摘要 多梳抑制复合物2 (PRC2)组蛋白甲基转移酶EZH2的抑制剂已被批准用于某些癌症，但实现其更广泛的效用取决于对每个癌症系统中PRC2生物学的了解。使用基因模型来删除 Ezh2 在KRAS驱动的肺腺癌中，我们观察到 Ezh2 单倍体不足的肿瘤致死率较低，级别较低 Ezh2 完全不足的肿瘤，其分化差且转移。利用三维培养和体内实验，我们确定EZH2缺陷型肿瘤易受H3K27去甲基化酶或BET抑制剂的影响。PRC2缺失/抑制导致FOXP2的去阻遏，foxp 2是一种促进迁移和干细胞的转录因子 FOXP2 可以通过更好抑制来抑制。低分化人类肺癌富含h3k 27 me 3-低状态，代表一种亚型，其可能受益于作为单一疗法的BET抑制或与额外的EZH2抑制组合。这些数据强调了PRC2在KRAS驱动的肺腺癌中的不同作用，并证明了三维培养在探索癌症表观遗传药物敏感性中的效用。
介绍 zeste同源物2 (EZH2)的增强子，多梳抑制复合物2 (PRC2)的酶组分，最著名的是组蛋白H3在赖氨酸27位的三甲基化(命名为H3K27me3)以沉默染色质区域 1 。PRC2在胚胎发育和细胞特性的维持中起关键作用，并可能在不同情况下作为癌基因或肿瘤抑制因子 2 。与致癌作用相适应，肺中的高EZH2表达是致癌的，驱动对EZH2的药物抑制的敏感性 3 并且与更差的肺癌预后相关 4 ,5 。然而，已经广泛观察到EZH2与H3K27me3水平的去耦 6 ,7 ,8 ,9 ，表明高EZH2不一定转化为高水平的PRC2催化功能。根据PRC2的抗肿瘤功能，删除PRC2成分 弹性能量密度(Elastic Energy Density) KRAS恶性肿瘤的增加+/ Trp53- 无效的肺癌，驱动侵袭性粘液性肿瘤，并改变肿瘤免疫微环境 10 ,11 。同样，删除 Ezh2 在致癌的KRAS和完整的背景下 Trp53 引发了侵袭性肺癌并加剧了免疫细胞的浸润 12
最近，EZH2催化活性的抑制剂他泽美司他(EPZ6438)被批准用于治疗晚期上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤 13 ，许多临床和临床前试验都集中在EZH2抑制剂与其他药物的联合应用上。EZH2抑制的一个结果是免疫细胞微环境的显著变化，这是当前药物组合的一个焦点 11 ,14 ,15 。其他努力集中在确定与低PRC2活性相关的表观遗传脆弱性。例如，当与MAPK/ERK激酶(MEK)抑制结合时，PRC2缺陷的恶性外周神经鞘肿瘤对H3K27ac-reader溴域和末端外基序(BET)蛋白的抑制敏感 16 。类似地，弥漫性内在脑桥胶质瘤中的H3K27M突变易于对药物JQ1的EZH2抑制和BET抑制敏感 17 ,18 ,19 。最后，GSK-J4抑制组蛋白去甲基化酶并稳定H3K27me3，抑制耐药肺癌细胞和来源于乳腺球的乳腺癌干细胞，两者都含有减少的H3K27me3 20 ,21 ,22 。尽管这些研究表明PRC2缺失可能与其他表观遗传药物协同作用，但这一观点尚未在肺癌中得到验证。
除了通过表观遗传机制控制基因表达外，转录因子还是重要细胞表型的主要调节因子，包括干细胞、增殖和迁移 23 ,24 。叉头盒蛋白P2 (FOXP2)是FOX转录因子家族的成员，共享保守的叉头或“翼螺旋”DNA结合结构域 25 。除了其在语言发育中的作用，已知FOXP2还在发育中的胚胎肺中表达，并可用于标记诱导多能干细胞衍生的肺泡肺祖细胞 26 ,27 。击倒 Foxp2 在小鼠模型中导致出生后肺泡化缺陷 28 。在成人中，FOXP2在远端肺上皮中表达并抑制肺细胞分化基因 29 ,30 。尽管有线索提示FOXP2在维持肺上皮干细胞中的重要性，但它在肺腺癌中的作用仍有待探索。
结果 Ezh2 在KRAS，单倍体和完全性功能不全导致不同的表型+/ Trp53 -无肺癌 我们创造了LSL: 克拉斯 G12D/+ ；Trp53 弗洛克斯/弗洛克斯 (LSL: lox-stop-lox)具有零个、一个或两个固定等位基因的基因工程小鼠模型 Ezh2 和通过鼻内给予腺病毒(AdCre)病毒诱导的原位肺肿瘤(图。 1a ).我们分析了由此产生的KRAS+/ Trp53 -在不同的时间点无肺部肿瘤。具有一个固定等位基因的小鼠 Ezh2 (Ezh2 杂合子；∈/+)的肿瘤负荷显著低于 Ezh2 野生型(WT)小鼠(图。 1b，c 和补充图。 1a ).相反，有两个固定等位基因的老鼠 Ezh2 (Ezh2 null，∏/∏)的肿瘤负荷明显较高，生存期明显较短，细胞核分级明显较高 Ezh2 野生型或杂合子肿瘤(图。 1d，e ).引人注目的是， Ezh2 无效肿瘤细胞转移到包括淋巴结、胸膜腔、胸壁、膈肌和肝脏的区域的倾向明显高于 Ezh2 野生型或杂合子肿瘤细胞(图。 1f ).免疫组织化学(IHC)染色显示 Ezh2 无效肿瘤细胞的EZH2表达显著低于 Ezh2 WT，还有那个 Ezh2 杂合细胞具有中等水平的EZH2表达(图。 第一代 和补充图。 1b，c ).证实了PRC2活性在 Ezh2 无效肿瘤缺乏，H3K27me3染色明显低于 Ezh2 无效肿瘤比其他两种基因型(补充图。 1d ).不像 弹性能量密度(Elastic Energy Density) 无效肿瘤， Ezh2 无效肿瘤具有罕见的阿辛蓝(粘蛋白)染色区域，但有时显示更多的胶原染色，与上皮-间质(EMT)表型一致(补充图。 1e
