绘制肾细胞癌染色质调控图 为了检测顺反子并确定肾细胞癌组织学亚型中的主要转录因子，我们对42例新鲜冰冻肾细胞癌肿瘤样本(24例肾细胞癌，6例肾细胞癌，12例肾细胞癌)进行了组蛋白染色质免疫沉淀，随后进行测序(ChIP-seq)，利用测序分析转座酶可及的染色质(ATAC-seq)和RNA测序(RNA-seq)。40个组织中的38个(95%)来自根治性肾切除术。在6例pRCC肿瘤中，4例为I型，1例为II型，1例未知。按照补充数据中的定义，患者被分为两个队列(1和2) 1 ，补充图。 S1 和结果部分。我们进行了H3K4me2 ChIP-seq来绘制活性和平衡增强子 27 和H3K27ac ChIP-seq来鉴定活性启动子和增强子 28 。进行ATAC-序列分析以确定染色质可及性景观，进行RNA-序列分析以捕获每个RCC亚型的转录程序。跨不同数据类型(补充数据)总共生成了153个库 1 和 2 和补充图。 S1 ).使用群组1来评估不同RCC组织学的调节情况，在所有样品中总共鉴定了153，321个启动子-远端(增强子)H3K27ac芯片-序列峰，其中大多数( n = 136，469)在两种或多种组织学中是常见的(图。 1 一， B ).例如，在 PAX8 在所有样品中，基因座由H3K27ac标记。 PAX8 是一种参与肾细胞癌早期肾脏胚胎发生和肿瘤发生的组织因子吗 29 ,30 并且是帮助将RCC与其他恶性肿瘤区分开来的临床诊断工具 31 (图。 1C ).无监督的层次聚类(图。 1D )和主成分分析(PCA)(补充图。 S2A )清楚地将三种组织学类型的RCC分开，并且两种分析都证明chRCC中的H3K27ac景观比pRCC或ccRCC更明显。此外，我们的队列与匹配正常的独立队列( n = 10)来自KIRC TCGA群组 32 显示了正常组织与不同肿瘤组织类型的清晰分离(chRCC，ccRCC，pRCC，补充图。 S2B S2C ).总的来说，与其他两种肿瘤组织学相比，一种肿瘤组织学中的16，852个峰显著增加或减少(例如，嫌色细胞相对于透明细胞和乳头状细胞)(“方法”，0.001的假发现率(FDR)，以及组间平均峰强度的至少四倍差异)。总之，在一个组织学中有12，908个位点上调:8939个是chRCC特异性的，3653个是pRCC特异性的，316个是ccRCC特异性的(图。 1E ).这些组织学特异性H3K27ac峰被H3K4me2 ChIP-Seq区别性标记，并与开放染色质相关，强烈表明它们是组织学特异性活性增强剂(补充图。 S2D ).此外，不同的表观遗传位点与最近的基因表达差异( P 值< 2 × 10 −16 ，卡方检验)(图。 1F–H ).伟大的 33 对8939 chRCC特异性H3K27ac峰的分析揭示了肌动蛋白调节、脂肪酸氧化和离子跨膜转运蛋白活性相关基因的富集(图。 2A )，与之前报道的mRNA信号分析一致，显示chRCC中离子跨膜转运信号增加 34 。对3653个pRCC特异性位点的类似分析显示了参与肾脏系统发育的基因的富集(图。 2B ).这与pRCC起源于胚胎肾源性rest前体病变的概念相一致，这种病变在成人生活中持续存在 35 。因为只有相对较少的ccRCC专用站点( n = 316)与chRCC和pRCC相比，并且ccRCC的增强子景观与pRCC的相似性大于chRCC，我们仅比较了ccRCC和pRCC之间的H3K27ac位点。大多数H3K27ac位点在两种组织学中是共有的( n = 113，786)，而1265个位点是ccRCC特异性的，2661个位点是pRCC特异性的(补充图。 S2E 和 S3A ).富含1265 ccRCC的峰与参与循环系统发育和血管生成的基因相关(图。 2C )，而2661个pRCC富集的峰基因再次富集了涉及肾脏胚胎发生的基因(补充图。 S3B ).H3K4me2峰的类似分析表明，chRCC与其他两种RCC亚型明显分离，具有可比较的组织学特异性和共同的“稳定”位点(补充图。 S3C 3F ).所有样品的H3K27ac和H3K4me2 ChIP-seq信号都是强相关的(Pearson相关性， r = 0.73)(图。 2D
