人表皮生长因子受体2 (HER2)是一种受体酪氨酸激酶，在乳腺、胃和其他实体肿瘤中起致癌作用。然而，抗HER2疗法目前仅被批准用于治疗乳腺癌和胃/胃食管结合部癌，并且治疗耐药性仍然是个问题。在这里，我们设计了一种抗HER2 IgG1双特异性双抗体(Ab)，zanidatamab，与曲妥珠单抗和曲妥珠单抗加pertuzumab (tras + pert)的组合相比，具有独特和增强的功能。Zanidatamab结合邻近的HER2分子 反式 并启动明显的HER2重组，如极化的细胞表面HER2帽和大的HER2簇所示，这在曲妥珠单抗或tras + pert中没有观察到。此外，zanidatamab，而不是trastuzumab或tras + pert，在体外诱导针对高HER2表达肿瘤细胞的有效补体依赖性细胞毒性(CDC)。Zanidatamab还介导HER2内化和下调，抑制细胞信号传导和肿瘤生长，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和吞噬作用(ADCP)，并在表达HER2的异种移植模型中显示出比tras + pert更好的体内抗肿瘤活性。总的来说，我们表明zanidatamab具有多种不同的作用机制，这些机制来源于双极性HER2参与的结构效应。
介绍 HER2在大约20%的乳腺癌和胃/胃食管结合部(GEJ)癌中过表达，并且是抗肿瘤治疗的有效治疗靶点 1 ,2 ,3 。HER2过表达激活多种信号通路，导致细胞增殖和肿瘤发生 4 。与EGFR家族的其他成员不同，HER2具有组成型活性，无需结合的活化配体即可启动信号通路。HER2过表达进一步导致HER2与EGFR家族其他成员的同型二聚化和异型二聚化，这可随后激活导致肿瘤生长的信号通路。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种经典的单克隆(单特异性)抗体(ab ),可与HER2的细胞外结构域4 (ECD4)结合，是FDA批准的首个HER2靶向疗法，用于治疗HER2过度表达的乳腺癌以及胃/胃食管结合部(GEJ)腺癌 5 。曲妥珠单抗通过抑制肿瘤细胞增殖来介导其抗肿瘤活性 6 抑制细胞信号传导 7 和抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 8 。Pertuzumab (Perjeta)是另一种HER2靶向单特异性抗体，它结合ECD2并阻断配体诱导的异二聚体驱动的激活 9 。曲妥珠单抗和pertuzumab也已经联合进行了评估(tras + pert ),其在临床前显示出增强的抗肿瘤活性 10 临床上 11 HER2阳性乳腺癌。
几种抗HER2药物，包括曲妥珠单抗、pertuzumab、lapatinib、neratinib、曲妥珠单抗emtansine (T-DM1)和曲妥珠单抗deruxtecan，已被批准用于治疗HER2阳性乳腺癌。除乳腺癌外，曲妥珠单抗和曲妥珠单抗deruxtecan被批准用于治疗胃癌 3 。然而，其他已批准的抗HER2疗法的临床益处，如拉帕替尼、T-DM1和pertuzumab，并没有普遍转化为HER2阳性胃癌。特别是，在HER2表达的胃癌/GEJ癌中，与曲妥珠单抗加化疗相比，tras + pert加化疗没有显著改善OS 12
除了乳腺癌和胃癌，HER2在其他实体瘤中也有过表达，包括胆道癌、结肠直肠癌、胰腺癌和卵巢癌等 3 但是HER2疗法尚未在这些癌症中获得批准。此外，对批准的HER2疗法的内在和获得性抗性仍然是一个临床问题，因为许多患者随着时间的推移表现出疾病进展 13 。因此，为了将HER2靶向治疗的临床益处扩展到其他HER2表达实体瘤，并治疗在标准护理治疗后发展的复发或转移性疾病患者，需要具有更强抗肿瘤活性和分化作用机制(MOA)的新型抗HER2治疗 3
在设计具有增强的抗肿瘤活性的抗HER2疗法的努力中，据报道，与曲妥珠单抗或亲本抗体组合相比，几种抗HER2双特异性(双paratopic)抗体具有增强的抗肿瘤活性 14 ,15 ,16 ,17 ,18 。双抗原抗体是一类双特异性抗体，靶向同一靶标上的两个非重叠表位。这些抗HER2双极性抗体显示受体内化和受体降解增加 17 ,19 可能由受体交联促进 20 ,21 ,22 ，这导致增强的肿瘤生长抑制活性。然而，这些双亲抗体都没有显示出双亲抗体或双亲抗体组合中所没有的独特的细胞毒性抗肿瘤机制。因此，迄今为止，双亲型抗体被描述为一种“组合”双特异性抗体，因为与具有相同特异性的亲本抗体组合相比，它们不提供额外的功能 23
抗肿瘤抗体通常表现出多种可能同时起作用并相互重叠的作用，例如中和靶抗原和激活细胞介导的细胞毒性。补体依赖的细胞毒性(CDC)途径的参与被认为是增加抗肿瘤抗体治疗效果的机制 24 并且是针对B细胞靶向单克隆抗体(包括利妥昔单抗和ofatumumab)的已报道的MOA之一 25 ,26 ,27 ,28 。曲妥珠单抗、pertuzumab和tras + pert通过多种MOAs介导抗肿瘤活性，但在人血清存在下不能在HER2表达细胞中引发CDC 29 ,30 ,31 。经典补体途径的参与受许多因素控制，包括抗原大小和密度，这些因素影响抗原-Ab复合物呈现允许有效C1q结合的几何形状的能力 32 。最佳CDC活性需要Ab抗原簇中Ab Fc结构域的六聚体组织 33 。在靶向Abs的CDC感受态B细胞(CD20)中，与利妥昔单抗相比，ofatumumab具有更强的CDC活性 28 ,34 ，这可能是由于Abs独特的膜近端表位和CD20结合动力学，其使得几何结构能够促进更大的C1q结合和补体激活 27 ,34 。增强CDC的策略，包括Ab六聚化 33 ,35 和Fc突变 36 在临床前研究中显示出增强抗肿瘤活性的前景。例如，六聚化用于产生具有增强的体外CDC活性的靶向抗CD37双抗原抗体的B细胞 37 。我们假设工程化的增强受体交联和聚集的双极性抗体可能提供结合C1q和参与这种有效抗肿瘤机制所需的受体-抗体组织，并维持和/或增强所有其他可测量的抗肿瘤MOA，归因于批准的抗HER2抗体治疗。
我们对zanidatamab(以前称为ZW25)进行了全面的机制评估，这是一种针对HER2的ECD4和ECD2的人源化双抗原IgG1样抗体。我们发现zanidatamab在表达HER2的肿瘤中通过多种MOAs介导体外和体内抗肿瘤活性，包括增加肿瘤细胞结合，HER2内化，抑制细胞信号传导和肿瘤生长，以及ADCC和ADCP。此外，我们发现zanidatamab在HER2过表达细胞中引发CDC，这种功能在曲妥珠单抗、pertuzumab或tras + pert组合中没有观察到。我们证明了zanidatamab结合的几何结构及其协同作用于邻近HER2分子的能力 反式 导致聚集HER2的能力提高，并具有诱导CDC的能力。
结果 zanidatamab的工程和建设 使用IgG1样异二聚体Azymetric构建Zanidatamab 铥 Fc平台 38 ，具有连接到重链1的抗HER2-ECD4单链可变片段(scFv)和重链2上的抗HER2-ECD2片段抗原结合(Fab)结构域(图。 1a ).原始前体双极性分子的scFv和Fab臂与HER2 ECD结合 K D 如通过使用单价单臂Ab (OAA)构建体的表面等离子体共振(SPR)所确定的，分别为1 nM和15 nM(补充表 1 ).
