头颈部肿瘤逐步进展的单细胞转录组分析

成纤维细胞是去卷积分析中第二常见的细胞类型(见补充图。4a).我们可以在每种细胞类型的上皮/恶性细胞(n= 17,例如, KRT6A)和成纤维细胞(n= 41,例如, 波斯特恩)(补充图。8)，这可以通过伪时间轨迹分析更清楚地证明28(图。4a).有趣的是，我们观察到LP的假时间更接近CA或LN，而不是NL，这可能表明恶变前LP成纤维细胞已经获得了CAF样特征(图。4b).为了进一步描述成纤维细胞的转录改变对癌症进展的影响，我们分析了成纤维细胞和恶性细胞之间的配体-受体(LR)相互作用(详情见补充方法).我们的目的是确定恶性细胞和成纤维细胞之间相互依赖的LR对，它们在恶性细胞中显示受体表达，但其相应的配体仅在成纤维细胞中表达，而在恶性细胞中不表达。我们可以鉴定出7个LR对，显示成纤维细胞中配体的相互依赖和逐步表达(即., COL1A1，COL1A2，COL6A3，THBS1，THBS2，TNC，以及LAMA4)和它们在恶性细胞中相应的假定受体(即, CD44，ITGB1，SDC4，CD47，以及ITGA6，图。4c).值得注意的是COL1A1-CD44配体-受体对表现出最突出和相互依赖的表达(图。4d, 顶端)，并且可以通过Puram的scRNA-seq数据进行验证(图。4d, 底部).此外，COL1A1表达与成纤维细胞的假时间最显著相关(r= 0.57,P < 2.2 × 10−16，补充图。9a).我们可以成功地证明COL1A1在成纤维细胞和CD44在上皮细胞(r= 0.43,P= 7.47 × 10−3，图。4e和补充图。9b).然而，CD44成纤维细胞中的表达与COL1A1表情(补充图。9c).这些结果表明CD44-COL1A1成纤维细胞和恶性细胞之间发生相互作用，但不是以自分泌的方式。免疫组织化学分析也证明了表达CD44的恶性细胞附近的成纤维细胞中显著的COL1A1表达(图。4f和补充图。9d).

此外，我们还评估了COL1A1-CD44通过进行siRNA介导的敲除实验进行相互作用COL1A1(siCOL1A1)和CD44(siCD44).两种HNSCC细胞系表达CD44(MSKQLL1和SCCQLL1，补充图。10a)和咖啡馆表达COL1A1(CAF48)被选择(补充图。10b).我们观察到用胶原蛋白(I型)处理诱导了肿瘤细胞的侵袭，而用si转染则消除了这种侵袭CD44(图。第四代移动通信技术).此外，MSKQLL1和CAF48的共培养增强了肿瘤细胞的迁移，但没有si的共培养CD44-用CAF48转染的MSKQLL1细胞或用si转染的MSKQLL1细胞COL1A1转染的CAF48细胞(图4h).综上所述，我们建议COL1A1在成纤维细胞和CD44上皮/恶性细胞相互作用，促进肿瘤发展。

CXCL8-表达caf会加重HNSCC进展

来自肿瘤组织(CA和LN)的caf进一步分为五个簇(CF0至CF4)，揭示了它们的代表性标记基因(图。5a和补充图。11a).当CAF群与Puram研究中以前的CAF群进行比较时21CF0和CF4与表达其标记基因(例如., CTHRC1, COL1A1, COL3A1, 波斯特恩，以及MFAP2，图。5b).然而，CF4不同于CF0，表现出更高的增殖活性(补充图。11b).CF2和CF3类似于Puram的CAF2和肌成纤维细胞，表达它们的标记基因，例如CXCL12和NDUFA4L2。有趣的是，我们发现了一种CAF亚型，CF1，表达CXCL8(IL-8编码基因)。在二维扩散图嵌入分析中，CF1显示出不同于其他CAF簇的独特表达模式29(图。5c, 左边的).伪时间投影分析也揭示了CF1是最后的轨迹，这意味着CF1是进展最快的成纤维细胞(图。5c, 正确).此外，我们证明了CF1的丰度与肿瘤的生长显著相关CXCL8TCGA-HNSCC独立数据集中的表达水平(r= 0.38,P= 2.72 × 10−18)，GSE41613(r= 0.74,P= 3.41 × 10−18)，GSE42743(r= 0.62,P= 3.54 × 10−9)，以及GSE65858(r= 0.68,P= 9.58 × 10−38，图。5d).当我们根据人乳头瘤病毒感染状态比较CAF亚型的比例时，在人乳头瘤病毒阴性肿瘤中观察到大多数CF1细胞，但在人乳头瘤病毒阳性肿瘤中没有观察到(P= 1.33 × 10−7，补充图。11c，左侧).TCGA数据还显示，CF1细胞在人乳头瘤病毒阴性肿瘤(10.15%)中比人乳头瘤病毒阳性肿瘤(5.04%)中更丰富(P= 5.26 × 10−7，补充图。11c，右).