图1: Ezh2 在KRAS，单倍体和完全性功能不全导致不同的表型+/ Trp53 -无肺癌。 a LoxP介导的缺失示意图 Ezh2 以产生EZH2 WT、杂合的和纯合的无效KRAS /tr p53-空 吉姆斯。 b 在相同时间点诱导并处死的近亲小鼠的肺的代表性H&E染色横截面，比例尺= 5 mm c 腺样体切除术后不同时间点相对于全肺的肿瘤负荷，以平均值+/-SEM表示。*表示 P = 0.0461 Ezh2 WT对空频段2， P = 0.028容器3， P = 0.0437 Bin 4，**表示 P = 0.005，***表示 P = 0.0001 Ezh2 通过带有多重比较的单因素方差分析确定杂合子与空值。箱子1 n = 4，9，6，容器2 n = 10，10，9，容器3 n = 11，14，6，容器4 n = 9，11，9 for Ezh2 WT、杂合、无效个体小鼠。d 指定基因型小鼠的存活率。*表示 P = 0.0376 Ezh2 WT与 Ezh2 杂合的，***表明 P = 0.0003 Ezh2 杂合子vs。 Ezh2 空，而*表示 P = 0.0397 Ezh2 WT与 Ezh2 通过对数秩检验为空。 n = 8，18，18 for Ezh2 WT、杂合、无效个体小鼠。e 由不知情的病理学家对切片组织进行核等级评分，并以平均值+/-SEM表示。*表示 P < 0.042 by one-way ANOVA with multiple comparisons, n = 6，9，8 for Ezh2 WT、杂合、无效个体小鼠。f 在肿瘤诱导后的第91-133天，通过大体检查和组织学对指定基因型的小鼠进行评分，确定其是否有转移(Met ),并绘制百分比。*表示 P = 0.012，**表示 P 费希尔精确检验= 0.0024。 n = 30，36，25 for Ezh2 WT、杂合、无效个体小鼠。g 用H&E、EZH2或H3K27me3染色的肿瘤切片的代表性图像，比例尺= 100 m。 n = 26个或更多的单个小鼠肿瘤切片被染色，数据总结在补充图中。1a、b、d 。基因型表示为:WT，+/+；杂合子，∈/+；null，∈/∈。本图提供了源数据。
为了进一步了解免疫微环境中的作用机制，我们对含有免疫细胞的大量肿瘤组织进行了RNA测序(RNA-seq)。我们首先利用了定时器2.0 31 ,32 并且特别使用了CIBERSORT算法 33 来估计免疫细胞的数量。 Ezh2 杂合子肿瘤比其他两种肿瘤含有明显更多的肿瘤浸润性CD8+ T细胞 Ezh2 基因型，单核细胞明显多于 Ezh2 WT肿瘤(补充图。 1f ).基因组富集分析(GSEA) 34 证明了 Ezh2 杂合子肿瘤的冷肿瘤基因标记明显较少富集，但淋巴细胞标记富集，表明存在抗肿瘤免疫微环境(补充图。 第一代 和补充表格 1 ).我们接下来使用HALO人工智能软件来分析免疫细胞浸润(补充图。 1h ).分析显示 Ezh2 与对照组相比，杂合子肿瘤具有明显更多的肿瘤相关淋巴细胞/单核细胞 Ezh2 无效肿瘤(补充图。 1i ).我们经IHC证实 Ezh2 与其他两种基因型相比，杂合子肿瘤具有显著更高的CD3+ T细胞浸润(补充图。 1j，k ).总体而言，这些数据表明 Ezh2 在KRAS产生不同的表型结果+/ Trp53 -无效的肺腺癌，完全不足驱动更具侵袭性和转移性的肿瘤，而部分不足产生抗肿瘤免疫微环境。
模型系统在细胞周期和基因表达方面不同 接下来，我们的目的是了解作为体内肿瘤表型基础的表观遗传学和转录差异，但在此之前，我们表征了可用于此目的的四种模型系统:(1)易于生长和操作的肿瘤衍生2D细胞系；(Matrigel transwells中的3D肿瘤样细胞，其可以扩增，但不如2D细胞容易；(3)代表体内肿瘤细胞的新鲜分选的肿瘤细胞，但是难以大量获得(补充图。 2a );和(4)含有大量基质细胞类型的全部(大块)肿瘤。与以前的报告一致 10 ，2D Ezh2 与2D相比，空培养物显示出更多拉长的间充质样细胞 Ezh2 WT培养物，而在3D肿瘤样和体内肿瘤的横截面中，间充质表型不太明显(图。 2a ).确认2D的急救人员 Ezh2 空细胞，我们进行了跨孔迁移试验，并观察到明显更多的迁移。 Ezh2 空单元格比 Ezh2 WT电池(补充图。 2b ).正如所料，我们观察到在2D和3D状态下， Ezh2 空细胞表达较低水平的 Ezh2 比其他两种基因型(补充图。 2c ).确认切除 Ezh2 基因，我们使用的是 Ezh2 验证野生型、完整固定型和切除固定型的基因组DNA Ezh2 具有相应基因型的肿瘤样中的等位基因(补充图。 2d