图1:h3k 27 AC信号在RCC组织学中的分布。 A 根据30个新鲜冷冻RCC肿瘤样品(12个chRCC，6个pRCC，12个ccRCC)的基因组区域，RCC H3K27ac峰的分布。 B 组织学特异性和常见H3K27ac峰的数量。 C 来自每个RCC组织学的六个代表性样本中PAX8的H3K27ac分布图。 D 基于H3K27ac ChIP-seq峰的样本对样本成对相关性的chRCC、ccRCC和pRCC的分层聚类。 E 肾细胞癌亚型中组织学特异性H3K27ac峰的分布。 F –H 火山图显示了一种组织学中基因表达的对数变化(FPKM)与其他两种组织学( F ccRCC与其他， G 巴勒斯坦红新月会与其他组织， H chRCC与其他)。双面的 P 在多重比较测试中使用并校正了数值(FDR调整 P 值< 0.05)。肾细胞癌，嫌色细胞肾细胞癌，透明细胞肾细胞癌，乳头状肾细胞癌。
图2:调控元件的表观遗传学注释确定了组织特异性途径和转录因子的富集。 A 对富含嫌色物质的峰进行大量分析( n = 8939).双面的 P 显示值。 B 对富含乳头状突起的峰进行大量分析( n = 3653).双面的 P 显示值。 C 对透明细胞中透明细胞富集峰的更好分析与仅乳头状的比较( n = 1265). A –C GREAT计算基因组区域和注释之间关联的统计丰富度。双面的 P 显示值。 D H3K27ac与H3K4me2 ChIP-seq各亚型峰之间相关性的密度图。 E 通过从头基序分析，chRCC特异性位点中存在四个最显著富集的核苷酸基序，受ATAC峰限制。 F , G 在每种组织学(chRCC，ccRCC，pRCC)的两个代表性样本中，分别在FOXI1和TFCP2L1附近的H3K27ac分布图。 H 通过从头基序分析，两个最显着富集的核苷酸基序存在于inccRCC特异性位点。 P 值是双面的，不可针对多重比较进行调整。 I , J 在肾细胞癌组织学的两个代表性样本中，分别接近ETS-1和HNF1B的H3K27ac谱。 K 通过从头基序分析，pRCC特异性位点中存在三个最显著富集的核苷酸基序。 P 值是双面的，不可针对多重比较进行调整。肾细胞癌，嫌色细胞肾细胞癌，透明细胞肾细胞癌，乳头状肾细胞癌。
每种亚型中富集的H3K27ac峰的从头基序分析确定了chRCC中高度富集的四个基序，包括一个类似叉头基序，和另一个类似与TFCP2相关的基序(图。 2E ).FOXI1，一个叉头TF家族，和TFCP2密切相关的TFCP2L1，都与肾脏闰细胞的发育有关，肾脏闰细胞被认为是chRCC的起源细胞 36 FOXI1 和 TFCP2L1 与ccRCC和pRCC中不存在或明显较低的信号相比，chRCC中基因位点的特征在于高H3K27ac信号(图。 2 f， G ).对推定的ccRCC特异性增强子的基序富集分析确定了一个类似于碱性亮氨酸拉链(bZIP) BATF基序的基序，和另一个类似于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH) TF家族成员HIF2α(也称为EPAS1)的基序(图。 2H ETS1 与BATF的bZIP家族中的，与冯-希佩尔林道(VHL)依赖性肾细胞癌肿瘤发生有关 37 H3K27ac在ccRCC中高度标记，在pRCC中不太明显，在chRCC中不明显(图。 2I EPAS1 是众所周知的在ccRCC中调节失调的原因 VHL 蛋白质功能。它是ccRCC的主要驱动力，位于多个关键致癌途径的上游。最近使用HIF2抑制剂的临床试验显示了晚期肾细胞癌患者的临床活性 38 ,39 。得分最高的pRCC特异性基序对应于HNF1β(图。 2 j， K ). HNF1β 是包含同源结构域的TFs超家族的一员，参与肾脏发生 40 ，并且在pRCC中被H3K27ac特异性地高度标记(图。 2K
肾细胞癌在参与染色质重塑和组蛋白甲基化途径的基因中存在复发性突变 7 ,8 ,41 ,42 ,43 ,44 。在我们的数据集中，功能丧失的单核苷酸变异和拷贝数改变(见“方法”)在RCC( VHL , PBRM1 , BAP1 ，以及 TP53) 与监督和非监督分析中的整体乙酰化差异不相关，尽管小尺寸很小。(补充图 S4A S4D 和补充数据 3 和 4 ).
