转移仍然是几乎所有乳腺癌相关死亡的原因。急诊室 − 乳腺癌预后较差，疾病复发通常发生在5年内 1 。相反，尽管他们最初有较好的预后，er患者 + 疾病有很大晚期复发的风险，并可能在几十年后出现转移性疾病 1 ,2 。这一延长的潜伏期的基础是ER的能力 + DTC以静止的治疗抵抗状态在继发性部位存活，直到被触发重新进入增殖并形成临床上可检测的转移性病变。次级位点微环境是控制肿瘤细胞存活和随后脱离休眠的关键 3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 ,10 ,11 。然而，由于缺乏合适的er临床前模型，对控制复发的微环境线索的机械理解仍然有限 + 转移复发，大多数研究使用雌激素受体 + 免疫缺陷小鼠或雌激素受体中的人乳腺癌细胞 − 小鼠乳腺肿瘤细胞。此外，考虑到er较长的等待时间 + 晚期复发，在衰老微环境模型中研究转移性复发是至关重要的。
在这项研究中，我们已经表征和使用ER的同系模型 + 乳腺癌，证明由于衰老或纤维化损伤引起的微环境变化如何支持DTC的增殖和生长。从转录谱中，我们发现 Pdgfc 作为在老化和纤维化肺中上调的关键因素，与活化成纤维细胞的积聚和增强的转移生长有关。相比之下，在PDGF特区 瞧 幼鼠微环境，表达 Pdgfc 通过散布的ER + 肿瘤细胞是DTC存活所必需的，突出了靶向PDGF-C信号以限制ER的机会 + 乳腺癌复发。
结果 雌激素受体的同源模型 + 乳腺癌转移复发 研究控制雌激素受体的机制 + 乳腺癌复发，我们表征了四种报道为er的小鼠乳腺肿瘤细胞系 + (参考 12 ).RNA测序(RNA-seq)证实，如先前报道 12 EMT6细胞表现出紧密连接蛋白低的间充质表型，而表达紧密连接蛋白的TSAE1、HRM1和F3II细胞表现出上皮形态(扩展数据图。 1a、b ).TSAE1、HRM1和EMT6细胞系具有高的 Esr1 表达，但F3II细胞表达水平与ER相当 − D2A1系和转移衍生物D2A1-m1和D2A1-m2(参考。 13 )(图。 1a 和扩展数据图。 1c ).与ER相比，ER信号通路基因在TSAE1、HRM1和EMT6细胞中上调 − 细胞系，而4-羟基他莫昔芬(4-OHT)处理降低了ER反应基因的表达 Greb1 (图。 1b，c 和扩展数据图。 1d ).类似地，TSAE1和HRM1细胞在含有雌激素的培养基中增强的集落生长被4-OHT和选择性ER降解剂氟维司群破坏(图。 1d 和扩展数据图。 1e ).当在同系免疫活性小鼠中作为原位肿瘤生长时，TSAE1、HRM1和EMT6细胞形成ER + 乳腺肿瘤(图 1e ).用雌二醇小球植入小鼠增强了TSAE1肿瘤的生长，并在较小程度上增强了HRM1肿瘤的生长。 1f 和扩展数据图。 1f );然而，所有三个呃 + lines在没有补充雌激素的小鼠中形成乳腺肿瘤，因此更好地再现了老年妇女中较低的雌二醇水平。
a ,b 小鼠乳腺肿瘤细胞系的RNA-seq分析。 a , Esr1 表情。 b 左侧热图显示了显著差异表达的基因(|log 2 (倍数变化)| > 0.585， P 值< 0.05) − (F3II，D2A1，D2A1-m1，D2A1-m2)和ER + (TSAE1、HRM1、EMT6)线路。对，独创性途径分析显示前四名显著( P < 0.05, right-tailed Fisher’s exact test) upregulated pathways (ER+ 对呃 − 线)。虚线， P 价值截止。清晰、协调的溶酶体表达和调节。 c , Greb1 在用载体或4-OHT处理24小时的TSAE1细胞中的表达( n = 4个生物重复)。 d ，平均每孔TSAE1菌落大小( n =每种情况6个孔),然后用赋形剂、4-OHT或氟维司群(fulv。)在不含酚红的DMEM或含脱炭(CS)胎牛血清(FBS)的培养基中培养7天。代表四个独立的重复。AU，任意单位。 e ，BALB/c (TSAE1、EMT6、F3II、D2A1)或FVB (HRM1)小鼠中的原发性肿瘤，进行ER-α染色(比例尺，50 m)。 f 原位注射(BALB/c)的TSAE1细胞没有( n = 5只小鼠)或与( n = 6只小鼠)雌二醇(E2)小丸。 g 原位注射的肿瘤细胞(TSAE1，EMT6，4T1， n =每组6只BALB/c小鼠；HRM1， n = 5只FVB小鼠)。左，肿瘤生长。中间，生存分析。由于原发性肿瘤大小限制(实线)，剔除所有具有TSAE1、HRM1或EMT6肿瘤的小鼠；由于转移性疾病的症状(虚线)，剔除所有具有4T1肿瘤的小鼠。右图，苏木精-伊红(H&E)染色的肺切片(比例尺，2.5毫米)，箭头指示小的转移沉积。 h 原位注射的mChLuc2标记的肿瘤细胞(TSAE1， n = 7和EMT6， n = 6只BALB/c小鼠；HRM1， n = 6只FVB小鼠)。在第33天(HRM1-mChLuc2和EMT6-mChLuc2)或第27天(TSAE1-mChLuc2)剔除小鼠。顶部，典型的离体肺IVIS图像(比例尺，计数)和H&E染色的肺切片(比例尺，2.5 mm)。下图，体外IVIS定量(总计数)。右图为荧光素酶染色的TSAE1-mChLuc2 TB肺的代表性图像(比例尺，125 m)。 a ,c ,f ,h ，数据表示为平均值±标准差( a )或s.e.m .( c ,f ,h );多重比较的单因素方差分析( c )，一个显示第25和第75个百分位数、中间值(直线)以及最小和最大值(触须)的方框图( d )或具有多重比较的双向ANOVA( f ).
