癌细胞通常会重新编程代谢模式，以满足其快速和可持续增长的生物量需求1,2,3。丝氨酸代谢在多种癌症类型中被激活，通过为大分子(如蛋白质、核苷酸和脂质)合成提供前体和为甲基化反应提供一碳单元来支持肿瘤生长和转移。此外，耦合一碳代谢的丝氨酸合成产生谷胱甘肽(GSH)和NADPH，两种主要的内在抗氧化剂，以维持癌细胞中的氧化还原平衡4,5,6,7。癌细胞中丝氨酸代谢所需的细胞内丝氨酸库可以通过细胞外输入或从头生物合成来补充6,8。因此，最近已经开发了丝氨酸代谢靶向策略，包括饮食丝氨酸/甘氨酸限制、丝氨酸合成抑制或其组合，并显示出对癌症治疗的有利效果5,9,10,11,12,13。然而，在癌症中调控丝氨酸合成的潜在机制仍不清楚。
磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)是丝氨酸从头生物合成途径中的第一个限速酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PG)形成3-磷酸羟基丙酮酸14,15。最近的研究表明，PHGDH经常过表达，以激活丝氨酸合成并促进几种类型的癌症中的肿瘤生长，包括乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑色素瘤16,17,18。PHGDH敲除或抑制剂显著抑制这些PHGDH过度表达的癌症的生长，表明PHGDH是癌症治疗的有希望的靶标16,17,18,19,20,21,22。据报道，癌症中PHGDH上调是由激活转录因子4、核因子红系-2相关因子2或MYC介导的基因扩增或转录上调的结果18,23,24,25。此外，E3泛素连接酶(Parkin和RNF5)的下调或去泛素酶JOSD2的上调被报道为乳腺癌或肺腺癌中PHGDH过表达的关键机制26,27,28。尽管在癌症中PHGDH过度表达的机制已经被很好地阐明，但是在癌症中PHGDH活性的作用和调节机制仍然知之甚少。
蛋白质精氨酸甲基化是一种普遍存在的翻译后修饰，由蛋白质精氨酸甲基转移酶催化29,30。目前，在哺乳动物中已经鉴定了九种PRMTs，根据它们的催化特异性将其分为三种不同类型。I型PRMT(PRM t1-4、PRMT6和PRMT8)催化单甲基精氨酸(me1)和不对称二甲基精氨酸(me2a)的形成，II型PRMT(PRM t5和PRMT9)产生me1和对称二甲基精氨酸(me2s)，而III型PRMT (PRMT7)催化me1的产生30,31。新的证据表明，蛋白质精氨酸甲基化在广泛的生物过程中起着至关重要的作用，如mRNA剪接、DNA损伤、转录和信号转导31,32。值得注意的是，最近的研究表明PRMTs介导的蛋白质精氨酸甲基化调节癌症代谢，包括葡萄糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂质代谢33,34,35,36,37。然而，蛋白质精氨酸甲基化在癌细胞丝氨酸代谢中的作用在很大程度上仍然未知。
在这项研究中，我们展示了PHGDH甲基化对于丝氨酸合成和HCC生长的重要作用。虽然在mRNA和蛋白水平下调，但PHGDH被PRMT1介导的R236甲基化激活，从而促进丝氨酸合成、氧化还原稳态和HCC生长。通过TAT标记的非甲基化肽阻断PHGDH甲基化抑制HCC生长，没有明显的毒性，表明PHGDH甲基化可能是HCC治疗的一个治疗弱点。
结果
HCC代谢组学和转录组学之间存在不一致
新的证据揭示了一些癌症中代谢组和转录组之间的异质性，如透明细胞肾细胞癌(ccRCC)38。为了研究HCC代谢物和基因表达特征之间的关系，对29对HCC和邻近正常组织(群组1)进行了非靶向代谢组学分析，并对来自同一群组的27对组织进行了RNA-seq分析(补充表1).代谢组学和转录组学图谱的无监督主成分分析揭示了肿瘤与正常样品的几乎完全分离(补充图。1a、b).总共169种代谢物(78种增加，91种减少，补充数据1)和2798个基因(1605个上调和1193个下调)分别通过代谢组学和转录组学分析在肿瘤组织中与正常组织相比具有不同的丰度(补充图。1c，d).与之前的代谢组学研究一致39,40，我们观察到三羧酸循环(TCA)中琥珀酸、延胡索酸和苹果酸水平降低，而HCC组织中D-苯基乳酸和L-色氨酸水平相对于正常组织升高。差异代谢物的KEGG途径富集分析揭示了甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、TCA循环、精氨酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的变化(补充图。1e).此外，与正常组织相比，差异丰度分数的增加显示了HCC组织中给定途径的代谢物上调或下调的趋势(补充图。1f)38。还计算了相关代谢基因的差异丰度分数，并随后与代谢物分数进行比较。令我们惊讶的是，我们观察到代谢组学和转录组学数据之间缺乏线性相关性。具体来说，十个代谢途径中有五个显示代谢物丰度增加，但基因表达水平降低(图。1a).这些结果证明了HCC代谢组学和转录组学之间的不一致性。