特定的主转录因子定义RCC亚型 接下来，我们试图系统地确定定义肾细胞癌三种亚型的候选组织特异性主因子。主TF通常在se内绑定 17 ,45 通常由SEs调节，并在转录核心调节回路(CRC)中相互调节 46 。我们采用了综合方法 47 ,48 利用RNA-Seq、ChIP-Seq和ATAC-Seq数据来鉴定候选的组织学特异性主TF(图。 3A ).该方法旨在利用正交信息来识别主TF的一致集合。我们结合了(1)肾细胞癌组织学亚型间差异表达的TFs的表达数据；(2)相对于其他癌症类型(CaCTS)的RCC组织学亚型特异性的TF 49 ；(3)肾细胞癌组织学亚型中不同的SE相关TFs和(4)在调节集团中具有组织学特异性连接的TFs(见“方法”)。这四项分析确定了200多个候选TF，在一项或多项分析中显示出组织学特异性关联。我们通过选择那些在一个以上的分析(“方法”，补充图。 S5A S5J 和 S6 和补充数据 5 –11 ).该分析突出了50个候选的组织学特异性主TF( N = 20，chRCC N = 14，pRCC N = 16，ccRCC)(补充数据) 12 )，包括 FOXI1 , TFCP2L1 ，以及 DMRT2 对于chRCC EPAS1、ETS1、BARX2 , ZNF395 对于ccRCC，以及 HNF1B 和 NR2F2 对于pRCC(图 3B ).使用这种荟萃分析方法选择的50个组织学特异性TF的SE排名、基因表达和CES根据其各自的组织学将样品紧密聚类(补充图。 S6A
图3:多维综合分析确定组织学特异性主TF。 A 用于提名参与CRC的组织学特异性主TF的方法概述。 B 整合了通过荟萃分析方法(CES、差异表达、SE等级分析和CaCTS)确定的50个组织学特异性TF的热图。 C ccRCC、chRCC和pRCC肿瘤样本中指示抗体的代表性免疫组织化学染色。显示了四个组织学特定的主TF。阳性肿瘤的数量/检查的肿瘤的数量显示在每个图像的下方(对于ccRCC， n TF bhl he 41 = 4， n = 3，适用于TFs HNF1B、NKX6.1和ZNF395。对于chRCC来说， n 对于TFs BHLHE41、HNF1B和ZNF395，n = 3；对于pRCC，n = 3；对于BHLHE41、NKX6.1和ZNF395， n 对于HNF1B = 2)。比例尺为50 μm。 D 在6个ccRCC和2个chRCC人类组织样品中EPAS1的芯片序列结合谱。 E 相对于ccRCC，对富含chRCC的EPAS1峰进行了大量分析。双面的 P 显示值。 F 与chRCC相关的富含ccRCC的EPAS1峰的出色分析。双面的 P 显示值。 E , F GREAT计算基因组区域和注释之间关联的统计丰富度。ChIP-seq染色质免疫沉淀测序，转座酶可及染色质测序的ATAC-seq分析，DEG差异表达基因，se超级增强剂，CaCTS癌核心转录因子特异性，CRC核心调节回路，RCC肾细胞癌，chRCC嫌色细胞RCC，ccRCC透明细胞RCC，pRCC乳头状RCC。源数据作为源数据文件提供。