在标准的二维文化中，老鼠 + 生产线的增长与急诊室相当 − 4T1和D2A1线路(扩展数据图。 2a )但表现出非增殖表型，当在低血清培养基中培养7-10天时，仍保持为单细胞或小细胞团；然而，这些细胞可以通过随后在来自er的条件培养基(CM)中培养而被刺激重新进入增殖 − 4T1细胞或正常肺成纤维细胞(扩展数据图。 2b，c ).用ZR-75-1人雌激素受体观察到类似的结果 + 乳腺癌细胞，与正常成纤维细胞CM相比，癌症相关成纤维细胞(CAF) CM增强了从休眠中的释放(扩展数据图。 2d ).类似的，呃 + 但不是呃 − 当在软琼脂中培养6周或在生长因子减少的基底膜提取物(BME)中培养时，细胞系显示出休眠表型 4 持续9-15天，细胞表现出对亲脂性染料的保留(扩展数据图。 2e–g ).当急诊室 + 将lines原位注射到没有补充雌激素的同系小鼠中，由于原发性肿瘤达到最大允许尺寸，实验结束，没有证据表明由转移性疾病引起的健康不良。事实上，随后的组织病理学显示在一些小鼠的肺中只有少量的转移沉积。相比之下，所有携带4T1肿瘤的小鼠由于转移负担而达到终点(图。 第一代 ).为了检测肺中的单个DTC，TSAE1、HRM1和EMT6细胞被改造成表达mCherry和荧光素酶(mChLuc2)。原位移植后，当肿瘤达到与引起症状性转移疾病的4T1肿瘤相当的大小时(约700-1，000 mm ),离体用体内成像系统(IVIS)对器官进行成像 3 ).检测到正IVIS信号；然而，荧光素酶的免疫染色仅显示单个DTC或小簇(通常< 10个细胞)，在肺中未检测到大转移疾病(图。 1h )或其他器官(扩展数据图。 2h ).考虑到ER的高表达和管腔分类，我们重点研究了TSAE1-BALB/c模型，使用HRM1-FVB模型进行验证。由于EMT6系的非上皮、紧密连接蛋白低表型，没有对其进行进一步的实验。
老化的微环境促进内质网的生长 + 故障诊断码 给定er之前较长的等待时间 + 远处复发，我们试图确定老化的微环境是否能促进雌激素受体的生长 + 故障诊断码TSAE1原发性肿瘤的生长与小鼠年龄无关，但年轻(12周结束时)小鼠的肺中仅存在单一DTC或小肿瘤细胞群，而年老(16个月结束时)小鼠的肺显示出显著增加的转移负担(图。 2a 和扩展数据图。 3a ).用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)标记证实，在年轻的肺中只有小百分比的肿瘤细胞是增殖的，但是增殖数量显著更高(EdU + )在老年肺中的小簇和大转移沉积物中都发现了肿瘤细胞(图。 2b 和扩展数据图。 3b ).使用实验性(静脉内肿瘤细胞接种)转移模型，所有小鼠的转移负担都大于在自发模型中观察到的转移负担，这可能是由于在肺中播散的DTC数量更高，尽管年轻小鼠的转移损伤主要局限于肺边缘和支气管树，而老年小鼠表现出更高的转移负担和更广泛的转移分布，在肺实质中具有显著的损伤(图。 2c 和扩展数据图。 3c
所有实验都使用接种到BALB/c小鼠中的TSAE1细胞。 a 原位接种入年轻或年老(15个月大)小鼠( n =每组6只小鼠)。左，肿瘤生长。右侧，肺转移负担的量化(第30天)和代表性图像(比例尺，1 mm)。更多量化数据见扩展数据图。 3a b ，原位接种入 n = 4年轻或 n = 3只年龄大于12个月的小鼠。EdU在扑杀前24小时注射(第33天)，EdU + 对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片中的肿瘤细胞进行定量；显示了代表性图像(比例尺，100微米)。附加图像显示在扩展数据图中。 3b c ，静脉接种入 n = 5岁以下 n = 4岁(9岁 - 月龄)小鼠。转移性肺负荷(第15天)，图像(比例尺，2.5毫米)。 d 年轻(12周龄)和年老(13月龄)小鼠NTB肺的RNA-seq图谱( n =每组5只小鼠)。左，层次聚类。对,“成纤维细胞激活信号”和“纤维化信号”基因的表达。 e 静脉内接种到幼鼠中，在赋形剂或博来霉素处理后3 d( n =每组6只小鼠)。转移性肺负荷(接种后15天)，代表性图像(比例尺，2.5 mm)。 f 在幼鼠中原位接种(第1天)，在第10天开始用载体或博来霉素处理( n =每组6只小鼠)。转移性肺负荷(第32天)，代表性图像(比例尺，2.5毫米)。 g ，在年轻和年老小鼠的NTB肺中的表达(RNA-seq)。 h 用赋形剂或博莱霉素处理并在7或14天后剔除的NTB小鼠( n =每组3只小鼠；RT–qPCR)。 i ，相关性分析 PDGFC 和 EDA2R 在人类非癌性肺样品中的表达( n = 1197名患者； GSE23546 ).DEG，差异表达基因；错误发现率。 j , Pdgfc 原代成纤维细胞中的表达(RT–qPCR )(三个独立重复)。 k ，静脉接种到幼鼠体内。在第3天和第8天，给小鼠静脉注射shNTC-或shPdgfc小鼠GFP + 咖啡馆( n =每组5只小鼠)。转移性肺负荷(第10天；shNTC和shPdgfc， n =每组10只小鼠)。 a –c ,e ,f ,h ,j ,k ，数据表示为平均值±标准差；双尾曼恩-惠特尼 U -测试( a ,k )，双尾 t -测试( b ,c ,e ,f ,j )，双尾皮尔逊相关( i )或具有多重比较的双向ANOVA( h ).