图2:模型系统在细胞周期和基因表达方面不同。 a 指示的体内肿瘤组织学、体外3D肿瘤球体组织学和2D细胞培养的代表性图像 Ezh2 基因型，比例尺= 100 m n =对每个基因型和培养系统检查3个或更多个小鼠肿瘤衍生培养物。b 使用来自PC3分析的最高加载基因的样品间相关性热图，其中皮尔逊相关性由样品间信息和样品间一致性加权(参见“方法”)。然后将1相关值用作分层聚类的伪距离，并使用dendsort的默认参数进行排序。 n = 17，13，20，21，分别用于总肿瘤、分类肿瘤、2D细胞培养物、3D肿瘤样个体小鼠肿瘤衍生样品。c 针对MSigDB数据库查询排序基因列表，并绘制2D、3D或体内分类肿瘤的选定基因签名的富集分数。点大小反映FDR估计值。数据见补充表格 3 . d 通过7AAD细胞周期流式细胞术在2D细胞和所示的3D肿瘤样中测量每个细胞周期阶段的细胞百分比 Ezh2 基因型以平均值+/-SEM绘制。*表示 P < 0.035, ** indicates P < 0.009, *** indicates P < 0.0009 by one-way ANOVA with multiple comparisons and Holm–Šídák’s post hoc test for comparing genotypes within culture system, and by two-tailed t 比较两个培养系统中相同基因型的试验。2D: n = 4, 3, 4;3D: n = 3，4，3 for Ezh2 WT、杂合、无效的单个小鼠肿瘤衍生培养物。e 通过免疫印迹检测2D细胞和3D肿瘤样物中所示蛋白质的表达。 f 通过免疫印迹检测2D细胞和3D培养物中所示蛋白质的标准化蛋白质丰度。****表示 P = 0.0000086，适用于2D的pH3与3D和* P = 0.024，而所有地区为3D Ezh2 双尾组合基因型 t 测试。 n =每个基因型/培养系统2个单独的小鼠肿瘤衍生培养物。基因型表示为:WT，+/+；杂合子，∈/+；null，∈/∈。本图提供了源数据。
为了理解每个模型系统中的转录情况，我们比较了四个模型(独立于 Ezh2 基因型)。使用从加权相关性导出的距离对样品进行无监督的分级聚类，结果显示2D细胞系形成了其自身的聚类，该聚类与所有其他样品不同，而体内样品紧密地聚类在一起，并且肿瘤样在体内和2D样品之间聚类，无论 Ezh2 表型(图 2b ).对所有样本进行的主成分(PC)分析确定，PC3显示了2D样本远离其他三组的分层(补充图。 2e ).该PC富含与上皮细胞增殖、肺发育、伤口愈合、细胞间相互作用和免疫反应相关的基因(补充表 2 ).类似地，GSEA研究表明，与2D培养物相比，肿瘤样细胞和分选的肿瘤细胞富含与免疫和肺谱系确定相关的转录信号，而2D细胞富含细胞周期基因信号(图。 2c 和补充表格 3 ).
为了从功能上验证细胞周期的差异，我们接下来比较了2D细胞系和3D肿瘤样细胞的细胞周期曲线，发现它们有显著的不同。与3D肿瘤样相比，2D培养显示更高百分比的S期细胞和更低百分比的G0/G1细胞 Ezh2 基因型(图。 2d ).有趣的是， Ezh2 杂合子肿瘤样细胞的G0/G1增加，而 Ezh2 与两者相比，空瘤样细胞具有更多的G2/M期 Ezh2 重量和 Ezh2 杂合子，与单等位基因缺失相比G0/G1更少。这些结果可能部分解释了由 Ezh2 体内杂合子和纯合子缺失。与细胞周期结果一致，2D培养物的增殖细胞核抗原(PCNA)和磷酸H3水平明显高于肿瘤样细胞(图。 2e，f ).有趣的是， Ezh2 无效肿瘤样表达的PCNA水平明显高于 Ezh2 野生型和杂合型肿瘤样，而所有2D细胞表达的PCNA水平相当。这些数据证明了培养系统中转录状态和生长模式的关键差异，在设计和测试新的治疗策略时应该考虑这些差异。
Ezh2 在不同模型中，缺陷导致pr C2-染色质占据率降低和基因表达差异为了进一步研究的分子后果 Ezh2 在体外和体内，我们使用RNA测序来研究基因表达的差异 Ezh2 每个模型系统中的基因型(补充图。 2f ).GSEA比较 Ezh2 对...无效 Ezh2 WT细胞，或 Ezh2 对...无效 Ezh2 杂合细胞证明了不同系统中PRC2介导的基因调控的复杂程度(图。 3a 和补充表格 4 ).比较时 Ezh2 对...无效 Ezh2 WT细胞，多梳靶向基因， HOX 基因、EMT和免疫相关信号都在 Ezh2 无效的2D文化。相比之下，许多相同的签名在 Ezh2 WT(耗尽于 Ezh2 空)在分选的细胞和肿瘤样中。这些结果表明，与2D细胞相比，肿瘤样细胞更忠实地再现了体内样品的基因表达模式。有趣的是，多梳靶基因在两种细胞中更均匀地富集(表达) Ezh2 空和 Ezh2 WT细胞与 Ezh2 杂合细胞，包括分选细胞和肿瘤样细胞(补充图。 3a ).这个结果表明 Ezh2 杂合子肿瘤可能具有稳定的典型PRC2活性，而不是部分丧失，这与组蛋白甲基化相关的基因，包括多梳复合物基因，在正常细胞中高度富集的观察结果是一致的 Ezh2 与其他两种基因型相比，杂合子细胞。最后，相对于 Ezh2 无效肿瘤样， Ezh2 杂合子肿瘤样有丰富的免疫基因标记，主要涉及I型干扰素反应途径，这表明 Ezh2 杂合细胞可能具有损伤相关分子模式(DAMPs)和STING信号的过度激活 35 .
