虽然癌症免疫疗法，包括肿瘤浸润淋巴细胞的过继细胞转移和免疫检查点抑制剂抗体可以介导转移性黑色素瘤患者的持久肿瘤消退，但其疗效仍然有限。因此，需要彻底了解肿瘤免疫逃逸机制，以克服对癌症免疫疗法的耐药性。肿瘤细胞可以通过多种机制逃避宿主的免疫识别，包括肿瘤细胞的内在和外在因素 1 ,2 ,3 。尽管通过阻断免疫抑制分子或通过使用过继细胞转移重建肿瘤反应性T细胞来靶向有缺陷的T细胞功能已经成为当前免疫疗法的焦点 4 ,5 在某些原发性和获得性患者中，治疗抗性强调需要识别和靶向其他起作用的因素 6 ,7 ,8 ,9 .
肿瘤抗原性的缺乏和T细胞在肿瘤中的募集和浸润不足，在某种程度上是对免疫疗法没有良好反应的患者的两个特征 10 ,11 ,12 ,13 。虽然对控制免疫治疗反应的分子机制的清楚理解仍在发展中，但多项临床观察已经将肿瘤内CD8的存在联系起来 + t细胞对I型干扰素(IFN)转录信号的反应 14 ,15 ,16 。类似地，几项临床前研究已经证实了I型IFN在引发自发性和医源性抗肿瘤免疫T细胞应答中的重要功能，强调了它们在触发一系列自分泌和旁分泌信号事件中的作用，所述事件导致肿瘤内MHC分子的增强表达和T细胞归巢趋化因子的诱导 16 ,17 。在驱动I型IFN诱导的不同上游途径中，干扰素基因刺激剂(STING)已被证明是检测免疫原性肿瘤和启动自发T细胞应答的主要途径 18 ,19 ,20 ,21 。这一发现启发了一些研究，以评估使用药理学STING激动剂直接激活该途径是否可用于促进抗肿瘤免疫反应 22 ,23 ,24 ,25 。虽然在临床前肿瘤模型中已经显示了STING激动剂的明确治疗活性，但是在癌症患者中使用这些药物的早期临床试验，无论是作为单一疗法还是与免疫检查点抑制剂组合，迄今为止都显示缺乏疗效 26 ,27 ,28 。因此，揭示STING通路激活的机制细节有可能提高抗肿瘤免疫。
黑色素瘤细胞中STING信号激活的另一个方面是CXCL10和CCL5的下游诱导 29 。这些趋化因子已被确定为CXCR3募集的主要介质 + 和CCR5 + 肿瘤特异性T淋巴细胞进入肿瘤及其在肿瘤内的表达与黑色素瘤患者的良好临床结果相关 30 ,31 ,32 。值得注意的是，它们也包含在12-趋化因子基因表达信号中，我们已经证明该信号揭示了肿瘤定位的三级淋巴样结构的存在，并发现其与某些转移性黑色素瘤患者的总生存期正相关 33 。然而，由于尚不清楚肿瘤细胞本身如何通过STING介导的这些趋化因子的诱导将T细胞微环境调节至积极的预后结果，因此确定潜在的操作机制具有生物学和临床相关性。
尽管抗原呈递细胞(APCs)参与依赖于螫伤的抗肿瘤免疫反应 18 ,22 最近的研究提供了令人信服的证据，即肿瘤细胞固有的刺痛活性也是一个重要的因素 34 ,35 ,36 。事实上，我们以前报道过，人黑色素瘤细胞系中STING信号的激活可以通过上调MHC类分子来增加其抗原性，从而导致更有效的免疫识别和向肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)呈递抗原 29 。然而，我们还发现，在人类黑色素瘤细胞系中存在广泛的STING信号损伤，这可能会限制它们对TIL介导的杀伤的识别和敏感性。此外，我们还利用全基因组DNA甲基化谱证明了cGAS和STING的启动子超甲基化导致这些基因的协同转录沉默，从而抑制了人黑色素瘤和黑色素瘤细胞系中的STING信号 37 。因此，可以假设肿瘤细胞中有缺陷的STING信号可能代表了一种逃避免疫识别和消除的机制，以及对基于STING激动剂和TIL的免疫疗法的抗性。
在这里，我们使用宿主免疫成分或肿瘤本身中有缺陷的STING信号的黑色素瘤小鼠模型，以显示DNA甲基转移酶抑制剂可以在体内挽救肿瘤细胞固有的STING信号功能障碍，并随后通过CD8诱导更大的肿瘤消退 + t细胞依赖机制。这些发现确立了肿瘤细胞中主动STING途径在形成对STING激动剂的治疗反应中的关键作用。