根据年龄分组的年轻和年老BALB/c小鼠的肺RNA-seq图谱，成纤维细胞活化和纤维化基因差异表达(图。 2d 和扩展数据图。 三维（three dimension的缩写） ).为了模拟肺纤维化，我们使用了鼻内博莱霉素治疗，这促进了成纤维细胞活化、巨噬细胞浸润和胶原蛋白沉积(扩展数据图。 3e ).静脉或原位接种后，er + TSAE1细胞在博莱霉素处理的肺中显示出显著增强的转移生长(图。 2e，f )，同时肺实质内的巨转移也显著增加。鉴于这些发现以及在我们的体外休眠模型中成纤维细胞CM对肿瘤细胞增殖的显著再激活(扩展数据图。 2b–d Pdgfa 和 Pdgfb 在老年小鼠肺中，与 Pdgfc 和 Pdgfd (图。 2g ).此外， Pdgfc 博莱霉素治疗后，纤维化肺中PDGF-C蛋白的表达和水平显著上调，而其他PDGF家族成员的表达显著下调(图。 2h 和扩展数据图。 3f，g ).这些发现通过分析来自博莱霉素处理的C57BL/6小鼠的肺的独立RNA谱数据集得到了验证 14 (扩展数据图。 4a ).此外，在从1197名年龄在4至85岁之间的患者收集的人肺组织中 15 的表达 PDGFC , PDGFD 和 地图 (编码组织纤溶酶原激活物(tPA))，负责PDGF-C前体的细胞外裂解 16 ，与年龄和表达显著相关 EDA2R 和其他与年龄相关的基因 15 ,17 ，但是没有与年龄相关的联系 PDGFA 或者 PDGFB (图。 2i 和扩展数据图。 4b
在人类的肺中， PDGFC 主要由成纤维细胞和骨髓细胞表达，其次由上皮细胞表达 18 老年小鼠肺的流式细胞术分析结果概述(扩展数据图。 4c ).此外，表达 Pdgfc 与年轻的成纤维细胞相比，在年老的原代小鼠肺成纤维细胞中升高(图。 2j ).确定老年肺成纤维细胞中PDGF-C水平的增加是否促进雌激素受体的转移生长 + 故障诊断码，PDGF-C 你好 用非靶向短发夹RNA (shRNA)对照(shNTC1和shNTC2)或shRNA种类靶向转导caf Pdgfc (扩展数据图。 4d，e )并在接种TSAE1细胞后3天和8天接种到小鼠中。老鼠接受 Pdgfc -耗尽的caf显示出减少的转移生长(图。 2k )和类似地，对照caf或来自老化肺的成纤维细胞，但不 Pdgfc -耗尽的caf或年轻的成纤维细胞，在BME休眠试验中支持TSAE1和HRM1生长(扩展数据图。 4f，g
Pdgfc 在转移微环境中的表达 为了评估转移微环境的变化，我们比较了非荷瘤(NTB)青年和老年小鼠肺纤维化相关基因和PDGF家族成员的表达(见图。 2d )与用TSAE1肿瘤细胞原位接种的年轻和年老小鼠(带有肿瘤(TB)的小鼠)的平行队列。这与年轻结核小鼠中存在有限转移性疾病和老年结核肺中存在大转移病灶相一致(图。 2a 和扩展数据图。 5a )，老化的TB肺具有较高的TSAE1肿瘤信号评分，这是一种与成纤维细胞活化和纤维化基因表达增加平行的模式，表明在存在转移性疾病的情况下微环境进一步活化(图。 3a ).值得注意的是，表达 Pdgfc 和 地图 在老年小鼠的结核肺中进一步升高，而其他PDGF家族成员的水平进一步降低(图。 3b
a ,b 年轻或年老(13个月大)BALB/c小鼠肺的RNA-seq图谱( n = 7或 n = 6只小鼠)原位接种TSAE1细胞(TB；第29天)。NTB老鼠来自无花果。 2d 。参见扩展数据图。 5a 为了组织学。 a TSAE1肿瘤信号、成纤维细胞激活信号和纤维化信号的得分( 方法 b , Pdgfa –Pdgfd 和 地图 表情。 c ，相关性分析 ESR1 和 PDGFC 在人乳腺癌细胞系中的表达(癌细胞系百科全书(CCLE))。 d , Pdgfc 体外小鼠肿瘤细胞系中的表达(RT–qPCR )(三个独立重复；TSAE1，四)。 e , PDGFC 在人类乳腺癌中的表达(代谢数据集；急诊室 − , n = 445名患者；急诊室 + , n = 1459名患者)。 f , Pdgfc 小鼠组织的RNAscope分析 a ,b ；α-SMA的复染(青色)。结核幼鼠肺、结核老年肺中的转移沉积物(met)和原发性肿瘤的代表性图像(比例尺，25 m)。 g –i ，通过流式细胞术从年轻小鼠的原发性(原位接种)和转移性(静脉内接种)肿瘤中分离mChLuc2标记的肿瘤细胞。 g , Pdgfc 在TSAE1-mChLuc2细胞中的表达(第16天，原位；第15天，静脉注射； n =每组5只小鼠)与体外细胞( n = 3个生物重复)。 h ，左， Pdgfc 在来自原发性肿瘤的4T1-mChLuc2细胞中的表达(第14天， n = 5只小鼠)，或肺转移(第10天， n = 4只小鼠)，相比于体外培养物(TSAE1， n = 4;4T1， n = 7个生物重复)。对， Pdgfc 在来自原发性肿瘤的D2A1-mChLuc2细胞中的表达(第20-25天， n = 3只小鼠)与体外培养物(TSAE1， n = 5;D2A1， n = 6个生物重复)。 i 将TSAE1-mChLuc2细胞原位接种到年轻或年老(10-13月龄)小鼠中。麦克亨利 + 从肺中分离肿瘤细胞(第31-35天； n =每组8只小鼠)。左，肿瘤细胞定量。对， Pdgfc 在分离的肿瘤细胞中表达。 a ,b ,d ,g –i ，数据表示为平均值±标准差；多个的 t -测试( a ,b )、皮尔逊相关(双尾) ( c )，多重比较的单因素方差分析( d ,g ,h )，一个显示第25和第75个百分位数、中间值(直线)以及最小和最大值(触须)的方框图( e )，双尾 t -测试( e ,i ，左)或双尾曼氏–惠特尼 U -测试( i ，对)。
