDnmt1耶科小鼠对对照组(图。3a，b).使用来自对照的新鲜冰冻切片进行VCAM-1染色Dnmt1耶科肿瘤证实了在管腔表面可检测到的VCAM-1的增加(补充图。14a).有趣的是，我们还发现MECA-79抗体染色阳性的血管数量增加，该抗体识别高内皮微静脉上存在的硫酸化碳水化合物表位，高内皮微静脉是对T细胞进入肿瘤很重要的特化血管(补充图。14b，c)10。因此，我们评估了Dnmt1沉默可以增加光和淋巴毒素刺激的HEV标记基因的表达，这些基因是已知的HEV新生的诱导物41。结果表明Dnmt1MGEC文化中的沉默足以增强Il33, Ccl21，以及Ccl19。其他基因如马德卡姆, Ackr1，以及Chst4仅相对于对照组显著增加，表明DNMT1在识别HEV ECs的选择性基因的调节中的直接作用(补充图。14d).
a用酶混合物解离原位注射的EO771乳腺肿瘤。CD45−/CD31+使用FACS(n = 3来自指定小鼠组的合并肿瘤)。b对tec中选定的靶基因进行qPCR分析，一式三份。数据分析采用方差分析，随后采用Sidak多重比较检验。c与中的相同"a除了所示的抗体组合用于鉴定胶原酶分散的肿瘤中的免疫细胞亚群(显示了代表性的等高线图)。dFACS分析的定量显示在“c” (n = 6小鼠/组),每个数据点是一只单独的小鼠。数据分析使用学生的t测试。e对照与对照的EO771乳腺肿瘤的冷冻切片Dnmt1耶科用抗CD8抗体染色的小鼠(红色荧光)。容器标有ZsGreen。这些图像显示了“小”的代表性视场(Dnmt1耶科-1)与“大”(Dnmt1耶科-2) CD8+T细胞簇和血管周围或血管内T细胞(放大5倍的方框区域显示在最右侧)。比例尺= 50 μm。fCD8的定量+t细胞/视野(n = 3每组的肿瘤)。使用学生的结果进行分析t测试。g使用与CD8共培养的MGECs的跨内皮迁移试验+指示条件下的t细胞。每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。结果用方差分析进行分析，然后用Dunnett多重比较检验。h对照与对照的EO771乳腺肿瘤的冷冻切片Dnmt1耶科用GzB抗体染色的小鼠(红色荧光)。血管用ZsGreen标记，细胞核(蓝色)用DAPI标记。这些图像显示了两个有代表性的肿瘤例子Dnmt1耶科老鼠。比例尺= 50 μm。iGzB百分比的量化+单元格来自n = 3每组肿瘤使用n = 4每只小鼠的冰冻切片。使用学生的结果进行分析t测试。所有学生的t检验都是不成对的和双尾的。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
使用流式细胞仪识别不同的免疫细胞群，我们发现CD8增加了2-3倍+肿瘤中的t细胞Dnmt1耶科小鼠对对照小鼠(图。3c，d).令人惊讶的是，CD11c+树突状细胞在2005年减少了近5倍Dnmt1耶科小鼠，而F480的总数+巨噬细胞或CD45+两组小鼠的造血细胞没有区别，表明对特定免疫细胞群的选择性影响。因为CD11c的数量+肿瘤中细胞减少，我们假设CD11c可能增加+细胞运输到引流淋巴结，在那里出现抗原呈递。事实上，这些淋巴结的免疫组织化学显示CD11c增加了约3倍+单元格在Dnmt1耶科小鼠对对照组(补充图。15).来自乳腺肿瘤的新鲜冷冻切片也证实了CD8的更高丰度+t细胞在Dnmt1耶科小鼠，在整个TME中表现为大簇，或明显束缚在血管壁上，提示有增强的滞胀(图。3e、f).为了测试这种可能性，我们使用由与CellTracker共培养的MGEC单层组成的跨孔培养系统进行了渗滤分析铥绿色标记的CD3/CD28激活的脾脏CD8+t细胞，同上。结果表明Dnmt1与对照组相比，沉默使TNFα或IFNγ刺激的跨内皮迁移增加约2倍(图。3g).最后，我们检测了颗粒酶B表达(GzB+)效应物作为近期抗原刺激/激活和细胞溶解功能的指标。类似于总CD8+t细胞，我们发现GzB增加了约4倍+移植到肿瘤中的细胞Dnmt1耶科相对于对照小鼠的小鼠(图。3h，我).综合来看，Dnmt1ECs的沉默产生了肿瘤免疫微环境的整体变化，包括CD11c的意外减少+树突细胞，CD8增加+t细胞，包括与脉管系统相关的和溢出脉管系统的t细胞，以及GzB的显著增加+溶细胞细胞。
CD8-阻断抗体挽救肿瘤生长，而ICB的功效在Dnmt1中增强耶科老鼠
