蛋白磷酸酶2A (PP2A)是主要的细胞丝氨酸/苏氨酸磷酸酶之一,估计控制高达60%的所有丝氨酸/苏氨酸磷酸化。基于其对促存活和增殖因子的负调节,它不仅是一种肿瘤抑制剂 1 而且还与多种其他疾病以及细胞生理学有关 2 。PP2A的复杂功能是通过其复杂的结构组织实现的,其中支架(亚单位;PP2A-A或PR65)和催化性C亚基(PP2Ac)一起形成核心酶,组成只有一个调节性B亚基成员的异源三聚体全酶。B亚单位被分成四个结构上不相关的家族,产生超过60种潜在的PP2A全酶,每种全酶可能具有不同的底物选择性和细胞功能 1 。因此,对调节PP2A蛋白复合物装配的机制的表征对于全面理解PP2A生物学是至关重要的,从而对于理解一般的磷酸蛋白质组调节也是如此 1 ,3 .
在PP2A复合物中,具有B56亚单位的PP2A三聚体主要是人类肿瘤抑制因子 4 ,5 ,6 ,7 。通过功能丧失研究表明,PP2A-B56α抑制驱动人类细胞的恶性转化,以及促进恶性生长 6 ,8 。最近的研究也将PP2A-B56α与正常的心脏功能和免疫调节联系起来 2 ,9 。因此,详细了解PP2A-B56α异源三聚体装配和底物识别是如何被调节的,可能对一些疾病有深远的医学意义。B56α与多达100种细胞靶蛋白相互作用(补充数据 1 和 10 ,11 )其中,最著名的是其抑制MYC致癌活性的能力 12 ,13 。B56蛋白通过保守的结合口袋识别它们的靶蛋白,该结合口袋与靶蛋白中具有LxxIxE共有序列的短线性基序(SLIMs)结合 10 ,14 ,15 ,16 。然而,抑制PP2A-B56α的机制知之甚少。更确切地说,B56α上的LxxIxE结合口袋是否受内源性调节机制的影响尚不清楚。
在癌症中,不同的PP2A复合物通过与蛋白质如CIP2A、PME-1、SET或ENSA/ARPP19的蛋白质相互作用来调节 17 。其中,CIP2A在不同的人类癌症类型中广泛过表达,并在异种移植和转基因小鼠模型中驱动肿瘤生长 18 ,19 ,20 ,21 ,22 ,23 ,24 。在致癌的CIP2A调节的PP2A靶点中,最著名的是MYC 5 ,21 ,25 。然而,最近确定CIP2A是BRCA突变的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞必需的中枢DNA损伤反应(DDR)蛋白 24 ,26 ,表明CIP2A在癌症中具有超出MYC调节的更广泛的作用。因此,发现CIP2A调节大约100种广泛涉及不同病理和生理过程的靶蛋白的S/T磷酸化 27 。CIP2A还广泛调节癌细胞治疗反应,其过度表达在临床上与激酶抑制剂治疗的复发相关 27 ,28 ,29 ,30 。总的来说,这些数据表明CIP2A是一种非常有吸引力的癌症治疗靶蛋白。然而,我们对CIP2A致癌性的结构决定因素的机械理解仍然非常初级。迄今为止,CIP2A唯一可用的结构跨越了该蛋白的前560个氨基酸,并揭示了CIP2A是一种与B56蛋白相互作用的专性同源二聚体 31 .
在这里,我们采用了多学科的方法来揭示CIP2A如何抑制PP2A- B56α的分子细节,揭示了一种独特的劫持和沉默机制,包括PP2A- B56α三聚体的分解和B56α对LxxIxE基序识别的直接抑制。CIP2A的N-末端B56α相互作用结构域的单点突变消除了TNBC细胞的肿瘤生长,从而证明了结果的癌症相关性。因此,除了它们对理解磷调节的一般相关性之外,该结果可以指导针对癌症和其他CIP2A相关疾病中CIP2A-B56α相互作用的治疗的发展 2 ,32 .
结果 化学交联偶联质谱显示CIP2A N-末端头结构域介导B56α结合 CIP2A抑制PP2A-B56α的机制尚不清楚(CIP2A-B56α复合物的结晶尚未成功 31 和徐未发表的数据)。因此,我们使用化学交联结合质谱(XL-MS)来确定CIP2A如何结合B56α。作为CIP2A蛋白,我们使用1-560片段,其晶体结构是可获得的,并且它是可以从细菌培养物中以可溶形式纯化的最长片段 31 。DSS(辛二酸二辛酯)和DMTMM (4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物)用于交联CIP2A-B56α复合物;DSS与伯胺反应,而DMTMM交联伯氨基和带负电荷的侧链(补充图。 S1A –S1C ).数据显示与B56α交联的CIP2A(1-560)残基主要位于N-末端头结构域(K18、K21、E23、E34、K40 ),在C-末端(K490)有一个额外的残基(图。 1A 和补充图。 2 ).在B56α中,两个区域介导CIP2A结合,一个N-末端区域(区域1,残基80-227)和一个C-末端区域(区域2,残基347-465)(图。 1B ).而区域1是基于先前的酵母双杂交(Y2H)实验预期的 31 之前没有提出区域2介导CIP2A相互作用。所观察到的交联的选择性得到了以下观察结果的支持:尽管有许多潜在的反应性残基分布在CIP2A和B56α结构中,但仅观察到非常小的子集形成了分子间交联(比较图。 1A湾 至补充图。 3 ).此外,在DSS交联剂浓度增加(高达500M;图5 2A湾 ),表明分子内和分子间相互作用的特异性。最后,CIP2A单独与CIP2A:B56复合物之间的交联结果的比较表明,当CIP2A与B56α复合时,CIP2A特异性分子内环的频率降低(补充图。 2A湾 ),表明与B56α的相互作用将CIP2A锁定在稳定的结构构象中。然而,重要的是将XL-MS分析视为筛选实验,其结果需要进一步的实验验证,并且XL-MS数据可能包含一些功能上不相关的交联。