在急诊室 − 乳腺癌，肿瘤细胞衍生的PDGF-C已被证明促进CAF募集 19 ,20 。然而，PDGF-C在er中的作用 + 乳腺癌在很大程度上被忽视了，主要是由于乳腺癌的低表达 PDGFC 在急诊室 + 体外培养的人乳腺癌细胞系 20 。事实上，表达 PDGFC 与...呈负相关 ESR1 乳腺癌细胞系中的表达(图。 3c )，以及 Pdgfc 在培养的雌激素受体中表达显著降低 + TSAE1和HRM1肿瘤细胞比ER − D2A1和4T1细胞(图。 三维（three dimension的缩写） ).这种情况在人类肿瘤中不太清楚，乳腺癌国际联盟的分子分类(代谢)数据集揭示了更高的 PDGFC ER中的表达式 + 乳腺癌比在急诊室 − 乳腺癌(图 3e ).由于代谢分析是大量肿瘤分析，不可能区分肿瘤细胞和基质 PDGFC 表情；然而，26个人类乳腺癌的单细胞RNA-seq分析 21 证明可比 PDGFC 跨ER的表达式 + 还有呃 − 肿瘤细胞，雌激素受体 + 细胞表达明显较高水平的 地图 (扩展数据图。 5b ).此外， Pdgfc TSAE1 TB幼鼠和老龄鼠的原位杂交(RNAscope)揭示了tsae 1 TB的广泛上调。 Pdgfc 在老年肺的原发性肿瘤和转移病灶中(图。 3f )，共同提高了肿瘤细胞导致 Pdgfc 在老龄结核小鼠肺中的表达。
为了解决这个问题，从原发性肿瘤和具有转移性病变的肺中分选TSAE1-mChLuc2肿瘤细胞。与培养中的细胞相比， Pdgfc 雌激素受体的表达显著增加 + 体内肿瘤细胞，而 Pdgfa 和 Pdgfb 不是(图。 3g 和扩展数据图。 6a ).类似地，肿瘤细胞 PDGFC ，使用人类特有的 PDGFC 探针，在ER中上调 + ZR-75-1肿瘤与培养中的ZR-75-1细胞的比较(扩展数据图。 6b ).相比之下，PDGF特区 你好 急诊室 − D2A1和4T1细胞没有显示进一步的上调。 Pdgfc 体内表达(图。 3h ).引人注目的是，从年轻和年老的肺中分离的TSAE1细胞显示出显著升高的肿瘤细胞数量和肿瘤细胞 Pdgfc 与年轻肺结核患者相比，老年肺结核患者的肺部表达情况(图。 3i )，说明 Pdgfc 雌激素受体表达上调 + 转移病灶中的肿瘤细胞与休眠的DTC的比较。至少部分地，这可能反映了与大转移病灶相关的活化微环境 Pdgfc 或者 PDGFC ER的表达 + 肿瘤细胞可以通过与PDGF-C共培养而被诱导 你好 扩展数据图。 6c ).相反，PDGF-C 你好 急诊室 − 4T1和AT-3细胞分别在老年BALB/c和C57BL/6小鼠中没有显示出增加的转移定居，表明它们的高内源性 Pdgfc 表达足以在PDGF-C细胞中启动转移定殖 瞧 年轻肺的微环境(扩展数据图。 6d–f
肿瘤细胞PDGF-C支持DTC存活和生长 为了测试肿瘤细胞衍生的PDGF-C在生长中的转移病灶中是否有助于生产性转移小生境的发展，用shNTC1或shNTC2或两种独立的shRNA种类靶向转导TSAE1细胞 Pdgfc (shPdgfc1，shPdgfc5)。所有shRNA细胞系在体外都表现出相当的生长率(图。 4a、b ).如前所示，较高数量的er + 静脉接种后播散到肺部的TSAE1细胞部分克服了PDGF-C的缺陷 瞧 微环境(图。 2c，e )，并且，在这些分析中， Pdgfc 敲除显著限制了转移生长(图。 4c )，HRM1 ER中概括了这一发现 + 型号(图。 4d 和扩展数据图。 7a，b ).重要的是，在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，基质PDGF-C水平升高，肺微环境被广泛激活(图。 2h 和扩展数据图。 3e–g )，TSAE1-shPdgfc和TSAE1-shNTC细胞显示出相当的转移生长(图。 4e ).当原位接种时，TSAE1-shNTC和TSAE1-shPdgfc原发肿瘤在年轻小鼠中生长相当(图。 4f )，免疫组织化学分析证实 Pdgfc 在体内维持敲除(扩展数据图。 7c ).如前所述(图1和2)。 1g，h 和 2b )，患有TSAE1-shNTC肿瘤的年轻小鼠表现出潜伏播散性疾病的证据，几乎没有大转移病变。耗尽 Pdgfc 进一步减少了这种转移定居(图。 4f )，表明低水平肿瘤衍生的PDGF-C在ER中的作用 + DTC存活。最后，为了支持PDGF-C的需要 你好 休眠DTC生长的微环境，过度表达 Pdgfc (图。 第四代移动通信技术 )，对体外细胞增殖或原发性肿瘤生长没有影响，但显著增加了转移负担(图。 4h