为了证实在正常对应组织中是否存在类似的TF特异性模式，我们转向了来自TCGA·基奇、KIRC和KIRP队列的基因表达数据集。组织学特异性主转录因子的GSEA分析显示，与正常相比，肿瘤中透明细胞和乳头状肾细胞癌特异性转录因子富集(FDR校正 q -值< 0.01)。与正常相比，肿瘤中嫌色细胞肾细胞癌特异性转录因子没有显著富集。在50个主TF中，34个(68%)在肿瘤组织中的表达比正常组织中的表达更显著(KIRC为14/16，KIRP为10/14，KICH为10/20，补充图。 S6B S6D
来自将军会队列(009/10/025)的临床相关性分析显示，在50个主TF中，高BARX2表达与整个ccRCC患者队列中总生存率的提高显著相关(补充数据 13 和补充图。 S6E )和在用抗PD1治疗的亚组中，nivolumab(补充数据 13 和补充图。 S6F
为了在蛋白质水平上提供概念验证的证据，我们通过免疫组织化学(IHC)研究了主TFs的表达特异性和定位。我们选择了四个符合以下标准的代表性主TF:(1)与其他两种肾细胞癌组织类型相比，通过批量RNA测序(来自TCGA ),组织学特异性TF的基因表达至少发生了两倍的变化，(2)针对IHC的高质量抗体，以及(3) TF以前没有在临床水平上得到验证和实施。对于4种TF(bhl he 41、HNF1β、NKX6.1和ZNF395)，我们发现组织学亚型的蛋白表达水平有显著变化(图。 3C ).更具体地说，两个ccRCC特异性主TF(bhl he 41和ZNF395)在ccRCC肿瘤中高度表达。两个TF分别在四分之四和三分之三的ccRCC样本中有核定位。NKX6.1，一种最近被描述为在chRCC中表达的TF，在两个嫌色细胞样本中的两个中检测到细胞核，在ccRCC或pRCC中没有表达。接下来，我们通过检查ccRCC和chRCC中的EPAS1顺反子，证实了命名的主TF EPAS1的组织学特异性体内结合。我们通过在另外八种原发性人类肿瘤( n = 2 chRCC n = 6 ccRCC，图。 三维（three dimension的缩写） ).亚型特异性EPAS1结合位点高度富集H3K27ac的亚型特异性位点。例如，4565个嫌色细胞特异性EPAS1结合位点中有2090个(46%)与嫌色细胞特异性H3K27ac位点重叠( P < 2.2e-16). This supports the conclusion that these differential EPAS1-binding sites are non-random and biologically relevant, because they coincide with regulatory elements that segregate closely with histology. ccRCC-specific EPAS1-binding sites were enriched for immune cell and white blood cell activation pathways and chRCC-specific EPAS1-binding sites were enriched for metabolic processes and fatty acid activation (Fig. 3 e， F ).