a基于KEGG途径的代谢物和基因的差异丰度分数相对于彼此作图。得分1表示给定途径中的所有代谢物增加，而得分1表示给定途径中的所有代谢物减少。bHCC组织与正常组织差异代谢产物的GO分析。使用带Bonferroni校正的双侧超几何检验进行统计分析。c人HCC组织和配对正常组织中的丝氨酸水平(n= 20个样本，群组2)。使用成对的双尾学生数据进行统计分析t-测试。d, e代表性图像(d)和定量分析(e)的IHC染色，使用PHGDH抗体(PA5-27578，ThermoFisher)在HCC组织和成对的正常组织(n= 42个样本，群组3)。标尺，50 μm。使用成对的双尾Student’s进行统计分析t-测试。f人HCC组织和配对正常组织中的PHGDH活性(n= 20个样本，群组2)。使用成对的双尾学生数据进行统计分析t-测试。gHuh7和PLC/PRF/5细胞在用或不用NCT-503 (20微米)处理的完全(CM)或丝氨酸和甘氨酸耗尽(-SG)的培养基中生长的生长率。数据表示为平均值±标准差(n= 4个独立实验)。使用带Bonferroni校正的双向ANOVA进行统计分析。hU-[13c]-葡萄糖掺入细胞中的丝氨酸和甘氨酸。i, jU-[13c]-葡萄糖碳转化为丝氨酸(i)和甘氨酸(j)在父母和PHGDHKO细胞。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。k父母和子女的增长率PHGDH在CM或-SG培养基中生长的KO细胞。数据表示为平均值±标准差(n= 5个独立实验)。使用带Bonferroni校正的双向ANOVA进行统计分析。l–nHuh7父母和PHGDH将KO细胞皮下接种到用对照(+SG)或无丝氨酸和甘氨酸饮食(-SG饮食)喂养的裸鼠中。肿瘤图像(l)，重量(m)，以及音量(n)进行了介绍。数据表示为平均值±标准差(n= 6只小鼠)。统计分析m是用双尾学生的t-测试和统计分析n使用带Bonferroni校正的双向方差分析进行。o肿瘤异种移植物中Ki-67的IHC染色的代表性图像。比例尺，50 μm。源数据作为源数据文件提供。
PHGDH催化活性的提高对HCC的生长是必不可少的
差异代谢物的功能富集分析揭示了两个主要途径:尿素循环，甘氨酸和丝氨酸代谢(图。1b).鉴于尿素循环在肝脏解毒中的重要作用41,42，我们对研究HCC发育中甘氨酸和丝氨酸代谢的失调特别感兴趣。在该途径的不同代谢物中，丝氨酸(一种支持肿瘤发生的代谢物)的水平4相对于正常组织，在HCC组织中显著升高(补充图。2a)，这与之前的代谢组学研究一致39,43,44。丝氨酸检测试剂盒在20对HCC组织和邻近正常肝组织中进一步证实了丝氨酸水平的增加(图。1c群组2)。然后我们确定丝氨酸水平的增加是否归因于PHGDH的上调，phg DH是催化丝氨酸从头合成途径的第一个关键步骤的限速酶4,45。然而，RNA-seq分析显示HCC组织中PHGDH的mRNA水平显著降低(补充图。2b).为了支持这一观察，使用两种不同的商品PHGDH抗体对42对HCC样本(第3组)进行的免疫组织化学(IHC)分析表明，与正常组织相比，PHGDH蛋白水平在HCC组织中显著下调(图。1d，e，补充图。2c，d).HCC组织中PHGDH的mRNA和蛋白水平的下降与以前的转录组学和蛋白质组学数据一致41,46。令我们惊讶的是，我们在20个HCC组织中观察到相对于它们的正常对应物，PHGDH的催化活性明显增加(图。1f).总之，这些数据表明，尽管PHGDH的mRNA和蛋白水平下调，但由于PHGDH活性增加，丝氨酸合成在HCC被激活。
假设丝氨酸合成促进肿瘤生长和存活4,8接下来，我们确定了PHGDH活性的增加是否有利于HCC细胞的生长。用PHGDH抑制剂NCT-503处理抑制了两种HCC细胞系Huh7和PLC/PRF/5的生长和增殖(图。第一代，补充图。2e，f).因为丝氨酸可以通过其转运蛋白输入细胞外或通过PHGDH介导的丝氨酸合成途径重新合成6,8，我们将NCT-503与丝氨酸/甘氨酸饥饿(-SG)结合，以耗尽HCC细胞中的丝氨酸。有趣的是，单独剥夺丝氨酸/甘氨酸导致细胞生长和增殖的下降，并进一步使HCC细胞对NCT-503处理敏感(图。第一代，补充图。2e，f).这些结果表明PHGDH活性对HCC的生长是必不可少的。为了证实这些观察，我们敲除了PHGDH表情(PHGDHKO)在Huh7和PLC/PRF/5细胞中使用CRIPSR/Cas9技术(补充图。2g).使用U-[13c)-葡萄糖追踪(图。1h)，我们发现总丝氨酸库的30–40%和总甘氨酸库的40–50%被U-[13c]-对照亲代细胞中追踪24小时的葡萄糖，而13c转化为丝氨酸和甘氨酸的过程完全被取消了PHGDH被击倒(图。1i，j)，这与之前的报告一致26。这PHGDH与亲代细胞相比，理论上没有PHGDH活性的KO细胞表现出减少的生长和增殖。此外，抑制生长和增殖引起的PHGDH当细胞在-SG培养基中生长时，KO被进一步夸大(图。1k，补充图。2h，我).这些发现得到了小鼠异种移植模型的进一步支持，在该模型中，移植物的大小、重量、生长率和Ki-67染色强度显著降低。PHGDH与亲代细胞相比，观察到KO肿瘤。值得注意的是，增长和扩散PHGDH当用α-SG饮食喂养小鼠时，KO肿瘤几乎完全被阻断(图。1l，o，补充图。2j).总的来说，这些结果表明增强的PHGDH活性对HCC的生长至关重要，尽管PHGDH在HCC的mRNA和蛋白水平都下调。
R236的精氨酸甲基化通过增加底物亲和力提高PHGDH活性
为了研究PHGDH活性的调节机制，我们通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析了人HEK293T细胞免疫沉淀的PHGDH。除了在另一项研究中报道的CHCHD327蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT1以最高分被鉴定为潜在的PHGDH相互作用蛋白质(补充图。3a，b).因为代谢酶的活性可以通过翻译后修饰来调节，因此，我们假设PHGDH可能被PRMT1甲基化，从而改变其活性。使用针对me1、me2a和me2s的抗体的免疫印迹分析显示，免疫沉淀的GFP标记的PHGDH确实经历了单甲基化和不对称的双甲基化(补充图。3c).在HEK293T、Huh7和PLC/PRF/5细胞中进一步证实了内源性PHGDH的单甲基化(图。2a).值得注意的是，PRMT抑制剂、AMI-1或腺苷二醛(AdOx)显著降低了PHGDH的精氨酸甲基化，伴随着PHGDH活性的降低(图。2a，补充图。3c，d).这些数据表明精氨酸甲基化增强了PHGDH催化活性。