A 红色表示使用DSS和DMTMM交联剂在B56α的分子间交联中鉴定的CIP2A(1-560)残基。CIP2A 1-560同型二聚体(PDB: 5UFL)单体显示为带状或空间填充模型。在空间填充模型中,1-330个氨基酸为青色,包括本研究中鉴定的紫色CIP2A头部结构域。包括二聚化结构域的331-560区域显示为蓝绿色。由于CIP2A的N-末端区域的高分子柔性,残基K21和E23的位置(用*表示)必须使用A24位置来近似,而K40使用R43的位置来近似。 B 使用DSS和DMTMM化学方法研究与CIP2A交联的B56α (PDB: 6NTS)残基的分布。交联氨基酸呈红色,大致分布在B56α上的两个不同区域,以两种不同的B56α方向显示。插页显示了由PP2A-A、PP2Ac和B56α组成的PP2A-B56α三聚体的整体结构组织。 C 两个不同CIP2A片段(1-330和1-560)的B56α交联的重叠。 D 使用CIP2A片段1-330和1-560在B56α上重叠CIP2A交联。 D , E 所示的交联位点来自DSS和DMTMM实验。 E 放大CIP2A的头部区域,显示一个CIP2A单体。在DSS和DMTMM与B56α的交叉连接中发现的CIP2A位点为红色,头结构域(1-43 aa)为紫色。残留物注释与图(A)中的相同。
将CIP2A的N-末端鉴定为主要的B56α相互作用基序与先前的数据一致,证明CIP2A(1-330)片段足以与B56α直接相互作用 31 。另一方面,先前观察到的C-末端区域331-560对CIP2A-B56α相互作用的稳定作用 31 可以用K490交联来解释(图。 1A ).为了进一步验证CIP2A(1-560)的N-和C-末端部分对B56α结合的贡献,我们还将CIP2A(1-330)片段与B56α交联(图。1C,D ).当比较CIP2A(1-330)和CIP2A(1-560)之间的交联CIP2A氨基酸时,CIP2A(1-330)概括了在CIP2A(1-560)中看到的所有N-末端交联(图。 1C ).另一方面,CIP2A与B56α交联的数量,CIP2A(1-560)明显高于CIP2A(1-330)(图。 1D )支持331-560区域在介导相互作用稳定性中的作用。CIP2A的N-末端头结构域上的交联氨基酸包含从头结构域的其余部分突出的脊状结构(图。 1E ).此外,允许细菌表达的最短N-末端CIP2A片段(aa。1-85)与B56α直接相互作用(补充图。 4A ).这些数据表明CIP2A的头部结构域包含自主的B56α相互作用基序。值得注意的是,CIP2A的头部结构域在从人类到鱼类的动物界中是高度进化保守的 花鳃金龟科 (补充图 4B ).
基于这些结果,我们推断CIP2A(1-560)的N-末端头结构域(图。 1E )是介导B56α相互作用的主要区域,而CIP2A的C末端区域(1-560)涉及K490,稳定CIP2A-B56α相互作用。
CIP2A的n-末端头域在癌细胞中稳定全长CIP2A蛋白 为了表征CIP2A头部结构域和B56α之间相互作用的功能相关性,我们对CIP2A的前40个氨基酸残基进行了诱变(图。 2A ).将突变引入V5标记的全长CIP2A(1-905)哺乳动物表达构建体,并在22RV1前列腺癌细胞中检测CIP2A蛋白表达。所选择的策略得到先前数据的支持,即CIP2A蛋白在细胞中的稳定性直接反映了其B56结合效率 31 。此外,这是研究这些N-末端头结构域氨基酸在全长CIP2A蛋白中的作用的唯一可用方法,因为功能实验所需的重组全长CIP2A蛋白的产量和质量仍然难以捉摸。
A CIP2A(PDB:5UFL)N-末端的突变用不同的颜色表示,也用于柱状图B,E,G,I B 前列腺癌22RV1细胞中全长CIP2A(1-905)V5变异体的瞬时过表达。代表性的蛋白质印迹图像显示在S5中。定量显示为平均值+标准差,来自 N = 3个生物重复。CIP2A突变体的表达水平被标准化为WT CIP2A的表达,其在每个实验中被设定为值1。双尾单样本Wilcoxon t检验。源数据作为源数据文件提供。 C 癌症衍生的CIP2A头部结构域突变体对乳腺癌MDA-MB-231细胞中CIP2A全长蛋白表达的影响。 D , F GST下拉试验比较重组GST标记的CIP2A(1-560) WT蛋白和K8A或A24E突变体之间的B56α直接相互作用。源数据作为源数据文件提供。 E , G 来自D和f的数据的量化。来自洗脱液的B56α信号被标准化为GST信号。定量显示为平均值+标准差,来自 N =分别为4和3个生物重复。将来自突变体的B56α信号标准化为来自WT CIP2A的信号,在每个实验中设定为值1。 E 双尾单样本Wilcoxon t检验。 H 通过在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中瞬时过表达来分析稳定和去稳定全长CIP2A(1-905)V5头部突变体的组合效应。源数据作为源数据文件提供。 I 量化( H ).显示的是平均值+ S.E.M N = 3个生物重复。在每个实验中,CIP2A突变体的表达水平被标准化为设定为值1的WT CIP2A的表达。双尾单样本Wilcoxon t检验。
值得注意的是,与野生型蛋白相比,所有六个测试的突变体都显示出对全长V5-CIP2A(1-905)蛋白水平的影响,这强烈表明了头结构域的功能重要性(图。 2B 参见补充图。 5A 对于蛋白质印迹)。特别是,K8A单点突变几乎消失,而K21A和K40A突变显著抑制全长CIP2A蛋白表达。另一方面,与野生型(WT)相比,A24E突变增加了全长CIP2A蛋白的表达(图。 2B 和补充图。 5A ).认识到CIP2A蛋白在人类癌症中高表达的功能重要性 18 ,21 ,23 ,24 ,26 ,33 ,我们探索了癌症衍生的CIP2A头部结构域突变对蛋白质表达的潜在影响。基于突变残基的定位和突变对B56α结合的预期影响,我们从COSMIC和cBioPortal数据库中选择了三个CIP2A头部突变(Q16E、S22A、E23K)。值得注意的是,当在MDA-MB-231 TNBC细胞中测试时,其肿瘤生长依赖于CIP2A蛋白的表达 34 ,Q16E显示出与A24E突变体相当的CIP2A稳定性。 2C ).