为了确定CD8的具体贡献+t细胞减少肿瘤生长Dnmt1耶科小鼠，我们使用CD8-阻断抗体进行了抗体耗尽实验。在连续四轮CD8-阻断抗体治疗后，CD8+t细胞在循环中被消融(图。4a).我们发现CD8-阻断抗体促进对照小鼠中肿瘤生长的快速加速，导致一些肿瘤达到其最大允许尺寸(1000 μm3)在12天内(图。4b).不出所料，肿瘤生长在2005年受到了损害Dnmt1耶科小鼠对对照组；此外，CD8-阻断抗体几乎完全挽救了肿瘤的生长Dnmt1耶科小鼠，由实验结束时肿瘤体积和肿瘤重量的恢复来表示(图。4b，c).CD8-封闭抗体在糖尿病中的修复作用Dnmt1耶科小鼠与微血管分支长度的统计学显著恢复无关，尽管小鼠的血管分支长度分布有增加的趋势Dnmt1耶科用CD8-封闭抗体治疗的小鼠与Dnmt1耶科单独的老鼠(图。4d，e).因为免疫关卡阻断的有效性部分依赖于免疫细胞对TME的可及性，我们询问ICB的有效性是否在以下情况下增强Dnmt1在脉管系统中基因沉默。与CD8-阻断抗体相反，ICB将肿瘤达到最大尺寸的时间延长了近两周，导致肿瘤的大小大约是2005年的一半Dnmt1耶科小鼠相对于它们各自对应的对照组(图。4f).这意味着2005年总存活率的显著提高Dnmt1耶科相对于IgG对照和所有其他组，用ICB处理的小鼠(图。第四代移动通信技术).这些数据表明，靶向内皮中的单个基因可以赋予TME继发性的、大规模的变化，包括抗肿瘤免疫细胞组成的显著改变和抗肿瘤免疫力的提高。
aCD8耗尽的验证+从指定小鼠抽取的血液中的细胞(n = 3).数据分析采用方差分析，随后采用Sidak多重比较检验。b对照与对照的肿瘤生长分析Dnmt1耶科用IgG对照或CD8-封闭抗体处理的小鼠(n = 5).结果用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。c研究结束时的肿瘤重量。使用ANOVA分析结果，随后使用Tukey多重比较测试(n = 5). d在指定治疗下血管分支长度的直方图量化(n = 3单个肿瘤和每组九个组织切片)。结果用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。e所示治疗后血管结构的代表性图像(ZsGreen标记肿瘤血管，DAPI标记细胞核；蓝色)。比例尺= 50 μm。f对照中的肿瘤生长与Dnmt1耶科用IgG对照或αPD-L1 + CTLA4组合(对照，n = 9; Dnmt1耶科+ IgG，n = 9；对照+ αPD-L1/CTLA4，n = 9; Dnmt1耶科+ αPD-L1/CTLA4，n = 9).数据分析采用方差分析，随后采用Tukey多重比较检验。g针对指定治疗的卡普兰-迈耶分析(对数秩曼特尔-考克斯检验p数值显示在图表上)。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
靶向内皮细胞培养物中的Dnmt1可增强细胞因子反应，从而增强血管细胞:T细胞的相互作用
DNA低甲基化试剂如抑制DNMT1的5-氮杂胞苷(5-Aza)先前显示可增强Th1趋化因子的表达，Th1趋化因子对CTL进入肿瘤很重要4。由于肿瘤血管系统是抗肿瘤免疫细胞的进入点，我们通过在存在或不存在促炎细胞因子TNFα或IFNγ的情况下，用5-Aza处理小鼠乳腺ECs (MGECs)的原代培养物后，集中于细胞粘附分子(CAMs)和趋化因子的EC表达，扩展了这一观察。5-氮杂本身导致内皮细胞形态的改变，这是“活化”内皮细胞的典型特征；此外，增加剂量的5-氮杂强烈增强了表达Vcam1, 埃塞尔, Cxcl9，以及Cxcl10当加入TNFα时(补充图。6a、b).相比之下，表达Icam2, Vcam1，以及Cxcl9当5-Aza与IFNγ一起加入时增强(补充图。6b).因为较高剂量的5-Aza似乎是细胞毒性的，这降低了其对CAM/趋化因子表达的增强作用，我们在TNFα或IFNγ存在下测定了GSK 3484862(dnm t1的非共价抑制剂)的活性，发现它产生了与5-Aza相当的结果(补充图。6b).这些结果表明，ECs中DNMT1的最佳抑制启动了细胞因子诱导的CAMs和趋化因子的上调，它们通过不同的机制发出信号。
5-氮杂能够抑制所有三种DNMT1蛋白的活性。尽管我们发现非常低水平的Dnmt3a/Dnmt3b在ECs中，当与Dnmt1我们使用了siRNA方法来专门消融Dnmt1在EC培养中的表达(补充图。7a).噪声抑制Dnmt1不影响的表达Dnmt3a/3b，但接近5-氮杂的作用，导致TNFα刺激增加约2-4倍Icam1, Vcam1，以及埃塞尔和大约25-100倍的增长Cxcl9/10/11它们是引导CXCR3的重要化学吸引剂+t细胞朝向肿瘤微环境(补充图。7b，图。2a，b).值得注意的是，沉默HDAC2，已知其与DNMT1物理相关，表观遗传调节转录，阻断了hda C2的增强。Cxcl9/Cxcl10与关联的表达式Dnmt1损失；这些结果表明，一旦DNMT1不再存在，HDAC2正调节这些趋化因子的表达(补充图。7c)35。尽管T细胞吸引趋化因子Ccl5也适度增强了Dnmt1随着TNFα的加入而沉默Dnmt1沉默对CXCR3结合趋化因子(Cxcl9/10/11)作为条件培养基的无偏见的高通量筛选Dnmt1与其他分泌因子相比，沉默/TNFα处理的ECs表现出丰富的CXCL9/10/11蛋白分泌(补充图。8a、b).