a Zanidatamab是一种人源化的双极性免疫球蛋白1 (IgG1)样抗体，具有结合HER2的近膜ECD4的scFv(浅蓝色)和结合HER2的ECD2二聚化结构域的Fab(深蓝色), trastuzumab和pertuzumab分别靶向相同的结构域。 b 代表性的类平均TEM图像，来源于216张图像，显示zanidatamab的3叶结构，具有来自单个实验的scFv、Fab和Fc区域的推定归属。 c 与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗相比，扎尼达单抗以更高的ab饱和度与肿瘤细胞系结合。流式细胞术用于定量zanidatamab、trastuzumab、pertuzumab和tras + pert (1:1)与SK-BR-3肿瘤细胞的结合。在…里 c ，数据为平均值SEM，来自 n = 3 独立实验。Ab结合SK-BR-3细胞的门控策略( c )如补充图所示。 11a 。源数据在源数据文件中提供。
以前有报道称抗体组合和双极性抗体可以诱导靶抗原交联，导致受体驱动的内化和受体下调增加 20 ,21 ,22 。我们假设，与HER2上两个非重叠表位结合的双抗原抗体会交联HER2，并且对抗HER2-ECD2 Fab或抗HER2-ECD4 scFv的亲和力增强会进一步增强HER2交联。计算模型显示，增加较弱的抗ECD2 Fab臂的亲和力将对双极性抗体的交联能力产生最大影响(补充结果；补充图 1 ).基于这些建模结果，我们使用结构导向方法将一系列突变工程化到较低亲和力的亲本抗-ECD2 Fab中，并将其筛选为OAA，以鉴定具有增加的抗-HER2结合亲和力的候选物。通过差示扫描量热法(DSC)测定，一个变体表现出与亲本Ab相似的热稳定性(补充图。 1e )，更重要的是，它与a K D 1.7 nM，用于结合HER2 ECD2(补充表 1 ).这种亲和力提高的Fab被整合到最终的抗HER2双抗原抗体zanidatamab中。Zanidatamab结合的人HER2明显低于纳摩尔 K D 0.74纳米，由SPR测定(补充表 2 ).
Zanidatamab通过透射电子显微镜(TEM)负染色成像以研究其结构特征。扎尼达单抗在溶液中呈单分散状态(补充图。 1g，h )，TEM成像显示zanidatamab没有寡聚化或聚集。TEM图像的二维平均显示zanidatamab似乎具有典型的Ab“Y”形，具有3个不同的叶，一个看起来像哑铃，另一个看起来像较小的叶，第三个看起来像环，与zanidatamab的Fab-scFv-Fc组成一致(图。 1a、b 补充结果)。
与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗相比，扎尼达单抗以增加的ab饱和度结合HER2表达肿瘤细胞 由于结合化学计量的差异，与典型的单特异性抗体相比，双特异性抗体已经显示出以增加的饱和度结合肿瘤细胞 15 (补充图 3a ).我们通过流式细胞术对一组表达一系列细胞表面HER2水平的肿瘤细胞系，包括SK-BR-3(her 2 3+；图。 1c )、NCI-N87 (HER2 3+)、JIMT-1 (HER2 2+)和MCF7 (HER2 1+)细胞(补充图。 2 ).Zanidatamab的表观K d 数值范围为2-5nM，在所有测试的细胞系中，最大结合容量(Bmax)比曲妥珠单抗或帕妥珠单抗高1.3-1.6倍。与zanidatamab相似，tras + pert也与所有HER2表达细胞系结合，与trastuzumab或pertuzumab相比具有更高的Bmax。
Zanidatamab结合HER2 反式 并在溶液中形成多聚体Ab:HER2复合物 了解我们的双极性抗体与HER2 ECD结合的机制，并获得有关其结合her 2 ECD能力的信息 独联体 和 反式 受体结合(结合单个HER2分子 相对 。结合两个不同的分子，补充图。 3a )，我们使用SPR来评估HER2 ECD结合的化学计量和动力学。我们比较了zanidatamab的HER2结合动力学，我们的抗HER2双极性前体分子(具有8倍低亲和力的抗ECD2结合臂；扎尼达单抗前体)和曲妥珠单抗的浓度。解离速率( k 离开 )将独立于抗体密度，因为其专性1:1结合模式；HER2 ECD仅在ECD4与曲妥珠单抗结合，与ab浓度无关(图。 2a 漫画，左)。如果双极性zanidatamab与HER2 ECD结合 独联体 ，它的解离速率 k 离开 由于曲妥珠单抗的1:1结合模式，预计也与抗体密度无关。如果双极性抗体与HER2 ECD结合 反式 ，它的解离速率 k 离开 预期将随着芯片表面上ab密度的增加而降低，因为HER2 ECD可以在高Ab密度下通过ECD2和ECD4被两个zanidatamab分子交联，但在非常低的Ab密度下不能交联(图。 2a 漫画)。SPR分析结果显示了解离率 k 离开 随着捕获的扎尼达单抗和扎尼达单抗前体密度的增加而降低，而解离速率 k 离开 曲妥珠单抗在所有测试的表面密度下保持不变(图。 2a ，对；补充表格 3 ).此外，减少了明显的 K D (增加的结合亲和力)是k的结果 离开 随着zanidatamab和zanidatamab前体的Ab捕获浓度的增加而减少，但曲妥珠单抗不增加(补充图。 3b ，补充表 3 ).这些观察支持双极性抗体如zanidatamab可以结合HER2 ECD的假设 反式 而且这种频率 反式 -结合在较高的Ab浓度下增加。
a 漫画描绘了SPR实验设置区分 独联体 和 反式 Ab:受体结合。离解常数 k 离开 对于单特异性抗HER2抗体对照(左),预期与抗体表面密度无关；对于双极性Ab结合，预期也是如此 独联体 。对于双极性Ab绑定 反式 受体的交联预计会随着Ab芯片密度的增加而增加(右)，导致 k 离开 减少。减少 k 离开 随着zanidatamab和zanidatamab前体表面浓度的增加而观察到，但对照曲妥珠单抗没有观察到，显示了zanidatamab和zanidatamab前体结合HER2的能力 反式 (右，见补充表 3 ).显示了来自两个独立实验的数据。 b HER2 ECD与抗HER2抗体混合物在HER2过量1倍、2倍和5倍时的AUC结果。作为参考，HER2 ECD和Abs分别运行，并用HER2:Ab混合物作图。对于zanidatamab和tras + pert，当HER2 ECD过量减少时，随着量的增加，检测到更高级的复合物。Tras或pert主要形成1:1和2:1 HER2:Ab复合物，仅检测到痕量的更高级复合物。大于2:1 (HER2:Ab)的复杂组成是近似的。 c 具有代表性的cryo-EM 2D等级平均值，7.6英寸的3D重建；分辨率(中)显示了与zanidatamab Fab和scFv结合的核心HER2分子，以及通过cryo-EM观察到的zanidatamab:HER2复合物的卡通表示(右)。在2D图像中观察到的模糊晕圈可能是由于多重构象中的Fc结构域。还显示了HER2(青色)与zanidatamab Fab(绿色)和scFv(蓝色)复合物的模型。单个zanidatamab分子不能跨越两个抗原结合域的C末端之间的距离(见补充图。 4 ).因为这种结构限制阻止了zanidatamab与HER2的结合 独联体 一个扎尼达单抗分子只能结合 反式 并通过结合一个上的ECD2和另一个上的ECD4来交联两个HER2分子。源数据在源数据文件中提供。
