Notch1突变驱动正常食管上皮克隆性扩增，但损害肿瘤生长

调查如何NOTCH1突变克隆定居正常上皮，我们跟踪了Notch1用谱系追踪法研究转基因小鼠中的突变克隆。小鼠食管上皮由角质化细胞层组成。增殖限于基底层的祖细胞(扩展数据图。2a).正在分化的细胞停止分裂，离开基底层并向脱落的上皮表面迁移。祖细胞分裂与邻近的分化细胞从基底层退出有关，确保基底层细胞密度保持恒定14。分裂的祖细胞产生两个祖细胞、两个分化的子细胞或每种类型的一个细胞。在野生型组织中，每种祖细胞结果的概率是平衡的，产生相同比例的祖细胞和分化细胞，维持细胞稳态(扩展数据图)。2a)15,16。改变祖细胞命运的突变导致祖细胞的过度生产，从而推动突变克隆的生长17,18.

对于血统追踪，我们生成了AhCreERT Rosa26floxedYFP Notch1弗洛克斯 三重转基因(YFPCreNotch1)老鼠。这些动物带有条件反射Notch1等位基因和遗传标记系统。可诱导的贷方（即credit）重组酶(AhCreERT)用于删除一个或两个条件Notch1等位基因在Notch1wt/flox或者Notch1弗洛克斯/弗洛克斯动物并诱导单独的条件性黄色荧光蛋白(YFP)报告基因等位基因(Rosa26floxedYFP)15,19。YFP在重组上皮细胞及其后代中表达(扩展数据图。2b，c).该模型在低剂量下被诱导重组分散的单个基底细胞(克隆诱导)，或在较高水平下被诱导重组大部分基底细胞(高诱导)(扩展数据图。2c，d).

乳房切除术Notch1等位基因和YFP报道基因的表达Rosa26位点可以组合或单独出现，导致Notch1表达或不表达YFP的突变或野生型细胞(扩展数据图。2c，d).我们证实了外显子1的重组状态Notch1野生型和完全重组的Notch1+/−和Notch1−/−食道上皮。Notch1mRNA和蛋白质的表达在2005年减半Notch1+/−并于2004年废除Notch1−/−细胞与野生型角质细胞的比较(扩展数据图。3a–h和补充表格6).然后我们通过在分散的单个祖细胞中诱导重组来进行遗传谱系追踪YFPCreNotch1+/+，YFPCreNotch1+/flox 或YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯老鼠。通过对YFP和刻缺蛋白1染色的上皮薄片成像来检测YFP表达克隆(图。2a).黄色荧光蛋白+ Notch1+/−或者YFP+ Notch1−/−分别从降低的强度或缺乏NOTCH1免疫染色来鉴定克隆，该方法通过检测来验证Notch1显微切割克隆中的重组(图。2b扩展数据图。3i–n和补充说明).

通过转基因缺失产生的克隆Notch1等位基因可能不反映Notch1衰老过程中出现的突变体。因此，我们研究了自发的Notch1对照中的突变克隆YFPCreNotch1+/+小鼠，和高度诱导的杂合上皮YFPCreNotch1+/flox动物。在对上皮细胞进行刻缺蛋白1免疫染色之前，将两种菌株老化(图。3a).NOTCH1染色阴性的上皮面积逐渐增加到12%Notch1+/+78%的人Notch1+/−65周的上皮细胞(图。3b，c和补充表格9).NICD1染色在老年人中广泛缺失Notch1+/−组织(扩展数据图。5a、b).这些观察表明，和人类一样，Notch1突变体定居在老化的小鼠食道中，这种选择在Notch1+/−上皮细胞。