a内源性PHGDH在用AMI-1或AdOx处理24小时的细胞中免疫沉淀。通过免疫印迹测定PHGDH的单甲基化(me1)水平。测量PHGDH活性并标准化为PHGDH蛋白。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。b通过FLAG珠免疫纯化的FLAG-PHGDH的R236单甲基化的MS鉴定。c使用Consurf着色方案的PHGDH蛋白的序列保守性。栗色和青色分别表示高保守性和低保守性。d用AdOx处理表达GFP-PHGDH WT、R236K或V83A的HEK293T细胞24小时。通过免疫印迹测定免疫沉淀的GFP-PHGDH的单甲基化(me1)水平。eFLAG-PHGDH WT、R236K或V83A在HEK293T细胞中表达。使用针对R236单甲基化的位点特异性抗体(mePHGDH (R236me1))来测量免疫纯化的FLAG-PHGDH的单甲基化，所述抗体在使用前与R236单甲基化(R236me1)肽或未修饰的肽预孵育。f内源性PHGDH在用AMI-1或AdOx处理24小时的细胞中免疫沉淀。使用mePHGDH (R236me1)抗体通过免疫印迹测定PHGDH的R236单甲基化水平。g用AMI-1或AdOx处理稳定表达FLAG-PHGDH WT、R236K或V83A的HEK293T细胞24小时。使用mePHGDH (R236me1)抗体通过免疫印迹测定免疫纯化的FLAG-PHGDH的R236单甲基化水平。测量免疫纯化的FLAG-PHGDH的活性，并将其标准化为FLAG-PHGDH蛋白。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。h, iFLAG-PHGDH WT、R236K或V83A在HEK293T细胞中表达并通过FLAG珠进行免疫纯化。FLAG-PHGDH的Km值为3-PG(h)或NAD+ (i)下定了决心。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。源数据作为源数据文件提供。
然后使用GPS-MSP工具预测PHGDH精氨酸甲基化的位点47，R236显示最高的甲基化得分(补充图。3e).免疫沉淀的PHGDH的MS分析证实了PHGDH在R236的单甲基化(图。2b).此外，R236及其周围的氨基酸(aa)在不同物种中高度保守(图。2c，补充图。3f)，并与PRMT1的共有RGG/RG甲基化基序非常匹配32。为了研究R236是否是PHGDH中的主要甲基化位点，我们将R236突变为赖氨酸(R236K)，这保留了它的正电荷，但对PRMTs介导的甲基化有抗性。与野生型相比，PHGDH R236K突变体的单甲基化水平明显降低。AdOx治疗可以降低PHGDH WT的单甲基化水平，但不能降低R236K突变体的单甲基化水平(图。2d).这些结果表明R236是PHGDH的主要甲基化位点。
为了更好地了解PHGDH的R236甲基化，我们产生了一种针对单甲基化R236的位点特异性抗体(mePHGDH (R236me1))，其特异性通过斑点印迹和肽竞争分析进行了验证(图。2e，补充图。3g).该抗体识别外源性和内源性PHGDH的R236单甲基化，其水平通过AMI-1或AdOx治疗显著降低(图。2f，g).此外，与野生型相比，R236K突变体显示R236单甲基化水平明显降低，伴随着PHGDH活性的显著降低(图。2g).与我们在图2中的观察一致。2aAMI-1或AdOx处理抑制了PHGDH WT的活性，但没有改变R236K突变体的活性(图。2g).总之，这些数据表明R236甲基化增加了PHGDH活性。
我们接下来通过检测PHGDH对其底物3-PG和辅酶NAD的亲和力，询问精氨酸甲基化如何增强PHGDH活性+。有趣的是，PHGDH对3-PG的Km值，而不是NAD+在AMI-1或AdOx治疗后升高了2-3倍(补充图。3h，我).与这一观察结果相一致，R236K突变导致3-PG的Km值增加约5倍，而NAD的Km值增加约5倍。+保持不变(图。2h，我).这些结果表明R236甲基化通过增加其对3-PG底物的亲和力来提高PHGDH活性。
PRMT1在R236甲基化PHGDH并提高其催化活性
哺乳动物中的蛋白质精氨酸甲基化由蛋白质精氨酸甲基转移酶催化，该酶包含9个成员，PRMT1-930。为了确定PHGDH R236甲基化的作者，我们在HEK293T细胞中共表达了FLAG-PHGDH和不同的GFP-PRMTs，并通过共免疫沉淀(co-IP)试验测定了它们的相互作用。发现PRMT1、PRMT5和PRMT8可能与PHGDH相互作用(补充图。4a).我们选择PRMT1进行进一步研究的原因如下:(1) LC-MS/MS分析从免疫沉淀的PHGDH中鉴定出得分最高的PRMT1(补充图。3a，b);(PHGDH的单甲基化和不对称双甲基化与PRMT1的催化特性一致；(R236周围的氨基酸序列与PRMT1的RGG/RG甲基化基序匹配32；(4) PRMT5被认为是FLAG M2琼脂糖的非特异性结合蛋白48；(5) PRMT8主要在人脑中表达49,50。相互co-IP分析显示，在HEK293T、Huh7和PLC/PRF/5细胞中，内源性PRMT1与PHGDH相互作用(图。3a，b).为了确定PRMT1是否直接结合PHGDH，使用重组人GST-PRMT1和His-PHGDH蛋白进行GST下拉测定。值得注意的是，观察到PRMT1和PHGDH之间的直接相互作用(图。3c).