图3: Ezh2 缺陷导致不同模型的基因表达差异。a 根据MSigDB数据库查询排序基因列表，并在 Ezh2 null或 Ezh2 杂合子相比 Ezh2 标绘了所示模型的WT。Dots大小估计FDR。数据汇总在补充表格中 4 . b 文氏图和热图描述了在下列基因中显著差异表达的基因 Ezh2 指定培养系统的空细胞与野生型细胞，对数倍数变化LFC > 0.5或LFC < 0.5，FDR < 0.05。基因更高 Ezh2 红色表示空值，较低的基因表示 Ezh2 空值用蓝色表示。热图描绘了由所示对比确定的选定基因的LFC。 c EZH2和H3K27me3结合的染色质峰的热图表现集中在一个5kb的窗口，显示 Ezh2 杂合的， Ezh2 空，并经过EPZ6438处理 Ezh2 WT小鼠肿瘤球状体与 Ezh2 重量 d 文氏图显示在FDR < E-10时SICER对所示基因显著调用的EZH2和H3K27me3峰 Ezh2 基因型或EZH2抑制剂处理的类器官。 e 描绘小鼠3D类器官芯片-seq样品的H3K27me3峰的大型分析热图，其富含所示的基因组。数据汇总在补充表格中 6 . f 维恩图显示了来自( b )中发现的H3K27me3芯片峰 Ezh2 WT肿瘤样物质减少了两倍以上或不存在 Ezh2 无效肿瘤样，带有 Foxp2 表示为共享基因。基因型表示为:WT，+/+；杂合子，∈/+；null，∈/∈。本图提供了源数据。
接下来，我们研究了这些基因之间的显著差异表达基因(DEGs) Ezh2 空和 Ezh2 不同系统中的WT细胞(图。 3b ).与GSEA一致， Hox 基因在2005年上调 Ezh2 没有2D细胞，但是 Hox 基因在肿瘤样和分类肿瘤中不表达。在肿瘤样中，与肺细胞分化相关的基因 Spdef , Muc5ac , 灯3 ，以及 Trp63 受到不同程度的调节 Ezh2 无效细胞，而许多相同的基因在2D细胞系中表达太低而无法评估。我们仔细检查了肿瘤样和分类肿瘤中显著上调的7个基因 Ezh2 空单元格。在这些基因中，叉头盒蛋白2( Foxp2 )编码一种对胚胎肺发育至关重要的转录因子 Ezh2 无效肿瘤样物和体内分类肿瘤 Ezh2 WT对应。
为了了解PRC2缺陷细胞的染色质占据情况，我们对EZH2进行了染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)。 Ezh2 野生型和杂合型肿瘤样，以及H3K27me3在 Ezh2 WT、杂合、无效和EPZ6438处理的WT肿瘤样物质。染色质峰的分析显示EZH2的占用率在 Ezh2 杂合的和 Ezh2 WT肿瘤样，而H3K27me3在 Ezh2 杂合性肿瘤样病变占同期肿瘤样病变的75% Ezh2 WT肿瘤样物质(图 3c 和补充图。 3b–d ).在…里 Ezh2 无效肿瘤样，H3K27me3峰是Ezh2 WT样品的13%,并且在EPZ6438处理中几乎完全耗尽 Ezh2 WT肿瘤样。有趣的是，尽管EZH2峰的数量相似 Ezh2 WT和杂合细胞，只有45%的峰在基因型之间共享(图。 三维（three dimension的缩写） ).类似地，有大量的H3K27me3峰是两者所独有的 Ezh2 重量和 Ezh2 杂合子细胞。然而，大多数H3K27me3峰保留在 Ezh2 在另外两种基因型中也发现了无效细胞，它们对应于编码主转录因子基因家族的基因，包括 Hox , 短袜 和 Nkx 家庭(补充表 5 和补充图。 3e ).对H3K27me3结合区域的进一步分析显示，大多数峰保留在 Ezh2 null和EZH2抑制剂处理的肿瘤样物位于基因启动子区域，而其他基因组位置的峰丢失，表明细胞中残留的少量H3K27me3优先保留在启动子区域，以最好地控制基因表达(补充图。 3f ).伟大的分析显示，虽然 Ezh2 杂合细胞在多梳靶标基因上具有较低的EZH2富集，它们在多梳靶标上保留H3K27me3(图。 3e 和补充表格 6 ).相对于 Ezh2 WT， Ezh2 杂合子肿瘤样显示与DNA损伤修复、干细胞和细胞周期相关的EZH2基因的富集增加，尽管这些相同的基因标记在H3K27me3富集中仅适度增加。最后，我们检查了H3K27me3峰 Ezh2 WT和无效肿瘤样，并发现32%的我们先前确定的deg的峰值在 Ezh2 空单元，包括排序单元和3D单元之间共享的所有七个deg，特别是， Foxp2 (图。 3f 和补充图。 3g
PRC2活性的丧失导致正常和恶性肺细胞中FOXP2表达增加 鉴于其在胚胎肺干细胞中的关键作用 26 ,27 接下来，我们寻求表征小鼠样品中FOXP2的表达。首先，我们在mRNA和蛋白质水平上证实了FOXP2在2D和3D细胞中的表达。 Foxp2 在2005年被提升 Ezh2 相对于的空单元格 Ezh2 2D和3D培养物中的WT细胞(图。 4a ).此外， Foxp2 mRNA水平明显高于对照组 Ezh2 零三维肿瘤样比在 Ezh2 无效的2D细胞。FOXP2蛋白在小鼠体内的表达 Ezh2 无效肿瘤样也远远高于 Ezh2 野生型和杂合型肿瘤样细胞和所有2D细胞(图。 4b ).为了使用这种抗体来确认FOXP2的正确条带，我们使用小干扰RNA来抑制foxp 2的转录 Foxp2 ，并观察到仅在75和100 kDa之间的带中有所降低(补充图。 4a、b ).为了测试EZH2/PRC2是否通过其酶活性调节FOXP2的表达，我们在大肠杆菌中重新表达了EZH2 WT和无酶活性的F667I突变体EZH2。 Ezh2 无效的小鼠肿瘤细胞。我们仅在EZH2 WT再表达细胞中观察到FOXP2蛋白表达的显著降低，但在F667I-突变EZH2再表达细胞中没有(图。 4c，d ).为了支持这些体外发现，我们证实了小鼠原发性肿瘤中FOXP2的表达明显高于对照组。 Ezh2 通过免疫染色发现无效肿瘤比其他两种基因型的多(图。 4e ).ChIP-seq显示H3K27me3和EZH2都在 Foxp2 在……里 Ezh2 WT细胞，但这些峰在 Ezh2 无效和EPZ6438处理的肿瘤样物(图。 4f 和补充图。 4c ).ChIP-qPCR也显示了H3K27me3富集的减少 Foxp2 5’转录起始位点(TSS)、调控元件和3’TSS，并显著降低了在对应于 Foxp2 翻译开始地点(ATG) Ezh2 空单元格与 Ezh2 WT(补充图 4d