a, YFPCreNotch1+/flox和YFPCreNotch1+/+以高水平诱导小鼠，并使其老化65周。b衰老食管上皮中的代表性NOTCH1染色YFPCreNotch1+/+和YFPCreNotch1+/flox小鼠在指定的时间点。白色虚线描绘阴性区域，实线描绘组织边缘。每个时间点代表三只小鼠的图像。比例尺:500米c，分数百分比1−面积随着年龄的增长而增加Notch1+/+(肯德尔的τ-b相关= 0.56，P= 0.0062)和Notch1+/−(肯德尔的τ-b相关= 0.91，P= 8.3 × 10−6)食管(平均标准差，n=每个时间点3只小鼠)。P显示的值来自双面韦尔奇t测试。d，示意图Notch1+/−细胞(紫色细胞)显示自发出现的扩增的刻缺蛋白1−细胞(黑色)老化，可能是由影响Notch1轨迹。e，高度诱导YFPCreNotch1+/flox小鼠年龄为54-78周龄，收集食管上皮并对其进行刻缺蛋白1(品红色)、YFP(绿色)和DNA(蓝色)染色。没有或完全染有YFP的扩展区域明显不同于正常出现的区域，这些区域由小YFP拼凑而成+克隆人。扩展缺口1−(黄色)和槽口1+(橙色)区域和正常出现的区域(蓝色)被隔离用于靶向测序(n=来自10只小鼠的246份活检)。彩色圆圈表示采样区域。白色虚线描绘了负区域。比例尺:500米f，正常出现的比例，扩展的刻痕1−和扩展缺口1+活组织检查Notch1突变或CNLOH。g，缺口比例1−和NOTCH1+带有次要错义、无意义或插入/剪接的区域Notch1突变。为f和g, n样品显示在括号中，冗余样品，定义为共享相同突变且间隔< 1 mm的活检，计数一次(n=总共227个独特的活检)。h，殖民模式按分数1克隆人。克隆适合度从单等位基因和双等位基因开始增加Notch1突变导致双等位基因改变的选择压力(蓝色箭头)。p.i .，诱导后，w.p.i .，诱导后周。WT，野生型。KO，敲除等位基因缺失Notch1外显子1。Mut，突变。ND，没有检测到。见补充表格9–11.

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为了定位潜在的克隆，我们对NOTCH1和YFP报道基因进行了染色。老化Notch1+/−上皮包含多个同质NOTCH1染色的卵圆形区域，YFP阳性或阴性，但远远大于大多数YFP标记的克隆(图。3d，e).这些暗示了克隆扩张。总共解剖了246个这样的“扩展”区域以及典型的“非扩展”区域，并对73个Notch途径和癌症相关基因进行了靶向测序(补充表1, 10和11).我们分析了CNLOH和VAF ≥ 0.2的突变，因为低于这个阈值的突变被认为不可能驱动克隆扩增。百分之九十七(180/185)的“扩展”区域Notch1VAF ≥ 0.2或CNLOH的蛋白质改变突变涉及Notch1位点(GRCm38—chr2:26，457，903-26，503，822)。相比之下，61个非扩展区域中只有2个Notch1突变和没有Notch1CNLOH(图。3f扩展数据图。5c，d和补充表格10).在其他基因中只发现了一些突变，有些可能是a基因中的过客Notch1突变克隆。百分之九十四(169/180)的扩展区域Notch1变更事件只携带一个事件(大约50%是一个Notch1蛋白质改变突变和剩余的CNLOH ),平均VAF为0.44，与它们是携带影响未重组的自发变化的克隆一致Notch1等位基因(图。3e–g，补充表格10, 11和扩展数据图。5c，d).在携带一个Notch1突变，85%的NOTCH1染色阳性+包含错义突变，而NOTCH1阴性染色克隆主要携带indel/剪接(51%)或无义突变(46%)(图。3g).总的来说，这些结果与人类食管老化的结果一致(图。1).

为了测试错义的影响Notch1突变，我们使用离体功能分析(扩展数据图。5e–j和补充表格10)22. Notch1+/−图中的组织。3e–g在固定前与乙二胺四乙酸(EDTA)在37℃孵育。这在没有配体结合的情况下促进了NICD的NOTCH1切割和核迁移(扩展数据图。1a)22。一些分数1+克隆显示核染色，但其他人没有(扩展数据图。5e).核染色克隆富含配体结合位点的错义突变，EGF重复序列8-12，而非核染色克隆富含NRR结构域的LNR重复序列的突变(扩展数据图)。5g，h, P= 0.001，卡方检验)。大多数配体结合结构域突变具有高度不稳定的性质，与破坏配体结合一致，这一过程在EDTA测定中被绕过(扩展数据图。5i)23,24。NRR结构域突变体聚集在LNR1和LNR2结构域中(扩展数据图。5j)25。相比之下，NOTCH1人类T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的激活突变(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)聚集在NRR的HD结构域中并在没有配体相互作用的情况下促进NEC切割(比较NRR的LNR1-2和LNR3-HD亚区中突变计数的双侧Fisher精确检验，P= 1.48 × 10−10扩展数据图。5j)26,27。这些观察表明食管NRR结构域突变可能阻止NOTCH1的裂解。我们的结论是，在杂合子上皮中，大多数自发突变破坏了NOTCH1的功能，赋予了邻近细胞适应性优势。