aMGECs用混乱的对照或Dnmt1用TNFα攻击前的siRNA。通过qPCR分析选择的cam。b与中的相同"a除了通过qPCR分析选择的趋化因子。c与中的相同"a, b除了在TNFα攻击前用p65抑制剂预处理细胞。dMGECs用混乱的对照或Dnmt1用IFNγ激发前的siRNA。通过qPCR分析选择的cam。e与中的相同"d除了通过qPCR分析选择的趋化因子。f与中的相同"d, e除了在IFNγ攻击前用JAK2抑制剂预处理细胞。qPCR图上的每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。所有qPCR数据用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。g在加扰的对照或之后，对浓缩的MGEC条件培养基中的CXCL9/CXCL10进行Luminex分析Dnmt1siRNA肿瘤坏死因子α挑战。每个数据点都是n = 3生物复制一式两份。数据分析采用方差分析，随后采用Dunnett多重比较检验。h使用活化CD8的粘附试验+t细胞在指定条件下与MGECs一起孵育。每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。数据分析采用方差分析，随后采用Tukey多重比较检验。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
由于众所周知TNFα通过NFκβ上调ECs中CAM/趋化因子的表达，我们研究了NFκβ的抑制是否会逆转CAM/趋化因子表达的增强Dnmt1沉默。阻断NFκβ亚单位p65部分抑制了NFκβ的表达。Vcam1, Ccl5, Cxcl9，以及Cxcl10在…情况下Dnmt1沉默和TNFα刺激(图。2c).使用与IFNγ刺激相同的策略，我们发现Dnmt1在这种情况下，沉默增强了Icam2, Vcam1，以及Cxcl9；的表达Cxcl10/11呈上升趋势Dnmt1在IFNγ刺激下沉默，但没有达到统计学显著性，可能是由于多个实验之间表达量的变化(图。2d，e).因为众所周知IFNγ需要JAK2进行信号转导，我们用药物抑制剂AG490阻断了JAK2。如前所述，JAK2抑制部分减少了Vcam1, Cxcl9，以及Cxcl10(图。2f).可能由于这些体外实验的短期持续时间，尽管现在已经很好地确定了DNA甲基化在抑制由内源性转座因子(TEs)驱动的IFN应答基因中的作用，但我们没有发现TNFα或IFNγ刺激的内皮细胞中几种候选TEs的一致上调Dnmt1消音(补充图。9a、b)8,36。综上所述，这些结果表明Dnmt1沉默部分通过TNFα和IFNγ下游典型信号通路的过度激活发挥作用。
Dnmt1沉默也增加了TNFα诱导的E-选择素和IFNγ诱导的VCAM-1的表面表达，但这些增加是适度的，可能是因为细胞因子刺激本身导致这些因子表达的大量增加(补充图。10a–d);相比之下，Dnmt1沉默导致分泌的CXCL9/CXCL10增加几倍，通过Luminex试验测量，这远远高于TNFα本身的刺激作用(图。2g).引入全长鼠Dnmt1抑制TNFα和IFNγ驱动的肿瘤坏死因子的表达。Cxcl9和Cxcl10正如所料，TNFα或IFNγ减少了DNMT1的富集或总甲基化(5mC)Cxcl9和Cxcl10使用染色质免疫沉淀(芯片)的启动子(补充图。11a–c).值得注意的是，在人类乳腺癌中CXCL9/10/11显示出与...的强烈正相关CD8表达(用作肿瘤内T细胞含量的替代物)，这与最近的一项研究一致(补充图。12a，b)1。在人类乳腺癌患者中，大量的CD8+t细胞或CXCR3+t细胞也与总存活率的提高相关(补充图。12c，d).这些数据与进一步增强血管细胞和CD8之间的串扰的策略的建议非常一致+t细胞可以通过克服否则不允许的肿瘤脉管系统来提高抗肿瘤免疫37。然而，应该注意的是，关于CXCR3的表达和人乳腺癌患者的存活也报道了矛盾的结果，这可能是由于报道的CXCR3在乳腺癌细胞上的表达可以促进CXCL9/10介导的运动性38,39。因此，我们分析了以下因素的直接功能影响Dnmt1MGECs相对于CD8的沉默+t细胞粘附。我们发现Dnmt1沉默增强TNFα和IFNγ刺激的细胞黏附铥绿色标记的CD3/CD28激活的脾脏CD8+相对于单独的细胞因子刺激，t细胞对MGEC单层(图。2h).包含CXCR3中和抗体减少了CD8+细胞因子刺激下t细胞与MGEC单层的粘附Dnmt1沉默。值得注意的是，从MGEC收集的条件培养基用Dnmt1siRNA和肿瘤坏死因子α足以促进T细胞粘附到次级MGEC单层，表明旁分泌介导的机制(补充图。13a，b).这些结果与已报道的肿瘤中驱动T细胞:血管细胞粘附的CXCL9/CXCL10/CXCR3轴相一致，表明EC衍生的CXCL9/CXCL10表达的增强与肿瘤细胞粘附之间的功能性联系。Dnmt1沉默和增强的CD8+t细胞贩运40.