a , Pdgfc 用shNTC1、shNTC2、shPdgfc1或shPdgfc5转导的TSAE1细胞中的表达(RT–qPCR)。代表五个独立的重复。 b 用shNTC或shPdgfc转导的TSAE1细胞的体外增殖。代表两个独立的重复。 c 将用shNTC或shPdgfc转导的TSAE1细胞静脉注射入年轻的BALB/c小鼠( n =每组5只小鼠)。转移性肺负荷(第14天)，具有代表性的H&E染色切片(比例尺，5 mm)。 d 用shNTC或shPdgfc转导的HRM1细胞(扩展数据图。 7a，b )静脉注射到年轻的FVB小鼠( n =每组5只小鼠)。转移性肺负担(第30天)。两只患有shPdgfc肿瘤的小鼠没有转移沉积。代表健康与环境 - 染色切片(比例尺，5 mm)。 e 将用shNTC或shPdgfc转导的TSAE1细胞静脉注射入博来霉素处理的年轻BALB/c小鼠( n =每组5只小鼠)。 2e 。转移性肺负荷(TSAE1接种后第11天)，具有代表性的H&E - 染色切片(比例尺，5 mm)。 f 将用shNTC或shPdgfc转导的TSAE1细胞原位注射入年轻的BALB/c小鼠( n =每组6只小鼠)。左，肿瘤生长。右图，肺转移沉积物的定量(第28天；shNTC和shPdgfc， n =每组12只小鼠)。底部，有代表性的H&E染色切片(比例尺，500米)。参见扩展数据图。 9a、b 用于原发肿瘤免疫染色。 g 携带对照载体(EV)或表达的TSAE1细胞 Pdgfc (Pdgfc o/e)。左边， Pdgfc TSAE1肿瘤中的表达(RT–qPCR )( EV， n = 6只小鼠； Pdgfc 过度表达， n = 5只小鼠)。对，体外增殖。代表两个独立的重复。 h 对年轻的BALB/c小鼠原位注射携带EV( n = 6只小鼠)或过表达(o/e) Pdgfc (n = 5只小鼠)。在第30-35天剔除小鼠。左，单个小鼠的肿瘤生长。对，肺部转移沉积的量化。数据表示为平均值±标准差(c –h );多重比较的单因素方差分析( c –e )或双尾 t -测试( f –h ).
PDGF-C介导的成纤维细胞活化 PDGF-C受体的表达由 PDGFRA 仅限于正常肺组织中的成纤维细胞(人类蛋白质图谱， http://www.proteinatlas.org 18 )和原发性人类乳腺癌 21 (扩展数据图。 8a ).同样，在急诊室 + 这里使用的肿瘤细胞， Pdgfra 和 PDGFRA 与小鼠(CAF，10T1/2)或人(MRC5)成纤维细胞相比，mRNA和PDGFRα蛋白水平可以忽略不计(图。 5a、b ).事实上，重组PDGF-C (rPDGF-C)治疗成纤维细胞而不是内质网 + 肿瘤细胞促进PDGFRα、AKT、ERK和S6磷酸化，这被PDGFRα抑制剂伊马替尼抑制(图。 5b )，并且与以前的报告一致 22 ,23 ,24 在rPDGF-C处理后，成纤维细胞增殖和迁移增加(图。 5c 和扩展数据图。 8b，c ).rPDGF-C处理的MRC5成纤维细胞的RNA-seq图谱和分泌转录组的分析鉴定了纤维化和创伤愈合途径的富集以及增加。 地图 表情(图。 5d 和扩展数据图。 8d ).据报道，PDGF-C可促进血管周围caf的积聚 25 但是我们观察到TSAE1原发性肿瘤的血管密度或周细胞或血管周CAF覆盖率与用shNTC或shPdgfc转导的细胞没有差异(扩展数据图。 9a )或活化的(α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的数量 + )成纤维细胞(扩展资料图。 9b ).然而，α-SMA明显较少 + 静脉接种TSAE1或HRM1细胞后shPdgfc转移病灶中的成纤维细胞(图。 5e，f 和扩展数据图。 9c )，表明在年轻的肺微环境中，肿瘤衍生的PDGF-C是促进成纤维细胞募集和活化所必需的。
a , Pdgfra 和 PDGFRA 在小鼠(上图)和人(下图)成纤维细胞(灰色)和肿瘤细胞系(彩色)中的表达(RT–qPCR)。两个独立重复、多个细胞系的代表性数据。 b 成纤维细胞和雌激素受体的蛋白质印迹分析 + 用载体rPDGF-C (100 ng ml)处理后的肿瘤细胞 −1 )和/或伊马替尼(1 M)。两个独立重复、多个细胞系的代表性数据。p，磷酸化；t，总计。 c 成纤维细胞和雌激素受体的CTG分析 + 用载体或rPDGF-C (100 ng ml)处理的肿瘤细胞 −1 ).每个细胞系的两个(HRM1)、三个(TSAE1、CAF)和六个(MRC5)独立重复的代表性数据。 d 用载体或rPDGF-C处理6小时(左)或24小时(右)的MRC5成纤维细胞的RNA-seq分析。处理后差异表达的基因(双尾 t -测试， P < 0.01) are highlighted in red with the top 20 significantly altered genes labeled. e ,f 对BALB/c小鼠的肺静脉注射TSAE1肿瘤细胞(图。 4c )，或者给FVB小鼠静脉注射HRM1肿瘤细胞(来自图。 4d )，并对α-SMA进行染色。根据α-SMA的数量对转移性沉积物进行评分 + 单元格(扩展数据图。 9c ).代表性图像(比例尺，500米)。注意，两只HRM1-shPdgfc小鼠没有检测到肺沉积物(图。 4d ).数据以平均值表示；多重比较的Kruskal-Wallis检验( e ,f ).