结果 单独黑色素瘤细胞固有的螫刺活性不足以持久控制肿瘤 为了研究肿瘤细胞固有的螫刺活性是否会影响对螫刺激动剂疗法的抗肿瘤反应，我们注射了螫刺 gt/gt 皮下注射B16-ISG或B16-ISG-斯汀的小鼠 击倒取胜 鼠黑色素瘤细胞，并用STING激动剂ADU-S100或作为载体对照的PBS在肿瘤内处理它们(补充图。 1a ).这种方法使我们能够将肿瘤细胞固有的刺痛活动的影响与宿主免疫系统驱动的影响分开。在肿瘤注射的第二周内，虽然我们没有发现PBS处理的B16-ISG和B16-ISG-斯汀之间的肿瘤生长有显著差异 击倒取胜 肿瘤，ADU-S100对B16-ISG肿瘤的治疗延缓了它们在STING中的生长 gt/gt 小鼠(补充图。 1b ).相比之下，ADU-S100治疗没有影响B16-ISG-斯汀 击倒取胜 肿瘤生长。此外，第14天对TIL的流式细胞术分析表明CD8的频率和总数显著增加 + 与对照组相比，经STING激动剂治疗的B16-ISG肿瘤中的t细胞(补充图。 1c，d )但不是在B16-ISG-斯汀戈 击倒取胜 肿瘤。与B16-ISG相似，STING激动剂治疗也在第14天延迟了两种不同黑色素瘤小鼠模型B16-F10和Yumm1.7的肿瘤生长(补充图。 1e ).这些结果表明，在低肿瘤负荷状态下，黑色素瘤固有的STING活性有助于T细胞启动和T细胞肿瘤运输。然而，当我们进行一个持续时间更长的类似实验时，在第20天，ADU-S100在B16-ISG肿瘤中失去了维持肿瘤控制的能力(图。 1a、b ).STING的B16-F10模型也得出了类似的结果 gt/gt 老鼠(图。 1c ).此外，我们没有发现CD8频率的显著差异 + 与对照组相比，浸润B16-ISG或B16-F10 ADU-S100治疗肿瘤的t细胞(图。 1d–g ).总之，这些结果表明，尽管黑色素瘤固有的螫刺活性可以在肿瘤生长的早期阶段(1-2周)介导抗肿瘤免疫反应，但它不足以介导对螫刺激动剂治疗的长期肿瘤控制。
STING激动剂治疗方案示意图。成群的刺 gt/gt 小鼠皮下注射1.5 × 10 5 第0天B16-ISG或B16-F10。在肿瘤注射后的第5、8、10、12、14、16、18和20天，用PBS或50 μg ADU-S100( a ).B16-ISG肿瘤生长曲线( b )和B16-F10( c )在斯汀戈 gt/gt 用PBS对照或ADU-S100处理的小鼠，如( a ).数据显示为平均值SEM，代表两个独立的实验。 n = 4只和5只小鼠( b )和 n = 5只和6只小鼠( c )分别用于ADU-S100和对照组。CD8的频率 + CD45内的细胞 + B16-ISG的人口( d )和B16-F10( f )用PBS对照或ADU-S100治疗的肿瘤( n =每组4只小鼠)。数据显示为平均值±SD，代表两个独立的实验。通过双边t检验确定统计显著性(ns，不显著)。代表性流式细胞仪图 d 和 f 显示在中 e 和 g ，分别为。
启动子高甲基化抑制小鼠黑色素瘤细胞系中STING的表达 我们最近报道，在一个显著的人类黑色素瘤细胞系亚群中，STING表达下调或缺失，主要是通过启动子高甲基化驱动的沉默 29 ,37 ，这可以通过DNA甲基化的药理学抑制来恢复(图。 2a ).这些发现使我们假设小鼠黑色素瘤细胞系中STING启动子的超甲基化也能介导它们的协同转录沉默，并导致STING信号功能的损伤。为了测试这一点，我们在B16-F10和Yumm1.7黑色素瘤细胞系用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2 '-脱氧胞苷(5AZADC，地西他滨)治疗前后，使用Infinium小鼠甲基化BeadChip微阵列进行了全基因组DNA甲基化谱分析。虽然我们在两种细胞系中都观察到了STING启动子的高甲基化，如β值所示，但用5AZADC处理后，STING启动子甲基化水平下降(图。 2b，c ).我们还发现，在用5AZADC处理后，B16-F10和Yumm1.7细胞系中STING蛋白表达的重建(图。 2d，e )进一步表明启动子超甲基化驱动的sting沉默，并表明它们在STING的表观遗传调节方面与人类黑素瘤细胞系相似。为了进一步评估去甲基化是否可以恢复STING信号的功能激活，在5AZADC治疗后，我们接下来用ADU-S100刺激这些细胞系，并评估STING依赖性下游效应。我们观察到IFN-β的诱导增加了46倍( p < 0.0001) (Fig. 2f )和经5AZADC预处理的B16-F10和Yumm1.7细胞中MHC类表面表达的显著增加(图。 2g，h )与暴露于ADU-S100后的未治疗对照组相比。尽管程度较轻，我们也在B16-F10和Yumm1.7细胞系中观察到5AZADC介导的IFN-β诱导和MHC类上调(图。 2f–h