为了确定在溶液中由zanidatamab和HER2 ECD形成的复合物的性质，使用了具有不同ab和HER2混合摩尔比的分析超速离心(AUC)。将Zanidatamab (125 kDa)、trastuzumab (145 kDa)、pertuzumab (145 kDa)或tras + pert(以1∶1的比例)在溶液相中与HER2 ECD (72 kDa)以1倍、2倍和5倍摩尔过量混合，并在沉降速度实验中通过AUC表征各组分和混合物。沉降系数S 20 w AUC实验中的峰面积与分子量相关，而归一化沉降系数分布中的峰下面积(c(s))与检测到的物质的相对量相关(图。 2b ).Zanidatamab与HER2 ECD形成2:1 (HER2:Ab)和更高级的多聚体复合物，并且仅形成痕量的1:1复合物。甚至当HER2 ECD摩尔过量时，也观察到zanidatamab的多聚体复合物形成。当HER2 ECD过量5倍时，zanidatamab主要形成2:1复合物和少量2:2复合物。当HER2 ECD相对于zanidatamab的摩尔过量从5倍减少到1倍时，多聚体复合物的相对量增加到总峰面积的约95%，呈现2:2、3:3(或2:3、3:2)和4:4(或4:3、3:4)复合物。在等摩尔浓度的HER2 ECD和zanidatamab时，在总峰面积的约10%处检测到大于4:4的复合物。当HER2的摩尔过量减少时，与tras + pert混合的HER2 ECD与增加的更高级多聚体复合物表现相似，在峰分布上有一些差异。当HER2 ECD过量时，曲妥珠单抗或pertuzumab主要形成2:1复合物，只有少量(<总峰面积的3%)较大的组合体。在HER2与曲妥珠单抗或pertuzumab等摩尔浓度时，1:1复合物占优势，而zanidatamab或tras + pert则不是这种情况。以前已经提出了在溶液中由抗HER2双极性分子驱动的更大复合物形成的证据 17 ,19 。Oganesyan等人。 39 类似地使用AUC来证明大的双极性驱动的HER2复合物的形成，这在亲代抗体中没有观察到。
我们通过冷冻电镜进一步检测了zanidatamab与HER2 ECD的复合物。2D分类平均揭示了与zanidatamab Fab和scFv结合的核心HER2分子(图。 2c 和补充图。 4a ).在图像外围观察到的扩散背景可能是由Fc的多重构象和结合到已解析HER2 ECD的两个抗体的第二抗原结合域形成的(图。 2c ，漫画)。7.6英寸的Cryo-EM 3D重建；分辨率用于拟合HER2与zanidatamab的Fab和scFv复合的模型(图。 2c ).我们的模型揭示了Fab和scFv结构域之间的方向和距离不能通过单个zanidatamab铰链来桥接(补充图。 4b )并且必须属于两个不同的zanidatamab分子。因为HER2 ECD采用刚性构象 40 这些结构限制排除了zanidatamab与HER2的结合 独联体 ，如前面的Oh和Bang所示 3 。这进一步证明zanidatamab必须结合HER2 反式 并通过结合一个上的ECD2和另一个上的ECD4来交联两个HER2分子。双极性抗体不能结合的类似结论 独联体 基于Oganesyan等人先前提出的晶体结构模型。 39
总的来说，这些结果支持zanidatamab结合HER2 ECD的概念 反式 导致zanidatamab:HER2多聚化。
Zanidatamab结合诱导细胞表面HER2帽的形成 为了确定HER2交联是否由 反式 zanidatamab的结合转化为肿瘤细胞表面HER2的不同聚集几何形状，我们使用共聚焦显微镜对高表达HER2的SK-BR-3细胞中ab诱导的HER2空间组织(使用单价抗HER2 ECD1-AF647 OAA检测)进行成像(图。 3 ).我们使用3D旋转圆盘共聚焦显微镜观察随机选择的细胞上HER2的微观结构，并确定不同的抗HER2抗体是否导致HER2结构或聚集的可观察差异。用不结合HER2的阴性对照Ab palivizumab(抗RSV蛋白F)处理的SK-BR-3细胞表现出HER2相对均匀的细胞表面分布，偶尔有HER2斑块或微簇(图。 3b、c、d ).相比之下，用zanidatamab、trastuzumab、pertuzumab或tras + pert处理的细胞的3D重建显示ab诱导的HER2在细胞表面的重组和聚集，明显更大比例的细胞表现出不同的微簇(图。 3b–d ，补充电影 1 ，补充图。 6 ).加入细胞后5分钟内，所有抗HER2抗体诱导HER2微团形成(图。 3c，d )，虽然程度不同。对于所有Ab处理，具有微簇的细胞的百分比在15分钟时达到峰值，并且在加入Ab后30分钟下降。
a 插图显示扎尼达单抗绑定在 反式 两种HER2分子的ECD2和ECD4以及用于检测Ab治疗后HER2定位的抗HER2 ECD1-AF647。标记HER2胞外结构域ECD1-4和酪氨酸激酶(TK)结构域。 b 细胞表面HER2帽相对于微团簇的图示和代表性的3D重建共聚焦显微镜图像。 c , d SK-BR-3细胞用200 nM抗HER2或阴性对照(NC) Ab palivizumab处理指定的时间。在用74 nM抗HER2 ECD1-AF647 OAA检测HER2之后，然后通过共聚焦显微镜对细胞成像(氟与抗体的比率为8.9)。显示微团簇或帽的细胞百分比显示为三个独立实验的平均SEM( c ).显示了来自三个独立实验的每个Ab治疗条件的30-43个图像(185-351个细胞)的代表性共焦图像，比例尺= 10微米( d ). (e )用200 nM抗HER2抗体或对照抗体处理SK-BR-3细胞15分钟，并通过dSTORM超分辨率显微镜成像。上面一行显示了在代表性ROI中HER2 dSTORM的定位(用148 nM抗HER2 ECD1-AF647 OAA检测)。彩条=本地化密度。下面一行显示了通过StormGraph聚类算法识别的HER2聚类，并通过聚类面积(nm)进行颜色编码 2 ).比例尺= 500纳米。对于每个Ab处理条件，来自多个细胞的55-124个图像(ROI)被成像。 f 每个聚类的本地化数量相对于聚类面积绘制成图，并显示最佳拟合线性回归。 g 本地化超过1500的集群的百分比。条形图上方的数字是相对于NC的倍数差。 h 确定每个ROI的平均聚类面积。violin图显示了每个Ab处理的平均簇面积的分布。使用双侧非配对进行成对比较 t -在原木上测试 10 比例和 p 使用Bonferroni方法校正数值。黑色括号表示比较和 p 价值(扎尼 相对 。tras df = 133， p = 0.005;扎尼 相对 。pert df = 135，zani 相对 。tras + pert (1:1) df = 147，zani 相对 。NC df = 116， p < 0.001). Source data are provided in the Source Data file.