PDGF-C在人类急诊室中的作用 + 转移复发模型 为了将这些研究扩展到人类乳腺癌，我们采用了人类雌激素受体 + 乳腺癌细胞系ZR-75-1。尽管将ZR-75-1细胞原位接种到缺乏功能性免疫系统的NOD SCID gamma (NSG)小鼠中，但仅在肺中发现单个DTC或小细胞群，几乎没有证据表明其扩散到其他器官(图。 6a 和扩展数据图。 10a ).肺分离后，分离的ZR-75-1细胞在体外保持非增殖性，但可以用成纤维细胞CM重新激活(图。 6a )，结果与体外休眠试验一致(扩展数据图。 2b–d ).当静脉注射时，ZR-75-1细胞扩散到肺部并保持大量休眠状态；然而，肿瘤细胞扩散到肝和骨，乳腺癌中其他常见的转移部位，最终形成大转移(图。 6b 和扩展数据图。 10b PDGFC RNAscope，使用人类特异性探针(扩展数据图。 10c )，对分离的肿瘤细胞进行经确认的定量PCR和逆转录(RT–qPCR)分析(扩展数据图。 6b )，显示上调 PDGFC 在ZR-75-1原发肿瘤细胞中表达，但低水平 PDGFC DTC的表达，再次支持了休眠DTC是PDGF-C的论点 瞧 。两个独立的ZR-75-1-shPDGFC细胞系的产生证实了 PDGFC 不影响体外肿瘤细胞增殖(扩展数据图。 10d )但是，静脉接种后，显著减少了单个DTC和较大病变的数量(图。 6c 和扩展数据图。 10e ).相反，用rPDGF-C或博莱霉素预处理年轻小鼠的肺促进了DTC的增殖(图。 6d ).总之，这些发现证明了肿瘤细胞来源的PDGF-C在支持DTC (PDGF-C 瞧 )生存和转移(PDGF-C 你好 )成长。PDGF-C的这种作用在ZR-75-1细胞异位表达的自发转移环境中得到进一步证明 Pdgfc 传播到肺部，而不是仅仅作为单个休眠细胞存在(图。 6a )，形成转移性沉积(图。 6e 和扩展数据图。 10f
所有的实验都包括将ZR-75-1-mChLuc2细胞接种到年轻的NSG小鼠中。 a ，原位接种(TB)，与NTB对照( n =每组5只小鼠)。左，离体肺IVIS成像(第34-43天； n = 4 TB小鼠，因为一只小鼠用于肿瘤细胞分离；比例尺，亮度，p s −1 厘米 −2 立体弧度 −1 ).右，结核肺染色的人核纤层蛋白A/C(比例尺，250 m)。从肺中分选的肿瘤细胞( n = 1 TB小鼠)用对照培养基或4T1或成纤维细胞(MRC5或3T3) CM处理。每个集落的细胞数(第7天和第14天)。 b ，静脉接种(TB； n = 6只小鼠)。左边的 , 肺的离体IVIS成像(第29天；比例尺，亮度，p s −1 厘米 −2 立体弧度 −1 ).NTB对照小鼠来自 a 。右，肺、肝和后腿骨的人类核纤层蛋白A/C染色(比例尺；肺，250米；肝和骨头，500米)。 c 静脉注射用shNTC1、shNTC2、shPDGFC2或shPDGFC5转导的细胞(shNTC和shpdgfc； n =每组分别有7或8只小鼠)。左上，全身IVIS信号(第28天；比例尺、计数)。右上，肝脏中的离体IVIS信号(第29天)。左下，用代表性的人核纤层蛋白A/C染色的肝脏切片(比例尺，5 mm)量化转移性沉积物和DTC。只有三个shPDGFC5后腿骨样本可用。 d 在第12天，将ZR-75-1-mChLuc2细胞静脉内接种(i.v .)( n = 5只赋形剂或rPDGF-C处理的小鼠； n = 4只博莱霉素处理的小鼠)。给小鼠注射EdU(第37天)并在24小时后剔除。EdU的百分比 + 人类(核纤层蛋白A/C + )肿瘤细胞，代表图像(比例尺，50 m)。 e 携带EV或过度表达(o/e)的细胞 Pdgfc 细胞被原位注射( n =每组5只小鼠)。在第45-60天剔除小鼠。左，单个小鼠的肿瘤生长。右图，肺转移沉积的定量，用代表性的人层粘连蛋白A/C染色(比例尺，125 m)。数据以平均值表示；西梅姆(a ，左； b –e ，对)；双尾检验的 t -测试( a –c 中右)、具有多重比较的单向ANOVA( d )或双尾曼恩–惠特尼 U -测试( c ，上，左中，下； e ).