超甲基化介导的STING沉默及其通过STING表观遗传重编程逆转的示意图 低的 黑色素瘤细胞( a ).β值热图显示了10个区域的DNA甲基化水平 讽刺 B16-F10和Yumm1.7小鼠黑素瘤细胞系中的CpG探针，用和不用5AZADC处理( b ).中值β值为10 讽刺 B16-F10和Yumm1.7细胞中的CpG探针。数据显示为平均值±SD( n = 3个生物重复)并且代表两个独立的实验( c ).用或不用5AZADC处理的B16-F10和Yumm1.7细胞中STING表达的免疫印迹分析。α-微管蛋白用作装载对照( d ).图像是三个独立实验的代表。用或不用5AZADC处理的每个细胞系的总STING与α-微管蛋白的比率( e ).在5AZADC处理后，用STING激动剂ADU-S100刺激B16-F10和Yumm1.7细胞24小时。使用ELISA测量细胞培养上清液中IFN-β的诱导，并报告为平均SD( n = 3个生物重复) ( f ).代表性直方图( g )和所示细胞系上MHC I (H2-Kb)表达的平均荧光强度(MFI)( n = 3个生物重复)。数据显示为平均值SD( h ).数据代表三个独立的实验( f –h ).统计显著性通过双侧t检验来确定( b 和 c )和单向方差分析( f 和 h )(ns，不显著)。
与我们5AZADC触发的IFN-β表达的发现一致，多项研究表明，DNA去甲基化剂和其他表观遗传调节剂可以通过去抑制内源性逆转录病毒(ERVs)和激活MDA5-MAVS途径，在癌细胞中诱导I型IFN应答 38 ,39 ,40 。为了确定对5AZADC治疗的MHC类上调是否通过I型IFN信号传导发生，我们在B16-F10和Yumm1.7细胞中使用IFNAR阻断抗体阻断了I型IFN受体。事实上，在两种细胞系中，IFNAR的阻断抑制了5AZADC诱导的MHC类上调(补充图。 2a，b )以及LMP2和TAP1的上调，它们是MHC类抗原加工途径的两个关键成分(补充图。 2c，d
为了评估5AZADC预处理和ADU-S100刺激对IFN-β诱导和MHC类上调的深远影响是否由STING信号的激活驱动，我们使用B16-ISG和B16-ISG-STING进行了类似的实验 击倒取胜 细胞(补充图。 3a ).类似于我们在B16-F10和Yumm1.7细胞中的观察，我们发现IFN-β的诱导增加了36倍( p < 0.0001) (Supplementary Fig. 3b )以及I类MHC表面表达增加4.4倍( p < 0.0001) (Supplementary Fig. 3c，d )在5AZADC预处理的B16-ISG细胞中对STING激动剂刺激的反应，但在5AZADC预处理的B16-ISG-STING中没有 击倒取胜 细胞。尽管我们在B16-ISG和B16-ISG-斯汀都观察到了5AZADC诱导的MHC类上调 击倒取胜 细胞系(补充图。 3c，d )，与5AZADC预处理的B16-ISG细胞不同，在5AZADC预处理的B16-ISG-STING中，用STING激动剂进一步刺激并没有增加MHC类的表面表达 击倒取胜 这表明DNA去甲基化诱导的黑色素瘤细胞对激动剂刺激的反应中IFN-β产生的增加和MHC I的上调是sting介导的。总之，这些数据表明，去甲基化可以增强小鼠黑色素瘤细胞系中STING信号的功能激活。
DNMT3A和DNMT3B参与黑色素瘤蛰伤沉默 启动子高甲基化介导的人螫伤抑制的观察 37 和小鼠黑色素瘤细胞系(图。 2b，c )提出了一种可能的表观遗传机制，由DNA甲基转移酶(DNMTs)驱动，包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。为了进一步研究DNMTs在黑色素瘤刺痛沉默中的作用，我们用靶向DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的小干扰RNA (siRNA)转染了B16-F10细胞。DNMT3A和DNMT3B的缺失，而不是DNMT1的缺失，导致B16-F10细胞中STING mRNA和蛋白表达的重建(图。 3a，b ；补充图 4a ).为了直接评估这些细胞中STING信号的功能激活，我们接下来用ADU-S100刺激它们。敲除DNMT3A和DNMT3B显著增加CXCL10的STING依赖性诱导(高达2.5倍， p < 0.0001) and IFN-β (up to 3.6-fold, p < 0.0001) in B16-F10 cells compared with siControl in response to stimulation with the STING agonist (Fig. 3c，d ).与这些发现一致的是，在B16-F10细胞中，用5AZADC药理学抑制DNA甲基化后，STING表达的重建与DNMT3A和DNMT3B表达的降低相一致(图。 3e ).在A375和SK-MEL-28两种飞机上也观察到了类似的效果 低的 人类黑色素瘤细胞系 37 (图。 3f ).此外，使用公开可用的cBioPortal数据集 41 我们发现了一个负相关，尽管并不显著 讽刺 和 DNMT3A (皮尔逊相关系数= 0.41)， DNMT3B (皮尔逊相关系数= 0.28)(图。 3g )，以及 DNMT1 mRNA水平(皮尔逊相关系数= 0.13)(补充图。 4b )在转移性黑色素瘤样本中，表明它们参与黑色素瘤刺痛沉默。