尽管所有测试的抗HER2抗体都诱导了微团的形成，但大约10-15%的zanidatamab处理的SK-BR-3细胞在细胞的一侧显示出大的、极化的HER2聚集物，我们称之为HER2“帽”(图。 3b–d ，补充图。 6 和补充电影 1 ).这些HER2帽在两个3D重建图像(补充电影 1 )和显示具有最大HER2荧光的细胞平面的2D共聚焦切片(图。 3c，d ).具有HER2帽的zanidatamab处理的细胞的百分比从5分钟增加到15分钟，但是30分钟后HER2帽基本上不存在。，尽管仍然观察到向细胞一侧偏振的荧光。trastuzumab、pertuzumab或tras + pert组合未观察到HER2 caps(图。 3c，d )在测试的任何时间点。使用二项式逻辑回归模型的成对比较显示，只有扎尼达单抗结合在5和15分钟时诱导显著的帽形成( p < 0.001) time points in SK-BR-3 cells (Supplementary Fig. 6c ).zanidatamab诱导HER2帽形成的能力在另外的HER2表达细胞系(NCI-N87)中得到证实，zanidatamab促进HER2帽形成的水平高于单独用曲妥珠单抗或pertuzumab观察到的水平。Tras + pert也在NCI-N87细胞中诱导HER2帽形成，但程度低于扎尼达单抗(补充图 6d–f ).总之，这些数据表明zanidatamab结合显著诱导不同的细胞表面HER2聚集，观察到极化的“HER2帽”，这在曲妥珠单抗或pertuzumab中没有观察到。
Zanidatamab结合诱导大细胞表面HER2簇 已经观察到zanidatamab结合在细胞表面诱导显著不同的HER2微尺度组织，我们假设zanidatamab也将在纳米级水平诱导HER2聚集的不同变化。为了测试这一点，我们进行了单分子定位显微术(SMLM)并使用随机光学重建显微术(dSTORM)来确定HER2分子在Ab处理的SK-BR-3细胞表面的定位坐标。使用StormGraph进行HER2聚类的定量分析 41 一种基于图论的聚类算法。
SMLM和StormGraph分析显示，zanidatamab比trastuzumab、pertuzumab或tras + pert更大程度地改变了HER2的局部纳米级聚集(图。 3e ).在用不结合HER2的阴性对照抗体处理后，在SK-BR-3细胞(用抗ECD1-AF647抗体)上检测HER2，显示许多小的HER2簇。相反，zanidatamab处理的细胞上的HER2簇更大，小HER2簇的数量相应减少(图。 3e ).重要的是，与曲妥珠单抗、pertuzumab或tras + pert相比，zanidatamab治疗诱导了更大簇的形成，以及更多数量的大簇。
为了量化HER2簇大小的这些差异，对于每个Ab处理，我们生成了簇面积对每个簇HER2定位数量的图(图。 3f ).在dSTORM中，荧光分子经历多个激发和发射循环(即闪烁),使得单个荧光团分子产生多个定位 42 ,43 44 ,45 )但他们往往依赖于多重假设。因此，我们报告了实验确定的每簇HER2定位数。
对于每个Ab处理，我们绘制了每个聚类的定位数量对每个聚类的聚类面积(每个条件> 2900个聚类)(图。 3f ).注意，对于所有Ab处理，聚类面积和每个聚类的定位数量之间存在很大程度上的线性关系( R 2 = 0.765–0.855)(图。 3f ).对于所有Ab治疗，97–99%检测到的HER2簇(> 2900簇/条件)包含少于500个定位(图。 3f ).重要的是，与图1中的dSTORM图像一致。 3e ，用扎尼达单抗处理的SK-BR-3细胞，以及在较低程度上用曲妥珠单抗处理的SK-BR-3细胞，具有更多的大簇(图。 3f ).相对于对照抗体，zanidatamab治疗使具有> 1500个定位的簇的百分比增加了17.5倍，而曲妥珠单抗引起了8.2倍的增加，而pertuzumab和tras + pert引起了这些大簇的频率的较小增加(图。 3g
为了分析不同Ab处理对HER2聚类的局部影响，我们计算了每个2 m × 2 m感兴趣区域(ROI)内所有聚类的平均聚类面积，我们对每个Ab处理(来自多个细胞的55-124个ROI)进行了成像，然后比较了这些值的分布(图。 3h ).在用阴性对照Ab处理的SK-BR-3细胞上，HER2定位主要存在于小簇中(图。 3e、f )和ROI平均聚类面积范围从2055-4061纳米 2 (几何平均值:2921纳米 2 )(图。 3h ).pertuzumab处理细胞的ROI平均簇面积范围为1699-5075nm 2 几何平均值为2835纳米 2 类似于对照Ab处理的细胞。曲妥珠单抗治疗将该几何平均值增加至4052 nm 2 ，采用2009–8846纳米 2 聚类面积的范围反映了平均聚类面积较大的ROI频率的适度增加。有趣的是，投资回报率平均集群面积(1641-6425纳米 2 范围)的几何平均值为3343 nm 2 ，其大小介于单独使用曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的几何平均值之间。扎尼达单抗治疗引起ROI平均簇面积的最大增加，产生4919 nm的几何平均值 2 以及2343-43915纳米的范围 2 。平均值的成对比较证实，与曲妥珠单抗相比，扎尼达单抗显著增加了ROI平均HER2簇面积( p = 0.005)、pertuzumab或tras + pert( p < 0.001) (Fig. 3h ).此外，只有扎尼达单抗治疗导致平均簇面积> 10，000 nm的ROI 2 。这些数据表明，zanidatamab在许多ROI中诱导了大HER2簇的形成，其程度明显大于trastuzumab、pertuzumab或tras + pert。
Zanidatamab促进有效的CDC，并增加表达HER2的肿瘤细胞上C1q结合和C3片段的沉积 接下来，我们询问与曲妥珠单抗、pertuzumab或tras + pert相比，zanidatamab观察到的饱和度增加和HER2聚集是否会转化为更高的Fc-效应子功能活性，如CDC。我们选择了一组高HER2表达(HER2 3+)细胞系(表 1 )来源于乳腺(BT-474、SK-BR-3、ZR-75-30、AU565、HCC1419)、胃(NCI-N87)、食管(OE-19)和肺(NCI-H2170)肿瘤，并通过在存在正常人血清(NHS)作为补体源的情况下测量Ab处理后的细胞存活力来评估CDC。对于所有高HER2表达细胞系，zanidatamab介导的浓度依赖性CDC具有平均IC 50 值在7至13 nM的范围内，并诱导大约40至95%的细胞死亡(即活细胞的百分比降低了4至60%)(图。 4a ，表格 1 ).在测试的最高抗体浓度下，Tras + pert在NCI-N87细胞中介导了弱的CDC，并且在比扎尼达单抗低得多的程度上，但是在任何其他表达HER2的癌细胞系中不诱导CDC介导的细胞死亡(表 1 ，图。 4a ，补充图。 7f，g ).为了证实所观察到的抗肿瘤活性是CDC依赖性的，将NHS中的补体级联成分热灭活或在EDTA (NHS + 0.01 M EDTA)存在下测试。使用热灭活的NHS，或使用NHS + 0.05 M EDTA的任何受试抗体均未观察到CDC(补充图。 7a、h、I ).然后，我们评估了四种低HER2表达癌细胞系(包括JIMT-1、ZR-75-1、MCF7和MDA-MB-175-VII)中的CDC活性，没有观察到任何抗HER2抗体(包括zanidatamab)的CDC(补充表 4 ).在任何受试细胞系中均未观察到曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的CDC(表 1 ，补充表 4 ).我们通过向肿瘤细胞中加入NHS分钟，37℃)来进一步评估CDC活性，随后进行抗体处理，并观察到类似的活性，其中在所有测试的细胞系中只有zanidatamab引发CDC(补充结果，补充图。 7f，g ).因此，zanidatamab在多种高HER2表达的癌细胞系中独特地支持了实质性的CDC，但在有限数量的低HER2表达的癌细胞系中没有。