甲，乙HEK293T、Huh7和PLC/PRF/5细胞中PHGDH和PRMT1的相互co-IP分析。IgG用作阴性对照。c重组GST-PRMT1与重组His-PHGDH一起孵育，然后用GST和His抗体进行GST下拉和免疫印迹分析。dFLAG-PHGDH WT或不同点突变体与HA-PRMT1在HEK293T细胞中共表达。用FLAG珠对FLAG-PHGDH进行免疫纯化，然后用HA抗体进行免疫印迹。e内源性PHGDH在用si转染的细胞中免疫沉淀争夺还是siPRMT1。用指定的抗体进行免疫印迹。测量PHGDH活性并标准化为PHGDH蛋白。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t测试。f内源性PHGDH免疫沉淀于PRMT1用HA-PRMT1 WT或SGT/AAA突变体拯救的KD细胞。用指定的抗体进行免疫印迹。测量PHGDH活性并标准化为PHGDH蛋白。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t测试。g重组GST-PRMT1、His-PHGDH和His-PSAT1与或不与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)一起孵育。然后对来自体外甲基化的反应混合物进行考马斯亮蓝染色、用mePHGDH (R236me1)抗体进行免疫印迹分析和PHGDH活性测定。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。h, i免疫沉淀的PHGDH对3-PG的Km值(h)或NAD+ (i)来自用si转染的细胞争夺还是siPRMT1。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。j用si转染表达FLAG-PHGDH WT、R236K或V83A的HEK293T细胞争夺还是siPRMT1，其次是带旗珠的IP。用指定的抗体进行免疫印迹。测量PHGDH的活性并将其标准化为FLAG-PHGDH蛋白。数据表示为平均值±标准差(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。源数据以源数据文件。
接下来，我们通过在HEK293T细胞中共表达不同截短的GFP-PHGDH和HA-PRMT1来绘制结合PRMT1的PHGDH结构域，用于co-IP分析(补充图。4b).发现PHGDH的底物结合结构域1 (SBD1，1-102aa)是PRMT1结合所必需的(补充图。4c).该结合区域进一步缩小至PHGDH的70-102aa(补充图。4d).然后我们突变了氨基酸(L70，T78，T79，V83，D84，A87，G92，V95，N97和P99)，这些氨基酸在进化上是保守的，位于PHGDH蛋白表面的70-102aa区域(补充图。4e，f).其中，V83A突变显著破坏了PHGDH和PRMT1之间的相互作用(图。三维（three dimension的缩写）)，表明V83对于PHGDH与PRMT1的结合至关重要。
鉴于PRMT1与PHGDH相互作用，我们确定PRMT1是否甲基化PHGDH，从而促进其催化活性。siRNA介导的PRMT1缺失显著减弱了HEK293T、Huh7和PLC/PRF/5细胞中PHGDH的甲基化水平，伴随着内源性和外源性PHGDH活性的明显降低(图。3e，补充图。5a–c).在用PRMT1抑制剂GSK3368715治疗时观察到类似的结果(图。5d)30。相反，PRMT1过表达导致PHGDH甲基化和活性显著增加(补充图。5e，f).为了进一步验证这些发现，我们使用了一种短发夹状RNA (shRNA)来靶向PRMT1抑制mRNAPRMT1在Huh7和PLC/PRF/5细胞中表达，然后重新表达PRMT1 WT或无酶活性的PRMT1突变体(SGT/AAA)51。重组表达PRMT1 WT，而不是SGT/AAA突变体，有效地挽救了PHGDH的甲基化水平和催化活性。PRMT1敲除(KD)细胞(图。3f).这些结果表明PRMT1促进PHGDH的R236甲基化。为了研究PRMT1是否直接甲基化PHGDH，使用重组人GST-PRMT1和His-PHGDH蛋白进行了体外甲基化分析。His-PHGDH的R236甲基化在PRMT1 WT存在时可检测到，伴随着PHGDH活性的明显增加，而PRMT1 SGT/AAA突变体的孵育未能诱导PHGDH甲基化和增加PHGDH活性(图。3g).值得注意的是，PRMT1KD导致PHGDH对3-PG的Km值增加3-4倍，但对NAD的Km值没有明显影响+(图。3h，我).总之，这些数据表明PRMT1直接结合并甲基化PHGDH，通过促进其对3-PG的亲和力，导致PHGDH催化活性升高。
鉴于我们发现PHGDH的V83对PRMT1结合至关重要，我们推测V83突变可能降低PHGDH甲基化并抑制PHGDH活性。事实上，V83A突变导致PHGDH甲基化和活性明显降低，达到R236K突变观察到的类似水平(图。2d，e，2g，3j).与PHGDH WT相比，AMI或AdOx治疗，或PRMT1KD导致R236K和V83A突变体的R236甲基化和活性的变化可以忽略不计(图。2d，2g，3j).此外，PHGDH的V83A突变显示3-PG的PHGDH的Km值增加了约5倍，但NAD没有+，类似于我们观察到的R236K突变(图。2h，我).据报道，R236位于催化中心，对PHGDH活性至关重要52。为了排除R236K突变阻断PHGDH活性而不考虑R236甲基化降低的可能性，我们在下面的功能研究中也包括了V83A突变体，一种甲基化缺陷的替代物。
PRMT1介导的PHGDH甲基化促进丝氨酸合成并改善氧化应激
鉴于PHGDH是丝氨酸从头合成的第一个限速酶4,45接下来，我们试图评估PHGDH的R236甲基化是否影响丝氨酸合成。PHGDH WT、R236K或V83A突变体的重新表达约等于生理水平PHGDHKO细胞。正如所料，R236单甲基化没有在PHGDHKO细胞重新导入PHGDH WT，而不是R236K或V83A突变体，恢复了R236甲基化水平(图。4a).U-[13c]-葡萄糖示踪显示，重新引入PHGDH WT显著挽救13c-葡萄糖衍生的丝氨酸和甘氨酸水平PHGDHKO细胞，但不是R236K或V83A突变体(图。4b，c).通过使用丝氨酸和甘氨酸检测试剂盒检测丝氨酸和甘氨酸水平来概括这些观察结果(补充图。6a、b).这些数据表明PHGDH甲基化促进了HCC细胞中丝氨酸的合成。