定量RT-PCR分析 讽刺 用DNMT3A (siDNMT3A)或DNMT3B (siDNMT3B)或非靶siRNA (siControl)特异性siRNA转染的B16-F10细胞中的mRNA表达( n = 3).数据显示为平均值±SD，代表两个独立的实验。使用单向ANOVA( a )(ns，不显著)。STING、DNMT3A和DNMT3B在指定细胞中表达的免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作加载对照( b ).CXCL10的水平( c )和IFN-β( d )在细胞培养上清液中，使用ELISA测量并报告为平均值SD( n = 3个生物重复)。数据代表两个独立的实验( c , d ).通过单因素方差分析确定统计学显著性。B16-F10中STING、DNMT3A和DNMT3B表达的免疫印迹分析( e )和A375和SK-MEL-28人黑素瘤细胞系( f )进行或不进行5AZADC治疗。图像在( b )和( e –f )是三个独立实验的代表。相关分析 讽刺 mRNA表达 DNMT3A 和 DNMT3B 在转移性黑色素瘤样品中( n = 21)使用皮尔逊相关系数从cBioPortal数据库中获得。所示的P值是从皮尔逊相关测试中得出的双侧P值( g ).
去甲基化可改善螫伤患者对螫伤激动剂治疗的黑色素瘤反应 gt/gt 老鼠 检验去甲基化介导的STING的重建和随后的STING信号的拯救 低的 黑色素瘤细胞可以提高激动剂诱导的体内抗肿瘤免疫反应，我们在STING中建立了B16-F10和Yumm1.7皮下肿瘤 gt/gt 小鼠，并用5AZADC和ADU-S100的组合在肿瘤内治疗它们(图。 4a ).虽然单独使用5AZADC或ADU-S100的治疗在延迟肿瘤生长方面无效，但是5AZADC与ADU-S100的联合治疗在B16-F10( p < 0.05 on day 22) and Yumm1.7 (p < 0.0001 on day 21) models (Fig. 4b，c ).类似地，ADU-S100和5AZADC的联合治疗显著延迟了B16-ISG侵袭性模型中的肿瘤生长( p < 0.0001 on day 21) (Fig. 4d );然而，它未能在缺乏STING的B16-ISG-STING中诱导肿瘤控制 击倒取胜 型号(图。 4e )表明了sting在介导对联合疗法的抗肿瘤反应中的关键作用。使用免疫印迹分析，我们进一步证实了B16-F10和Yumm1.7肿瘤在体内用5AZADC治疗后STING蛋白表达的重建(图。 4f，g ).与这些发现一致的是，我们观察到转录因子的显著增加。 Ifnb1 (p < 0.0001) and H2-k1 (p < 0.0001) genes downstream of STING signaling in tumors treated with the combination therapy compared to the agonist alone (Fig. 4h ).总的来说，这些结果表明表观遗传重编程可以恢复黑色素瘤固有的刺痛信号缺陷，并因此启动对体内刺痛激动的治疗反应。
STING激动剂和5AZADC治疗方案示意图。成群的刺 gt/gt 小鼠皮下注射1.5 × 10 5 B16-F10或Yumm1.7或1 × 10 5 B16-ISG或B16-ISG-斯汀 击倒取胜 用50μg ADU-S100和/或0.1 mg/kg的5AZADC或PBS( a ).B16-F10肿瘤生长曲线( b )，Yumm1.7( c )，B16-ISG( d )和B16-ISG-斯汀 击倒取胜 e )在斯汀戈 gt/gt 根据( a ).数据显示为平均SEM，代表两个独立实验( n =每组5只小鼠( b ), n = 4、4、4和5只小鼠( c ), n = 4、6、5和7只小鼠( d ), n = 6、6、5和6只小鼠( e )分别为对照、5AZADC、ADU-S100和5AZADC + ADU-S100组)。STING、DNMT3A和DNMT3B在STING肿瘤病变中表达的免疫印迹分析 gt/gt 接受或不接受5AZADC治疗的携带B16-F10或Yumm1.7肿瘤的小鼠。β-肌动蛋白用作加载对照( f ).图像是两个独立实验的代表。使用ImageJ 1.53 a版软件( g ).定量RT-PCR分析 干扰素b1和H2-k1 螫伤中B16-F10肿瘤的mRNA表达 gt/gt 用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的小鼠(n = 3个生物重复)。数据显示为平均值±SD，代表两个独立的实验( h ).统计学显著性通过双向( b –e )或单向方差分析( h )(ns，不显著)。