a 在高HER2表达肿瘤细胞(AU565，NCI-H2170，OE-19，NCI-N87，BT-474，SK-BR-3；HER2 3+) ; trastuzumab、pertuzumab和tras + pert (1:1)无效。 b 在NHS存在的情况下，扎尼达单抗介导了NCI-N87细胞上最高的C1q和C3片段(C3b/iC3b/C3dg)沉积。与曲妥珠单抗、pertuzumab或阴性对照相比，在NHS存在下Zanidatamab和tras + pert结合导致NCI-N87细胞中C1q(左)C3b/iC3b/C3dg(右)沉积增强。扎尼达单抗介导的浓度依赖性ADCC( c )和ADCP( d )在活性与曲妥珠单抗、pertuzumab和tras + pert相当的NCI-N87细胞中。在…里 a –d ，数据为平均值SEM，来自 n = 3 (AU565、NCI-H2170、OE-19、BT-474、SK-BR-3)或 n = 6 (NCI-N87)个独立实验。在…里 b –d 数据为平均值SEM，来自 n = 3个独立实验。在…里 c , d n =用生物学上独立的PBMC样本进行的3个独立实验( c )，或者与来源于三种生物学上独立PBMC样品的巨噬细胞( d ).的门控策略 b , c 和 d 见补充图。 12d，a，b ，分别为。源数据作为源数据文件提供。
为了阐明zanidatamab诱导CDC能力增强的基础，我们分析了补体参与和经典途径激活的早期步骤。我们使用流式细胞术评估C1q(补体级联的第一个成分)和C3片段(C3b/iC3b/C3dg)的沉积，后者是膜攻击复合物形成上游的后续级联成分，在有NHS存在下Ab结合后，在代表性HER2 3+细胞系NCI-N87上的沉积。在所有检测的抗HER2抗体治疗中，扎尼达单抗介导了最高的C1q和C3片段沉积(图。 4b ).Zanidatamab和tras + pert介导浓度依赖性C1q沉积，而曲妥珠单抗或pertuzumab没有检测到C1q沉积。Zanidatamab和tras + pert介导浓度依赖性C3片段沉积，而trastuzumab和pertuzumab在NCI-N87细胞上显示微弱的C3片段沉积。与tras + pert相比，zanidatamab显示C1q和C3片段(包括C3b/iC3b和C3dg)的最大几何MFI分别高1.4倍和6.5倍。我们进一步比较了在NHS存在下SK-BR-3细胞上C3b/iC3b/C3dg和C3b/iC3b的沉积。正如在NCI-N87细胞中观察到的，与tras + pert相比，zanidatamab介导了最高的C3b/iC3b/C3dg或C3b/iC3b沉积，而trastuzumab或pertuzumab没有介导C3片段沉积。(补充结果，补充图。 8a
我们还评估了zanidatamab和tras + pert在兔补体血清存在下的CDC活性，以与tras + pert在高HER2表达(HER2 3+)肿瘤细胞中的CDC数据进行比较 46 。Zanidatamab和tras + pert在具有兔补体血清的NCI-N87、BT-474和OE-19细胞中显示CDC活性。Zanidatamab显示出大约3-4倍的低IC 50 与tras + pert相比，trastuzumab或pertuzumab无活性(补充图。 7b
我们还评估了不同的预调理作用(加入血清前扎尼达单抗与肿瘤细胞孵育5、15、30分钟和1小时)和NHS孵育时间点(5、15、30分钟和1小时)的影响，以及改变NHS百分比(0-80% NHS)对SK-BR-3和NCI-N87细胞中扎尼达单抗的CDC活性的影响。在NHS测试的所有条件下，zanidatamab引发CDC活性(补充结果，补充图。 7c–e ).总之，这些数据将CDC确立为扎尼达单抗的一种快速且持续分化的细胞毒性作用机制，这在曲妥珠单抗、pertuzumab或tras + pert中未观察到。
Zanidatamab调解ADCC和ADCP 为了评估额外的Fc介导的效应子功能，我们使用流式细胞术分别以人PBMC和PBMC来源的巨噬细胞作为效应子细胞，评估了zanidatamab介导HER2表达的癌细胞的ADCC和ADCP的能力。表达HER2的NCI-N87细胞系的扎尼达他单抗介导的浓度依赖性ADCC和ADCP(图。 4c，d 具有与曲妥珠单抗、pertuzumab和tras + pert相当的活性。SK-BR-3 (HER2 3+)和JIMT-1 (HER2 2+)的ADCC和ADCP也进行了评估，并显示出与扎尼达单抗、曲妥珠单抗、pertuzumab和tras + pert相当的浓度依赖性活性(补充图。 8b，c
Zanidatamab促进ab内化和表面HER2下调 据报道，抗HER2双极性抗体的内在化和受体降解高于基础率 17 可能通过抗原交联来促进 20 ,21 ,22 。我们使用高含量成像和流式细胞术研究了SK-BR-3 (HER2 3+)和NCI-N87 (HER2 3+)细胞中HER2的内化。高含量成像显示扎尼达单抗治疗导致受体介导的内化水平从15分钟增加到6小时(图。 5a ，左)。与曲妥珠单抗或培妥珠单抗相比，Zanidatamab和tras + pert具有相似的效果，并诱导了更大的内化。通过流式细胞仪评估的内化同样显示，在SK-BR-3和NCI-N87细胞中，扎尼达单抗处理(24小时)导致明显大于曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的内化(大约两倍)(图。 5a ，右，已调整 p < 0.001). Internalization was also evaluated in JIMT-1 cells (HER2 2+), where zanidatamab induced a similar increased internalization compared to trastuzumab (adjusted p = 0.007)和pertuzumab(调整后 p = 0.02)，相当于tras + pert(补充图。 9f
a 与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗相比(15分钟至6小时)，扎尼达他单抗显示出增加的受体介导的内化，通过高含量显微镜( n = 3个独立实验)。(右)与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗相比，扎尼达单抗具有显著更强的受体介导内化作用(调整 p < 0.001) in SK-BR-3 cells or NCI-N87 cells (24 h), measured by flow cytometry (n = 3 SK-BR-3 或n = 4个NCI-N87独立实验)。对多次比较的Bonferroni校正实验进行双向ANOVA控制，数据标准化为曲妥珠单抗，ANOVA的df = 3，而 t -测试。 b 与曲妥珠单抗相比，扎尼达单抗表现出明显更强的表面HER2下调( p = 0.001)和pertuzumab( p < 0.001) in SK-BR-3 cells and compared to trastuzumab (p = 0.04)和pertuzumab( p = 0.02)，通过流式细胞术评估。