NFIB是CARM1底物 为了确定CARM1的底物，我们用以前报道的ADMA抗体免疫沉淀了含ADMA的肽 36 来自蛋白水解消化的CARM1野生型(WT)和敲除(KO)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。用于富集ADMA甲基化肽的两种抗体(D4H5和D6A8)已经显示识别CARM1底物的子集，但是它们也识别PRMT1底物 36 。因此，在本实验中使用CARM1 WT和KO MEFs将有助于我们鉴定CARM1特异性底物。然后通过LC-MS/MS鉴定富含ADMA的肽。总共对1062种含有二甲基化精氨酸的肽进行了编目(补充数据 S1A ).其中，从CARM1 WT中鉴定了270个肽，但没有从KO MEFs中鉴定(图。 1a )，表明这些是CARM1介导的甲基化的位点。
图1:NFIB作为CARM1底物的鉴定。 a 从CARM1野生型(WT)或敲除型( Carm1 −/− )MEFs，并经LC-MS/MS鉴定。 b 从核因子I家族中鉴定出的肽。 c 从CARM1 WT或KO MEFs中免疫沉淀NFIB蛋白，并用抗ADMA (D4H5)或NFIB的抗体进行免疫印迹。 d GFP载体对照、GFP-NFIB-WT或-R388K、GFP-NFIC-WT或-R395K构建体被转染到HeLa细胞中。GFP标记的蛋白质被免疫沉淀并用抗ADMA (D4H5)或GFP的抗体进行免疫印迹。 e 使用NFIBme2a抗体验证NFIB甲基化。分析来自NFIB WT/KO HeLa细胞、CARM1 WT/KO MEFs和用CARM1抑制剂(CARM1i，TP-064)处理的WT MEFs的总细胞裂解物。肌动蛋白显示为加载对照。 f 对来自WT或的细胞裂解物进行IP-MS，一式三份 Carm1 −/− 使用NFIBme2a抗体的MEFs。对所有四种NFI家族蛋白的专有光谱计数进行分析并作图。数据以平均值SEM表示 ；P 由双尾学生t检验确定的值。所有印迹显示为来自三个独立实验的代表性数据。
值得注意的是，所有的核因子I (NFI)家族成员(NFIA、NFIB、NFIC和NFIX)都被鉴定为仅在CARM1 WT MEFs中甲基化，并且它们在甲基化精氨酸位点附近含有保守的氨基酸序列(图。 1b ).该基序富含脯氨酸，这表明CARM1甲基化基序，并且与报道的用于肽富集步骤的D4H5抗体的识别基序一致 10 。NFI肽占CARM1 WT MEFs特有的总肽的约8%，表明它们是CARM1的主要靶标。我们对NFIB的甲基化特别感兴趣，因为两者 Nfib 和 Carm1 基因敲除小鼠在出生前后死亡，原因是类似的肺部发育缺陷 24 ,25 ,37 ,38 。为了证实NFIB在细胞中被CARM1甲基化，我们从CARM1 WT MEFs和CARM1 KO MEFs中免疫沉淀(IPed)了NFIB，并用特异性ADMA抗体(D4H5)通过免疫印迹检测了NFIB的甲基化(图。 1c ).ADMA抗体只从CARM1 WT中检测到IPed NFIB，而没有从CARM1 KO MEFs中检测到。此外，我们还进行了NFIB或NFIB的GFP融合 R388K (其中精氨酸甲基化位点突变为赖氨酸)并将其转染到HeLa细胞中。然后，GFP标记的NFIB蛋白被IPed用于通过Western检测ADMA(图。 1d ).可以观察到野生型的甲基化，但不能观察到突变的NFIB。类似地，当R395突变为赖氨酸时，NFIC的甲基化被消除。