接下来，我们评估了CF1和CC1的丰度是否相互关联，因为CF1和CC1的丰度都具有攻击性特征。正如预期的那样，CC1和CF1丰度在合并的HNSCC数据中显著相关(r= 0.41,P= 1.11 × 10−38，图。5e)，暗示CF1和CC1可能共同作用。事实上，半乳糖凝集素-7(在CC1中表达)促进各种癌症类型的转移，包括HNSCC30。IL-8(在CF1中表达)由促进肿瘤进展的多种细胞类型产生31, 32。为了评估这一假设，我们证明了半乳糖凝集素-7治疗显著诱导CXCL8在各种CAF细胞(CAF30、CAF57、CAF58和CAF70)以及HNSCC细胞(SCCQLL1和SNU1066)中的表达(图。5f).相比之下，IL-8治疗没有诱导半乳糖凝集素-7在HNSCC的牢房里。(补充图12).这些结果表明，半乳糖凝集素-7激活恶性细胞(CC1)和成纤维细胞(CF1)表达IL-8，促进HNSCC的侵袭性进展。

Treg细胞中LAIR2的表达与HNSCC进展相关

在免疫细胞中，NK/T细胞是scRNA-seq数据中最常见的细胞类型。具有染色体畸变的细胞被重新指定为非确定细胞类型，并在以下分析中排除(见“方法”)。然后，将NK/T细胞群进一步分为六个亚群；幼稚T细胞、CD8+CCL5+、CD4+FOXP3+(调节性T细胞，Treg)、CD4+CD154+(滤泡辅助性T细胞)、循环T细胞和NK细胞(图。6a，顶端).显示较高增殖活性的T细胞群被称为循环T细胞，其显示CD8编码基因的较高表达(即, CD8A和CD8B)比CD4抗艾滋病药（Cluster of Differentiation 4）如前所述33(图。6a, 底部和补充图。13a).在HNSCC进展过程中，循环T细胞和CD4+ T细胞的比例增加，而无论其人乳头瘤病毒感染状态如何，幼稚T细胞和CD8+ T细胞的比例都下降(图。6b).伪时间轨迹分析证明了T细胞根据组织类型的逐步转变(图。6c).值得注意的是，LP中的Tregs表现出两个伪时间分布的峰值，表明了癌前病变中T细胞状态的改变。特别是，我们观察到白细胞相关免疫球蛋白样受体2(LAIR2, CD306)在LP中的Tregs(置换学生的t-testP= 2.50 × 10−9，折差= 2.32，图。6d和补充图。13b).虽然的功能LAIR2很大程度上是未知的，LAIR2已知为激活促炎过程的可溶性胶原受体34。因此，COL1A1成纤维细胞中的表达可以激活LAIR2Tregs介导的下游信号传导。为了证明这一点，我们观察到COL1A1成纤维细胞中的表达水平较弱，但显著相关LAIR2表达水平(r= 0.48,P= 2.48 × 10−3)和丰富的Tregs(r= 0.38,P= 2.60 × 10−2，图。6e).此外，我们证明胶原蛋白治疗显著诱导FOXP3小鼠Tregs中的表达(图。6f和方法).此外，通过进行荧光激活细胞分选(FACS)分析，我们证实胶原蛋白治疗增加了从HNSCC患者PBMCs中获得的FOXP3+CD25+ Tregs和LAIR2+FOXP3+CD25+ Tregs的数量(图。6克，高和补充图。13c和“方法”)。综上所述，我们认为来自成纤维细胞的胶原蛋白与Tregs相互作用，诱导LAIR2和FOXP3表达，并为肿瘤进展提供有利的微环境。

讨论

作为TCGA的下一步，使用大规模、多组癌症谱阐明分子异质性，详细描述连续变化的癌前图谱将有利于描述癌症进展期间的驱动事件。在这项研究中，我们旨在描述HNSCC从淋巴结到癌前LP、CA和转移性淋巴结组织的逐步进展，并展示HNSCC逐步进展过程中单细胞水平的转录动力学。关于恶性细胞、成纤维细胞和免疫细胞之间相互作用的关键发现总结于图。7.

除了Tregs之外，CD154-表达CD4+ T细胞在肿瘤发展过程中增加(见图。6b). CD154是一个CD40促进细胞间相互作用的配体CD40-表达细胞，包括B细胞、巨噬细胞和滤泡辅助性T细胞40. CD154诱导细胞增殖和侵袭以及不良预后，这意味着CD154+T细胞提供了促进肿瘤的免疫环境41。相比之下，循环T细胞建立了一个功能失调的程序和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)激活33。我们一致地证明了循环T细胞标记物的表达水平与功能障碍T细胞标记物的表达水平显著相关(r= 0.47,P= 1.5 × 10−28)和TIL分数(r= 0.3,P= 3.66 × 10−12，补充图。16).虽然我们没有进一步评估CD154+CD4 T细胞和循环T细胞的功能，但我们的结果表明，T细胞库的改变在HNSCC的逐步进展中起着关键作用。