黑色素瘤对5AZADC和ADU-S100联合治疗的反应依赖于CD8 + t细胞 鉴于CXCL10在调节CXCR3中的重要作用 + t细胞运输到肿瘤中，我们接下来测试了是否去甲基化介导的STING信号的拯救 低的 B16-F10黑色素瘤模型可以恢复黑色素瘤固有的CXCL10诱导。定量逆转录PCR分析表明增加了2.6倍( p < 0.0001) in CXCL10 螫伤中B16-F10肿瘤的基因表达 gt/gt 用5AZADC和ADU-S100联合治疗后的小鼠(图 5a ).这种CXCL10诱导的增加与肿瘤内CXCR3的高频率相关 + CD8 + t细胞(图。 5b )，证明使用去甲基化试剂逆转STING的表观遗传沉默可以促进CD8的肿瘤浸润 + t细胞。为了直接评估所观察到的抗肿瘤作用是否归因于功能性肿瘤抗原特异性CD8的产生 + t细胞，我们接下来进行抗体介导的CD8 + 或者CD4 + 携带B16-F10病毒的叮咬处的t细胞 gt/gt 接受联合治疗的小鼠。通过脾细胞的流式细胞术分析证实了成功的耗尽(补充图。 5 ).而CD4的减少 + t细胞没有改变肿瘤控制，CD8的减少 + t细胞完全消除了联合治疗的抗肿瘤活性( p < 0.001 on day 22) (Fig. 5c ).这些数据表明CD8 + t细胞对于5AZADC和ADU-S100联合治疗的疗效至关重要。
定量RT-PCR分析 Cxcl10 螫伤中B16-F10肿瘤的mRNA表达 gt/gt 用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的小鼠( n = 3个生物重复)。数据显示为平均值±SD，代表两个独立的实验( a ).显示CXCR3频率的代表性流式细胞仪图 + CD8 + 用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的B16-F10肿瘤中的t细胞。数据代表两个独立的实验( b ).讽刺 gt/gt 用PBS或5AZADC + ADU-S100联合CD8-或CD4-消耗抗体治疗患有B16-F10肿瘤的小鼠(见方法)。显示了肿瘤生长( c) 。数据显示为平均值SEM( n = 4只小鼠用于PBS对照，5AZADC + ADU-S100 + α-CD4和5AZADC + ADU-S100 + α-CD8和 n = 5只小鼠用于5AZADC + ADU-S100组)。数据代表两个独立的实验( a –c ).统计显著性通过单向( a )或双向方差分析( c ).(ns，不显著)。
CD8 + 5AZADC和ADU-S100组合治疗的小鼠中的til显示较少的衰竭表型 为了描述5AZADC和ADU-S100联合治疗如何影响肿瘤微环境，我们接下来评估了CD8的丰度和表型 + 蒂尔斯。流式细胞术分析表明，联合治疗导致肿瘤浸润CD8的频率显著增加 + t细胞( p < 0.05) (Fig. 6a，d ).这些CD8 + 相对于对照组治疗的肿瘤，TIL还表达较低水平的抑制性受体LAG-3和PD-1，表明用5AZADC和ADU-S100的联合治疗可以诱导功能性CD8 + 活化而非衰竭状态的t细胞群(图。 6b、c、e–h ).这些发现，以及在缺乏CD8的情况下 + t细胞联合治疗没有产生治疗效果(图。 5c )，强调CD8的重要性 + t细胞在去甲基化介导的肿瘤细胞内源性刺激再激活中诱导抗肿瘤反应。