我们也产生了自己的识别NFIB的甲基特异性抗体 R388me2a 主题(补充图。 1a )并产生NFIB KO HeLa细胞以帮助表征该抗体(补充图。 1b ).在来自NFIB WT和KO HeLa细胞、CARM1 WT和KO MEFs以及用载体或特异性CARM1抑制剂处理的WT MEFs的总细胞裂解物上测试这种纯化的抗体(NFIBme2a) 31 (TP-064)。这种NFIBme2a抗体完全依赖于CARM1，因为当CARM1缺乏或被抑制时，它不识别任何蛋白质(图。 1e ).NFIB敲除细胞的Western分析揭示NFIBme2a抗体确实识别除NFIB以外的其他CARM1甲基化蛋白，这些可能是其他NFI家族成员(图。 1e ).确实，质谱。使用我们自己的甲基特异性抗体，对CARM1 WT和KO MEFs进行了一式三份的分析，我们确定了NFI家族成员的强烈富集(图。 1f )，以及许多被认为是CARM1底物的其他蛋白质(补充数据 S1B
CARM1是NFIB的转录辅激活因子 NFIB是一种转录因子，它控制着许多对小细胞肺癌分化、毛囊干细胞行为、雄激素受体信号传导、巨核细胞成熟和神经元发育至关重要的基因的表达 39 。我们感兴趣的是确定CARM1对NFIB的甲基化是否是促进其转录活性的一种方式。为了鉴定直接的NFIB靶基因，我们进行了染色质免疫沉淀，然后测序(ChIP-seq)来检测NFIB结合位点在HeLa细胞基因组中的分布。ChIP-seq使用两种独立的NFIB抗体进行，也使用稳定表达GFP-NFIB的HeLa细胞系上的GFP抗体(补充图。 1c ).通过比较所有3组ChIP-seq数据，我们发现1696个高置信度基因座直接与NFIB结合，我们称之为NFIB YYY (YYY =所有三个Abs都是)(补充图。 1d ).我们还使用识别CARM1沉积的组蛋白H3 r 17m 2 a标记的抗体进行了ChIP-seq实验。虽然这种H3R17me2抗体识别H3上的甲基化位点，但它也与许多其他CARM1底物交叉反应 8 和甲基化NFIB本身(补充图。 1e ).因此，h 3r 17m 2 a芯片峰表示CARM1活性区域，而不一定是h 3r 17m 2 a标记本身。我们发现大约三分之一(523)的NFIB YYY 峰与含有CARM1活性的位点重叠(补充图。 1f 和补充数据 S2 )，代表CARM1调节的候选NFIB结合位点。我们从这组523个峰中选择了6个NFIB结合位点，并通过ChIP-qPCR验证了这种结合(补充图。 第一代 ).为了测试NFIB的甲基化是否影响转录调节，我们比较了野生型NFIB (NFIB-WT)或甲基化缺陷突变体(NFIB-R388K)过度表达时这些选择的基因的mRNA水平。一般来说，NFIB-WT的过表达显著增加了所选基因的mRNA水平，而NFIB-R388K的过表达不促进转录(补充图。 1h ).与这一发现相一致的是，CARM1抑制剂TP-064对NFIB甲基化的抑制也显著抑制了所有选定的NFIB靶基因的表达，除了FERMT1(补充图。 1i ).这些结果表明，CARM1对NFIB的甲基化在调节由该转录因子驱动的基因表达程序中起着重要作用。
TRIM29是甲基化NFIB的效应分子 作为一个转录因子，NFIB在其N-末端包含DNA结合结构域，C-末端区域具有反式激活和抑制活性 40 。NFIB (R388)上的CARM1甲基化位点位于C-末端转录调节结构域，因此这种甲基化可能不会影响NFIB的DNA结合特性。在许多情况下，TFs的翻译后修饰通过促进协同调节转录的效应蛋白的募集来调节它们的激活子/阻遏子功能。因此，我们试图确定NFIB甲基化位点的“解读者”。为此，我们在HeLa细胞中异位表达了GFP标记的NFIB野生型或其R388K突变型。然后，我们使用GFP-Trap亲和方法纯化各自的蛋白质复合物，并通过蛋白水解消化和LC-MS/MS鉴定相互作用的蛋白质(图。 2a 和补充数据 S3 ).我们感兴趣的是识别结合GFP-NFIB但不结合GFP-NFIB的蛋白质 R388K ，因为这些将是CARM1甲基化位点的候选效应蛋白。