为了进一步验证我们在驱动不同肾细胞癌组织学的转录同一性中提名的主TF的方法，我们在一个肾细胞癌细胞系中操纵TF的表达。我们假设chRCC特异性TFs的过度表达和ccRCC特异性TFs的抑制可以改变ccRCC细胞系786-O的转录景观，使其变得更像嫌色细胞。 FOXI1 在4/4主TF分析中被评为chRCC特异性TF(图。 3B ).此外，FOXI1在闰细胞(ICs)中选择性表达，闰细胞是chRCC的假定细胞来源 36 ,50 并且在chRCC中比在TCGA数据集中的其他癌症亚型更高表达(补充图。 S7A ).我们也操纵了 EPAS1 作为第二个目标，因为它在我们的综合分析中对ccRCC具有高度特异性(图。 3B 和补充图S8B)，并且先前的研究已经表征了其在ccRCC的发病机理中的作用 51 。我们在ccRCC细胞系786-O (FOXI1 OE)中过量表达foxi 1；抑制EPAS1 (EPAS1 KD)并同时干扰同一细胞系中的两个基因(FOXI1 OE/EPAS1 KD)(补充图。 S7C 7E 和补充数据 14 ).在补充图中描述了表达变化。 S8A S8F 和补充数据 15 –18 。在786-O中用FOXI1 OE/EPAS1 KD对下调基因进行的基因集合富集分析(GSEA)显示了参与免疫反应的基因的富集(图。 4A ).与对照细胞相比，786-O细胞中伴随的FOXI1 OE和EPAS1 KD导致chRCC特异性主TF如TFCP2L1和NR3C2的上调，以及ccRCC特异性主TF如ETS-1和ZNF395的下调。(图。 4B ).进一步的监督分析表明，与EPAS1 KO/FOXI1 OE细胞系相比，EPAS1的下游靶标CAIX在WT 786-O细胞系中显著过表达。相反，CD117，一种众所周知的chRCC免疫组化标记 52 与WT 786-O细胞系相比，在EPAS1 KO/FOXI1 OE细胞系中过表达。尽管CK7表达在临床上是chRCC的支持性标记 53 ，其表达在WT 786-O和操纵的细胞系状态中是一致的(图。 4C ).值得注意的是，在FOXI1 OE/EPAS1 KD细胞和FOXI1 OE only细胞系之间仅有109个差异表达的基因( P < 0.05, q < 0.01, Supplementary Fig. S8D 和补充数据 17 ).
图4:ccRCC细胞系中两个主TF的功能扰动产生更类似chRCC的转录谱。 A 细胞系786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD中下调的GO生物学术语。双面调整 P 针对多重比较修正的值。 B 786-O CTRL和786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD之间差异表达的TF在表达水平上的排序。每个TF点代表一个TF。使用来自DESeq2的Wald测试。紫色圆点表示已调整 P DESeq表达式得出的值< 0.001。 C CAIX、CD117和CK7在不同786-O细胞系条件下的基因表达水平。 D 热图显示了在不同细胞系条件下，ccRCC与chRCC中前20个上调基因的相对表达，反之亦然。 E GSEA分析显示，在786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD与786-O CTRL的比较中，chRCC与ccRCC数据集的前100个上调基因。 F ccRCC与chRCC在786-O CTRL与786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD中前100个上调基因的GSEA分析。CTRL对照、KD敲除、OE过表达、TF转录因子、GSEA基因集富集分析、786Oc1 CTRL1、786Oc2 CTRL2、786OD1 786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD1、786OD2 786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD2、NES标准化富集评分、FDR假发现率、FC倍数变化、肾细胞癌、chRCC嫌色细胞肾细胞癌、ccRCC透明细胞肾细胞癌、pRCC乳头状肾细胞癌。
然后我们比较了786-O实验条件和RCC肿瘤表达数据之间的差异表达基因(图。 4D 和补充图。 S8G ).将chRCC和ccRCC基因组定义为每种组织学相对于其他组织学的前100个上调基因，我们表明，与对照相比，chRCC基因组在786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD细胞系中富含上调基因(图。 4E )，并且在786-O对照与FOXI1 OE/EPAS1 KD细胞系中，ccRCC基因组富含上调基因(图。 4F ).FOXI1 OE/EPAS1 KD 786-O细胞系表现出chRCC特异性候选主TF、TFCP2L1、GATA2、DDIT3、NKX6-1的显著高表达，以及ccRCC特异性候选主TF、ZNF395和TSC22D3的低表达。786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD与786O CTRL比较中的差异TF与chRCC与ccRCC人类样本比较中的差异TF的重叠程度比ccRCC与pRCC人类样本比较中的差异TF更大(补充数据 19 ).总之，这些数据表明单一chRCC主转录因子候选物的过表达， FOXI1 在ccRCC细胞系786-O中，敲除或不敲除 EPAS1 ，导致显著的表达变化，使细胞系更像chRCC细胞系，而没有对786-O细胞中存在的一组突变进行任何修饰。
等位基因失衡诠释生殖系肾细胞癌风险变异 等位基因不平衡，ChIP-seq reads中杂合单核苷酸多态性(SNPs)的差异等位基因表现，提供了以下体内比较 独联体 -两个单倍型之间的调节活性(图。 5A ).因此，等位基因不平衡可以突出候选因果变异的功能相关性 22 ,32 ,54 ,55 ,56 ,57 32 到H3K27ac芯片-来自20个ccRCC和6个pRCC的序列数据(“方法”)。我们在ccRCC和pRCC组合样本集中测试的183，099个峰中识别出10，605个染色质不平衡的H3K27ac峰，我们将其定义为在多重假设测试校正后具有一个或多个不平衡SNPs的峰(图。 5B 和补充数据 20 ).