PDGF-C信号阻断损害ER + 转移性生长 鉴于肿瘤衍生的作用 Pdgfc 在急诊室 + DTC存活和生长，我们评估了伊马替尼对PDGFRα的药物抑制是否限制了转移生长。正如所料，考虑到成纤维细胞限制 Pdgfra 和 PDGFRA 表达，伊马替尼影响CAF，但不影响肿瘤细胞的生存能力(图。 7a ).用TSAE1细胞静脉接种小鼠的伊马替尼治疗抑制了肺中的转移生长，并减少了转移病灶中的成纤维细胞活化(图。 7b 和扩展数据图。 10g ).类似地，伊马替尼治疗显著降低了ZR-75-1的全身转移，其趋势是肝脏中的转移生长减少，肺部中发展为肿瘤细胞簇的DTC比例减少(图。 7c ).如前所示(图1)。 4c Pdgfc TSAE1细胞的耗竭严重损害了转移生长(图。 7d )，当与伊马替尼联合治疗时，肺肿瘤细胞含量有少量但不显著的额外减少，这可能至少部分是由于伊马替尼抑制对肿瘤细胞和非肿瘤细胞来源的PDGF-C均有反应的成纤维细胞上的PDGFRα 你好 纤维化和老化的肺可以抑制雌激素受体的转移 + 故障诊断码在TSAE1细胞接种前用伊马替尼或用PDGF-C-阻断抗体治疗纤维化肺，显示阻断体内PDGF-C信号传导 25 ,26 ，从接种TSAE1的那天起，在减少转移生长方面同样有效(图。 8a、b ).类似地，PDGF-C-封闭抗体显著降低了在老龄小鼠中观察到的增加的转移生长(图。 8c
er的细胞滴度分析 + 载体或伊马替尼(1 M)处理72小时后的肿瘤细胞和成纤维细胞(两个独立重复、多细胞系的代表性数据)。 b 将TSAE1细胞静脉注射到年轻的BALB/c小鼠中，小鼠按照指示接受赋形剂或伊马替尼( n =每组5只小鼠)。中，肺转移负担(第15天)，具有代表性的肺切片(比例尺，5 mm)。下图为肺的α-SMA染色，并对转移沉积的α-SMA阳性细胞数进行评分(扩展数据图。 10g )，有代表性的图片(比例尺，500 m)。 c ，将ZR-75-1-mChLuc2细胞静脉注射入年轻的NSG小鼠中，小鼠按照指示接受赋形剂或伊马替尼治疗( n =每组6只小鼠)。中左，第14天全身IVIS信号。IVIS信号量化，具有代表性的图像(比例尺显示辐射亮度，第页 −1 厘米 −2 立体弧度 −1 ).中右，肝脏中离体IVIS信号的定量(第21天)。左下方，肝脏转移沉积的数量。右下，肺中单细胞、双重细胞、3-5个肿瘤细胞、6-10个肿瘤细胞或> 10个肿瘤细胞的肿瘤沉积物的百分比。 d 将用shNTC1或shPdgfc1转导的TSAE1肿瘤细胞静脉内接种到年轻的BALB/c小鼠中，按照指示用赋形剂或伊马替尼对其进行治疗( n =每组5只小鼠)。转移性肺负荷(第14天)，显示了代表性的肺切片(比例尺，5 mm)。数据以平均值表示；西梅姆( b –d );双尾检验的 t -测试( b ,c (左上))，双尾曼恩–惠特尼 U -测试( c 右上和下)或具有多重比较的双向ANOVA( d ).