CD8的频率 + CD3内的细胞 + 人口( a )和LAG-3 + (b )和PD-1 + (c )CD3内的细胞 + CD8 + Yumm1.7 STING中的肿瘤人口 gt/gt 用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的小鼠。 n = 3、3、4和4只小鼠( a )和 n = 3、3、4和5只小鼠( b , c )分别作为对照组、5AZADC组、ADU-S100组和5AZADC + ADU-S100组。代表性流式细胞仪图 a , b ，以及 c 显示在中 d , e ，以及 f ，分别为。MFI( g )和代表性直方图( h )的LAG-3 + 和PD-1 + CD3内的细胞 + CD8 + Yumm1.7 STING中的肿瘤人口 gt/gt 用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的小鼠。 n = LAG-3 MFI的3、3、4和4只小鼠，以及 n = 3、3、4和5只小鼠的PD-1 MFI在( g )分别作为对照组、5AZADC组、ADU-S100组和5AZADC + ADU-S100组。数据代表两个独立的实验。数据显示为平均值±标准差。通过单因素方差分析确定统计显著性(ns，不显著)。
5AZADC和ADU-S100的联合治疗促进CD8的活化和效应功能 + t细胞 为了评估联合应用ADU-S100和5AZADC的肿瘤内治疗是否诱导全身性免疫效应，我们检测了荷瘤小鼠脾脏中T细胞的频率和分化状态。在脾T细胞群中，用5AZADC和ADU-S100联合治疗导致CD8百分比增加 + t细胞(图。 7a ；补充图 6a ).我们还观察到更高频率的激活CD69 + CD44 + CD8 + 用5AZADC和ADU-S100的组合治疗的荷瘤小鼠的脾T细胞与用任一种单一药物治疗的小鼠的脾T细胞的比较(图。 7b，c ；补充图 6b ).此外，联合治疗显著增加了CD8的中枢记忆表型 + T细胞(T 厘米 ，CD44 + CD62L + ; p < 0.01) in the spleens of tumor-bearing mice (Fig. 7d，e ；补充图 6c ).同样，CD8 + 用ADU-S100和5AZADC联合治疗的肿瘤中的T细胞显示更高的T细胞频率 厘米 (补充图 7a，b ).此外，激活标记CD69 + 和CD44 + 在CD8上以更高的频率表达 + 与用ADU-S100或5AZADC单独治疗的肿瘤相比，用联合疗法治疗的肿瘤的TIL( p < 0.01) (Supplementary Fig. 8a–c ).接下来，我们对荷瘤小鼠的脾细胞进行细胞内细胞因子染色，以确定联合治疗是否也会影响CD8的功能状态 + t细胞。脾脏CD8 + 相对于单独用ADU-S100处理的小鼠，用5AZADC和ADU-S100的组合处理的荷瘤小鼠中的t细胞表达更高水平的IFN-γ和TNF-α(图。 7f，g ；补充图 6d，e )表明联合治疗刺激了更强的全身性抗肿瘤T细胞反应。总之，这些结果表明，肿瘤细胞中去甲基化介导的STING再激活可以促进CD8的扩增、活化和效应功能 + t细胞。
讽刺 gt/gt 如图所示，用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100对患有Yumm1.7肿瘤的小鼠进行肿瘤内治疗。 4a ；接种肿瘤细胞后21天收获脾脏，用流式细胞仪分析。显示的是脾CD8的频率 + CD3内的细胞 + 人口( a )，CD69的频率 + CD44 + CD8内的细胞 + 人口( b )，CD44的代表性直方图 + CD3内的细胞 + CD8 + 人口( c )，中央记忆的频率(T 厘米 ，CD44 + CD62L + )CD8 + t细胞( d )，有代表性的饼图显示了确定的T细胞亚群的相对比例[天真:CD44 - CD62L + ；效应子:CD44 - CD62L - ；效应记忆(EM): CD44 + CD62L - ；中央记忆(CM): CD44 + CD62L + ] (e )、IFN-γ的细胞内表达( f )和TNF-α( g )在CD8中 + t细胞。数据代表两个独立的实验。 n = 3只小鼠用于PBS对照和5AZADC，以及 n = ADU-S100和5AZADC + ADU-S100组的4只小鼠( a –b ), (d )和( f –g ).数据显示为平均值±标准差。代表性的流式细胞仪图 a , b , d ，以及 e , f ，以及 g 见补充图。 第6(a)、(b)、(c)、(d)和(e)条 ，分别为。通过单因素方差分析确定统计显著性(ns，不显著)。