我们选择了15种蛋白质，它们被GFP-NFIB复合物中的两种或多种肽识别，而在GFP-NFIB中没有肽 R388K 复杂。大多数选择的蛋白质都报道了与转录调节因子相关的功能。将这些效应子候选物克隆到带有标签的表达载体中，并在HeLa细胞中过量表达(在少数情况下，使用市售抗体直接检测到内源蛋白)，然后用DMSO或CARM1抑制剂处理细胞。免疫共沉淀与NFIB相互作用的蛋白质，并检测FLAG标签信号(图。 2b ).TRIM29以CARM1依赖的方式与NFIB相互作用。这种甲基化依赖的相互作用通过体外肽下拉试验得到进一步验证，其中GST标记的TRIM29优先结合甲基化的NFIB肽(图。 2c )，表明这是一种直接的互动。TDRD3是一种甲基化读码器，与许多用ADMA标记的蛋白质结合，包括组蛋白H3和H4、RNA聚合酶II和MED12 9 ,19 ,41 。在这里，我们表明TDRD3也可以结合到NFIB上的CARM1甲基化位点，并且它们可以被共抑制(图。 2c 和补充图。 2a ).因此，甲基化形式的NFIB可能受TRIM29或TDRD3的共同调节，这有待进一步研究。
图2: TRIM29是甲基化NFIB鉴定的效应器。 a 筛选结合野生型但不结合突变型NFIB的蛋白质的工作流程。 b 用指定的转录调节因子转染HEK293T细胞。在CARM1抑制剂存在或不存在的情况下培养细胞。免疫沉淀NFIB蛋白复合物，并使用抗FLAG抗体通过蛋白质印迹测试这些候选物的相关性。 c GST标记的全长TRIM29与生物素标记的未甲基化或甲基化的NFIB肽一起孵育。使用链霉亲和素缀合的珠子进行肽下拉。 d 显示融合到FLAG和GST的TRIM29结构域的方案，用于在( e )和( f ). e 将全长和截短的TRIM29构建体转染入HEK293T细胞。在CARM1抑制剂存在或不存在的情况下培养细胞。NFIB被IPed，并且这些TRIM29突变体的相互作用通过使用抗FLAG抗体的蛋白质印迹来测试。 f GST标记的全长和截短的TRIM29与生物素标记的未甲基化或甲基化的NFIB肽一起孵育。使用链霉亲和素缀合的珠子进行肽下拉。 g ChIP-seq tracks显示NFIB在GFAP基因启动子区域的分布。三种不同的抗体被用于生成轨迹:Abcam抗体、Bethyl抗体和检测异位表达的GFP-NFIB的GST抗体。 h HEK293T细胞用GFAP-luc，连同GFP对照构建体，NFIB-WT，NFIB-R388K，TRIM29，TRIM29加NFIB-WT，或TRIM29加NFIB-R388K共转染。用双荧光素酶法检测荧光素酶活性。相对荧光素酶活性相对于GFP对照标准化。实验以生物三份进行。数据以平均值表示 扫瞄式电子显微镜 ; P 由双尾学生t检验确定的值。 i 将HEK293T细胞与GFP吕克以及GFP对照构建体、NFIB、NFIB加TDRD3或NFIB加TRIM29共转染。用双荧光素酶法检测荧光素酶活性。相对荧光素酶活性相对于GFP对照标准化。实验一式三份。数据以平均值SEM表示； P 由双尾学生t检验确定的值。 j 在H69 SCLC细胞系中通过GFP trap鉴定TRIM29相互作用蛋白，随后进行MS分析，如( a ).来自GFP标记的TRIM29和GFP(对照)的MS分析的高可信度候选相互作用蛋白列表。星号表示先前通过质谱鉴定的TRIM29结合蛋白 42 。所有印迹显示为来自三个独立实验的代表性数据。