ECs中Dnmt1的条件性缺失使肿瘤血管重新编程，导致肿瘤内和血管周围CD8数量增加+t细胞和增加的GzB+细胞
接下来，我们使用FACS通过门控CD45来分离肿瘤相关内皮细胞(tec)-/CD31+来自胶原酶分散的原位移植的EO771乳腺肿瘤的细胞。我们证实上调了Vcam1, 埃塞尔, Cxcl9，以及Cxcl10在tec中使用RT-qPCRDnmt1耶科小鼠对对照组(图。3a，b).使用来自对照的新鲜冰冻切片进行VCAM-1染色Dnmt1耶科肿瘤证实了在管腔表面可检测到的VCAM-1的增加(补充图。14a).有趣的是，我们还发现MECA-79抗体染色阳性的血管数量增加，该抗体识别高内皮微静脉上存在的硫酸化碳水化合物表位，高内皮微静脉是对T细胞进入肿瘤很重要的特化血管(补充图。14b，c)10。因此，我们评估了Dnmt1沉默可以增加光和淋巴毒素刺激的HEV标记基因的表达，这些基因是已知的HEV新生的诱导物41。结果表明Dnmt1MGEC文化中的沉默足以增强Il33, Ccl21，以及Ccl19。其他基因如马德卡姆, Ackr1，以及Chst4仅相对于对照组显著增加，表明DNMT1在识别HEV ECs的选择性基因的调节中的直接作用(补充图。14d).
a用酶混合物解离原位注射的EO771乳腺肿瘤。CD45−/CD31+使用FACS(n = 3来自指定小鼠组的合并肿瘤)。b对tec中选定的靶基因进行qPCR分析，一式三份。数据分析采用方差分析，随后采用Sidak多重比较检验。c与中的相同"a除了所示的抗体组合用于鉴定胶原酶分散的肿瘤中的免疫细胞亚群(显示了代表性的等高线图)。dFACS分析的定量显示在“c” (n = 6小鼠/组),每个数据点是一只单独的小鼠。数据分析使用学生的t测试。e对照与对照的EO771乳腺肿瘤的冷冻切片Dnmt1耶科用抗CD8抗体染色的小鼠(红色荧光)。容器标有ZsGreen。这些图像显示了“小”的代表性视场(Dnmt1耶科-1)与“大”(Dnmt1耶科-2) CD8+T细胞簇和血管周围或血管内T细胞(放大5倍的方框区域显示在最右侧)。比例尺= 50 μm。fCD8的定量+t细胞/视野(n = 3每组的肿瘤)。使用学生的结果进行分析t测试。g使用与CD8共培养的MGECs的跨内皮迁移试验+指示条件下的t细胞。每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。结果用方差分析进行分析，然后用Dunnett多重比较检验。h对照与对照的EO771乳腺肿瘤的冷冻切片Dnmt1耶科用GzB抗体染色的小鼠(红色荧光)。血管用ZsGreen标记，细胞核(蓝色)用DAPI标记。这些图像显示了两个有代表性的肿瘤例子Dnmt1耶科老鼠。比例尺= 50 μm。iGzB百分比的量化+单元格来自n = 3每组肿瘤使用n = 4每只小鼠的冰冻切片。使用学生的结果进行分析t测试。所有学生的t检验都是不成对的和双尾的。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
使用流式细胞仪识别不同的免疫细胞群，我们发现CD8增加了2-3倍+肿瘤中的t细胞Dnmt1耶科小鼠对对照小鼠(图。3c，d).令人惊讶的是，CD11c+树突状细胞在2005年减少了近5倍Dnmt1耶科小鼠，而F480的总数+巨噬细胞或CD45+两组小鼠的造血细胞没有区别，表明对特定免疫细胞群的选择性影响。因为CD11c的数量+肿瘤中细胞减少，我们假设CD11c可能增加+细胞运输到引流淋巴结，在那里出现抗原呈递。事实上，这些淋巴结的免疫组织化学显示CD11c增加了约3倍+单元格在Dnmt1耶科小鼠对对照组(补充图。15).来自乳腺肿瘤的新鲜冷冻切片也证实了CD8的更高丰度+t细胞在Dnmt1耶科小鼠，在整个TME中表现为大簇，或明显束缚在血管壁上，提示有增强的滞胀(图。3e、f).为了测试这种可能性，我们使用由与CellTracker共培养的MGEC单层组成的跨孔培养系统进行了渗滤分析铥绿色标记的CD3/CD28激活的脾脏CD8+t细胞，同上。结果表明Dnmt1与对照组相比，沉默使TNFα或IFNγ刺激的跨内皮迁移增加约2倍(图。3g).最后，我们检测了颗粒酶B表达(GzB+)效应物作为近期抗原刺激/激活和细胞溶解功能的指标。类似于总CD8+t细胞，我们发现GzB增加了约4倍+移植到肿瘤中的细胞Dnmt1耶科相对于对照小鼠的小鼠(图。3h，我).综合来看，Dnmt1ECs的沉默产生了肿瘤免疫微环境的整体变化，包括CD11c的意外减少+树突细胞，CD8增加+t细胞，包括与脉管系统相关的和溢出脉管系统的t细胞，以及GzB的显著增加+溶细胞细胞。