图PRC2活性丧失驱动力增加 FOXP2 在正常和恶性肺细胞中的表达。 a 的相对表达 Foxp2 小鼠原发性2D肿瘤细胞和3D肿瘤球体中的mRNA Ezh2 基因型以平均值+/-SEM的形式绘制。*表示 P < 0.043 by one-way ANOVA with multiple comparisons and Holm–Šídák’s post hoc test between genotypes and two-tailed t 条件之间的测试。 n =每个基因型/培养系统3个单独的小鼠肿瘤衍生培养物。b FOXP2蛋白在2D细胞和3D肿瘤样细胞中的表达 Ezh2 用免疫印迹法检测基因型。总组蛋白H3与Fig。 2e 。ǂ表示用来自细胞信号技术公司的FOXP2抗体看到的非特异性条带。 c 免疫印迹和 d 中所示蛋白质的标准化丰度 Ezh2 WT， Ezh2 空， Ezh2 WT为空 Ezh2 重新表达(WT)，以及 Ezh2 F667I突变体为空 Ezh2 重新表达(F6771)。量化数据以平均值+/-SEM的形式绘制。*表示 P < 0.0261 by one-way ANOVA with multiple comparisons and Holm–Šídák’s post hoc test. n =来自两种细胞培养物的3个单独的印迹实验。e 在指定基因型的肿瘤中，FOXP2阳性染色的肿瘤细胞核的百分比绘制为盒须图，误差线为最小-最大值，盒界为第25和第75个百分点，中线为中间值。*表示 P = 0.0233，采用多重比较的单因素方差分析和Holm–I dák的事后检验。 n = 29，38，23 for Ezh2 WT、杂合、无效个体小鼠。f H3K27me3芯片的可视化-seq峰富集在增强子和启动子区域 Foxp2 在所示的3D肿瘤球体样本中。 g 的表达 FOXP2 用或不用5 M EPZ6438处理10天的人细胞系HBEC3KT、BEAS2B、BEAS-KP、H460、H2030、A549和H2009中的mRNA以平均值+/-SEM作图。*表示 P < 0.043, ** indicates P < 0.009, *** indicates P = 0.0003乘双尾 t 测试。 n =每个细胞系/条件下3个单独的细胞培养物。h 免疫印迹和 i 用或不用5 M EPZ6438处理10天的人细胞系HBEC3KT、BEAS2B、BEAS-KP、H460、H2030、A549和H2009中所示蛋白质的标准化丰度。顶部的FOXP2组是SIGMA抗体，底部的FOXP2组是细胞信号技术抗体。量化数据以平均值+/-SEM的形式绘制。*表示 P < 0.032, *** indicates P = 0.000778，双尾 t 测试。 n = 4，其中两个单独的印迹实验来自每个细胞系/条件的一个细胞培养物，每个细胞系/条件用两种不同的FOXP2抗体探测。基因型表示为:WT，+/+；杂合子，∈/+；null，∈/∈。本图提供了源数据。
接下来，为了测试EZH2抑制是否会导致 FOXP2 在人类样本中，我们测量了用EPZ6438处理的人类细胞系中FOXP2的表达。EZH2的抑制作用显著增强 FOXP2 人癌细胞系H460、H2030、A549和H2009中的mRNA表达，以及具有额外的 KRAS G12V 和 TP53 R175H 突变(BEAS-KP)(图。 第四代移动通信技术 ).EZH2抑制也上调人类癌细胞系H460、H2030、A549和BEAS-KP中FOXP2的蛋白表达，但不上调永生化上皮细胞系HBEC3KT和BEAS2B中的蛋白表达(图。 4h，我 ).ChIP-qPCR显示在用EPZ6438处理的H460和BEAS-KP细胞中，在FOXP2基因的推定调控位点5’处H3K27me3富集的损失(补充图。 4e，f ).为了理解在鼠细胞中观察到的2D对3D表达差异是否也能在人类细胞中观察到，H460和H2030在两种条件下生长并用EPZ6438处理。虽然EPZ6438能够在两个系统中驱动增加的FOXP2表达，但是3D人类细胞表现出高得多的表达 FOXP2 mRNA水平比他们的2D同行(补充图。 第四代移动通信技术 ).总之，这些数据表明EZH2/PRC2主要通过其EZH2酶活性直接调节FOXP2表达，EZH2的缺失或抑制增加小鼠和人来源的恶性肺细胞中FOXP2的表达。
FOXP2决定肺上皮细胞的干细胞和迁移能力 已经确定FOXP2是肺上皮细胞中PRC2的直接靶点，我们试图了解FOXP2是否能驱动在肺上皮细胞中观察到的表型差异。 Ezh2 无效的肿瘤细胞。我们在两种永生化肺上皮细胞系HBEC3KT和BEAS2B以及两种KRAS驱动细胞系H460和H2030中过表达FOXP2(图。 5a 和补充图。 5a ).当在基质胶培养物中生长时，FOXP2过表达的BEAS2B培养物比对照培养物产生更多且显著更大的类器官(图。 5b ).考虑到转移潜能的增加 Ezh2 无效肿瘤细胞，我们通过transwell迁移试验检测FOXP2过表达是否改变迁移能力。我们观察到，与对照培养物相比，FOXP2过表达培养物对所有受试细胞系的迁移能力显著增加(图。 5c，d ).此外，FOXP2过表达赋予BEAS2B培养物对依托泊苷和卡铂的抗性(补充图。 5b，c )，这与处于更像干细胞状态的细胞相对抵抗化疗的理论相一致 36