证实了22RV1细胞中全长CIP2A蛋白表达的降低(图。 2B ),在体外下拉试验中,细菌产生的CIP2A(1-560) K8A突变体与野生型CIP2A(1-560)相比,表现出降低的B56α直接结合(图。 2D ).还发现重组CIP2A(1-560) K21A突变体与B56的相互作用不如CIP2A 1-560 WT蛋白有效(补充图。 5B,C ).当在N-末端CIP2A(1-330)片段的背景下测试时,A24E突变反而显示直接B56α结合增加(图。 2F ).由于它们的不稳定性,其他测试的头结构域突变不能作为细菌蛋白表达。由于这些结果强烈表明K8A和A24E突变对CIP2A蛋白稳定性的影响与其B56α结合倾向有关,我们询问K8A突变全长CIP2A降低的细胞稳定性是否可以通过伴随A24E突变增加其B56α结合亲和力来挽救。事实上,当用携带A24E和K8A突变的构建体瞬时转染MDA-MB-231细胞时,我们观察到全长CIP2A蛋白表达恢复到WT水平(图。 2 h, I ).作为CIP2A蛋白稳定性变化的分子解释,我们检测了全长蛋白上潜在的泛素化位点。以前,CIP2A蛋白的稳定性被证明受芯片介导的泛素化的调节 35 ,但CIP2A上的泛素化位点尚未被表征。基于数据库信息( https://www.phosphosite.org/ ),赖氨酸647 (K647)是最普遍的泛素化CIP2A氨基酸。值得注意的是,K647A突变挽救了MDA-MB-231细胞中CIP2A K8A突变体的表达,但没有进一步增加已经稳定的A24E突变体的表达(补充图。 5D ).
总之,这些数据表明CIP2A的N-末端头域介导与B56α的相互作用,是癌细胞中全长CIP2A蛋白表达的关键决定因素。结果进一步表明,N-末端头突变体的稳定性降低是由C-末端K647介导的,这可能取决于CIP2A-B56α相互作用的紧密性而不同地暴露于泛素化。
CIP2A的N-末端头结构域上的单个氨基酸突变消除了TNBC致瘤性 为了测试CIP2A的N-末端头域的癌症相关性,我们通过CRISPR/Cas9创建了携带K21A突变的MDA-MB-231单细胞克隆。选择K21A突变是因为其对CIP2A蛋白表达的中度去稳定作用(图。 2B ),因为在K8A突变体中观察到CIP2A蛋白表达几乎完全丧失,基于先前的CRISPR/Cas9敲除数据(Avana 2020 Q1; https://depmap.org )24 。使用直接核糖核蛋白(RNP)介导的转染,通过两个独立的指导RNA(gRNA)靶向K21 36 。两种gRNAs都导致基因组CIP2A靶向(补充图。 6A )和转染细胞池中CIP2A蛋白表达的降低(补充图。 6B ).基于对CIP2A表达更强的影响,选择gRNA #2细胞池进行单细胞克隆。在测序的单细胞克隆中,我们可以从两个克隆(克隆1和克隆2)中验证K21A突变(补充图。 6C )在实验中与不含gRNA的RNP转染的对照细胞相比较。
CIP2A蛋白在两个单细胞克隆中的表达降低通过蛋白质印迹法得到证实(图。 3A ).CIP2A靶向也抑制了验证的PP2A-B56α靶MYC的表达(图。 3A ).重要的是,当通过邻近连接分析(PLA)评估时,全长内源性CIP2A蛋白上的K21A突变几乎完全消除了CIP2A-B56α相互作用(图。 3B角 ),尽管仍有大约50%的K21A突变蛋白在用于该测定的细胞中表达(补充图。 6D ).PLA反应的特异性通过在没有CIP2A一抗的情况下进行测定来测试(补充图。 6E ).这些数据进一步证实了N-末端头结构域在全长CIP2A与B56相互作用以及CIP2A蛋白稳定性中的关键作用 在电影中 .