总的来说，这些观察结果表明，单倍体不足是正常食管有效建群的关键Notch1变异人。中性突变体不会在组织中定居15,28。一个等位基因的缺失使突变祖细胞的命运偏向祖细胞的产生，增加了突变克隆在上皮细胞中扩增和持续存在的可能性(扩展数据图。4e，f和视频2). Notch1灭活的细胞具有进一步增加的适合度，使得持续杂合克隆中第二个等位基因的亚克隆丢失将产生胜过两者的细胞Notch1+/+和Notch1+/−邻居(图。3h).这个模型解释了克隆的高流行率NOTCH1衰老人类食管中的突变和CNLOH。

Notch1 −/−上皮具有最小的表型

a，YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯小鼠被高度诱导并老化11周，使突变细胞完全占据食管上皮。对照组未被诱导YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯老鼠(+/+)。分离食管上皮并测序。b，UMAP图显示了来自每个库的1500个细胞的覆盖(n=每种基因型2只小鼠；+/+1,n= 2,454;+/+2,n= 3,194;−/−1,n= 1,929;−/−2,n= 5,534).c左，UMAP图显示了通过scRNA-seq鉴定的细胞类型。右图，堆积条形图显示了每个库的细胞类型比例。不可用。d，UMAP图显示了来自每个文库的注释为角质细胞的1400个细胞的覆盖(+/+1，n= 1,555;+/+2,n= 1,932;−/−1,n= 1,403;−/−2,n= 3,919).Milo测试显示通过UMAP空间的局部细胞密度没有显著差异(补充说明). e左图为角质细胞的UMAP图。右图，堆积条形图显示了每个库中属于基底层或基底层以上的角质细胞的估计比例(补充说明). f热图显示了角质细胞群体中基底细胞、细胞周期和分化的代表性标记基因的Seurat加工表达值，如图所示g(参考中的标记列表。32).细胞群分为三种不同的细胞状态:循环基础细胞、静止基础细胞和分化细胞。g，基于通过莱顿算法的修拉分析管道的代表细胞群的角质细胞的UMAP图。h角质形成细胞的UMAP图，显示了循环基础(橙色)、静止基础(绿色)和分化(紫色)细胞状态，基于在中进行的聚类和分化标记分析f和g. i堆积条形图显示了每个库中每个细胞状态(上条形图)和每个簇(下条形图)的角质细胞比例。见补充表格16.

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为了验证scRNA-seq的发现，我们进行了细胞追踪分析。老鼠和Notch1−/−在收集之前，分别在48小时和1小时向食管上皮细胞和同窝仔对照注射EdU和5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU )(扩展数据图。7l).EdU染色揭示了随后48小时内S期细胞的命运，BrdU+细胞目前处于S期。还对细胞进行了磷酸组蛋白H3 (pHH3)染色，这是一种G2/M期标记物(扩展数据图。7m).基底上EdU的比率+:EdU总计+反映分化细胞的产生及其分层的细胞，BrdU的比例+基底细胞和pHH3的百分比+，BrdU−野生型的基底细胞都是相似的Notch1−/−上皮，与scRNA-seq结果一致(扩展数据图。7n–r，补充表17和补充说明).

我们还检查了诱导的上皮细胞YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯年龄为52周的小鼠和对照同窝出生的小鼠。在两种基因型中，组织厚度、基底细胞密度和分化标记KRT14、KRT4和LOR以及增殖标记Ki67的表达是相似的。5a–d和补充表格18).脉冲标记和edu 48小时的短期谱系追踪证实，在S期细胞的比例或分化细胞的分层方面，分别在以下两者之间没有显著差异Notch1−/−和野生型食管(图5e–h).