a–e PHGDH被打昏(PHGDHKO)，随后重新表达PHGDH WT、R236K (RK)或V83A (VA)。用指定的抗体进行免疫印迹(a).U-[13c]-葡萄糖碳转化为丝氨酸(b)和甘氨酸(c)用LC-MS/MS检测GSH(d)和ROS(e)在生长于CM或-SG培养基中的这些细胞中测量水平。数据输入b–e被表示为平均值SD(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。f–j PHGDHKO plusPRMT1用PHGDH WT、R236K (RK)或V83A (VA)拯救KD细胞，结合或不结合PRMT1再表达。用指定的抗体进行免疫印迹(f).U-[13c]-葡萄糖碳转化为丝氨酸(g)和甘氨酸(h)用LC-MS/MS检测GSH(i)和ROS(j)水平是在生长于CM或-SG培养基中的细胞中测量的。数据输入g–j被表示为平均值SD(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t测试。源数据以源数据文件。
丝氨酸合成通过维持细胞内氧化还原稳态、促进大分子合成和为甲基化反应提供一碳单元来支持肿瘤细胞生长45。我们和其他人先前报道，HCC进展与氧化应激密切相关，并伴有较高的抗氧化能力53,54,55。因此，我们假设通过PHGDH甲基化激活丝氨酸合成可能增加抗氧化能力，从而防止HCC细胞氧化应激诱导的生长抑制。为了验证这一假设，我们检测了谷胱甘肽和NADPH的水平，它们是两种主要的细胞还原剂和丝氨酸合成途径的下游产物15。谷胱甘肽水平，谷胱甘肽/GSSG和NADPH/NADP+比率在2000年大幅下降PHGDHKO细胞在完全培养基(CM)中生长，这与先前的研究一致56，并通过重组表达PHGDH WT而不是R236K或V83A突变体得到拯救(图。4d，补充图。6c，d).有趣的是，丝氨酸/甘氨酸剥夺降低了GSH水平、GSH/GSSG比率和NADPH/NADP+比例，并导致进一步减少PHGDHKO细胞。这种降低通过以类似于生长在CM培养基中的细胞的方式重新表达PHGDH WT来恢复，但当R236K或V83A突变体被重新表达时则不是这样(图。4d，补充图。6c，d).GSH和NADPH生成的减少导致活性氧(ROS)水平的显著积累(图。4e).总的来说，这些结果说明PHGDH甲基化通过激活HCC细胞中的丝氨酸合成来防止ROS积累并维持氧化还原平衡。
为了确定PRMT1在PHGDH甲基化介导的丝氨酸合成刺激和抗氧化能力提高中的作用，我们敲除了PRM t1基因。PRMT1使用靶向3’UTR的shRNAPRMT1mRNA输入PHGDHKO细胞，随后PHGDH WT、R236K或V83A突变体的再表达与PRMT1再表达结合或不结合。PHGDH的R236甲基化只在PHGDH WT和PRMT1基因的再表达中观察到。PHGDHKO plusPRMT1KD细胞(图。4f).在没有PRMT1表达的情况下，用PHGDH WT、R236K或V83A突变体拯救不能恢复由以下原因引起的降低的丝氨酸和甘氨酸水平PHGDHKO。重新表达PRMT1和PHGDH WT的组合，而不是其R236K或V83A突变体，明显恢复了小鼠的丝氨酸和甘氨酸水平。PHGDHKO plusPRMT1KD细胞(图。4g，h，补充图。6e，f)，表明PRMT1通过在R236甲基化PHGDH来促进丝氨酸合成。值得注意的是，还原型谷胱甘肽水平、还原型谷胱甘肽/GSSG比率和NADPH/NADP+比率在PHGDHKO plusPRMT1只有当PHGDH WT和PRMT1同时重新导入时，KD细胞才可能升高(图。4i，补充图。6克，高).支持这一观察，救援PHGDH在PRMT1存在但不存在的情况下，通过PHGDH WT再表达观察到KO诱导的ROS积累。无论PRMT1是否存在，重新表达R236K或V83A突变体对增加的ROS水平的影响可以忽略不计(图。4J).总之，这些结果表明，PRMT1介导的PHGDH R236甲基化促进丝氨酸合成并改善HCC的氧化应激。
PRMT1介导的PHGDH甲基化促进HCC生长
我们接下来研究了PHGDH的R236甲基化是否在调节HCC细胞生长中起作用。细胞生长和增殖的减少，由PHGDH图中观察到的KO。1k和补充图。2h通过在生长于CM或-SG培养基中的细胞中重新表达PHGDH WT，I得到了极大的恢复。当重新引入PHGDH的R236K或V83A突变体时，降低的细胞生长仍然受到轻微影响(图。5a–c，补充图。7a–c).为了证实这些观察结果，我们通过皮下接种建立了小鼠异种移植模型PHGDH用PHGDH WT、R236K或V83A突变体拯救的KO Huh7细胞进入用对照(+SG)或-SG饮食喂养的BALB/c裸鼠。通过检查肿瘤的大小、重量和生长率，我们发现与PHGDH WT的拯救相比，R236K或V83A的拯救表达显著抑制了肿瘤的生长。值得注意的是，当用a -SG饮食喂养小鼠时，R236K或V83A再表达几乎完全阻断了肿瘤生长(图。5d–f).此外，正如Ki-67染色所反映的，肿瘤的生长抑制伴随着肿瘤细胞增殖的显著减少(图。5g，h).这些数据表明，在体外和体内，R236处的PHGDH甲基化促进了HCC细胞的生长和增殖。
a–c PHGDHKO Huh7细胞用PHGDH WT、R236K (RK)或V83A (VA)重新表达。增长率(a)、集落形成试验(b)，以及克隆数量的量化(c)这些细胞在CM或-SG培养基中生长。数据输入a被表示为平均值SD(n= 5个独立实验)，并使用带有Bonferroni校正的双向ANOVA进行统计分析。数据输入c被表示为平均值SD(n= 3个独立实验)，并使用双尾学生的进行统计分析t-测试。d–f单元格在a–c皮下接种到用+SG或-SG饮食喂养的裸鼠中。肿瘤图像(d)，重量(e)，以及音量(f)进行了展示。数据表示为平均值±标准差(n= 6只小鼠)。统计分析d是用双尾学生的t-测试和统计分析f使用带Bonferroni校正的双向方差分析进行。g, h代表性图像(g)和定量分析(h)的IHC染色检测肿瘤异种移植物中的Ki-67d–f。比例尺，50 μm。数据输入h被表示为平均值SD(n= 6只小鼠)。统计分析是使用双尾学生的t测试。i PHGDHKO plusPRMT1用PHGDH WT、R236K (RK)或V83A (VA)拯救KD Huh7细胞，结合或不结合PRMT1再表达。这些细胞在CM或-SG培养基中生长的生长率。数据表示为平均值±标准差(n= 5个独立实验)，并使用带有Bonferroni校正的双向ANOVA进行统计分析。j–l单元格在i皮下接种到用+SG或-SG饮食喂养的裸鼠中。肿瘤图像(j)，重量(k)，以及音量(l)进行了介绍。数据表示为平均值±标准差(n= 5只小鼠)。统计分析k是用双尾学生的t-测试和统计分析l使用带Bonferroni校正的双向方差分析进行。m, n代表性图像(m)和定量分析(n)的IHC染色检测肿瘤异种移植物中的Ki-67j–l。比例尺，50 μm。数据输入n被表示为平均值SD(n= 5只小鼠)。统计分析是使用双尾学生的t测试。源数据以源数据文件。