图ccRCC和pRCC中等位基因不平衡的H3K27ac峰。 A 杂合SNPs等位基因不平衡示意图。 B 示意图显示了RCC (pRCC和ccRCC)样本中总H3K27ac峰中等位基因不平衡H3K27ac峰的子集。 C AI at RS 4903064(chr 14:73279420；DPF3)在RCC中。 D RS 4903064 C-等位基因序列产生一个HIF-2a结合位点。 E 43个样本中rs4903064附近峰中EPAS1芯片信号的RPKM值。基因型显示在 X 轴。方框边界对应于第一和第三四分位数；晶须延伸到最大1.5倍的四分位间距。显示了双侧未调整的p值。使用Kruskal–Wallis检验进行统计分析。 F 重叠的EPAS1和H3K27ac芯片rs4903064基因组坐标约10 Kb范围内的7个样品的序列跟踪。显示了单个样品的基因型。G 文氏图显示了肾细胞癌中不平衡的H3K27ac峰与ATAC-序列峰的重叠。 H 与所有H3K27ac峰相比，H3K27ac峰中来自GWAS的RCC和其他疾病的风险SNP的富集具有差异等位基因不平衡。经验片面的 P 显示数值(未针对多次比较进行调整)。使用Kruskal–Wallis检验进行统计分析。GWAS风险SNPs rs7132434和rs4733579显示肾细胞癌等位基因不平衡。 I 显示Chr12 SNP rs7132423和Chr8 SNP rs4733579处的AI。 J EPAS1内Chr2 SNPs的AI。显示rs46552601和rs46541176。 K EPAS1内的Chr2 SNPs，按组织学划分的不平衡图。显示不平衡的调整Q值。ChIP-seq染色质免疫沉淀测序，Ca癌，HTN高血压，Dx诊断，T2D二型糖尿病糖尿病，艾滋病自身免疫性疾病，C0参照等位基因，C1交替等位基因，AI等位基因失衡，肾细胞癌，chRCC嫌色细胞肾细胞癌，ccRCC透明细胞肾细胞癌，pRCC乳头状肾细胞癌，SNP单核苷酸多态性。
我们假设染色质AI峰对应于由主转录因子结合的调控元件。在这些元素中，存在 反式 -作用因子(即主TF)可能导致可观察到的调节元件活性，如H3K27ac AI峰。一个例子是RS 4903064(chr 14:73279420；14q24.2)，eQTL用于 DPF3 58 (图。 5C ).rs4903064在我们的H3K27Ac数据集中等位基因不平衡，在所有三种组织学亚型(ccRCC、chRCC和pRCC)中均显示为GWAS风险变异体，该SNP的C等位基因改变被认为产生了HIF结合基序(图。 5D 59 。为了证实这一点，我们在来自23例ccRCC患者的43个样本的独立队列中使用了EPAS1转录因子芯片-Seq数据，以研究GWAS风险变体rs4903064(见“方法”)对EPAS1结合的影响。对11个原发性、21个转移性ccRCC样本和11个正常肾组织样本的分析显示，具有纯合C/C等位基因的肿瘤明显富含EPAS1峰(图。 5 e， F )在肿瘤和正常组织中，而rs4903064是一个 EPAS1 cQTL。这证实了先前的文献，即C等位基因产生一个HIF结合位点 59
我们应用我们的染色质人工智能分析来注释GWAS识别的肾细胞癌风险SNPs 58 。通过ld评分回归分析评估，RCC GWAS风险变异体的染色质AI峰高度富集(16.7倍) P = 1.9 × 10− 4 )60 。将不平衡的H3K27ac峰子集化到TF可能结合的可及染色质区域(通过来自RCC组织的ATAC序列评估 61 )导致显著的额外富集(43.2倍； P = 7.0 × 10− 6 ，图。 5 g， H ).这种富集是H3K27ac峰总量的五倍以上，h3k 27 AC峰本身富集了8.1倍( P = 1.2 × 10− 4 ).相比之下，来自英国生物银行的多种其他GWAS表型 62 显示出与RCC GWAS SNPs相比实质上更少的富集，表明这种富集对于RCC的特异性(图。 5H