总之(图。 8d )，这些数据表明低级 Pdgfc ER中的表达式 + DTC有助于它们的存活，但不足以在健康的年轻肺中产生允许转移的小生境。相反，在老化或纤维化的肺中，活化的PDGF-C 你好 间质支持转移生长，强调PDGF-C信号的抑制是限制ER转移复发的机会 + 乳腺癌。
讨论 急诊患者晚期复发的风险 + 乳腺癌依赖于最初的临床病理诊断；然而，即使是那些低度淋巴结阴性(T1N0)肿瘤，在接下来的5-20年中也有10-17%的远处复发风险 2 。尽管这种风险持续存在，我们对晚期ER的理解 + 由于缺乏合适的临床前模型，转移性复发仍然受到限制。这里，我们用ER + 小鼠乳腺肿瘤细胞系，并证明在同系年轻免疫活性小鼠中，没有额外的雌激素补充以更好地模拟老年妇女的激素环境，来自原发性肿瘤的细胞扩散到继发性部位，但无效率地发展成大转移病变。相比之下，为了模拟与年龄相关的微环境变化，在老龄小鼠或纤维化肺小鼠中进行的平行实验揭示了加速的转移生长。
使用这些模型，我们试图确定在转移前老年小鼠肺中上调的因子。RNA-seq分析揭示了大量与成纤维细胞活化和纤维化发展相关的基因，先前报道这些基因促进了转移定殖 27 。然而，特别令人感兴趣的是生长因子PDGF家族的四个成员表达模式的不一致。PDGFs在上皮起源的癌症中的功能主要是关于成纤维细胞的激活和/或血管生成的促进 28 ,29 。然而，很少有研究检测PDGFs在转移中的作用。有趣的是，我们的研究表明，虽然经典PDGFs的表达 Pdgfa 和 Pdgfb 在衰老(NTB和肺结核)和纤维化肺中表达下调 Pdgfc 和 地图 (tPA)，编码PDGF-C激活所需的蛋白水解酶，被强烈上调。
在正常的肺、肝和骨中，er的主要位置 + 乳腺癌复发，PDGF-C水平低(人类蛋白质图谱 18 ,30 ).相比之下，在患病组织中，巨噬细胞亚群中PDGF-C水平增加 25 ,26 ，咖啡馆 31 ,32 和肿瘤细胞 19 ,33 ,34 。在这里，我们证明 PDGFC 和 Pdgfc ER的表达 + 细胞在原发性肿瘤和确定的转移病灶中升高，但在继发性部位的非增殖性DTC中保持低水平。然而，这种低级的 Pdgfc 表达作为肿瘤细胞起着重要的功能作用 Pdgfc 损耗显著减少 + DTC存活。相反，异位表达 Pdgfc 在急诊室 + 细胞增强转移生长，表明雌激素受体水平 + DTC衍生的PDGF-C单独不足以有效的转移生长。PDGF-C克服了这一缺陷 你好 老年或纤维化小鼠的肺微环境，或通过鼻内施用rPDGF-C预处理年轻小鼠的肺。重要的是，这种缺陷在PDGF-C中并不明显 你好 急诊室 − 4T1和AT-3细胞系，它们在年轻和年老的小鼠中表现出相同的转移生长。在三阴性乳腺癌中，诊断时的年龄与不良预后相关，小于40岁的患者预后更差 35 。尽管其他因素如延迟检测无疑会导致不良预后，但在多变量分析中，预后效应仍然显著 35 小鼠模型进一步证实了这一点，与年龄较大(> 10个月大)的小鼠相比，三阴性乳腺异种移植物在年轻(8-10周龄)小鼠中表现出更早的发病和增强的生长 36 以及雌激素受体的等效转移产物 − 这里报道的年轻和年老小鼠的细胞系。
为了支持我们在急诊室的数据 + 越来越多的证据表明，包括免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质在内的老化基质在促进肿瘤发生中的作用 37 。免疫区室可以调节DTC休眠和转移生长之间的平衡 5 ,6 ,38 并且，当在人类和小鼠衰老过程中发生改变时，对治疗反应和转移控制有影响 37 。同时，衰老的成纤维细胞显示出分泌组的改变，Wnt拮抗剂分泌的卷曲相关蛋白(sFRP)1和sFRP2促进了转移生长 17 ,39 类似地，转化生长因子(TGF)-β的鼻内给药创造了纤维化环境，支持乳腺肿瘤细胞在肺部的生长 4 。在这里，我们描述了上调表达的 Pdgfc 在老年小鼠成纤维细胞和 PDGFC 人类肺样本大数据集中年龄相关基因的表达和表达。值得注意的是，这里和其他关于衰老微环境的研究中使用的12-16个月大的小鼠 17 ,39 被认为相当于中年或中年后期的女性( https://www.jax.org ).随着人类年龄的增长，年龄相关基因的表达持续增加 15 ，预计 Pdgfc 在18-24个月大的小鼠中表达会进一步增加。除…之外 Pdgfc ，我们显示了老年小鼠肺中成纤维细胞活化和纤维化基因的上调，重要的是，对于其中的大多数，包括 Pdgfc 和 地图 ，在结核肺中的表达进一步增强，支持肿瘤细胞和活化的微环境之间的正反馈循环。虽然巨噬细胞以及成纤维细胞和肿瘤细胞有助于这种上调 Pdgfc 在结核老化肺中的表达，我们的发现在使用人类ER的休眠模型中得以概括 + 免疫妥协小鼠的ZR-75-1细胞，表明PDGF-C可以以非免疫依赖性方式引发其促转移作用。
利用雌激素受体的同源模型 + 年轻和老年小鼠的乳腺癌揭示了以前未被重视的PDGF-C在er中的作用 + 乳腺癌转移和伊马替尼靶向PDGFRα的效用，伊马替尼是一种耐受性良好的临床相关治疗药物，在老年和年轻慢性髓细胞白血病患者中具有同等的疗效和安全性 40 ,41 并能减少博莱霉素诱导的纤维化 42 。重要的是，鉴于伊马替尼还靶向其他酪氨酸激酶，如KIT、CSF1R和BCR-ABL 43 ，我们的发现用PDGF-C-阻断抗体概括。总之，这些数据加强了越来越多的证据，描述了转移微环境在调节DTC生长中的作用 44 ,45 ,46 并支持PDGF-C 你好 微环境通过募集和激活PDGFRα阳性成纤维细胞并增加PDGF-C前体蛋白水解裂解所需的tPA水平，支持老年小鼠或肺纤维化小鼠的快速转移生长。相比之下，年轻健康的肺中低水平的PDGF-C不足以创造一个有利于转移的微环境来支持内质网 + DTC增长。相反，树突状细胞的存活和生长依赖于肿瘤细胞衍生的PDGF-C。然而，在单个内质网的临床情况下 + 如自发性转移试验中所模拟的，位于继发性部位的DTC产生的PDGF-C水平不足以产生强大的肿瘤细胞-间质串扰和产生有效的转移小生境，延迟转移生长，直到这些继发性部位的年龄相关变化触发er + 重新唤醒故障诊断码。
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