A 在两个独立的MDA-MB-231 CIP2A K21A突变克隆中CIP2A和MYC蛋白表达的蛋白质印迹分析。源数据作为源数据文件提供。 B HA-B56α与内源性CIP2A相互作用的邻近连接试验(PLA)。用HA-B56α构建体转染的MDA-MB-231对照和MDA-MB-231_K21A突变克隆1细胞接受具有抗HA和抗CIP2A抗体的PLA。红点表示HA-B56α和内源性CIP2A蛋白之间的关联。显示的是来自的代表性图像 N = 3 PLA实验。比例尺= 10米 C PLA的定量显示在( B )使用自动宏检测PLA信号。误差条代表来自2次技术复制的3个不同区域的平均值+/-SD。带威尔士校正的双边不成对t检验。 D MDA-MB-231对照和CIP2A K21A突变克隆的贴壁依赖型菌落生长潜力。 E 量化( D ).显示了来自每个所示细胞系的两个技术重复的平均值( n = 2). F MDA-MB-231对照和CIP2A K21A突变克隆在软琼脂上的非贴壁生长潜力。 G 量化( F ).以每个指定细胞系的三次技术复制的平均值+/-标准差表示。带威尔士校正的双尾t检验。 H 来自MDA-MB-231对照的原位乳房脂肪垫异种移植肿瘤的生长曲线( n = 7只小鼠)或CIP2A K21A突变克隆( n = 8只小鼠)。误差条代表平均值+/-标准差双侧方差分析。 I 在第30天从( H ). J 蛋白质印迹分析切割的PARP (Cl。PARP)、磷酸化的MEK和磷酸化的波形蛋白,它们来自两个独立的MDA-MB-231 CIP2A K21A突变克隆,它们培养在普通塑料或低附着多聚HEMA包被的平板上。源数据作为源数据文件提供。 K CIP2A上的K21A突变如何导致蛋白质不稳定,从而从CIP2A介导的抑制中释放B56的示意图。这导致PP2A-B56靶的去磷酸化和肿瘤发生的抑制。
有趣的是,两个CIP2A变体克隆和对照细胞在塑料中的集落形成潜力相当(图。 3D,E ).然而,完全符合不依赖于贴壁生长的PP2A-B56抑制的要求 6 ,7 CIP2A K21A靶向克隆几乎完全不能在软琼脂上生长成球体(图。 3F ).上述数据证明体外CIP2A的K21A突变体和B56之间的相互作用降低 在电影中 。然而,还不清楚CIP2A的K21A突变体的蛋白质表达减少在多大程度上导致软琼脂上恶性生长的丧失。为了解决这个问题,我们创建了两个独立的CIP2A shRNA克隆,它们与K21A突变Crispr克隆中观察到的CIP2A蛋白表达水平大致相似(补充图。 6F ).我们还将CIP2A siRNA滴定至仅部分抑制CIP2A表达的水平(补充图。 6G ).值得注意的是,两种类型的CIP2A变形MDA-MB-231细胞仍然完全能够在软琼脂中形成菌落(补充图。 6H–K ).这表明K21A突变Crispr克隆恶性生长潜力的完全丧失(图。 3F )不能仅由这些克隆中CIP2A蛋白表达的部分抑制来解释,但它也涉及CIP2A-B56相互作用的丧失。
基于CIP2A上的单个K21氨基酸对于转化细胞生长是必需的结果,通过原位异种移植物分析测试了K21A突变对MDA-MB-231细胞致瘤性的影响。值得注意的是,与对照细胞相比,两个克隆都显示出显著受损的肿瘤生长(图。 3H ).特别是对于克隆1,只有5/8的肿瘤是可触知的,并且肿瘤生长非常缓慢,平均大小仅为113 mm 3 30天后(图 3I ).因为CIP2A K21对于MDA-MB-231细胞的体外非贴壁生长是选择性必需的(图。 3 f,G对D,E)和体内(图。 3H,我 ),我们评估了失巢凋亡(由于细胞粘附的丧失而导致的凋亡)的诱导,以及在非锚定依赖性条件下与细胞存活相关的PP2A调节的磷酸化靶标。为此,对在塑料或低亲和力聚HEMA包被的平板上培养24小时的克隆进行了PARP切割和MEK MAPKK和波形蛋白磷酸化的研究。PARP切割的增加证实了K21靶向克隆在低亲和力条件下对失巢凋亡诱导的敏感性增加(图。 3J ).有趣的是,在两种情况下,K21靶向克隆中的前存活MEK MAPKK的磷酸化都降低了,但这种效应在来自低亲和力平板的细胞中更明显,这为失巢凋亡增加提供了合理的解释 37 (图。 3J ).此外,PP2A上磷酸化作用靶向波形蛋白 38 ,支持锚定独立增长 39 在两种条件下,K21A克隆中的。
总的来说,这些结果证实了CIP2A的N-末端头结构域的癌症相关性。他们还发现靶向头部结构域是阻断CIP2A驱动的TNBC细胞恶性生长的有效策略 24 (图。 3K ).
CIP2A从PP2A-B56α异源三聚体上劫持B56α和PP2Ac 尽管上述结果清楚地证明了N-末端头结构域与CIP2A致癌性的相关性,但是仍然完全不知道CIP2A如何机械地影响PP2A-B56α全酶的功能。为了解决这个问题,我们将CIP2A(1-560)交联位点映射到PP2A-B56α三聚体构型中的B56α结构。有趣的是,基于交联位点的CIP2A(1-560)在B56α上可能覆盖的假想表面积的比较(图。 4A 红色),涉及B56α与A亚基相互作用的已知位点(图。 4A ,紫色) 40 ,41 揭示了这些表面区域高度重叠(图。 4A 右侧面板,阴影圆圈)。此外,CIP2A交联位点之一K358邻近B56α上的PP2Ac相互作用表面(图。 4A 右侧面板)。这些观察促使我们假设CIP2A(1-560)与B56α的结合可能会干扰PP2A-B56α全酶装配。