与扎尼达单抗相比，Tras + pert介导了显著更强的HER2下调( p = 0.001)中( n = 3 SK-BR-3或 n = 4个NCI-N87独立实验，双样本双边t检验，多重比较用Bonferroni校正，df = 4)。 c 与未处理的细胞相比，Zanidatamab减少了总HER2 (24小时)(调整 p = 0.08，SK-BR-3；调整过的 p = 0.06，NCI-N87)。 d Zanidatamab介导的对pHER2、pHER3、pEGFR、pAKT和pERK的抑制(调节 p = 0.06)，与未处理的细胞(24小时)相比。 e 扎尼达他单抗介导的抑制作用 p = 0.047)和pAKT(调整后 p = 0.082)，与未处理的细胞(15分钟)相比，通过免疫印迹评估。在…里 c (df = 2)， d (df = 2)并且 e (df = 3)，通过免疫印迹进行评价。在…里 c 和 d (n = 3) 而在 e (n = 4)独立实验，一个样本双侧 t -测试与未处理细胞值100%的比较 p 使用Benjamini & Hochberg错误发现进行的价值调整，与调整后的价值进行比较 p 显示值< 0.1。数据输入 a (左)是平均SEM， a (右)， b –e ，意味着95%可信区间。的门控策略 a (右)和 b 见补充图。 12e，f 。源数据在源数据文件中提供。
然后我们用流式细胞仪测量抗HER2抗体治疗后细胞表面HER2水平的变化。在SK-BR-3和NCI-N87中，Zanidatamab和tras + pert下调细胞表面HER2(图。 5b )、BT-474和JIMT-1细胞(补充表 5 ；补充图 9g ).曲妥珠单抗在SK-BR-3中下调细胞表面HER2(图。 5b )、BT-474和JIMT-1细胞(补充表 5 ；补充图 9g )，并在NCI-N87细胞中介导了较弱的作用。Pertuzumab在所有测试的细胞系中介导了微弱的作用。这些结果共同表明zanidatamab和tras + pert诱导了强有力的Ab:HER2复合物内化，导致HER2表面水平的降低。
Zanidatamab减少总细胞HER2并抑制细胞内信号传导 在观察到扎尼达单抗治疗后HER2内化和细胞表面HER2水平降低后，我们通过免疫印迹研究了对SK-BR-3和NCI-N87细胞中总HER2和细胞内信号水平的影响。孵育24小时后，在SK-BR-3和NCI-N87细胞中，zanidatamab和tras + pert将总HER2降低至与对照组相似的水平(图。 5c ).曲妥珠单抗或帕妥珠单抗治疗后未观察到总HER2水平显著降低。
据报道，曲妥珠单抗抑制下游信号事件，特别是高HER2表达肿瘤细胞中的pHER3和pAKT 7 。因此，我们在NCI-N87和SK-BR-3细胞中评估了扎尼达单抗处理(15分钟或24小时)后的细胞内信号水平(包括磷酸化和总HER2、HER3、EGFR、AKT和ERK)。与对照细胞相比，用zanidatamab或tras + pert处理NCI-N87细胞24小时导致pHER2、pHER3、pEGFR、pAKT和pERK水平降低(图。 5d ，补充图。 9a ).在用Abs处理15分钟的SK-BR-3细胞中，与对照细胞相比，只有zanidatamab导致pHER3减少，而所有测试的抗HER2 Abs都降低了pAKT水平(图。 5e ，补充图。 9b ).用zanidatamab处理24小时导致SK-BR-3细胞中HER2、pHER3和pAKT水平降低(图。 5c ，补充图。 9b，d 和补充数据 1 ).我们还研究了zanidatamab治疗在低HER2表达的JIMT-1 (HER2 2+)细胞系中的作用。与在SK-BR-3细胞中观察到的相似，用zanidatamab处理15分钟和24小时均降低了总HER2、pHER3和pAKT水平(补充图。 9c，e 补充数据 1 ，补充数据 2 ).在15分钟或24小时的时间点，抗HER2抗体都没有引起SK-BR-3或JIMT-1细胞中pHER2、HER3、EGFR、pEGFR、EGFR、ERK或pERK水平的显著变化。总之，zanidatamab治疗降低了表达HER2的SK-BR-3和JIMT-1乳腺癌细胞中HER2，pHER3和pAKT的总水平，并降低了NCI-N87胃癌细胞中HER2，pHER2，pHER3 pEGFR，pAKT和pERK的水平。
扎尼达单抗抑制配体非依赖性和EGF驱动的高HER2表达肿瘤细胞的生长 我们接下来评估HER2内化、下调和磷酸信号传导减少的效应是否会转化为高HER2表达细胞系的抗增殖反应。我们首先通过测量ab治疗后的肿瘤细胞活力来评估zanidatamab的配体非依赖性抗肿瘤活性。Zanidatamab介导高HER2表达乳腺(BT-474、SK-BR-3、ZR-75-30、HCC2218、AU565、HCC1419)、胃(NCI-N87)、食管(OE-19)和肺(NCI-H2170)以及低her 2-MDA-m b-175-VII癌细胞系中细胞活力的浓度依赖性降低(图。 6a ，补充表 6 ).扎尼达单抗的作用大于或相当于曲妥珠单抗、培妥珠单抗或曲妥+培。成对比较显示显著更强的生长抑制( p 值< 0.03)，与ZR-75-30、AU565、NCI-H2170、OE-19、SK-BR-3和NCI-N87细胞中的tras + pert相比，与所有10种细胞系中的trastuzumab相比，以及与除MDA-MB-175-VII以外的所有细胞系中的pertuzumab相比(补充表 7 ).
a Zanidatamab在表达HER2的肿瘤细胞中介导配体非依赖性肿瘤生长抑制，包括AU565、NCI-H2170、OE-19、BT-474、NCI-N87和SK-BR-3 (HER2 3+)。数据为平均值SEM，来自 n = 3 (SK-BR-3)， n = 4 (OE-19)， n = 6 (AU565，BT-474，NCI-H2170)或 n = 12 (NCI-N87)独立实验。见补充表格 6 , 7 分别用于完整数据和成对比较。 b Zanidatamab在表达HER2的细胞系中介导EGF依赖性肿瘤生长抑制，包括BT-474、NCI-N87和NCI-H2170 (HER2 3+)。相对于未处理的细胞(无EGF，无Ab)绘制百分比存活力。上方的水平虚线(绿色)代表EGF刺激后的活细胞百分比(%活力 (+表皮生长因子) ).较低的水平虚线(灰色)代表以100%为参照的未处理细胞的存活力。数据为平均值SEM，来自 n = 3(NCI N87，NCI h 2170)或 n = 5 (BT-474)独立实验。见补充表格 8 , 9 完整数据和成对比较。源数据在源数据文件中提供。
然后我们评估了在表皮生长因子(EGF)介导的生长条件下的抗肿瘤活性(图。 6b ).配体介导的her 2-异二聚体形成( 例如 。HER2-EGFR)驱动补偿性信号和增殖，并被认为在驱动曲妥珠单抗耐药性中起作用 47 。我们首先确定了观察到EGF介导的生长增殖的细胞系、培养基条件和配体浓度(补充表 8 ).在确定的条件下，与非配体处理的BT-474、NCI-H2170、NCI-N87、OE-19和ZR-75-30细胞相比，加入EGF导致细胞增殖增加12%至86%(补充表 8 ).重要的是，在所有测试的细胞系中，与EGF处理的对照相比，zanidatamab介导了显著的浓度依赖性生存力降低(图。 6b ，补充表格 8 和 9 ).在所有5种细胞系中，扎尼达单抗介导的EGF驱动的生长抑制作用明显大于曲妥珠单抗或pertuzumab，在NCI-H2170细胞中，扎尼达单抗介导的EGF驱动的生长抑制作用明显大于曲妥珠单抗或pertuzumab。扎尼达单抗和tras + pert在BT-474、NCI-N87、OE-19和ZR-75-30细胞中介导了类似的作用(补充表 9 ).