接下来，我们绘制了TRIM29与甲基化NFIB直接相互作用的区域。为此，我们生成了TRIM29的四种截短形式(图。 2d )并将这些FLAG标记的蛋白质与内源性NFIB进行共IP。在这个实验中，HeLa细胞也用CARM1抑制剂处理。我们观察到TRIM29的N末端结构域和C末端结构域都与NFIB相互作用(图。 2e ).当NFIB甲基化被抑制时，C端和NFIB之间的相互作用显著降低，而N端和NFIB之间的相互作用保持不变，这表明TRIM29的C端结构域负责甲基化依赖的相互作用。为了证实这一点，使用全长TRIM29的GST融合体、仅C-末端结构域的融合体以及没有C-末端的TRIM29的融合体进行了肽下拉分析(图。 2d ).显然，C-末端结构域特异性地直接与甲基化NFIB相互作用(图。 2f ).使用co-IP分析，我们还表明内源性NFIB和TRIM29相互作用，并且这种相互作用被CARM1抑制剂阻止(补充图。 2b
据报道，TRIM29的C-末端结构域介导与许多蛋白质的相互作用 42 。这个区域是一个孤儿结构域，在其他蛋白质中没有同源区域。为了进一步确定TRIM29作为精氨酸甲基化读码器的特征，我们将TRIM29的C-末端结构域与来自纤维蛋白的甲基化GAR基序一起孵育。TRIM29与具有ADMA标记的原纤维蛋白GAR基序强烈相互作用，但不是SDMA形式(补充图。 2c ).正如所预料的，TDRD3的都铎区显示出与ADMA标记更强的结合，而SMN的都铎区显示出与SDMA标记更强的结合。因此，除了NFIB之外，TRIM29可能结合额外的甲基化蛋白。
TRIM29促进NFIB靶基因的转录 特异性结合精氨酸甲基化转录调节因子的效应物可以影响下游的转录程序 13 ,19 ,43 。GFAP是星形胶质细胞中NFIA和NFIB的一个被充分研究的靶基因 44 ,45 ,46 ，以及通过我们的芯片序列识别的直接NFIB靶。事实上，两种NFIB抗体(Abcam和Bethyl)都表现出GFAP启动子峰，这在异位GFP-NFIB表达时升高(图。 2g ).为了确定TRIM29是否能共同激活NFIB调控的GFAP的表达，我们进行了体外荧光素酶报告基因分析。我们发现TRIM29可以显著促进GFAP启动子驱动的转录。当野生型NFIB过表达TRIM29时，可以看到这种辅激活子活性，但当甲基化缺陷型NFIB突变体过表达时，则看不到(图。 2h ).接下来，我们比较了TRIM29和TDRD3的共激活子活性，因为我们已经证明这两种蛋白都可以作为甲基化NFIB肽的阅读子(图。 2c ).使用GFAP荧光素酶报告基因分析，我们看到TRIM29，而不是TDRD3，与NFIB共同激活该启动子的表达(图。 2i 和补充图。 2d ).因此，我们将注意力集中在TRIM29上，它是甲基化NFIB的一种新型效应分子。接下来，我们证实了TRIM29蛋白在本研究中使用的细胞系中的表达(补充图。 2e )并观察到大多数已鉴定的NFIB调节基因的表达(见补充图。 第一代 )在TRIM29过表达时被促进(补充图。 2f
NFIB的过度表达与小细胞肺癌的晚期肿瘤分期和转移相关 27 ,28 因此，我们假设NFIB的甲基化也可能调控小细胞肺癌的进展。由于上述机制研究是在HeLa和HEK293T细胞中进行的，我们试图证实SCLC细胞中NFIB/TRIM29的相互作用。为此，我们在H69 SCLC细胞系中用GFP-TRIM29进行了GFP-trap实验，发现排名第一的结合蛋白是NFIB(图。 2j 和补充数据 第四心音 ).因此，在HeLa和H69细胞系中的相互GFP-trap实验确定了NFIB/TRIM29相互作用(图。 2a，j