A 在CIP2A分子间交联中鉴定的B56α位点与B56α接触支架A亚单位的位点重叠(PDB: 6NTS)。a亚基为黄色,催化亚基为灰色,B56α为小麦。CIP2A和B56α之间的XL-MS交联显示为红色。PP2A-A和PP2Ac与B56α的相互作用位点分别显示为洋红色和浅紫色(基于参考文献。 40 ,41 ).B56α表面中PP2A-A和CIP2A之间的重叠在右图中显示为透明的椭圆形。 B 与预组装的PP2A-B56α异源三聚体(A-B56α-PP2Ac)孵育后,与CIP2A(1-560)相互作用的PP2A三聚体组分的考马斯染色SDS-PAGE。A = PP2A-A;C = PP2Ac。显示了来自四个实验的代表性图像。 C 类似于在( B ).PP2A-A之间蛋白质印迹信号的不同强度( A )、B56α和PP2Ac(以及洗脱液中B56α和PP2Ac之间),是由于同时用于印迹膜的抗体的不同亲和力。 N = 3个生物重复。 D PP2A三聚体-GST-CIP2A(1-560)相互作用的GST下拉分析。在所有样品中使用等摩尔量的PP2A蛋白。CIP2A(1-560)蛋白的量按指示用PP2A滴定。分子量标记的位置不可用。 E , F GST( F )或GST-CIP2A(1-560)( G )和预先装配的PP2A-A-B56α-PP2Ac三聚体(ABC)(中间的图)或B56α和PP2Ac (B + C)蛋白质(下面的图)。通过蛋白质印迹分析从指定级分洗脱的蛋白质。从每个部分洗脱的蛋白质复合物的近似分子量是基于用标准蛋白质的校准。分子量标记的位置不可用。 N = 1. G CIP2A介导的PP2A-B56α复合物劫持的示意图。在CIP2A低表达的正常细胞中,PP2A-B56α全酶(A-B56α-C)保持完整。在CIP2A高表达的癌症中,CIP2A直接与B56α和PP2Ac相互作用,导致A亚单位从三聚体中排出。因此,在癌细胞中,CIP2A作为一种伪A亚单位发挥作用,稳定三聚体CIP2A-B56α-PP2Ac复合物。
为了研究这种有趣的可能性,我们在体外将GST融合的CIP2A(1-560)与预先组装的PP2A-B56α全酶(A-B56α-PP2Ac)一起孵育,并通过考马斯凝胶染色分析谷胱甘肽-珠免疫沉淀物的蛋白质相互作用的重建。支持上述基于结构的假设,发现CIP2A捕获B56α和PP2Ac,但不捕获PP2A三聚体的支架A亚单位(图。 4B ).这些结果通过对来自独立实验的谷胱甘肽珠免疫沉淀物的蛋白质印迹分析得到证实(图。 4C ).与其他数据一致,在GST下拉实验中没有检测到CIP2A(1-560)和A亚基之间的直接相互作用(补充图。 7A ).这些结果通过证明支架亚基的CIP2A浓度依赖性置换以及从全酶中提取B56和PP2A-c而得到证实(图。 4D 和补充图。 7B ).重要的是,数据还证明了CIP2A(1-560)从全酶中提取B56α的能力高于CIP2A(1-330)(图。 4D ).这与C-末端相互作用区在稳定CIP2A-B56相互作用中的作用一致 31 (图。 1C,D ).有趣的是,虽然CIP2A-PP2Ac相互作用以前没有报道过,但它们的直接相互作用通过GST下拉实验得到了证实(补充图。 7C ).
上述结果暗示了一个模型,其中CIP2A可以潜在地作为三聚体CIP2A-B56α-PP2Ac复合物的伪A亚单位。为了证明这种CIP2A-B56α-PP2Ac复合物可以重建,我们将预组装的PP2A全酶(A-B56α-PP2Ac)仅与GST或与GST-CIP2A(1-560)一起孵育,并对样品进行分析凝胶过滤分析(图。 4E,F 和补充图。 7B ).令人放心的是,在与GST共孵育的对照样品中(图。 4E 中图),A-B56α-PP2Ac三聚体组分在级分3和4中共洗脱,且不含GST,而在与GST-CIP2A(1-560)一起温育的样品中(图。 4F 中图),CIP2A与B56α和PP2Ac共洗脱,在级分2-4中没有A-亚基。我们还进行了凝胶过滤来模拟CIP2A-B56α-PP2Ac三聚体中A亚基被排除后的情况。因此,我们将单独的GST或GST-CIP2A(1-560)与B56α和PP2Ac一起孵育,它们在没有任何支架蛋白的情况下不构成稳定的二聚体 40 ,41 。与之前的数据一致,B56α和PP2Ac在与GST孵育时没有共洗脱(图。 4E 下面板)。然而,在GST-CIP2A(1-560)的存在下,PP2Ac和B56α在也含有GST-CIP2A(1-560)的高分子量复合物2和3中共洗脱(图。 4F 下面板)。
这些结果揭示了在CIP2A结合时PP2A-B56α全酶的重组,导致未预见的三聚体CIP2A-B56α-PP2Ac复合物的形成(图。 第四代移动通信技术 ).
CIP2A沉默LxxIxE基序依赖性底物与B56α的结合 上述结果确定了CIP2A从PP2A-B56α复合物中劫持B56α和PP2Ac的机制。然而,如果CIP2A仅仅作为一个伪A亚单位发挥作用,那么新形成的CIP2A-B56α-PP2Ac异源三聚体是否还能识别B56α靶还不清楚。令人兴奋的是,我们提出了B56α (aa)上的CIP2A(1-560)交联位点。171,181,217和227),排列在识别B56α底物中LxxIxE基序的凹槽中(图。 5A ).另一方面,最近确定了LxxIxE底物与B56α高亲和力结合的额外决定因素,B56α是b56α氨基酸E301-E341之间的酸性斑块 42 夹在LxxIxE基序和B56α (aa)的C端CIP2A交联位点之间。347、354和358)(补充图。 8A ).这些结果表明,CIP2A可以通过空间阻止识别含有LxxIxE基序的底物蛋白来沉默CIP2A-B56α-PP2Ac三聚体中的B56α。为了研究这种可能性,我们使用了来自BubR1的含LxxIxE基序的蛋白片段,它是原型B56α底物 15 ,43 ,44 。在实验中,在加入V5标记的重组CIP2A(1-560)之前,将GST标记的BubR1(647-720)与B56α预孵育,并从谷胱甘肽珠下拉样品中评估B56α与BubR1的结合效率。值得注意的是,尽管发现CIP2A不与BubR1相互作用(图。 5B 泳道2),它有效地与BubR1的B56α竞争(图。 5B,C 通道1对通道3)。