去甲基化可以进一步提高具有完整螫刺活性的小鼠中螫刺激动剂的效力 为了进一步研究肿瘤细胞中去甲基化诱导的STING再激活在增强具有完整STING活性的宿主对STING激动剂治疗的抗肿瘤反应中的功能重要性，我们给C57BL/6小鼠注射B16-F10或Yumm1.7肿瘤细胞，并用ADU-S100和5AZADC的组合治疗它们(图。 8a ).在这种情况下，STING在宿主抗原呈递细胞中起作用，与5AZADC或载体处理的对照组相比，单独的ADU-S100导致肿瘤控制；然而，在B16-F10和Yumm1.7模型中，联合治疗在抑制肿瘤生长方面更有效(图。 8b，c ).尽管CD8的百分比没有可检测的差异 + TIL(图。 8d )，用ADU-S100和5AZADC的组合治疗的肿瘤更富含表达CD8的效应细胞因子 + t细胞比单独用ADU-S100处理的t细胞多(图。 8e，f ).这些数据表明，肿瘤细胞中螫刺活性的恢复可以增强甚至在螫刺完整的宿主中对螫刺激动剂疗法的抗肿瘤反应，并且表明肿瘤和宿主来源的螫刺一起可以在促进抗肿瘤免疫中起关键作用。
STING激动剂和5AZADC治疗方案示意图。各组C57BL/6小鼠皮下注射1.5 × 10 5 B16-F10或Yumm1.7细胞，并用50μg ADU-S100和/或0.1 mg/kg的5AZADC或PBS( a ).B16-F10肿瘤生长曲线( b )和Yumm1.7( c )在C57BL/6小鼠中，根据( a ).数据显示为平均SEM( b –c ).控制， n = 3;5AZADC， n = 4;ADU-S100， n = 6;以及5AZADC + ADU-S100， n = 7只老鼠在( b )和控制， n = 6;5AZADC， n = 5;ADU-S100， n = 5;以及5AZADC + ADU-S100， n = 5只老鼠在( c ).CD8的频率 + t细胞( d )和表达IFN-γ的CD8 + t细胞( e )在第21天用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的C57BL/6小鼠的Yumm1.7肿瘤中。 n = 5，4，4，4只小鼠在( d )和 n = 4，4，4，4只老鼠在( e )分别作为对照组、5AZADC组、ADU-S100组和5AZADC + ADU-S100组。数据显示为平均值±标准差。CD8细胞内IFN-γ和TNF-α细胞因子染色的代表性流式细胞仪图 + 在第21天用PBS、5AZADC、ADU-S100或5AZADC + ADU-S100处理的C57BL/6小鼠的Yumm1.7肿瘤中的t细胞( f ).数据代表两个独立的实验。统计学显著性通过双向( b –c )或单向方差分析( d –e )(ns，不显著)。
讨论 在多种临床前癌症模型中，通过瘤内注射合成的环状二核苷酸直接激活宿主STING途径已被证明是一种有吸引力的治疗策略 22 ,25 ,42 。然而，目前在癌症患者中测试作为单一疗法或与免疫检查点抑制剂组合的刺痛活化药物的临床试验迄今为止提供了很少(如果有的话)客观反应的证据 26 ,27 ,28
这种对STING激动剂治疗结果的差异增加了这样一种可能性，即靶向STING途径不仅在宿主的抗原呈递细胞中具有功能相关性，这是以前临床前研究的焦点，而且在肿瘤细胞中具有良好记录的表观遗传学驱动的功能障碍STING活性，跨越几种人类癌症类型，包括黑色素瘤 29 ,35 ,43 ,44 。尽管存在这种常见的抑制，但使用表观遗传调节剂靶向和恢复肿瘤细胞中的STING信号传导的能力 35 ,37 为探索肿瘤细胞固有的STING活性的表观遗传重编程是否能提高STING激动剂的治疗效果提供了理论基础。在这项研究中，我们使用多种方法在缺乏螫刺和有足够螫刺的宿主体内研究了这一原理。
与我们之前在人类黑色素瘤中的发现一致 37 ，我们在两种不同的鼠黑素瘤细胞系中发现启动子高甲基化驱动的STING沉默。在体外和体内，用5AZADC对DNA甲基化的药理学抑制导致了STING蛋白表达的重建，表明在这些实验模型中，调控STING表达的常见表观遗传机制的参与。我们进一步表明，去甲基化介导的STING沉默的逆转不仅在体外实验中大大增加了激动剂诱导的肿瘤细胞产生IFN-β，而且在STING缺陷小鼠的肿瘤内也是如此。在宿主树突状细胞中，STING介导的IFN-β诱导已被很好地表征，并显示出对其活化和细胞毒性T细胞的交叉引发是必需的 22 ,23 。类似地，对放射治疗的适应性免疫反应的启动与树突状细胞介导的IFN-β诱导有关 45 。然而，令人信服的临床和实验证据支持肿瘤细胞自身产生的IFN-β在介导对联合免疫检查点抑制剂的放射治疗的抗肿瘤反应中的重要性 46 ,47 ,48 。与这些研究一致，我们发现去甲基化介导的肿瘤中依赖于STING的IFN-β产生的恢复导致了更好的肿瘤控制。肿瘤细胞中的IFN-β诱导可对肿瘤细胞和APCs产生直接作用 16 ,47 。事实上，我们先前已经表明，在人类黑色素瘤细胞系中，STING介导的IFN-β诱导可以增加其表面MHC类的表达，因此使其成为细胞毒性CD8的更好靶点 + t细胞识别和杀伤 29 ,37 。癌细胞产生的IFN-β在Batf3依赖的树突状细胞的募集和激活中的重要性也已经在不同的环境中得到证实 47 ,49 。尽管机制尚不清楚，但可以想象，去甲基化介导的肿瘤中STING依赖性IFN-β产生的恢复可以在驱动肿瘤浸润性树突细胞的成熟和活化中发挥更积极和直接的作用。