然后，我们通过重新表达PHGDH WT，R236K突变体，V83A突变体或PRMT1来确定PRMT1在PHGDH甲基化诱导的HCC生长中的作用PHGDHKO plusPRMT1KD细胞。有趣的是，Huh7和PLC/PRF/5细胞的生长受阻是由PHGDHKO plusPRMT1只有当PHGDH WT和PRMT1都重新表达时，KD才显著恢复。与生长在CM培养基中的细胞相比，当培养基中的丝氨酸和甘氨酸被剥夺时，这种恢复更显著(图。5i，补充图。7d–h).我们通过植入进一步验证了这些结果PHGDHKO plusPRMT1用PHGDH WT、R236K突变体、V83A突变体或PRMT1拯救的KD Huh7细胞进入用对照或-SG饮食喂养的裸鼠。与体外获得的数据一致，肿瘤的大小、重量和生长率，以及肿瘤中Ki-67阳性细胞的比例，通过拯救PHGDH WT加PRMT1的表达而显著提高，但不通过单独用PHGDH WT拯救，或用PHGDH突变体加PRMT1拯救(图。5j–n).此外，通过PRMT1抑制剂GSK3368715的处理，HCC细胞的生长显著降低。7i–k)和体内(补充图。7l–n)响应丝氨酸/甘氨酸饥饿。总之，这些结果表明PRMT1介导的PHGDH的R236甲基化促进了HCC细胞的生长和增殖s体外和体内。
在人类HCC组织中，PHGDH在R236被PRMT1高度甲基化
为了评估PRMT1介导的PHGDH甲基化的临床相关性，对42对HCC样本(队列3)进行了IHC分析，该队列用于检测PHGDH蛋白水平(图。1d，e，补充图。2c，d).IHC结果显示，相对于邻近的正常肝组织，PHGDH R236单甲基化和PRMT1的水平在HCC组织中均显著增强(图。6a–d).为了证实这些观察结果，我们在20对HCC组织和邻近正常肝组织(群组2)中进行了co-IP或免疫印迹分析，该群组用于测量丝氨酸水平和PHGDH活性(图。1c，f).与图1中IHC染色的观察结果一致。1d，e和补充图。2c，d，与正常组织(N)相比，PHGDH蛋白在HCC组织(T)中的表达水平较低(图。6e，f，补充图。8a).有趣的是，与正常组织相比，HCC组织中甲基化PHGDH水平明显增加(图。6e，f和补充图。8b).在另一组16对HCC组织和邻近正常肝组织中也观察到PHGDH蛋白水平降低和PHGDH甲基化水平升高(第4组，补充图。8c–f).平行地，发现PRMT1蛋白水平在HCC组织中上调(群组2，图。6e，f和补充图。8g).此外，染色强度的定量显示，HCC组织中的PRMT1蛋白水平与甲基化PHGDH的量和PHGDH催化活性正相关(图。6g–I，补充图。8h).PHGDH的R236甲基化水平也与PHGDH活性呈正相关(图。6j).此外，我们比较了HCC患者的总生存期，发现较高水平的PHGDH甲基化和PRMT1蛋白与较差的HCC患者预后相关(图。6k，l).总之，这些结果证明了HCC发育需要高水平的PRMT1介导的PHGDH甲基化。
a, b代表性图像(a)和定量分析(b)的IHC染色，在HCC组织和成对的正常组织(n= 42个样本，群组3)。标尺，50 μm。使用成对的双尾Student’s进行统计分析t测试。c, d代表性图像(c)和定量分析(d)对HCC组织和配对正常组织中的PRMT1进行IHC染色(n= 42个样本，群组3)。标尺，50 μm。使用成对的双尾学生t检验进行统计分析。英、法在20个HCC组织(T)和配对的正常组织(N)中用指示抗体进行IP和免疫印迹分析。WCL，全细胞溶解产物。测定免疫沉淀的PHGDH的R236单甲基化，并标准化为PHGDH蛋白(n= 20，群组2)。g用mePHGDH (R236me1)和PRMT1抗体在HCC组织中进行IHC染色的代表性图像(n= 42个样本，群组3)。比例尺，50 μmhPearson相关检验分析HCC组织中mePHGDH (R236me1)和PRMT1的IHC染色强度之间的关系(n= 42个样本，群组3)。iPearson相关检验分析HCC组织中PHGDH活性和PRMT1染色强度之间的关系(n= 20个样本，群组2)。jPearson相关检验分析HCC组织中PHGDH活性与mePHGDH (R236me1)染色强度之间的关系(n= 20个样本，群组2)。k, l基于mePHGDH (R236me1)(k)或PRMT1(l) (n= 30个样本)。使用双侧对数秩检验进行统计分析。源数据以源数据文件。
用合成肽阻断PHGDH甲基化抑制HCC生长
鉴于PRMT1介导的PHGDH R236甲基化是HCC发展所必需的，我们研究了PHGDH甲基化是否可以作为治疗靶点。我们合成了一个竞争性的非甲基化PHGDH肽，包含R236甲基化位点(230-241aa)，在其N-末端区域标记了一个转录反式激活子(TAT)肽。R236处相应的单甲基化肽和未处理组用作阴性对照(图。7a).相互co-IP分析显示甲基化和非甲基化肽对PHGDH和PRMT1之间的相互作用没有明显影响(补充图。9a–c).此外，内源性PRMT1可以与生物素偶联的非甲基化肽免疫沉淀，但不能与生物素偶联的TAT或甲基化肽免疫沉淀(补充图。9d).有趣的是，用PRMT1抑制剂GSK3368715预处理阻断了非甲基化肽与PRMT1的结合(补充图。9e).然后我们检测了合成肽对PHGDH甲基化和活性的影响。非甲基化肽，而非甲基化肽，显著抑制了PHGDH的R236甲基化和酶活性(图。7b，c)，伴随着丝氨酸和甘氨酸水平的明显降低(图。7d，e)，尽管丝氨酸生物合成途径中的另外两种酶磷酸丝氨酸氨基转移酶1 (PSAT1)和磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)的水平补偿性增加(补充图。9f).这些数据表明，非甲基化肽通过结合PRMT1的活性位点抑制PHGDH R236甲基化和催化活性，但对PHGDH与PRMT1的相互作用没有明显影响。此外，与甲基化肽处理相比，用非甲基化肽处理的细胞显示出受抑制的GSH水平、GSH/GSSG比率和NADPH/NADP+比率以及增强的ROS水平。当将非甲基化肽治疗与丝氨酸/甘氨酸耗竭相结合时，这些变化进一步加剧(补充图。9g–j).与这些观察结果相一致的是，单独的非甲基化肽处理或丝氨酸/甘氨酸剥夺抑制了HCC细胞的生长和增殖，而联合处理显示了HCC细胞生长和增殖的进一步减少(图。7f，补充图。9k，我).