图5: FOXP2驱动肺上皮细胞的干细胞和迁移。 a 通过免疫印迹检测用FOXP2慢病毒转导的HBEC3KT、BEAS2B、H460和H2030细胞中的FOXP2蛋白表达。EV是空的矢量控制线。 b 有或没有FOXP2过表达的BEAS2B 3D类器官的平均直径和类器官计数以平均值+/-SEM绘制。*表示 P = 0.034乘双尾 t 测试。 n =每组3个单独的细胞培养物。c 代表性图像，比例尺= 100米，以及 d 在有或没有FOXP2过表达的HBEC3KT、BEAS2B、H460和H2030细胞中，迁移细胞的平均数量标准化为生长率，绘制为平均值+/-SEM。*表示 P < 0.047, ** indicates P = 0.0041乘双尾 t 测试。 n = 3，4，5，5分别为每组HBEC3KT，BEAS2B，H460，H2030单个细胞培养物。e 对照MSigDB数据库查询排序基因列表，并绘制相对于EV系在FOXP2过表达细胞系中富集的所选基因签名的富集分数。点大小估计FDR。数据汇总在补充表格中 7 . f 通过免疫印迹检测用所示小发夹转导的2D H460细胞中的FOXP2蛋白表达，其代表 n =每组一个细胞培养物的4次印迹实验。 shGFP 是对照细胞系。 g 在指定的培养天数，对有或没有FOXP2敲除的2D H460细胞进行结晶紫生长测定，并对平均值+/-SEM作图。**表示 P < 0.0024, *** indicates P < 0.001 shFOXP2 与…相比 shGFP 双尾的 t 测试。 n =每组6个单独的细胞培养物。h 有或没有FOXP2敲除的3D H460球体的平均直径绘制为平均值+/-SEM。***表示 P = 0.000017 shGFP 相对 shFOXP2.1 和 P = 0.00000038 shGFP 相对 。shFOXP2.2 双尾肿瘤样 t 测试。 n =每组6个单独的细胞培养物。i 迁移细胞的平均百分比标准化为 shGFP 相对细胞生长率以平均值+/-SEM表示。***表示 P = 0.000014相比于 shGFP 双尾细胞 t 测试。 n =每组4个单独的细胞培养。j 有或没有FOXP2敲除的H460中迁移细胞的代表性图像。本图提供了源数据。
为了发现FOXP2过表达改变的转录程序，我们对FOXP2过表达和对照培养物进行了RNA测序。GSEA揭示了FOXP2的过度表达驱动了许多与EMT、细胞粘附、TNFα、RAS信号和肺发育相关的基因的转录扩增(图。 5e 和补充表格 7 ).RAS信号富集的发现不是H460和H2030 KRAS突变系所独有的，在HBEC3KT和BEAS2B系中也观察到了。最后，为了将人类细胞系中FOXP2的过度表达与基因表达变化联系起来。 Ezh2 我们检查了零球状体 NDRG4 和 MYCN 在FOXP2过表达或EZH2抑制H460和H2030肿瘤样。 5d，e ).这两个基因在2005年被高度上调 Ezh2 根据编码数据，它们是潜在的PRC2/FOXP2下游基因 37 。在这些培养物中，FOXP2过表达和EZH2抑制的结合导致肿瘤细胞凋亡显著增加。 NDRG4 和 MYCN 与对照培养物相比，证实了这些基因可能受EZH2和FOXP2的调控。接下来，我们测试了FOXP2的减少是否可以减少肺癌的侵袭性表型。在人类细胞系H460、A549和H2009中用两种不同的短发夹敲除FOXP2显著抑制了2D培养中的细胞生长(图。 5f，g 和补充图。 5f–I ).与对照组相比，FOXP2敲除也导致明显更小的3D肿瘤样物 shGFP 在H460培养中(图。 5h ).此外，FOXP2敲除的H460细胞迁移明显少于对照组，表明FOXP2在细胞迁移中的关键作用(图。 5i，j ).总之，这些发现确定了FOXP2在正常和恶性成人肺上皮细胞的干细胞和迁移中以前未被认识到的作用。
多梳缺陷驱动BET和组蛋白去甲基化酶抑制剂敏感性 我们接下来的目标是确定PRC2缺陷型KRAS+/的表观遗传治疗脆弱性 Trp53 -无肺腺癌。我们假设因为 Ezh2 无效肿瘤是最具侵袭性的，稳定H3K27me3或阻止H3K27ac读取的方法可以使异常的表观遗传状态重新正常化，并逆转侵袭性表型。因此，我们集中精力测试组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4和BET抑制剂JQ1(图。 6a ).在2D培养中，半最大抑制(IC 50 )中的值 Ezh2 用GSK-J4或JQ1处理的野生型、杂合型和无效培养物(图。 6b ).然而， Ezh2 无效的肿瘤样物质对GSK-J4或JQ1的敏感性显著高于 Ezh2 WT肿瘤样物质(图 6c 和补充图。 6a Ezh2 杂合子肿瘤样细胞对JQ1同样敏感 Ezh2 空，但对葛兰素史克-J4公司仅适度敏感。2D和三维文化之间缺乏共识，促使我们研究体内药物的脆弱性。将肿瘤样物皮下移植到免疫低下的小鼠上。有趣的是，与3D文化体系相一致的是 Ezh2 与对照组相比，GSK-J4抑制了无效移植物，JQ1治疗显著抑制了无效移植物 Ezh2 WT移植物，而JQ1对 Ezh2 杂合移植物介于其他两种基因型之间(图。 6d 和补充图。 6b
图6:多梳缺陷驱动BET和JMJD3/UTX抑制剂敏感性。 a 描述PRC2缺陷肿瘤中表观遗传状态恢复机制的示意图。 b , c 葛兰素史克-J4(上图)和JQ1(下图)的存活率( b )用药物培养4天后的2D培养物，以平均值+/-SEM作图。葛兰素史克J4公司: n = 7, 7, 7;JQ1 n = 5，6，5 for Ezh2 WT、杂合、无效的单个小鼠肿瘤衍生培养物。c 用药物培养12-14天后的3D肿瘤样物以平均值+/-SEM绘制。葛兰素史克J4公司:*表示 P = 0.0158 Ezh2 WT与 Ezh2 空，* * * * P = 0.0006 Ezh2 野生型或杂合型vs Ezh2 nullJQ1: *表示 P < 0.039 and **P = 0.0084 for Ezh2 WT与 Ezh2 空(低)或 Ezh2 通过带有多重比较的单向方差分析和Holm-ídák的事后分析，比较WT与杂合子(上图)。