A CIP2A-B56α交联位点(红色;PDB: 6NTS)与B56α的LxxIxE结合沟相关。以浅紫色表示的残基构成了B56α在氨基酸212-271之间的LxxIxE结合区。深紫色的残基表示参与PP2A-A相互作用的氨基酸,如图2所示。 4 . B CIP2A(1-560)V5与原型LxxIxE基序靶BubR1(LxxIxE肽647-720)的竞争超过了它与B56α的直接结合。源数据作为源数据文件提供。 C GST下拉数据的量化来自( B )显示为平均值+标准差 N = 3个生物重复。双侧t检验。 D 单独使用GST-BubR1(647-720)或与CIP2A N末端头肽(aa)组合使用的B56α竞争分析。18-40).源数据作为源数据文件提供。 E 来自D的数据的量化显示为平均值+来自 N = 4个生物重复。双侧t检验。 F 使用纯化的重组GST标记的CIP2A(1-560)和B56α WT或B56变体Y215Q和R222E的体外结合试验,其包含防止与LxxIxE沟底物蛋白相互作用的突变 10 。源数据作为源数据文件提供。 G 量化来自( F )显示为平均值+标准差 N = 3个生物重复。 H GFP标记的B56α WT或指示的三重突变体在HEK-293-T细胞中表达。通过抗PP2A-A免疫印迹来定量GFP陷阱下拉后与GFP标记的B56α结合的PP2A-A亚单位的量。显示的是定量的抗PP2A-A信号与定量的抗GFP信号的比值的平均值+ S.E.M,相对于B56α WT(设定为100 %),来自 N = 3次生物复制。双边单样本t检验。 I 三重B56α突变体(K181A/K217A/K227A)表现出K227 (B56)-D117(PP2A-A)盐桥的缺失。PP2A-B56α的重叠(PDBID 6NTS: PP2A-A,黄色;B56α,米色)和PP2A-B56γ (PDBID 2IAE: PP2A-a,浅青色,B56γ,青色),其中PP2A-A D177和B56α/B56γ K227/K202残基显示为棒状并被标记。氢键相互作用用虚线表示。使用Pymol生成图像。
为了将这些结果与CIP2A-B56α相互作用的结构要求直接联系起来,我们测试了CIP2A的头结构域肽(aa.18-40)是否能够单独阻断B56α-BubR1相互作用。在实验中,B56α与CIP2A头肽预孵育,之后复合物与GST-BubR1共免疫沉淀。与我们的模型完全一致,BubR1与B56α的结合在CIP2A头肽存在时减少(图。 5D ).我们进一步比较了CIP2A与B56α变异体的结合,b56α变异体具有消除LxxIxE基序靶结合的凹槽突变 10 。值得注意的是,Y215Q和R222E这两种测试的B56α变异体都表现出BubR1结合的完全丧失 10 它们对CIP2A结合仅有轻微影响:Y215Q根本不影响CIP2A结合,与B56α野生型相比,R222E具有约40%的抑制作用(图。 5F,G ).这些结果表明CIP2A抑制B56α与LxxIxE基序底物的结合,但其本身不是经典的LxxIxE基序底物。
为了确定B56上LxxIxE结合沟附近的交联残基是否对CIP2A结合或PP2A全酶装配有作用,我们将K181、K217和K227突变为丙氨酸。在体外GST下拉分析中,这些突变不影响CIP2A-B56的直接相互作用(补充图。 8B ).这可以通过在这些实验条件下多个其他CIP2A-B56交联位点潜在地足够稳定相互作用来解释。然而,当测试时 在 纤维素,这些B56突变在PP2A三聚体的稳定性中具有重要作用,这通过B56-A和B56-PP2Ac相互作用的非常有效的抑制以及催化PP2A活性的丧失来证明(图。 5H 和补充图。 8C )来自B56突变蛋白下拉样品。这些结果表明,除了其在底物识别中的关键作用外,B56上的LxxIxE沟区在PP2A三聚体稳定性中也具有重要作用。PP2A-A亚基的D177和B56α的K227之间的极性相互作用最好地解释了这一点(图。 5I ;PDBID 6NTS)。与CIP2A和B56α和B56γ之间的保守相互作用一致 31 (补充图 5B,C ),PP2A-A的D177以类似的方式与B56γ的K202相互作用(图。 5I ;PDB:2个 41 ).
这些结果为CIP2A与B56的LxxIxE区结合后PP2A-A亚基从B56上的置换提供了机理解释。