与我们在人类黑色素瘤细胞系中的观察结果相似，在去甲基化介导的STING信号激活后，小鼠黑色素瘤中CXCL10上调。与CXCL9(另一种CXCR3结合趋化因子)一起，CXCL10是肿瘤特异性CD8募集的主要趋化因子 + t细胞进入肿瘤 31 ,32 。此外，作为12-趋化因子基因特征分类器的一员 33 ，其表达与肿瘤相关的三级淋巴结构的存在相关 50 ,51 ,52 其在黑色素瘤和许多其他癌症类型中迅速成为强有力的预后标记 53 ,54 ,55 。在我们的研究中，肿瘤局部CXCL10诱导与CD8更高频率相关 + 肿瘤内的t细胞。这些数据表明，STING功能肿瘤可以启动CXCL10/CXCR3轴，并随后引导效应T细胞运输和进入肿瘤部位。此外，CXCL10已被证明促进效应T细胞的产生和功能 56 ,57 。根据这些数据，我们发现了CD8 + t细胞依赖机制介导联合治疗的抗肿瘤效应。这一发现也与我们观察到的在去甲基化介导的STING信号恢复后，人和小鼠黑色素瘤细胞中依赖于STING的MHC类上调相一致，STING信号可以增强其抗原性和对CD8裂解的敏感性 + t细胞 29 ,37 。尽管有人提出STING激动剂可以通过激活促凋亡转录程序来诱导T细胞死亡 58 最近的研究表明这种作用依赖于STING激动剂的类型和剂量 59 ,60 。与小鼠螫配体DMXAA不同，用包括cGAMP在内的环状二核苷酸刺激T细胞不会导致T细胞死亡。此外，最近的两个报告表明，T细胞固有的STING信号可以控制CD8的分化和效应功能 + 和CD4 + t细胞 60 ,61 。虽然我们最初的体内研究是在STING进行的 gt/gt T细胞缺乏螫刺并因此对螫刺激动剂不敏感的小鼠，我们后来在螫刺充足的C57/BL6小鼠中的实验没有表明对单独用ADU-S100处理或当与5AZADC组合时处理的小鼠的T细胞的频率或功能有任何不利影响。
此外，与CD8的动员和扩大相一致 + 肿瘤内的t细胞，我们发现脾CD8的频率增加 + 肿瘤内注射ADU-S100和5AZADC治疗的荷瘤小鼠中的t细胞。这些脾脏CD8 + t细胞主要表现出效应/记忆表型，表现为抗原经历和活化标记物(包括CD44和CD69)的高表达，以及IFN-γ效应细胞因子产生细胞的高频率。基于这些观察，很可能由拯救和激活STING信号驱动的局部肿瘤细胞诱导的I型IFN反应可以促进系统性抗肿瘤CD8 + t细胞免疫。这一观点被最近的两个出版物进一步支持，这两个出版物描述了癌细胞及其I型IFN产物在启动CD8中的新作用 + 通过树突状细胞的MHC类修饰的t细胞反应 49 ,62 。尽管需要额外的实验来完全理解我们观察到的导致全身性激活的因素，不管确切的机制如何，我们的数据表明通过肿瘤内联合治疗靶向肿瘤细胞固有的STING信号能够引发抗肿瘤CD8 + t细胞反应。
由于肿瘤细胞中STING途径的恢复和再激活可以恢复其抗原性以及T细胞肿瘤运输，未来工作的关键问题将是这种策略是否可以提高黑色素瘤患者中基于T细胞的免疫疗法的疗效，特别是那些涉及自体TIL过继细胞转移的患者。类似地，将来确定除黑色素瘤以外的实体瘤中靶向肿瘤细胞固有的STING活性如何影响免疫治疗结果将是重要的。通过表观遗传重塑恢复肿瘤细胞固有的STING活性也可能有利于CAR T细胞治疗，这是通过调节肿瘤微环境并为CAR T细胞运输和在实体瘤中的持续存在提供有利环境来实现的 63
总之，我们的数据表明黑色素瘤细胞中STING的表观遗传学沉默不仅是肿瘤内在免疫逃避机制的标志，而且确实可以赋予对STING激动剂治疗的抗性。因此，我们已经表明，临床上可获得的DNA甲基化抑制剂与STING激动剂的合理组合可以在STING环境中产生强烈的抗肿瘤反应 低的 黑素瘤的鼠模型。因此，通过表观遗传重编程对肿瘤细胞固有的STING信号缺陷进行识别和药理学修复，对于在临床上成功使用STING激动剂疗法可能是至关重要的。虽然进一步确定每种成分的最佳剂量水平和治疗方案还需要更多的工作，但我们的研究提供了一个框架来设计适当的临床治疗模式，为黑色素瘤和其他实体瘤选择合适的患者。