CD8-阻断抗体挽救肿瘤生长，而ICB的功效在Dnmt1中增强耶科老鼠
为了确定CD8的具体贡献+t细胞减少肿瘤生长Dnmt1耶科小鼠，我们使用CD8-阻断抗体进行了抗体耗尽实验。在连续四轮CD8-阻断抗体治疗后，CD8+t细胞在循环中被消融(图。4a).我们发现CD8-阻断抗体促进对照小鼠中肿瘤生长的快速加速，导致一些肿瘤达到其最大允许尺寸(1000 μm3)在12天内(图。4b).不出所料，肿瘤生长在2005年受到了损害Dnmt1耶科小鼠对对照组；此外，CD8-阻断抗体几乎完全挽救了肿瘤的生长Dnmt1耶科小鼠，由实验结束时肿瘤体积和肿瘤重量的恢复来表示(图。4b，c).CD8-封闭抗体在糖尿病中的修复作用Dnmt1耶科小鼠与微血管分支长度的统计学显著恢复无关，尽管小鼠的血管分支长度分布有增加的趋势Dnmt1耶科用CD8-封闭抗体治疗的小鼠与Dnmt1耶科单独的老鼠(图。4d，e).因为免疫关卡阻断的有效性部分依赖于免疫细胞对TME的可及性，我们询问ICB的有效性是否在以下情况下增强Dnmt1在脉管系统中基因沉默。与CD8-阻断抗体相反，ICB将肿瘤达到最大尺寸的时间延长了近两周，导致肿瘤的大小大约是2005年的一半Dnmt1耶科小鼠相对于它们各自对应的对照组(图。4f).这意味着2005年总存活率的显著提高Dnmt1耶科相对于IgG对照和所有其他组，用ICB处理的小鼠(图。第四代移动通信技术).这些数据表明，靶向内皮中的单个基因可以赋予TME继发性的、大规模的变化，包括抗肿瘤免疫细胞组成的显著改变和抗肿瘤免疫力的提高。
aCD8耗尽的验证+从指定小鼠抽取的血液中的细胞(n = 3).数据分析采用方差分析，随后采用Sidak多重比较检验。b对照与对照的肿瘤生长分析Dnmt1耶科用IgG对照或CD8-封闭抗体处理的小鼠(n = 5).结果用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。c研究结束时的肿瘤重量。使用ANOVA分析结果，随后使用Tukey多重比较测试(n = 5). d在指定治疗下血管分支长度的直方图量化(n = 3单个肿瘤和每组九个组织切片)。结果用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。e所示治疗后血管结构的代表性图像(ZsGreen标记肿瘤血管，DAPI标记细胞核；蓝色)。比例尺= 50 μm。f对照中的肿瘤生长与Dnmt1耶科用IgG对照或αPD-L1 + CTLA4组合(对照，n = 9; Dnmt1耶科+ IgG，n = 9；对照+ αPD-L1/CTLA4，n = 9; Dnmt1耶科+ αPD-L1/CTLA4，n = 9).数据分析采用方差分析，随后采用Tukey多重比较检验。g针对指定治疗的卡普兰-迈耶分析(对数秩曼特尔-考克斯检验p数值显示在图表上)。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
ScRNA测序显示增殖的tec在IFN和TNF反应基因中减少
肿瘤脉管系统，像受伤的脉管系统一样，已知显示出血管内和血管间的异质性42。为了进一步探索TEC的异质性Dnmt1表达和抗肿瘤免疫反应，我们对FACS分离的CD45进行了scRNA-seq-/CD31+来自胶原酶分散的正常乳腺的ECs。过滤部分后Cd45+ (Ptprc), Myh11+(平滑肌)，Epcam+(上皮)，以及Cspg4+tSNE图显示了正常乳腺ECs (NECs)的分布(补充图。16a，b，图。5a).我们接下来扫描了Dnmt1表达，并发现它在每个簇中的单个ECs中低水平表达，但也在单个簇(这里称为簇12)中富集(图。5b，c).这些内皮细胞的无偏聚类显示，聚类12也富含几种增殖标记，包括Top2a，表明簇12是有丝分裂簇(补充图。16c，图。5c).使用CD45-/CD31+来自E0771乳腺肿瘤的tec，我们也可以鉴定有丝分裂簇，标记为Top2a，它富含于Dnmt1相对于其他集群；值得注意的是，这个簇不同于第二个簇，第二个簇类似于最近描述的由基因代表的IFN应答EC簇，例如Irf8, Ifit2, Isg15，以及Cxcl10(补充图17a–d)41.