总之，zanidatamab在几种HER2表达细胞系中介导配体非依赖性和EGF驱动的生长抑制，包括乳腺癌、胃癌、食道癌和肺癌。在许多细胞系中，扎尼达单抗的作用明显大于曲妥珠单抗、pertuzumab或tras + pert。
Zanidatamab在高HER2表达的胃癌体内模型中促进有效的抗肿瘤活性 在GXA 3054模型中评估扎尼达单抗和曲妥珠单抗的体内抗肿瘤活性，该模型是高表达her 2(her 2 3+；补充表格 10 2)胃癌患者来源的人肿瘤异种移植物(PDX)模型。使用相对于对照的肿瘤体积变化率来评估抗肿瘤活性，肿瘤生长率抑制大于100%表明退化。虽然扎尼达单抗和曲妥珠单抗相对于对照组都显著降低了GXA 3054的生长速率(分别为307.6%和110.5%)，但与曲妥珠单抗相比，扎尼达单抗治疗诱导了更大的肿瘤消退(图 7a
a 植入裸鼠的患者来源的胃异种移植物模型GXA 3054的平均肿瘤体积。用指定的试验品以30 mg/kg静脉注射治疗荷瘤小鼠，每周两次，持续五周， n =每组10个。*** p 值= 3.17 e07。 b 植入裸鼠的细胞衍生胃异种移植物模型NCI-N87的平均肿瘤体积。用治疗的荷瘤小鼠；单剂扎尼达单抗或曲妥珠单抗，4mg/kg；或曲妥珠单抗+帕妥珠单抗组合，总共4 mg/kg(每种药物2 + 2 mg/kg)，IV，每周两次，持续四周， n = 7 每组。通过对对数转换肿瘤生长数据拟合线性混合效应模型，并比较所有治疗组之间的生长率，确定两个模型的统计显著性，从拟合模型中得出。片面的 F -在所有增长率相等的零假设下，检验用作综合检验。事后双边Tukey检验用于推断治疗组之间生长率的差异，并解释多重比较。** p < 0.01 vs. trastuzumab or tras + pert. In a 和 b 数据为平均值SEM。源数据作为源数据文件提供。
我们接下来试图确定在HER2 3+ NCI-N87胃细胞系衍生异种移植物(CDX)模型中，与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗+ pert的组合相比，扎尼达单抗是否具有更强的抗肿瘤活性(图。 7b ；补充表格 10 ).扎尼达单抗(4 mg/kg)比曲妥珠单抗(4 mg/kg)和曲妥珠单抗+ pert (2 + 2 mg/kg)诱导了对NCI-N87异种移植物的肿瘤生长速率的更大抑制(肿瘤生长速率抑制分别为268%、86%、155%)。
总之，这些数据表明，在体内胃癌模型中，扎尼达单抗比曲妥珠单抗或曲妥珠单抗+ pert的组合具有更好的肿瘤生长抑制活性。
讨论 靶向HER2改善了HER2阳性转移性乳腺癌和胃癌/GEJ癌患者的预后。然而，由于这些患者的癌症最终会发展，因此仍然需要具有更高疗效和不同作用方式的抗HER2疗法 3 。为了解决当前治疗标准的局限性，我们设计了一种双极性抗HER2抗体，zanidatamab，一种人类IgG1样双特异性抗体，它识别两个非重叠表位(ECD2和ECD4)并促进受体交联。在这里，我们证明了与监管机构批准的抗HER2单克隆抗体trastuzumab和pertuzumab相比，zanidatamab具有独特和增强的功能。我们发现zanidatamab结合了HER2 反式 并形成明显的大细胞表面HER2簇。我们假设zanidatamab独特的Ab:HER2交联导致有效的CDC，这种活性在trastuzumab、pertuzumab或tras + pert中没有观察到。Zanidatamab还介导HER2内化和下调，抑制细胞信号传导和肿瘤生长，以及ADCC和ADCP。当转化为体内模型时，zanidatamab在表达HER2的异种移植物模型中显示出优于曲妥珠单抗和tras + pert的体内抗肿瘤活性。
与典型的单特异性抗体相比，双极性抗体已经显示出以增加的饱和度结合肿瘤细胞 15 并诱导受体交联 20 ,21 ,22 导致细胞内在效应，包括受体内化和下调、受体信号传导减弱和生长抑制。我们假设，与曲妥珠单抗或pertuzumab相比，双极性Ab zanidatamab将增加Ab饱和度，并在表达HER2的肿瘤细胞上形成不同的受体簇，这些受体簇可以额外促进Fc介导的细胞毒性(包括CDC)的细胞外部效应。
通过流式细胞术对细胞表面与HER2表达癌细胞结合的评估显示，与单特异性Abs曲妥珠单抗或pertuzumab相比，zanidatamab具有1.3至1.6倍高的最大结合能力(饱和度)。SPR实验和cryo-EM衍生的模型证明了HER2参与的机制，并显示zanidatamab结合HER2 ECD。 反式 。这 反式 扎尼达单抗的结合导致大的交联HER2:扎尼达单抗复合物或簇的形成，这在溶液中由AUC观察到，在细胞表面上由显微镜实验显示。总的来说，集群的形成受到 反式 受体结合和交联可被视为双极性抗体如zanidatamab的定义特征之一。
使用dSTORM，我们发现用zanidatamab治疗HER2表达的乳腺癌细胞(SK-BR-3)诱导大HER2簇的形成，其程度远远大于曲妥珠单抗、pertuzumab或tras + pert治疗。这与AUC数据形成对比，在AUC数据中，zanidatamab和tras + pert在溶液中促进类似的大寡聚物。我们认为AUC观察到的溶液中游离HER2 ECD的聚集不能完全代表细胞膜中HER2分子的结合限制。此外，预计HER2与其他HER受体家族成员一起作为单体、同二聚体或异二聚体存在于细胞表面 48 ，这在同质HER2环境中的AUC研究中没有出现。
在宏观水平上也观察到了zanidatamab的独特的聚集性质。Zanidatamab促进HER2或cap的大的极化簇的形成，这是这种双极化ab的独特性质，不能被tras + pert或Ab单独概括(图。 3a–d ).在向细胞中加入扎尼达单抗后5和15分钟观察到的这种加帽现象，可能反映了细胞表面HER2重新分布到高度交联的受体聚集体中，该聚集体极化到细胞的一侧。我们假设帽状结构是通过dSTORM观察到的HER2组织的纳米级变化的结果。
加入zanidatamab后30分钟HER2帽的缺失可能是ab结合后受体内化动力学的结果。事实上，我们在加入SK-BR3细胞后15分钟就观察到了扎尼达单抗的内化(图。 5a ).据我们所知，我们首次报道了Ab诱导的HER2在肿瘤细胞上加帽的观察结果。
Ab抗原簇中Ab Fc区的六聚体组织已被证明是最佳CDC活性所必需的 33 。因为我们已经观察到zanidatamab结合诱导大的细胞表面HER2簇，我们询问zanidatamab在细胞表面的寡聚Fc组织是否可以促进六聚化并使补体结合和活化。事实上，在一组HER2表达细胞系中对CDC的评估表明，zanidatamab在所有测试的高HER2表达(HER2 3+)细胞系中介导了有效的抗肿瘤活性。在dSTORM成像中，zanidatamab诱导的HER2簇的独特性是明显的(图。 3e )和共焦显微镜(图。 三维（three dimension的缩写） ).我们的数据表明，在共聚焦显微镜下，HER2帽在30分钟时的消失并不影响CDC活性，因为zanidatamab与SK-BR-3和NCI-N87细胞预孵育30分钟至1小时并没有导致比早期时间点观察到的更低的CDC活性。事实上，CDC效力随着zanidatamab:肿瘤细胞预孵育时间的延长而增加(补充图。 7c ).将NHS的百分比增加到80%表明扎尼达单抗增加了CDC，而所有其他抗HER2治疗仍然无效(补充图。 7d ).我们的数据表明，zanidatamab诱导的HER2簇促进了细胞表面HER2的独特组织，从而促进了zanidatamab Fc的独特组织，满足了促进CDC活性所需的六聚体Fc的要求。此外，我们的建模表明zanidatamab结合HER2能够形成六聚体(补充图。 10 )并提供了为什么zanidatamab的HER2聚集似乎为C1q结合提供了高亲和力停靠位点的基本原理。此外，在NCI-N87和SK-BR-3细胞中，zanidatamab早在加入血清后5分钟就引发了快速CDC(补充图。 7e )，这是一个与在dSTORM (15分钟)和共焦(HER2在5和15分钟封顶)数据中观察到的大HER2簇形成相一致的时间尺度。