a,未诱导的YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯用DEN和SOR处理小鼠。治疗后28周收集组织。从下层粘膜下层切下肿瘤，将正常上皮切成2 mm的网格阵列2靶向测序前的样本。比例尺，1毫米b，数量Notch1每个氨基酸的突变由正常网格活检(上图)和肿瘤(下图)中的NOTCH1蛋白结构域绘制Notch1野生型小鼠(正常，n=来自6只小鼠的115份活检；肿瘤，n=来自7只小鼠的17份活检)。结构域:EGF样重复序列，LNR，HD，TM，跨膜，RAM，RBP-J相关模块，ANK，锚蛋白重复序列，TAD，反式-激活域，害虫，富含脯氨酸，谷氨酸，丝氨酸和苏氨酸。c，dN/dS比率为Notch1突变(上图)和比例Notch1正常上皮中的突变组织(紫色条) (n=来自6只小鼠的115个活组织检查)和肿瘤(n=来自7只小鼠的17份活检)。双尾的PdN/dS比值的似然比检验2. d，代表NOTCH1(品红色)和KRT14染色(绿色)在肿瘤和周围组织中，DNA是蓝色的。六只动物的10个肿瘤的典型图像。白色虚线描绘了肿瘤与邻近正常组织的区别。比例尺，250米e，缺口比例1+来自相同对照动物的正常上皮和肿瘤中的染色区域(每个点代表一只小鼠，n=来自四只小鼠的40个肿瘤)。双尾配对学生的t测试。f的代表性图像显示了与正常邻近组织相比，肿瘤内角质形成细胞(KRT14，绿色)中的细胞核NICD1(洋红色)。DNA是蓝色的。六只动物的10个肿瘤的典型图像。比例尺，25米g，KRT14的比例+在相同切片中肿瘤和周围上皮中具有细胞核NICD1染色的角质细胞(每个点代表一个肿瘤，n=来自六只小鼠的10个肿瘤)。双尾配对学生的t测试。见补充表格19–23.

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正常上皮含有高密度的携带改变蛋白质突变的克隆。为了确定哪些基因具有克隆优势，我们计算了每个基因中沉默突变与蛋白改变突变的比率，dN/dS3,34。dN/dS比显著高于1的正选择突变基因(q < 0.05) were the Notch pathway genes 陷波1、陷波2和Adam10，加上Fat1，Trp53和Arid1a，所有这些都是在正常人的食道中选择的Ripk4和丘克(补充表格21)2,21.

在肿瘤中，最普遍的突变基因是已知的小鼠食管肿瘤驱动因子Atp2a2，其在正常上皮中不被选择(扩展数据图。8a、b和补充表格19–22)35,36。蛋白质改变Notch1与邻近上皮相比，突变在肿瘤中受到较弱的选择，并且较不普遍(图。6b，c扩展数据图。8a、b和补充表格19–22).免疫染色证实肿瘤中比正常组织中有更多的细胞对NOTCH1和NICD1染色阳性(图。6d–g和补充表格23).这些发现与人类的观察结果相似，表明Notch1野生型细胞比携带野生型细胞的细胞更容易引发肿瘤Notch1突变2,5.

接下来，我们使用高诱导方案，在食管上皮细胞中删除一个或两个等位基因。YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯和YFPCreNotch1+/flox在洞穴和分类处理前小鼠。未诱导的同窝仔用作对照(图。7a).所有三种基因型的肿瘤密度相似，这表明Notch1不是肿瘤发生所必需的(图。7b，c和补充表格24).然而，2005年的肿瘤明显较小Notch1−/−上皮，其中免疫染色证实了Notch1表达和功能(图。7d–f和补充表格24).分化标记(LOR、ITGA6和KRT14)的免疫染色显示在两种基因型的病变中有多层未分化的角质形成细胞。凋亡标记物(裂解的胱天蛋白酶3)、内皮细胞(CD31)和免疫细胞(CD45)在肿瘤中也相似Notch1−/−和Notch1+/+上皮(图7e，f和扩展数据图。8d，e).CDH1缺失导致肿瘤发生37。肿瘤来自Notch1+/+，但不是Notch1−/−食管显示CDH1表达的局灶性缺失(扩展数据图。8f–h和补充表格24).

a，高度诱导YFPCreNotch1+/flox(+/)和YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯()小鼠或未诱导的对照(+/+)小鼠用DEN和SOR处理并老化28周。为b–d, Notch1+/+, n= 11;Notch1+/− n= 10;Notch1−/−, n= 12.b，每个基因型的代表性食管图像。比例尺，1毫米c每个基因型的肿瘤密度。意思是s.e.m .，每个点代表一只老鼠。单向方差分析；调整过的P来自Tukey多重比较测试的值。d每个基因型的肿瘤面积。平均±标准差，每个点代表一个肿瘤。克鲁斯卡尔-沃利斯试验；调整过的P来自邓恩多重比较测试的值。e,f，肿瘤来自Notch1+/+ (e)和Notch1−/− (f)将上皮切片并染色，用于H&E(左图)、角质细胞祖细胞标志物角蛋白14 (KRT14，绿色)和刻缺蛋白1(品红色)(中图)或角质细胞分化标志物loricorin(LOR，品红色)和祖细胞标志物ITGA6(灰色)和KRT14(绿色)(右图)。DNA是蓝色的。图像代表n= 19个肿瘤来自Notch1+/+和n= 13个肿瘤来自Notch1−/−上皮细胞。比例尺，250米g，未诱导YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯用DEN/SOR处理小鼠(+/+)，并老化9周。在收集前，用抗刻缺蛋白1 NRR1.1E3或CTRL处理小鼠6周。h在对照和抗NRR1.1E3处理的小鼠的食管上皮中，用白色箭头显示了用KRT6a染色(红色)标记的代表性肿瘤。比例尺:100米i肿瘤面积的定量(平均值±s . e . m .，每个点代表一个肿瘤，n=每组4只小鼠)。P来自双尾Mann-Whitney检验的值。数据见补充表格24.