体内小细胞肺癌的肿瘤生长需要CARM1介导的NFIB甲基化 我们通过对人类肿瘤样本进行CARM1、NFIB和NFIBme2a的免疫染色，检测了小细胞肺癌中的CARM1-NFIB调节模块。我们发现高水平的CARM1和NFIB是不良患者存活率的独立预测因子(图。 3a )和CARM1的组合 高的 /NFIB 高的 预测更差的存活率(图。 3a ).接下来，我们分析了从 将军澳 携带三种肿瘤抑制因子的条件性敲除的SCLC小鼠模型( Rb1，Rbl2，Trp53 )47 通常在人类癌症中突变。我们观察到随着癌症进展为恶性疾病，CARM1、NFIB和NFIBme2a的水平增加(图。 3b ).此外，我们注意到NFIB表达与人SCLC细胞系对CARM1抑制剂(CARM1i，TP-064)的敏感性相关(补充图。 3a ).为了研究CARM1的酶活性在驱动SCLC发展中的重要性，我们使用修饰的H69进行了异种移植(图。 3c–f )和CORL47(补充图。 3b，c )细胞。这些细胞包含CRISPR介导的CARM1敲除，并用WT或酶失活(R168A) CARM1拯救。当CARM1被切除时，肿瘤体积显著受损，当KO细胞补充突变CARM1时，这种表型没有得到挽救(图。 3c，d 和补充图。 3b ).我们的结果表明NFIB的CARM1甲基化与小细胞肺癌的发生有关。因此，我们想独立测试NFIB R388甲基化在癌症扩展调节中的作用。NFIB的消耗导致体内SCLC H69细胞的生长减弱(图。 3e、f ).与野生型NFIB的互补，而不是含有R388K取代的NFIB，能够完全恢复体内的癌性生长(图。 3e、f 和补充图。 3c ).我们进一步证实，CARM1i现象复制了H69和CORL47细胞中CARM1的基因切除和NFIB甲基化，并且抑制剂对癌细胞生长没有非特异性作用(补充图。 3d，e ).类似于CARM1的遗传或药理学抑制和NFIB甲基化的去除，我们观察到TRIM29缺失后SCLC细胞的致瘤能力降低(补充图。 3f，g ).总之，这些数据表明，CARM1通过NFIB R388的甲基化和随后甲基化阅读器TRIM29的募集来调节SCLC肿瘤生长。
图3: CARM1介导的NFIB在K388的甲基化促进了小细胞肺癌的发病。 a CARM1和NFIB的高表达预示着小细胞肺癌患者的低存活率。CARM1和NFIB小细胞肺癌组织芯片IHC分析。 P 对数秩检验值， n = 32 (16 ♂ / 16 ♀，无性别差异)。 b CARM1、NFIB和NFIB的免疫印迹分析 R388me2a 在来自SCLC小鼠模型的三个独立且有代表性的组织活检裂解物(分析的六个)中( 将军澳 )在具有非转移性和转移性疾病的肿瘤发生的早期和晚期。 c H69 SCLC细胞在经修饰以表达sgRNA CARM1或sgRNA对照并过表达WT或催化缺陷型R168A CARM1( n = 5; P 采用Tukey多重比较检验的双向ANOVA得出的值，数据代表平均值SEM)。 d 用细胞裂解物的指示抗体进行免疫印迹，如在( c ). e sgRNA NFIB缺失的H69 SCLC细胞与野生型或R388K突变型NFIB的互补作用表明，NFIB甲基化是SCLC细胞体内生长所必需的( n = 5; P 在中确定的值( c )).sgControl是指( c ). f 用细胞裂解物的指示抗体进行免疫印迹，如在( e ). g 的原理图 Rb1Rbl2Trp53 (将军澳 )小鼠SCLC模型 Carm1 信用证/信用证 敲除等位基因或a Nfib R388K突变体。 h 代表何和的磷染色，比例尺100米 i 指示突变小鼠中肿瘤负荷的量化( n = 6，平衡♂/♀，无性别差异)。 P 采用Tukey多重比较检验的双向ANOVA得出的值；方框图，线表示中间值，方框表示第75和第25个百分位数，触须表示最小值和最大值。 j 增殖标记定量(磷酸H3 + 细胞),如在( i ) (n = 6). k 卡普兰-迈耶生存曲线 将军澳 控制( n = 9，中位生存期193d)和 TKOCarm1 击倒取胜 n = 7297d) 和TKONfib R388K 突变小鼠( n = 6，288d)。 P 通过对数秩检验得出的值，平衡♂/♀，未发现性别差异。 l 所示小鼠模型中的肝转移发生率如( i ). m 用来自指定突变小鼠的两种独立和代表性肿瘤活检裂解物的指定抗体进行免疫印迹。在所有方案组中，纽蛋白都是一个加载质控品。