使用这种方法，我们能够精确定位总共30个风险SNP(补充数据 21 )，并突出了一些例子。位于chr 12上的Rs7132434被认为是一种功能性变异体，它改变AP-1的结合，导致AP-1的表达上调。 BHLHE41 ，从而通过诱导肿瘤生长 白细胞介素11 63 (图。 5I ).另一个例子是rs4733579，它位于chr 8上，与rs35252396一起位于LD中(图。 5I ).后者已被证明通过调节MYC和PVT1的表达对RCC易感性有贡献 64 。值得注意的是，rs35252396是一个indel，因此不能由stratAS评估。我们的分析还强调了rs46552601和rs46541176(图。 5J )，二者均位于chr2p21上 EPAS1 基因，其中至少59个SNP已经被精细定位。这两个SNP等位基因不平衡，H3K27Ac峰仅在ccRCC中出现，而在pRCC中没有，这与h3k 27 AC的特殊作用一致。 EPAS1 (HIF2 -α )在ccRCC发病机制中的作用(图。 5K ).建议做进一步的工作，从功能上验证这两个SNPs在ccRCC发病机制中的作用。最后，rs4765623位于 SCARB1 基因座最近在RCC进展中得到证实 32
TFs可以读取遗传密码并绑定 独联体 激活或抑制基因表达的调节元件。我们假设具有显著染色质AI的基因座可能是TF结合的先兆，因此以等位基因特异性的方式与基因表达的调节相关。我们利用来自ccRCC H3K27Ac数据集的染色质AI和来自KIRC TCGA队列的RNA-seq数据的等位基因特异性表达(ASE)。保留了在ccRCC H3K27Ac数据集和RNA-seq KIRC TCGA样本中具有至少50个读数的SNP基因座。保留的SNPs在ccRCC中被分类为染色质等位基因不平衡或等位基因平衡。染色质等位基因不平衡的SNPs包含H3K27ac峰，与野生型等位基因相比，显著偏向备选等位基因( P < 0.05). For the 22,162 chromatin allelically imbalanced SNPs, we matched a background set of chromatin allelically balanced SNPs lying within the H3K27ac consensus peak set. Allele-specific expression of genes whose transcription start site lies within 50 Kb of the chromatin allelically imbalanced and balanced SNPs was analyzed in the TCGA KIRC dataset (N = 412)，显著性截止值为 P -调整后< 0.01。在分析的独特基因中，染色质等位基因不平衡的SNPs明显更可能位于具有ASE的基因的50 kb内(1170/2646，44%)，而背景组的染色质等位基因平衡的SNPs (65/940，6.9%， P = 8.4e 25，补充数据 22 –25 ).