对于这两种药物， n = 7，5，5 for Ezh2 WT、杂合、无效的单个小鼠肿瘤衍生培养物。d GSK-J4和JQ1治疗组小鼠移植物体积的变化相对于安慰剂治疗组小鼠移植物体积的变化以平均值+/-SEM的形式绘制。***表示 P < 0.0008, **P < 0.0091, *P < 0.0472 for Ezh2 WT与 Ezh2 空(低)或 Ezh2 杂合子vs。 Ezh2 重复测量和多重比较的单向方差分析为空。葛兰素史克J4公司: n = 5, 5, 4;JQ1: n = 5，5，6 for Ezh2 WT、杂合、无效的单个小鼠肿瘤衍生移植物。e 安慰剂或JQ1治疗1周和2周后相对肿瘤体积变化的量化 Ezh2 null或 Ezh2 杂合荷瘤小鼠，**表明 P = 0.0021表示第1周， P = 0.0003对于弱2由双面 t 对log2转换值的测试。 f 小鼠肺部在基线(第0周)和JQ1治疗第1周的代表性磁共振图像 Ezh2 空鼠标。 g 在H2009和BEAS-KP培养物中，EPZ6438与JQ1组合的Bliss协同作用得分的热图。最具协同作用的领域的幸福指数为10.15 (H2009)和10.99 (BEAS-KP)，表明具有协同作用。 n 对于H2009和BEAS-KP单个细胞培养物，分别= 3，4。基因型表示为:WT，+/+；杂合子，∈/+；null，∈/∈。本图提供了源数据。
为了测试JQ1是否可以靶向在天然肺微环境中生长的肿瘤，我们用JQ1治疗原位荷瘤小鼠，并通过磁共振成像(MRI)测量肿瘤体积的变化。七天的JQ1治疗减少了肺部肿瘤结节的体积 Ezh2 无效的和杂合的芽，而安慰剂组的肿瘤继续生长(图。 6e，f 和补充图。 6c ).额外的7天JQ1给药足以将肿瘤维持在退化状态，尽管没有观察到额外的肿瘤负荷减少。为了进一步探索鼠肿瘤药物易感性发现的临床意义，我们研究了几种 KRAS 突变的人类非小细胞肺癌细胞系。EZH2敲除使人类细胞系H2030对JQ1敏感(补充图。 6d，e )，这种致敏作用在3D球体培养中比在H460的2D培养中更明显(补充图)。 6f ).此外，药物基质实验证明了JQ1与EPZ6438在H2009和BEAS-KP细胞中组合时的协同作用(图。 6g
对BET抑制剂的不同反应激发我们探究FOXP2是否参与了EZH2缺陷细胞的这种治疗作用。首先，我们对JQ1处理的3D肿瘤样和皮下移植物进行了RNA测序，结果显示BET抑制导致显著降低 Foxp2 用...表达 Ezh2 空细胞(补充图。 6g c-Myc ，一个经常被JQ1处理改变的基因 38 在JQ1处理的移植物中的表达也显著降低，证实了该药物的疗效。对小鼠3D肿瘤样的RT-qPCR显示 Foxp2 被100 nM JQ1显著抑制 Ezh2 杂合的和无效的肿瘤样细胞，但在 Ezh2 WT肿瘤样(补充图。 6小时 )，这可能解释了基因型之间药物敏感性的差异。在JQ1处理的H2030培养物中， FOXP2 中的水平显著下降 shEZH2 行，但不是在 shGFP 行，再次表明监管 FOXP2 与细胞对JQ1的敏感性增加相关(补充图。 6i ).同样，在EZH2 WT获救时 Ezh2 我们证明无效的肿瘤样物质降低了FOXP2的水平，JQ1的效果明显不如 Ezh2 用保持高水平FOXP2的F677I EZH2突变体重建的无效肿瘤样物(补充图。 6j ).最后，我们观察到过表达FOXP2的H460细胞比对照细胞对JQ1更敏感，而且敏感性的增加在3D培养中比在2D中更明显(补充图。 6k，l ).总之，这些数据表明，在肺腺癌中，PRC2活性降低赋予了对BET抑制和去甲基化酶抑制的敏感性，且FOXP2可能是BET抑制的有希望的靶标。
EZH2与PRC2活性的分离可以解释EZH2和FOXP2在患者样本中的共表达 为了将我们的发现扩展到人类肺癌患者样本，我们在肺癌组织微阵列上对EZH2、H3K27me3和FOXP2进行了免疫组织化学染色。与之前的研究一致 6 ,9 H3K27me3染色在ADC中明显高于SCC，而EZH2则相反(图。 7a ).在ADC样本中FOXP2的表达是可变的，但发现在低分化肿瘤中明显高于其他三组。因为我们使用的小鼠模型是腺癌，并且当 Ezh2 删除后，我们接下来只关注ADC和低分化肺肿瘤。在该队列中，我们观察到，与低分化肿瘤相比，高分化和中分化肿瘤的EZH2明显较低，H3K27me3明显较高，低分化肿瘤的H3K27me3较低，但矛盾的是EZH2水平较高(图。 7b，c ).有趣的是，EZH2表达与FOXP2表达呈强正相关(图。 7d ).在FOXP2阳性的肿瘤中(> 10%的细胞核)，这反映了在一些肿瘤中发现的高表达 Ezh2 杂合子和大多数 Ezh2 在无效肿瘤中，EZH2和H3K27me3之间存在显著的负相关关系(补充图。 7a ).为了研究EZH2/FOXP2表达与患者预后的相关性，我们使用KM绘图仪查询了癌
症基因组图谱中已发表的RNA测序数据 39 在366例肺腺癌样本中。与以前的报告一致，高于 EZH2 在肺腺癌中，表达与显著更差的无复发生存率相关(补充图。 7b ).在我们的组织微阵列中，EZH2表达也与较差的总生存期相关，但重要的是要注意，在我们的数据集中，SCC患者的总生存期明显短于肺ADC患者，这与SCC肿瘤通常具有较高EZH2表达的事实相一致(补充图。 7c，d ).重要的是，更高 FOXP2 表达与诊断后250个月的无复发生存期显著缩短相关(图。 7e