CARM1/NFIB合作促进小细胞肺癌GEMMs中的癌症 为了直接测试CARM1-NFIB轴在小细胞肺癌发病机制中的作用，我们建立了一个 Nfib R388K 使用CRISPR/Cas9策略的突变小鼠模型。同源重组驱动突变的供体DNA被设计用来代替R 388 赖氨酸残基，同时破坏 Nfib 基因(补充图。 3h ).EcoRV位点的缺失有利于有效的基因分型(补充图。 3i Nfib R388K 纯合小鼠是可存活的，没有表现出明显的表型。为了进一步验证突变NFIB小鼠模型的建立，我们从野生型or的肺和脾组织中免疫沉淀出NFIB Nfib R388K 纯合小鼠，并使用我们开发的抗NFIBme2a抗体进行Western分析(图。 1e ).NFIB来自野生型老鼠，但不是 Nfib R388K 纯合小鼠，可以用抗NFIBme2a抗体检测，从而证实在小鼠模型中R388位点是突变的(补充图。 3j ).然后我们穿过了 Nfib R388K 获得具有SCLC的TKO GEMM的小鼠 TKONfib R388K 老鼠(图。 3g ).此外，我们之前已经产生了CARM1的条件性敲除等位基因 25 这只老鼠也被放到了 将军澳 要生成的行 TKOCarm1 击倒取胜 老鼠(图。 3g ).腺病毒-Cre气管内灌洗用于诱导条件性等位基因重组，并启动癌症发展。在TKO小鼠模型中，CARM1的丢失和NFIB上CARM1甲基化位点的突变都导致肺肿瘤负荷以及肿瘤细胞增殖生物标志物磷酸H3的水平显著降低(图。 3h–j ).两者 TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 突变小鼠的存活时间明显延长 将军澳 控制(图 3k ).这两种模型也显示了肝转移的显著减少(图。 3l ).通过用NFIBme2a抗体进行蛋白质印迹，在两种小鼠模型中都证实了NFIB甲基化的缺失(图。 3m ).这些结果支持了CARM1介导的NFIB精氨酸甲基化在小细胞肺癌发生中的作用。
CARM1和NFIB共享促进开放染色质状态的能力 为了获得对NFIB/CARM1途径的分子理解，我们对获得的相同肿瘤活检进行了ATAC序列和RNA序列分析 将军澳 , TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 变异老鼠。ATAC序列揭示了染色质可及性的巨大变化。不同基因组区域的可及性图谱显示 TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 与相比显示相似的模式 将军澳 (补充图 4a ).对染色质可及性所有变化的更详细分析揭示了CARM1的缺失或NFIB的突变导致超过30，000个位点的上调和下调(图。 4a、b ).重要的是，当 TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 相比之下，可达性几乎没有差异(图。 4c )，这意味着在 TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 是匹配的。对于在肿瘤样品之间观察到的RNA-seq变化也是如此(补充图。 4b ).可达性和表达变化的相似性，之间 TKONfib R388K 和 TKOCarm 击倒取胜 通过测量这两个数据集的线性相关性，进一步验证了肿瘤。 4d，e )，明显的分组 TKONfib R388K 和 TKOCarm 击倒取胜 当对转录组变化进行基因簇分析时(图。 