a从混合的(n = 20)乳腺。btSNE绘图显示Dnmt1不同集群间的表达。箭头指向集群12。c小提琴情节显示丰富的Dnmt1和Top2a在第12组。dtSNE绘图显示Top2aPyMT TECs中的表达式。e Dnmt1血液中的表达与来自PyMT模型的有丝分裂tec的比较。f描述E2F靶(在有丝分裂簇中发现)和IFN或TNF反应(主要在非有丝分裂簇中发现)的基因组富集分数的tSNEs。g针对E0771和PyMT TECs的集群，包括带注释的集群和Top2a或者Dnmt1表情。箭头指向有丝分裂簇。h共表达Dnmt1和Cxcl9或者Cxcl10有丝分裂和干扰素样簇。i血管亚型描述的候选IFN反应基因和有丝分裂基因的气泡图。
接下来，使用公开可用的数据集，我们使用PyMT乳腺肿瘤模型检查了来自tec的SmartSeq2数据41。这些数据包含血液tec以及淋巴细胞和HEV样细胞群。仅在血液tec上过滤后，我们鉴定了有丝分裂簇并证实Top2a被充实了；此外，Dnmt1在这个有丝分裂簇中表达(图。5d，e). Dnmt1是一个已知的E2F靶基因，在有丝分裂细胞中上调，我们可以确认有丝分裂簇中的标志性E2F靶基因，它不同于富含标志性IFN反应或TNF信号通路的细胞(图。5f).这些数据表明，富含Dnmt1，可能抑制对IFN反应或TNF信号传导重要的基因。
为了使用E0771和PyMT模型更全面地描述tec中的基因表达，我们检查了第二个注释良好的scRNAseq数据集(图。5g)41。我们再次发现Top2a和Dnmt1在有丝分裂簇中富集。值得注意的是，只有0.01%的正常乳腺ECs表达Top2a如上所示，这个数字在乳腺tec中攀升至约15%,作为整体有丝分裂增强的指标。然后我们检测了干扰素应答基因的共表达Cxcl9和Cxcl10对抗Dnmt1。不出所料，Cxcl9/Cxcl10主要富集在IFN群中；我们发现25%的内皮细胞共同表达Cxcl9/Dnmt117%共同表达Cxcl10/Dnmt1(图。5h).当我们使用PyMT TECs的Smartseq2数据检查它们的共表达时，这些百分比较低:只有5.8%的细胞共表达Cxcl9/Dnmt11.7%共表达Cxcl10/Dnmt1。我们最终使用E0771和PyMT TECs绘制了基于血管亚型的IFN反应和有丝分裂标记基因，并发现它们是不同的(图。5i).综合来看，Dnmt1在一个小的ECs有丝分裂池中富集，并且该簇不同于表达对调节血管/免疫细胞交互作用重要的IFN-应答基因的簇。这些结果通常与增殖细胞中免疫调节途径的抑制一致，这与最近描述当与细胞周期抑制剂组合时ICB在实体瘤中增强功效的工作一致5,43。此外，我们的数据表明沉默Dnmt1可能将ECs从有丝分裂型转变为IFN反应型。
靶向DNMT1增强表达CXCR3的T细胞在流动状态下对人三维血管网的粘附
为了进一步了解人类TEC在增殖和IFN反应基因方面的异质性，我们访问了最近两项研究的scRNA-seq数据，这两项研究全面解析了人类乳腺癌的单细胞景观44,45。我们的目标是确定TOP2A表示“…人”DNMT1-富集的tec类似于我们在小鼠乳腺肿瘤模型中的发现。而另一项最新研究也发现Top2a你好在鼠肺中，tec通常聚集成簇，与IFN反应簇不同，我们无法在这些人类研究中鉴定出鼠等效的关联46。然而，从这些数据中显而易见的是，人类乳腺tec一般表达非常低水平的Th1趋化因子，这也是我们使用公开可用的数据集探测人类肺tec时发现的(图。6a、b)46。这些数据指出了鼠肿瘤模型与人类癌症之间的关键差异，并可能与使用小鼠移植肿瘤发生的EC增殖/血管生成的加速速率有关。然而，这些数据提供了一个机会来探索人类内皮细胞是否也可以通过靶向DNMT1来表达丰富的Th1趋化因子。事实上，我们发现人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达低水平的Th1趋化因子，但是它们的表达，以及它们与Th1趋化因子的关系VCAM1可通过在TNFα或IFNγ攻击前用5-Aza引发而增强(图。6c，d).