CIP2A对PP2A-B56α抑制的“劫持和沉默”模型的验证 在电影中 上述体外结果揭示了PP2A全酶抑制的前所未有的劫持和沉默机制。在这个模型中,CIP2A从PP2A-B56α三聚体中排出A亚单位,并随后抑制B56α与LxxIxE基序底物的结合。为了验证这两种抑制模式 在电影中 我们首先通过亲和纯化与质谱联用(AP-MS)的方法分析了CIP2A对B56α相互作用体的影响 45 。为此,我们使用稳定表达人CIP2A(1-905)V5或空载体对照的鼠NIH3T3细胞(图。 6A 和补充图。 8D ).NIH3T3细胞不表达内源性CIP2A蛋白,但CIP2A过表达增加其增殖潜能 21 。这些特征使它们成为研究由CIP2A过表达导致的PP2A-B56α抑制的理想细胞模型。这些稳定的细胞用YFP标记的B56α瞬时共转染,GFP-Trap免疫沉淀和MS分析用于鉴定B56α相互作用复合物(图。 6A ).用三个重复样品进行的AP-MS实验的结果证实了仅在CIP2A(1-905)V5过表达细胞中CIP2A与B56α的关联(图。 6B 和补充数据 2 ).此外,完全支持CIP2A可以从A-B56α-PP2Ac三聚体中排出A-亚单位的模型,在CIP2A过表达细胞中,与B56α相关的A-亚单位(PPP2R1A)显著减少(图。 6B ).另一方面,在CIP2A过表达具有显著影响的所有B56α共沉淀蛋白中,验证CIP2A在防止b56α-底物相互作用中的功能(> Log2倍变化1, p < 0.05), 80% of proteins showed decreased B56α binding (Fig. 6B,C ).值得注意的是,63%的这些蛋白质有一个候选LxxIxE基序(图。 6C 和补充数据 2 )这与我们的体外结果一致。
A NIH3T3细胞,稳定表达人CIP2A(1-905) V5,或空载体对照(见补充图。 8D ),用YFP-B56α WT瞬时转染,随后用GFPTrap免疫沉淀并通过质谱分析。 B CIP2A(1-905)V5过表达细胞中与B56α差异相互作用的蛋白质( N = 3)与对照( N = 3).指示的蛋白质超过2倍差异的阈值 p < 0.05 (two-sided t-test using log2 of protein abundances, normalized to the protein abundance of B56α in the CTRL_1 sample, as an input). C 显示CIP2A过表达后B56α结合减少或增加的蛋白质份额饼图(不包括PPP2R1A和CIP2A)。柱状图表明在与B56α的相互作用被CIP2A降低的蛋白质中,具有推定的LxxIxE基序的蛋白质的百分比份额。 D 与对照克隆相比,CIP2A K21A克隆1中去磷酸化的蛋白质百分比份额(FDR < 0.05)的饼图表示与从去磷酸化的蛋白质(橙色)中发现的推定lxx xe基序相关,或者去磷酸化的蛋白质是否是具有验证的lxx xe基序的蛋白质的相互作用体(红色)。 E 基于CIP2A K21A克隆中去磷酸化的磷酸肽的显著富集的激酶基序1。背景表示从相同样品中通过MS鉴定的所有磷酸肽中发现的基序数量。 F 与对照克隆相比,在CIP2A K21A克隆1中富含去磷酸化的靶的衰老过程的反应组分析图像捕获。CIP2A介导的PP2A-B56α抑制作用的示意图。在CIP2A低表达的正常细胞中,PP2A-B56α通过LxxIxE沟和相邻的酸性斑块(橙色)与其底物蛋白(浅蓝色)结合,导致底物去磷酸化。在癌细胞中具有高 CIP2A 基因转录,CIP2A与PP2A-B56α三聚体结合导致A的排出和CIP2A-B56α-PP2Ac三聚体的形成。在这个可选择的三聚体中,CIP2A保护LxxIxE沟和邻近的酸性斑块不受B56α底物的影响,因此底物保持磷酸化(深蓝色)。CIP2A通过其头部结构域与B56α结合进一步稳定了CIP2A蛋白。
为了证实这些结论,我们验证了N-末端K21A突变对含有LxxIxE基序的蛋白质磷酸化的影响。对照克隆和CIP2A K21A克隆1之间的LC-MS分析的磷酸蛋白质组的比较(都是一式三份)导致从CIP2A K21A细胞中显著(FDR < 0.05)下调的63种单独蛋白质中鉴定出78种磷酸肽(补充数据3 ).整个MS/MS标识数据可以从补充数据中找到 4 并来自地理数据库(PXD035179)。
值得注意的是,53%的蛋白质去磷酸化CIP2A K21A细胞具有候选LxxIxE基序(图。 6D 和补充数据 4 ).先前的研究表明,含有LxxIxE的蛋白质可以作为PP2A-B56α介导的去磷酸化的其他蛋白质募集的支架 46 。使用PINA.3数据库 47 ,我们发现在我们的筛选中鉴定的另外15%的蛋白质是具有验证或预测的LxxIxE对接基序的蛋白质的相互作用体 46 ,48 (图。 6D 和补充数据 4 ).因此,在CIP2A K21A克隆中去磷酸化的68%的蛋白质或者是含有LxxIxE的蛋白质,或者是它们的相互作用物,强烈支持CIP2A抑制PP2A-B56底物识别的观点。我们还分析了来自CIP2A K21A细胞的去磷酸化肽中激酶靶基序的富集,使用来自相同MS分析的所有定量磷酸肽作为背景(图。 6E ).值得注意的是,在富集的基序中,14-3-3蛋白结合基序是许多信号转导蛋白中牢固确立的PP2A-B56α靶标 49 。此外,最近的研究表明PP2A-B56和CLK2在不同的生理和病理背景下的功能关系 50 ,51 。最后,最近报道RSK2介导的Emi2磷酸化促进了其与PP2A-B56的相互作用 52 ,53 。最后,在途径分析中,CIP2A调节的磷蛋白在衰老相关蛋白中富集(图。 6F 和补充数据 5 ),这与先前将CIP2A与衰老逃避联系起来的证据一致 18 ,为CIP2A K21A突变克隆中有效的肿瘤生长抑制提供了合理的机理解释。
总体而言,这些结果提供了全面的 在电影中 CIP2A通过劫持和沉默机制抑制PP2A-B56α功能的验证:通过从三聚体中驱逐A亚单位,并通过屏蔽B56α与其LxxIxE基序底物蛋白的结合(图。 6F ).