aTAT甲基化和TAT非甲基化肽的aa序列。b, c内源性PHGDH在用甲基化或非甲基化肽(20微米)处理24小时的Huh7和PLC/PRF/5细胞中免疫沉淀b).测量PHGDH活性并标准化为PHGDH蛋白(c).数据输入c被表示为平均值SD(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t测试。d, e总丝氨酸(d)和甘氨酸(e)在用甲基化或非甲基化肽(20微米)处理24小时的-SG培养基中生长的细胞中的水平。数据表示为平均SD(n= 3个独立实验)。统计分析是使用双尾学生的t-测试。f在用甲基化或非甲基化肽(20微米)处理的CM或-SG培养基中生长的Huh7和PLC/PRF/5细胞的生长率。数据表示为平均值±标准差(n= 5个独立实验)。使用带Bonferroni校正的双向ANOVA进行统计分析。g–i图像(g)，重量(h)，以及音量(i)的HCC PDX肿瘤，其来自用α-SG饮食喂养并用甲基化或非甲基化肽处理的小鼠。数据表示为平均值±标准差(n= 6只小鼠)。统计分析h是用双尾学生的t测试和统计分析i使用带Bonferroni校正的双向方差分析进行。jPDX肿瘤中Ki-67 IHC染色的代表性图像g–i。比例尺，50 μmk–m图像(k)，重量(l)，以及音量(m)的Huh7和PLC/PRF/5肿瘤异种移植物，其来自用α-SG饮食喂养并用甲基化或非甲基化肽处理的小鼠。数据表示为平均值±标准差(n= 5只小鼠)。统计分析l是用双尾学生的t-测试和统计分析m使用带Bonferroni校正的双向方差分析进行。nHuh7和PLC/PRF/5肿瘤异种移植物中Ki-67的IHC染色的代表性图像k-m。比例尺，50 μm。源数据以源数据文件。
为了研究非甲基化肽在体内的抗肿瘤效果，建立了HCC患者来源的异种移植物(PDX)模型。喂食a -SG饮食的小鼠的PDX肿瘤的生长几乎完全被非甲基化肽的治疗所阻止，但甲基化肽没有(图。7g–j，补充图。9m).在Huh7和PLC/PRF/5细胞的皮下小鼠异种移植模型中进一步证实了非甲基化肽的抗肿瘤作用(补充图。7k–n, 9n).重要的是，通过测量小鼠体重和评估主要器官的病理学特征，我们发现用非甲基化肽治疗对小鼠没有明显的毒性作用(补充图。10a，b)，尽管观察到轻微的体重减轻(< 11%)，可能是由于先前报道的饮食丝氨酸/甘氨酸限制10。因此，这些发现表明靶向PHGDH甲基化并结合饮食中的丝氨酸/甘氨酸限制可能是治疗HCC的潜在治疗策略。
讨论
这项研究揭示了HCC代谢物丰度和基因表达之间的不一致性。具体来说，HCC的丝氨酸水平增加，但丝氨酸合成的限速酶PHGDH的表达下调。HCC中丝氨酸水平的提高是由于PHGDH催化活性的增强，这是由于PRMT1介导的R236处PHGDH的精氨酸甲基化。PRMT1介导的PHGDH甲基化和激活促进丝氨酸合成，维持氧化还原稳态，支持HCC生长。使用TAT标记的非甲基化肽结合膳食丝氨酸/甘氨酸限制阻断PHGDH甲基化协同抑制HCC生长。总的来说，我们的发现提供了通过PRMT1介导的精氨酸甲基化调节PHGDH活性和丝氨酸合成的机制，并表明抑制PHGDH甲基化在HCC有潜在的治疗应用。
代谢失调是癌症的标志。在过去的十年中，代谢组学、转录组学或代谢组学和转录组学图谱的整合分析在HCC被广泛用于鉴定潜在的代谢生物标志物39,41,57,58,59。然而，这些研究主要集中在基因表达和代谢模式之间具有一致差异丰度的代谢基因或代谢物。在这里，通过结合基因表达和代谢谱分析，我们发现了HCC代谢组学和转录组学数据之间的异质性。在其他类型的癌症中也观察到了类似的不一致，如ccRCC38。HCC代谢组学谱和基因表达模式之间的异质性不仅在代谢途径的水平上，而且在个体代谢物和代谢基因的水平上。具体来说，我们发现与正常组织相比，HCC组织中的丝氨酸水平显著升高，但是丝氨酸合成的限速酶PHGDH在mRNA和蛋白水平上显著下调。因此，代谢基因的表达并不总是替代代谢物的丰度。代谢组学和转录组学之间的不一致可能源于复杂的代谢转移、代谢酶的转录后或翻译后调节以及酶同种型的存在。此外，为了将来更好地理解这种异质性，需要更广泛的代谢组覆盖范围和更大的HCC队列。