与zanidatamab不同，tras + pert、trastuzumab或pertuzumab不介导HER2帽、大HER2簇或CDC的形成。特别是，由tras + pert处理形成的簇的大小并不比单独使用曲妥珠单抗时看到的大。尽管细胞流式细胞仪结合数据显示zanidatamab和tras + pert结合具有相同的ab密度，但通过dSTORM观察到的tras + pert簇分布图显示了这些治疗中HER2结合的差异。基于所观察到的tras + pert聚类图，这两种抗体可能独立地与HER2受体结合。有趣的是，tras + pert引发弱CDC的唯一细胞系(NCI-N87)也显示了tras + pert结合后HER2帽形成的适度增加。当我们和其他人 46 在兔补体血清存在下，tras + pert显示CDC活性，重要的是注意到tras + pert在人补体存在下无活性(补充图。 7b ，图。 4 ).由于与人血清相比，兔血清介导高背景CDC活性的能力(由于功能途径的差异，包括裂解靶细胞而没有大量C3沉积的能力 49 以及缺乏对人补体调节蛋白的交叉反应性和抑制作用 50 )，在使用兔血清得出有关CDC结果的结论时应谨慎。总的来说，我们在zanidatamab中观察到的明显的大HER2簇形成与其CDC活性相关。我们提出，这些大的HER2簇可能是局部高密度C1q或f C受体结合相互作用实现补体介导的细胞反应的位点。
我们对zanidatamab的观察结果，包括ab诱导的靶受体帽化和聚集，以及高靶表达肿瘤细胞中的CDC，与已批准的I型抗CD20抗体(如利妥昔单抗)的观察结果相似。已经显示利妥昔单抗结合诱导B细胞表面CD20加帽 51 CD20聚集导致更强的C1q结合和CDC的激活 52 在具有高CD20表达水平的肿瘤细胞中 53 。此外，利妥昔单抗结合CD20后受体帽的形成与ADCC增加的靶杀伤相关 51 。利妥昔单抗有几种作用机制，包括ADCC和CDC 54 ,55 。已经提出ADCC和CDC可以在异质肿瘤细胞群中协同作用，例如，补体清除具有高CD20表达的细胞，而ADCC清除具有低CD20表达的细胞 56 。我们假设在CDC中观察到的差异的原因与zanidatamab在高 相对 。低HER2表达细胞系可能是大簇形成和随后C1q参与所需HER2密度的函数，以及与抑制CDC的补体调节蛋白(CD46、CD55、CD59)相比HER2的相对水平的函数 57 。这需要进一步的调查和确认。
专性双特异性抗体，具有独特的功能活性，不能被抗体的组合重现，代表了抗肿瘤治疗的一种新兴方法 23 。独特的聚类特性和有效的CDC活性将zanidatamab定义为专性双极性ab，因为这些活性不能被tras + pert概括。据我们所知，我们描述了第一个专性双边Ab的例子。除了CDC，zanidatamab还促进了大量其他抗肿瘤活性，这些活性存在于一系列HER2表达细胞中，如图2所示。 8 .
我们假设 反式 zanidatamab的双极性HER2结合特性形成了其多种作用机制的基础。扎尼达单抗结合导致细胞表面ab饱和度增加约1.5倍，并导致受体交联。zanidatamab参与介导的大细胞表面HER2簇促进C1q结合，可能通过促进六聚化，并在HER2高细胞系中引发有效的CDC。在所有表达HER2的细胞中，包括HER2低表达的肿瘤，也观察到ADCC和ADCP活性。也可能是受体交联和聚集阻止HER2与其他信号配偶体的同二聚化和异二聚化，导致观察到的配体非依赖性和配体依赖性信号抑制。此外，大的受体簇不能有效地从早期的内体中回收，最终导致受体内化和降解的增加。总之，这些机制有助于zanidatamab在体外和体内的肿瘤细胞死亡和生长抑制的总体效果。
我们假设 反式 zanidatamab的双极性HER2结合特性导致细胞表面ab饱和度增加，HER2交联，以及独特的大受体簇的形成，形成了对这种Ab观察到的不同MOA的基础。在细胞外，与曲妥珠单抗、pertuzumab和tras + pert相比，这些特性导致ADCC和ADCP活性，以及扎尼达单抗特有的强大的CDC活性。Zanidatamab驱动的交联和聚集可能，至少部分地，通过阻止HER2同型二聚化和与其他信号配偶体的异型二聚化，有助于配体非依赖性和配体依赖性信号抑制，这是一种先前描述的DARPin双极性分子的现象18 。交联影响HER2:zanidatamab复合物的循环，导致受体内化和降解增加 21 其与HER2信号通路的直接抑制相结合，促进了对表达HER2的癌细胞生长的抑制。这些机制之间可能存在相互作用；例如，快速Fc介导的效应子功能和细胞内机制的机会，它们共同促成肿瘤细胞死亡和生长抑制的总体效果。在zanidatamab治疗的肿瘤中可能存在抗肿瘤框架，其中某些机制在高HER2表达的肿瘤中占主导地位，而其他机制在HER2低表达的肿瘤中占主导地位；然而，这需要进一步的调查。
体外观察到的Zanidatamab的功能在体内表达HER2的胃癌异种移植物中转化为有效的肿瘤生长抑制。在PDX模型GXA 3054中，扎尼达单抗治疗诱导肿瘤消退，而曲妥珠单抗治疗没有。在CDX模型NCI-N87中，与曲妥珠单抗或tras + pert相比，扎尼达单抗介导了显著更强的抗肿瘤活性，这与体外观察一致，其中扎尼达单抗在NCI-N87胃癌细胞中也显示出与曲妥珠单抗和tras + pert相比显著更强的生长抑制。在包括食管癌、胃癌、肺癌和乳腺癌在内的细胞系中，与曲妥珠单抗和tras + pert相比，Zanidatamab还显示出显著更强的体外配体非依赖性和EGF驱动的生长抑制作用。(图。 6 补充表7，9)此外，包括HER2下调、内化以及pHER3和pAKT抑制的细胞内在抗肿瘤MOAs可能有助于在体外和体内观察到的扎尼达单抗的抗肿瘤活性。因为与人类和其他哺乳动物相比，小鼠模型的补体活性受损 58 ,59 扎尼达单抗治疗在PDX模型中引起显著退化的能力表明，其他抗肿瘤机制对观察到的总体效果有显著贡献。我们的数据证实了其他人报道的小鼠血清中受损的CDC活性，并且zanidatamab在小鼠血清中高表达HER2的NCI-N87中没有引发CDC活性(补充图。 7f ).这些数据强调了使用小鼠模型的翻译挑战，因为它们可能低估了由CDC驱动的抗肿瘤活性。鉴于这些限制，每种所述机制对zanidatamab体内抗肿瘤活性的相对治疗作用仍有待确定，目前正在进行临床评估。虽然在啮齿动物模型中的发现并不总是转化为临床结果，但是在我们的PDX模型中zanidatamab的强抗肿瘤活性及其在体外的效力表明zanidatamab将在临床环境中发挥作用。
来自正在进行的1期研究(NCT02892123)的数据表明，zanidatamab对晚期HER2表达癌症(包括乳腺癌、胃癌和胆道癌)患者具有良好的耐受性和单一药物活性，这些患者在接受标准护理治疗(包括施用HER2靶向药物，如曲妥珠单抗、pertuzumab和T-DM1)后出现进展 60 ,61 。本文提供的临床前数据支持了扎尼达单抗作为单一疗法观察到的临床抗肿瘤活性的作用机制，以及扎尼达单抗与曲妥珠单抗和tras + pert的潜在差异，这分别是HER2阳性胃癌和乳腺癌治疗的当前标准的一部分。Zanidatamab目前正在多个HER2过表达实体瘤的临床试验中进行评估，包括HER2基因扩增胆道癌的注册临床试验(NCT04466891)。
总之，zanidatamab是一种双极性抗HER2抗体，与trastuzumab、pertuzumab和tras + pert相比，具有独特和增强的功能。体内和体外观察到的强抗肿瘤活性表明，zanidatamab将在临床环境中显示活性，甚至可能比目前的抗HER2疗法和乳腺癌和胃癌以外的适应症具有更大的功效。