讨论 在过去的二十年中,在理解蛋白丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶(PPP )(历史上被认为是缺乏底物特异性的混杂酶)如何选择性地去磷酸化其底物方面取得了重大进展 1 ,3 。大多数PPP在底物识别中的精确性的关键是在催化亚单位和不同的调节亚单位之间形成二聚或三聚体复合物;例如三聚体PP2A复合物的B亚单位。因此,尤其是因为不同的含B亚单位的PP2A复合物可能具有甚至相反的细胞功能,如肿瘤抑制或肿瘤发生 54 ,了解单个PP2A B亚基的功能和调节是必不可少的。最近发现了一些PPP调节亚单位选择性识别靶蛋白的氨基酸序列决定簇1 ,10 ,14 ,42 ,49 ,55 。然而,调节亚单位的区域是否介导底物相互作用。本身受内源性机制的调节,知之甚少。这一水平的调节将提供一种复杂的细胞机制,以选择性地影响PPP亚复合物的功能,而不会通过PPP催化活性的非选择性调节产生有害影响。这种底物识别调节机制的鉴定也可以促进选择性治疗PPP调节方法。
在这项工作中,我们发现了抑制PP2A-B56复合物装配和人癌蛋白CIP2A底物识别的结构机制。我们证明CIP2A可以从PP2A-B56α三聚体中劫持B56α和PP2Ac,作为新形成的CIP2A-B56α-PP2Ac三聚体的支架,并随后通过B56α沉默底物识别(图。 6F ).虽然大部分实验是通过使用B56α蛋白进行的,但我们也通过使用B56γ验证了N-末端头突变体K21A的影响(补充图。 5B,C ).结合B56家族蛋白在介导CIP2A相互作用的区域结构上非常保守的概念,我们假设所呈现的结果可以潜在地推广到B56蛋白家族。基于这些结果,可以想象CIP2A与B56α上K227附近的结合将如何干扰B56-PP2A-A相互作用,从而从PP2A-A劫持B56(图。 5H,我 ).在该模型中,局部蛋白质浓度和B56对CIP2A结合的PP2A-A的主动排斥将比基于蛋白质相互作用亲和力的纯竞争更关键。尽管这里描述的机制明显不同于先前描述的TIPRL介导的PP2A抑制机制 56 ,它们在替代三聚体的形成方面彼此相似,其中抑制蛋白(CIP2A或TIPRL)替代了典型的PP2A复合物成分。CIP2A取代了PP2A三聚体的A亚基,TIPRL通过几个步骤,劫持了C亚基,形成TIPRL-PP2Ac-α4复合物 56 。这些研究表明,劫持PP2A复合物成分可能是内源性抑制蛋白抑制PP2A的常用机制。
非常重要的是,我们为研究的所有主要结论提供了赛璐珞验证。首先,介导B56α结合的CIP2A头部结构域氨基酸的单点突变体显著影响癌细胞中CIP2A蛋白的表达(图。 2 ).值得注意的是,这些结果验证了突变的N-末端残基与全长CIP2A功能的相关性,CIP2A也包含非结构化的C-末端尾。其次,B56α相互作用组的AP-MS分析证实CIP2A过表达从B56α中排出A亚基(图。 6B ).第三,两种类型的蛋白质组学分析与生物信息学分析的结合证实了CIP2A抑制B56α与癌细胞中LxxIxE基序底物的结合(图。 6 和补充数据 4 ).第四,CIP2A的N-末端仅一个氨基酸的突变就足以消除侵袭性TNBC细胞系的肿瘤生长(图。 3 ).总之,所发现的CIP2A既破坏PP2A-B56α肿瘤抑制复合物的功能,同时又保护自身免于降解的双头策略,可能解释了CIP2A作为人类癌蛋白的显著效力。然而,尽管PP2A-B56α显然是CIP2A致癌活性的重要靶点,我们的数据并不排除CIP2A促进肿瘤发生的其他潜在机制。
已知CIP2A与B56α亚基相互作用的关键氨基酸交联的共分布为CIP2A和B56α亚基之间的竞争提供了机制基础(图。 4A ).我们也为CIP2A的B56α沉默功能提供了充分的证据。交联数据、诱变和肽竞争实验都支持CIP2A N-末端头部与B56α结合在空间上阻碍LxxIxE基序底物结合的结论。然而,与真正的B56α LxxIxE底物不同,CIP2A与B56α的结合不依赖于实际的LxxIxE结合沟。因此,CIP2A不仅是PP2A-B56α的假底物,还是一种空间抑制蛋白(图。 6F ).我们的结果进一步暗示了LxxIxE沟区在稳定PP2A三聚体方面的重要作用。非常有趣的是,最近鉴定的CIP2A变体NOCIVA(新的CIP2A变体),其由融合到独特的C末端尾部的N末端CIP2A氨基酸1-545组成 57 ,包含此处确定的对CIP2A-B56α相互作用至关重要的所有结构特征。因此,这项研究的结果很可能也与理解诺西伐促进髓系肿瘤治疗耐药性的机制相关 57 。然而,很明显,需要额外的结构研究来理解CIP2A和NOCIVA与PP2A-B56相互作用的分子水平细节。
这些结果可能会促进PP2A再激活疗法的发展。我们的结果揭示了CIP2A头部结构域是介导PP2A-B56α抑制的关键结构区域,但也是CIP2A蛋白高表达的区域,正如在人类癌症中观察到的那样 19 ,33 。因此,该结果将为靶向CIP2A的治疗策略铺平道路。基于单个氨基酸K21的突变几乎完全抑制MDA-MB-231细胞的致瘤特性(图3),我们提出,通过同时防止PP2A-B56α抑制和引起CIP2A蛋白破坏,防止CIP2A头部结构域与B56α结合的疗法将构成有效的癌症治疗策略。值得注意的是,药物诱导的靶蛋白降解的益处是显而易见的。这种方法不仅会抑制CIP2A对PP2A-B56α的功能,而且会去除任何其他CIP2A蛋白的功能,例如直接与TopBP1结合 24 ,26 ,并导致预计甚至在药物代谢后仍保持的更长的药效作用。尽管此处对TNBC细胞的功能相关性进行了验证,但是对CIP2A蛋白表达的抑制的治疗效果已经通过跨人类癌症类型的大量研究进行了验证 18 ,20 ,21 ,23 ,33 ,34 。CIP2A抑制也使癌细胞对大量癌症疗法敏感 27 ,28 ,30 .
总之,这项工作描述了介导肿瘤抑制因子PP2A-B56α抑制的多蛋白复合物调控的劫持和沉默机制。该结果还通过揭示CIP2A致癌性背后的结构决定因素,为开发新的靶向癌症疗法提供了明确的线索。因为CIP2A也通过调节Tau和APP与阿尔茨海默病密切相关 32 ,58 这些结果可能与癌症以外的人类疾病有广泛的相关性。