a使用来自乳腺癌的人scRNAseq数据，通过细胞类型检查指示的趋化因子。b使用来自乳腺癌的人scRNAseq数据，通过细胞类型检查指示的趋化因子。来自a-b的数据是先前生成的44,45. c在TNFα攻击前用5-Aza引发的人内皮细胞(HUVEC)中指定靶基因的qPCR分析(n = 3一式三份测定的生物复制物)。结果用方差分析进行分析，然后用Dunnett多重比较检验。d同样是在”c“除了用IFNγ治疗。e在指定的条件下用人类内皮细胞生成可灌注的3D网络。三万个过度表达CXCR3的T细胞用CellTracker标记铥绿色，流经3D网络，洗涤，并成像用于分析。比例尺= 100 μm。最右边是在所示条件下粘附的T细胞的定量。每个点代表一个单独的微流体装置。结果分析使用不成对的双尾学生的t测试和p数值显示在图表上。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
探索抑制人内皮细胞中的DNMT 1如何影响与免疫细胞的功能性相互作用，特别是CD8+t细胞，我们使用以前建立的方法用HUVECs生成3D血管网络47。这种体外系统使用ECs和血管周围壁细胞的灌注、自组织网络和接近人体循环的流速。在网络建立后，我们用5-氮杂卓进行预处理，然后用TNFα或IFNγ进行额外治疗。在通过这些网络输注过表达CXCR3 (CXCL9/10受体)的Jurkat细胞后，结果显示，与单独细胞因子治疗相比，添加5-氮杂提高了T细胞对ECs的粘附性约2倍(图。6e).这些结果与下述概念一致，即5-氮杂引发可以增强T细胞对人内皮细胞的粘附，即使在完全应激/血流条件下。
有效的EC有丝分裂原FGF2对抗DNMT1i介导的CAMs和T细胞吸引趋化因子的增强
因为血管生成与免疫抑制有关，我们假设内皮细胞有丝分裂原如FGF2或VEGF可能通过其调节内皮细胞生长因子表达的能力而具有免疫抑制作用。Dnmt1。正如预期的那样，FGF2刺激了内皮细胞的体外增殖和血管生成，但是这些作用被Dnmt1消音(补充图。18a，b).此外，FGF2刺激减少了CD8的数量+t细胞粘附于TNFα刺激的MGECs(补充图。18c).我们还发现FGF2刺激，而不是VEGFA，剂量依赖性地增加DNMT1向细胞核的转移，同时减少其在细胞质中的表达(图。7a，补充图。18d).已知DNMT1在增殖细胞中响应有丝分裂原而富集，并且DNMT1缺失显示出导致成纤维细胞中几种抑制性细胞周期蛋白依赖性激酶的上调48；同样的，Dnmt1内皮细胞中siRNAs表达上调Cdkn1a和Cdkn1c这可以部分解释EC增殖的缺陷Dnmt1在血管系统中是遗传靶向的(补充图。18e).
a收获用指定浓度的FGF2或VEGF处理的MGECs，分成胞质或核部分，然后使用SDS-PAGE分析指定的蛋白质，随后进行免疫印迹(代表n= 3个独立的印迹)。b收获用指定浓度的FGF2处理的MGECs，分成胞质或核部分，然后使用Phos-tag凝胶电泳(代表n= 3个独立的印迹)。c使用以下工具量化核pDNMT1信号n = 3独立凝胶。结果用方差分析进行分析，然后用Tukey多重比较检验。d对照与FGF2刺激的MGECs的芯片分析。使用与DNMT1抗体孵育的交联全细胞提取物进行芯片。通过qPCR分析捕获的DNMT1/DNA复合物，以评估DNMT1在Cxcl9/Cxcl10对照与FGF2处理的MGECs中的启动子(n = 3生物复制)。结果分析使用不成对的双尾学生的t测试。e按指示处理的MGECs中指示基因的qPCR分析；每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。f按指示处理的MGECs中指示基因的qPCR分析；每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。g按指示处理的MGECs中指示基因的qPCR分析；每个数据点都是n = 3生物复制一式三份。h显示FGF2/DNMT1轴通过抑制CAMs和趋化因子在促进非许可性肿瘤脉管系统中的作用的示意图。靶向DNMT1导致对抗肿瘤免疫很重要的TNF或IFN应答基因的增强。使用ANOVA以及Tukey的多重比较测试来分析面板中的结果e–g。所有误差线均为平均值±标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
DNMT1调控域中的几个丝氨酸/苏氨酸残基被蛋白激酶C (PKC)或细胞外信号调节激酶(ERKs)磷酸化，导致蛋白质的稳定性49,50。众所周知，ERK1/2在内皮细胞中被FGF2激活，我们观察到FGF2刺激后磷酸化的细胞核DNMT1增加，这种增加被高选择性抑制剂(ERK1)阻断ERK1/2所抑制(图。7b，c，补充图。18f).鉴于这些数据，我们假设FGF2在ECs中是免疫抑制的，部分是通过直接调节DNMT1表达/核易位。我们发现FGF2刺激导致DNMT1在启动子上富集3-15倍。Cxcl9和Cxcl10(图。7d).此外，在TNFα激发前用FGF2预处理内皮细胞，导致内皮细胞的表达降低了几倍。Vcam1, Cxcl9，以及Cxcl10；相比之下，VEGF刺激导致这些相同因子的适度抑制(图。7e，补充图。18g).
最后，我们测试了DNMT1在TNFα存在下介导FGF2免疫抑制作用的相对贡献。令人惊讶的是，沉默Dnmt1在FGF2/TNFα激发之前，FGF2本身不能减轻FGF2的抑制作用(图。7f).这些结果表明，DNMT1可能赋予稳定的甲基化标记，这些标记从所分析的候选基因的调控序列中逐渐去除，和/或FGF2可以通过激活替代但互补的抑制途径来促进EC无能51。认为siRNAs只是部分减少Dnmt1水平或最低水平Dnmt3a/3b表达可以补偿选择性靶向Dnmt1我们使用5-氮杂来抑制DNMT1和ERKi的活性。DNMT1和ERK1/2的组合阻断再次部分拮抗了FGF2抑制TNFα诱导的细胞凋亡的能力Vcam1和Cxcl9但是完全对抗Cxcl10压制；此外，同时阻断DNMT1和ERK1/2导致细胞凋亡显著增加。Vcam1, Cxcl9，以及Cxcl10mRNAs(图。7g).综上所述，这些数据表明FGF2通过DNMT1/ERK依赖性和非依赖性途径，有效拮抗EC CAMs和趋化因子的表达，这些因子对CTL归巢和进入肿瘤或肿瘤引流淋巴结很重要(图。7h).