先前的研究报道，由于基因扩增、转录或翻译后修饰，PHGDH在许多不同的癌症类型中频繁过表达，包括乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤16,17,18,23,24,25,26,27,28。然而，我们发现HCC组织中PHGDH mRNA和蛋白水平明显降低。最近的转录组学和蛋白质组学研究也显示HCC组织中PHGDH的mRNA和蛋白水平分别降低41,46。尽管mRNA和蛋白水平下调，但值得注意的是PHGDH的催化活性在HCC组织中大大增加。事实上，一项非常早期的研究报道，在大鼠肝癌模型的肿瘤中，PHGDH活性增强60。增加的PHGDH活性能够刺激丝氨酸合成和由此产生的丝氨酸积累以支持HCC的生长，这与先前的报道一致，该报道显示PHGDH介导的丝氨酸合成对于HCC发育和索拉非尼抗性是必需的23,56,61。值得注意的是，我们不能排除丝氨酸转运蛋白对HCC丝氨酸水平升高的作用。有趣的是，最近的一项研究表明，尽管高PHGDH活性支持癌细胞增殖，但低PHGDH表达的细胞在乳腺癌中表现出更高的转移潜力62。因此，低PHGDH表达可能导致HCC转移，而高PHGDH活性促进细胞存活和生长。此外，除丝氨酸外，还产生α-酮戊二酸(α-KG)作为中间体，可以补充TCA循环，调节组蛋白去甲基化，支持癌细胞生长4,16,17。因此，α-KG在HCC的作用和功能值得进一步研究。
我们证明PHGDH的R236甲基化促进其活性并刺激丝氨酸合成。据报道，R236位于PHGDH的催化中心，并负责PHGDH活性，可能是由于其锚定3-PG羧基的正电荷性质52。为此，精氨酸突变为带负电荷的谷氨酸(R236E ),确实破坏了PHGDH的酶功能，通常被用作无酶活性的PHGDH突变体52,63,64。有趣的是，我们发现保留正电荷的R236K突变也极大地抑制了PHGDH对3-PG的亲和力，从而消除了PHGDH的活性。因此，R236的正电荷性质似乎不是决定PHGDH活性的关键因素，从而为R236甲基化在PHGDH激活中的作用提供了理论基础。在我们的功能研究中平行使用V83A突变体进一步支持了这一点，V83A突变体破坏了PHGDH与PRMT1的相互作用，并表现出与R236K突变体相当的降低的PHGDH甲基化水平和催化活性。
蛋白质精氨酸甲基化至少部分通过调节代谢重编程与癌症发展越来越相关。例如，PRMT5介导甾醇调节元件结合蛋白的R321甲基化，并阻止其泛素-蛋白体降解，从而增加新的脂肪生成并加速HCC生长37。此外，丙酮酸激酶M2异构体在R445、R447和R455被PRMT4甲基化，通过这种甲基化，有氧糖酵解被转换为氧化磷酸化，从而使乳腺癌细胞能够增殖和转移33。PRMT4还显示通过甲基化苹果酸脱氢酶1 (MDH1)抑制胰腺导管腺癌中的谷氨酰胺代谢，或通过甲基化甘油醛-3-磷酸脱氢酶抑制HCC糖酵解，两者都导致癌细胞的生长和增殖减少34,35。然而，PRMTs是否参与调节癌症中的丝氨酸代谢尚不清楚。此外，PRMT1在癌细胞代谢重编程中的作用仍然知之甚少。我们证明PRMT1通过甲基化并随后激活PHGDH来促进HCC的丝氨酸合成。这一发现揭示了丝氨酸代谢和蛋白质精氨酸甲基化之间的机械联系。据报道，PRMT1在HCC被上调以促进细胞生长和转移65,66但是其潜在的机制，尤其是其在HCC的直接蛋白靶点，还不清楚。我们发现PRMT1直接相互作用，甲基化并激活PHGDH，从而促进丝氨酸生物合成，维持氧化还原稳态，并支持HCC生长。
最近，限制饮食中的丝氨酸和甘氨酸引起了人们对抑制培养的癌细胞和荷瘤小鼠中肿瘤生长的极大关注9,12,67,68，强调了丝氨酸代谢在癌症进展中的关键作用。我们发现，通过PHGDH抑制剂或阻断PHGDH甲基化来抑制PHGDH活性，使HCC细胞更容易受到丝氨酸和甘氨酸剥夺的影响，这表明细胞外输入的丝氨酸和重新合成的丝氨酸对HCC的生长至关重要。事实上，据报道，PSAT1的缺失与饮食中丝氨酸/甘氨酸限制的结合协同抑制了c-MYC驱动的肝癌中的肿瘤发生11。与其他使用PHGDH抑制剂或在PHGDH过度表达的癌症中减少PHGDH的研究不同，我们惊奇地发现PHGDH抑制也对PHGDH下调的HCC有效，尽管在HCC phg DH下调的机制尚不清楚，需要进一步研究。这一发现支持了PHGDH活性是决定PHGDH抑制的抗癌效果的关键因素的观点。因此，我们的研究可能拓宽了PHGDH靶向策略在癌症治疗中的应用，不仅在PHGDH过度表达的癌症中，而且在PHGDH过度激活的癌症类型或亚型中，尽管PHGDH没有过度表达。
鉴于PRMT1介导的PHGDH甲基化在HCC生长中的关键作用，我们开发了一种治疗性肽来阻断PHGDH甲基化。通过靶向PHGDH甲基化，这种肽在丝氨酸和甘氨酸限制的协同作用下，有效抑制丝氨酸合成和抑制HCC生长，且无明显副作用。总之，我们的研究揭示了一种调节PHGDH活性和丝氨酸代谢的机制，并提示PRMT1介导的PHGDH甲基化是HCC的一个潜在治疗靶点。