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这些观察表明Notch1有利于肿瘤生长。为了测试这一假设，我们用NOTCH1功能封闭抗体(抗NRR1.1E3)治疗野生型小鼠38。该抗体降低了食管上皮中切割的NOTCH1的水平，消除了细胞核NICD1免疫染色，并改变了编码Notch1功能丧失标记(扩展数据图。9a–e扩展数据图。6d和补充表格25).Anti-NRR1.1E3也减少了Notch1−/−克隆诱导中的克隆YFPCreNotch1弗洛克斯/弗洛克斯小鼠通过抑制野生型细胞中的NOTCH1信号传导(扩展数据图。9f–I和补充表格25).给予野生型小鼠DEN和SOR，允许肿瘤发展9周，给予抗NRR1.1E3或对照抗体6周(图。7g).与对照组相比，抗NRR1.1E3显著降低了肿瘤大小，表明NOTCH1信号有利于已建立病变的生长(图。7h，我和补充表格24).

去理解如何Notch1缺失改变了肿瘤的生长，我们对来自Notch1−/−上皮细胞，发现它们有相同的驱动突变，Atp2a2，(6/7肿瘤)，作为肿瘤Notch1+/+上皮(17/17肿瘤)(扩展数据图。8a–c和补充表格20和26)35,36。肿瘤和邻近正常组织的转录组比较显示，在两种基因型的肿瘤中，编码与DNA复制、细胞周期和RNA加工相关的基因的转录本上调，与脂质代谢相关的mrna下调(图。8a–c扩展数据图。10a，b和补充表格27和28).这些变化与报告的影响是一致的Atp2a2角质细胞突变35,36,39,40。肿瘤的比较Notch1+/+和Notch1−/−上皮细胞显示DNA复制和细胞周期相关转录物在Notch1−/−肿瘤(图8d–f扩展数据图。10c，d和补充表格29和30).此外，KRT14中表达pHH3和CCNB1的循环细胞的比例+肿瘤中的细胞减少Notch1−/−与…相比Notch1+/+食道(图8g，高扩展数据图。10e，f和补充表格24).最后，当RAS/MEK/ERK信号通路被激活时Atp2a2突变细胞，我们测量了磷酸化ERK1/ERK2和总ERK1/ERK2染色，发现前者在肿瘤中显著减少。Notch1−/−与…相比Notch1+/+上皮(图8i，j和补充表格24)36,40。这些发现与突变体下游信号减弱一致Atp2a2在肿瘤细胞中缺乏Notch1(图。8k).

一旦一个地区成为了比尔利的殖民地Notch1突变体，突变细胞的表型回复到野生型细胞的表型。尽管NOTCH1信号在大多数组织中被破坏，但这种向接近正常细胞状态的逆转解释了老年人食管上皮的正常外观。

在…里Atp2a2突变肿瘤，将细胞分裂与分化细胞从基底细胞层的出口联系起来以维持细胞稳态的约束不起作用。在这种情况下，细胞分裂越快，病变扩张越快。作为损失Notch1减缓细胞分裂速度，Notch1−/−病变比野生型肿瘤小(图。8k).

这些发现可能与人类相关吗？超过90%的人食管鳞状细胞癌(ESCC)保留一个或多个野生型拷贝NOTCH1而是从高比例细胞具有双等位基因的上皮发育而来NOTCH1破坏，争论野生型NOTCH1支持ESCC的发展。有双等位基因的ESCC子集呢NOTCH1颠覆？5一种可能性是NOTCH1缺失，与其他多种基因组改变相关，在这些情况下促进转化。或者，看似合理的是NOTCH1这些肿瘤的改变是“过客”,是从正常组织带过来的，需要野生型NOTCH1在致癌过程中被其他基因组变化所忽略。