讨论
在肿瘤中，克隆衍生的内皮细胞亚群被认为可以抑制Th1趋化因子和CAMs，它们对免疫监视很重要13,14,18。最近的研究还表明，在损伤部位或肿瘤中，内皮细胞来源于高度增殖和分级的祖细胞，这些祖细胞经历了内皮细胞命运的短暂转变，包括回到允许重新进入细胞周期的更原始的状态52,53,54,55,56。我们在小鼠中的研究揭示了IFN应答基因的增殖和激活之间的反向关联；因此，有可能肿瘤中重新进入细胞周期的内皮细胞也不太允许白细胞进入。可能由于报道的人乳腺癌中TEC的低增殖率，对公开可获得的人scRNA-seq数据的检查没有揭示TEC增殖和CAMs/趋化因子表达之间的明确的负相关；然而，这些数据确实揭示了人类tec总体上表达低水平的Th1趋化因子57。与鼠内皮细胞相似，我们使用人内皮细胞的体外数据证实了这些趋化因子的低组成型表达，这些趋化因子可由细胞因子刺激诱导，并通过抑制DNMT1进一步增强。尽管我们未能在人类肿瘤中明确识别出与我们在小鼠中的观察相匹配的亚群，但我们的数据与最近的一项研究很好地一致，该研究识别出Top2a你好与富含两者的IFN应答亚群不同的鼠肺tec增殖簇Cxcl9和Cxcl10 46.
阻断DNMT1部分减轻FGF2对CAMs/趋化因子的TNFα刺激的拮抗作用，表明FGF2通过次级的非冗余途径抑制ECs中CAM/趋化因子的表达。FGF2是一种有效的EC分裂原，并且在细胞周期抑制和抗肿瘤免疫增强之间存在确定的联系。例如，CDK4/6抑制显示增强抗原呈递，这伴随着IFNγ应答的增加；有趣的是，作者将这一结果与DNMT1的下调、TEs的低甲基化和刺激肿瘤免疫监视的趋化因子分泌增加联系起来5。正如所预测的，ICB与CDK4/6和PI3Kα抑制剂的添加增强了抗肿瘤免疫反应，进一步支持了针对细胞周期和增强T细胞功能的途径的组合方法具有协同作用的概念58。因此，EC有丝分裂原如FGF2激活细胞周期可能通过拮抗TNFα或IFNγ驱动的途径，主动抑制内皮中对免疫监视重要的因子；因此，可能需要克服FGF2的这种免疫抑制作用来增强淋巴细胞穿过内皮进入肿瘤。
这项研究的一些局限性包括，考虑到Dnmt1在中删除Cdh5-Cre老鼠，预计损失Dnmt1整个脉管系统的功能可以诱导CAMs和趋化因子的表达，这些因子驱动免疫细胞渗入正常组织和器官微环境。然而，我们的数据表明Dnmt1沉默本身对增加CAMs或趋化因子的组成型表达作用很小；相反，Dnmt1在TNFα或IFNγ等细胞因子存在的情况下，抑制似乎更像是CAM/趋化因子表达的增强剂。由于这些细胞因子预计在TME中富集，这可以解释在下列情况下对免疫/血管串扰的局部影响Dnmt1被消融了。此外，在细胞因子刺激的同时抑制NFκβ或JAK2只能部分减轻细胞因子的作用Dnmt1沉默CAM或趋化因子表达的增强。这些结果表明，额外的机制，包括免疫原性内源性逆转录病毒的暴露Dnmt1抑制和增强先天性IFNγ反应或直接抑制增殖，在我们的体内模型中是有效的2,5,8,59。最后，虽然目前的研究集中在如何Dnmt1ECs的缺失影响CD8的总数+t细胞存在于TME中，未来的研究可以集中在趋化因子(如Cxcl9/10)或其他因子如何通过ECs表达的背景下Dnmt1缺失具有直接血管抑制作用，串联调节T细胞衰竭或T细胞肿瘤内运动和存活。
目前正在临床试验中测试免疫调节药物(如Durvalumab或Pembrolizumab)和低甲基化药物(包括5-Aza和地西他滨)的组合，但这些研究远未完成(NCT02811497和NCT02957968)。除了内皮的表观遗传重编程之外，这些组合方法的任何益处可能是由于对癌细胞或免疫细胞的直接影响。这可能导致活化的肿瘤脉管系统,( I)将淋巴细胞导向TME ,( ii)更易于捕获抗肿瘤免疫细胞，以及(iii)促进渗出以克服免疫排斥并增强抗肿瘤免疫。