4f )和主成分分析(补充图。 4c，d ).从这些相似之处可以看出， TKONfib R388K 和 TKOCarm 击倒取胜 肿瘤在描述差异表达基因和染色质可及性变化的文氏图中显示重叠(补充图。 4e )并分享GSEA签名(图。 第四代移动通信技术 和补充图。 5a ).此外，我们发现先前发表的 27 从鼠KP1细胞获得的NFIB ChIP-seq峰与下调的ATAC-seq峰显著重叠 TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 对抗 将军澳 控制超过93%的共享峰 TKONfib R388K 和 TKOCarm1 击倒取胜 (补充图 4f ).作为一些需要CARM1和NFIB甲基化位点的常见调控靶标的例子，我们显示了LINGO1、SOX1、EPHB3、FOXA和MYCL的浏览器轨迹(补充图。 5b )并验证这些变化也发生在蛋白质水平(图。 4h ).因此，CARM1甲基化NFIB，它们一起合作重塑染色质并共同调节基因表达。
图4:NFIB car m1甲基化调节SCLC细胞的染色质可及性以促进肿瘤生长。 a –c 不同染色质可及性区域的ATAC序列分析 将军澳 (控制)与 TKONfib R388K 相对 TKOCarm1 击倒取胜 d 对照、NFIB突变体和CARM1敲除肿瘤之间差异染色质可及性的相关性 n =每组3只独立小鼠。皮尔逊相关系数( r )被计算了。 e 从每组n = 3只独立小鼠中收集的对照、NFIB突变体和CARM1敲除肿瘤之间差异基因表达的相关性。皮尔逊相关系数( r )被计算了。 f RNA-seq检测表达变化的基因簇分析。 g CARM1-NFIB轴调节多个致癌程序。分离自下列细胞的癌细胞中与CARM1和NFIB K388甲基化缺陷相关的顶级基因组富集分析(GSEA)特征的实例 将军澳 (控制)与 TKONfib R388K 和...相对 TKOCarm1 击倒取胜 变异老鼠。提供了标准化富集分数(NES)和错误发现率(FDR)(“方法”中的详细统计描述)。 h 用肿瘤活检裂解物的指示抗体进行免疫印迹 将军澳 (控制)， TKONfib R388K TKOCarm1 击倒取胜 变异老鼠。每个基因型显示两个独立的样本。显示为装载对照的纽蛋白。 i –k CARM1抑制减弱了三种SCLC PDX模型的生长，并且与依托泊苷和顺铂(E/P)组合导致NSG小鼠中的肿瘤消退。肿瘤体积定量和PDX的免疫印迹按指示进行处理( n =每组6只小鼠； P 通过双向ANOVA和Tukey多重比较测试确定数值，数据代表平均值SEM)。
CARM1小分子抑制剂具有治疗小细胞肺癌的治疗潜力 重要的是，像NFIB这样的转录因子被认为是“不可破坏的”目标 48 。然而，作为一种酶，CARM1是治疗上易处理的靶点，最近已经有了几种有效的和特异性的CARM1抑制剂(CARM1i) 31 ,32 ,33 ；这些抑制剂在体内小鼠模型中具有活性。因此，我们通过将CARM1i与标准治疗方案(即依托泊苷和顺铂(EP)化疗方案)进行比较，验证了carm 1 I可能对小细胞肺癌有治疗价值的假设。用EP、CARM1i和EP + CARM1i测试了三个独立的SCLC患者来源的异种移植物(PDX)模型。在所有三种模型中，用CARM1i或EP进行单一治疗可以显著减弱肿瘤生长，但不足以导致癌症消退(图。 4i–k ).引人注目的是，EP + CARM1i组合对肿瘤体积产生了最显著的影响，并导致三分之二的pdx部分消退。因此，临床前研究提供了四种独立的证据(使用异种移植物的互补试验；a Nfib R388K 敲入小鼠、CARM1条件性敲除小鼠和CARM1抑制剂)支持CARM1作为SCLC患者的潜在治疗靶点。