图7:EZH2与PRC2活性的分离可以解释ezh 2和FOXP2在患者样品中的共表达。 a ADC、ADSCC、低分化肿瘤和SCC标本中标记物EZH2、H3K27me3和FOXP2的阳性染色肿瘤细胞核绘制为盒须图，误差线为最小-最大值，盒界为第25和第75百分位，中线为中间值。*表示 P = 0.0164，**表示 P < 0.0084, *** indicates P < 0.0006 by one-way ANOVA with multiple comparisons and Holm–Šídák’s post hoc test. n 对于ADC、ADSCC、低分化和SCC个体肿瘤，分别= 92、24、17、104。b 肺腺癌和低分化癌标本中EZH2和H3K27me3阳性细胞核的百分比。*表示 P < 0.0425, ** indicates P < 0.0086 by one-way ANOVA with multiple comparisons and Holm–Šídák’s post hoc test. n = 13，51，97，分别代表高、中、低分化的个体肿瘤。c 肺腺癌标本的代表性图像被定义为分化良好、中等和低分化，对指示标记进行染色，比例尺= 100 m。染色的肿瘤数量在( b ). d 基于原发性肺癌标本中阳性染色肿瘤细胞核百分比的EZH2和FOXP2相关性。显示了皮尔逊相关系数和p值。 n = 161个个体肿瘤。e Kaplan-Meier无复发生存曲线 FOXP2 -高和 FOXP2 诊断后250个月通过RNA测序测量的低肿瘤；阳性和阴性组由最佳临界值确定。这 P 数值通过对数秩检验计算。 n = 366个个体肿瘤。f , g 2D的免疫印迹( f )H460，A549，BEAS-KP，还有 g Ezh2 用或不用500微米SAM处理WT UK803细胞6天。 h 用或不用500微米SAM处理6天的H460、A549和BEAS-KP细胞中的标准化蛋白质丰度标绘为平均值+/-SEM。*表示 P = 0.012，**表示 P = 0.009，适用于EZH2和 P = 0.0045 for FOXP2 by two-tailed t 测试。 n = 3种不同的细胞系。基因型表示为:WT，+/+；杂合子，∈/+；null，∈/∈。萨姆，S-腺苷蛋氨酸。本图提供了源数据。
鉴于EZH2在NSCLC中很少突变，观察到肿瘤中去耦的一个可能原因是在高增殖性肿瘤中EZH2上调，但甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的可用性有限 10 。为了检验SAM水平影响PRC2稳定性和活性的假设，将500个微米SAM加入到人细胞系H460、A549和BEAS-KP的培养基中6天。正如所料，与对照组相比，这些用SAM处理的人类细胞系具有更高的H3K27me3，有趣的是具有显著更低的EZH2和FOXP2(图。 7f，h ).治疗安 Ezh2 具有SAM的WT鼠2D培养导致EZH2和H3K27me3标记的类似解耦(图。 7g 和补充图。 7e ).总之，EZH2表达与PRC2活性分离，高EZH2、低H3K27me3和高FOXP2模式在低分化晚期肺癌中富集。
讨论 在这里，我们揭示了EZH2杂合性和完全缺陷在调节肿瘤状态中的不被重视的作用，由此 Ezh2 杂合性肿瘤具有较低的肿瘤负荷、较低的细胞核分级和较低的致死率 Ezh2 无效肿瘤。虽然 Ezh2 杂合子肿瘤样细胞的H3K27me3标记减少了25%,它们对典型PRC2靶基因的抑制作用最强，这表明典型PRC2活性的增加，而不是部分缺失，驱动了肿瘤样细胞的生长 Ezh2 杂合表型。这些细胞在细胞周期上也有变化，I型干扰素反应途径增加，并且在体内有大量T细胞浸润，这些机制可以解释为什么肿瘤负荷较低。 Ezh2 杂合子小鼠。相比之下， Ezh2 无效肿瘤更易转移且级别更高。尽管事实上EZH2抑制剂可以在癌症中驱动更具侵袭性的表型，但是由于对肿瘤微环境的影响以及驱动肿瘤细胞的额外治疗脆弱性的能力，EZH2抑制剂仍然可能具有临床实用性。我们数据表明，在KRAS驱动的肺癌中，PRC2缺乏状态，无论是自然发生的还是通过EZH2抑制，可能更容易受到抑制。我们观察到 Ezh2 裸瘤样、皮下移植和原发性肺肿瘤对BET抑制剂JQ1敏感。从机制上讲，我们确定FOXP2是胚胎肺祖细胞的关键调节因子 28 在BET抑制有效的情况下，在H460细胞系中，FOXP2的过表达增加了对JQ1的敏感性。我们证实了FOXP2是恶性肺上皮细胞中PRC2介导的基因沉默的直接靶点，并且FOXP2的强制表达增加了肺上皮细胞的干细胞和迁移。
值得注意的是，我们的药物反应发现和FOXP2的鉴定仅仅是由于使用3D肿瘤样培养物才在体外发现的。我们发现，与3D肿瘤样相比，鼠2D培养物具有极高水平的S期和肺谱系决定相关基因的下调，这显示了肺特异性转录程序的保留。这一发现与3D培养物能够保留其来源的天然组织的更多特征的信念相一致 40 Ezh2 无效基因型，2D细胞系具有明显的去抑制作用 Hox 基因，但是在3D肿瘤球体中， Ezh2 无效细胞能够继续抑制 Hox 基因，而是表现出 Foxp2 。总之，这些发现强调了在癌症研究中使用3D系统进行遗传、表观遗传和药物验证实验的力量。
最后，虽然患者样本中FOXP2和EZH2的共表达似乎与我们小鼠模型的结果相矛盾，但我们相信这些结果是相互支持的。几篇论文，包括我们自己的，已经表明EZH2和它的催化标记H3K27me3在体内呈负相关 6 ,7 ,8 ,9 ,41 ,42 ,43 。这种丰富的EZH2可能是PRC2非依赖性复合物的一部分 44 ,45 ,46 ，或由于各种原因而不能完成组蛋白甲基化(假定的一个原因是缺乏SAM)。因此，高EZH2可指示较低的PRC2功能，我们的小鼠模型和体外数据显示，在KRAS驱动的腺癌中降低PRC2功能的一个结果是去抑制FOXP2。以这种方式，EZH2缺失导致PRC2功能障碍的小鼠模型和EZH2高表明PRC2功能障碍的人类样品匹配。此外，对患者样本RNA测序数据的回顾性分析显示 FOXP2 表达预测显著更短的无复发生存期。我们的数据表明，当SAM丰富时，这可能是分化较好的肿瘤和正常组织的情况，PRC2活性高，EZH2下调。然而，在通常具有低水平H3K27me3的侵袭性肿瘤中 7 ,47 EZH2可能被上调，但由于缺乏可用的SAM而不能发挥其催化功能。未来的研究重点是了解SAM细胞库调节的生理或病理生理代谢机制，特别是在体内，以及这一过程是否可以逆转进行治疗干预。
