低IL-1RN可预测患者的AML进展
为了研究IL-1RN在人AML中的表达，我们重新分析了381例AML患者队列(GSE14468)中纯化AML母细胞的公开可用阵列23,24,25并发现低IL1RN与存活率降低有关(图。1a).我们根据FAB分别分析了分化程度更高的AML特征IL1RN是M4-M5 AML患者生存率降低的预后标志(n= 164)(图。1a).很少有M0-M3急性髓细胞白血病患者有高IL1RN表情(n= 7/217).事实上，我们根据FAB将较低成熟/分化的M0-M3患者确定为最低的患者IL1RN表达，对M4-M5(图。1b).M0-M3患者表现出高IL1B到IL1RN比率(补充图。S1A).在19名配对诊断复发的AML患者队列中(dbGaP登录号phs001027)26，我们相关性低IL1RN来自预后较差的AML母细胞的RNA-Seq数据中的表达(补充图。S1B)，并减少了IL1RN复发时与诊断时(补充图。S1C).
图1:低IL-1RN预测患者的AML进展。
a全球AML患者生存数据(n= 381)和M4-M5 AML患者生存数据(n= 164)分析为以下函数IL1RNAML母细胞中的表达(GSE14468)。p值表示似然比测试。bmRNA表达IL1RN在AML blast(GSE 14468)中，比较AML亚型M0-M3(n= 224)对M4-M5(n= 171).cqRT-PCR mRNA表达IL1RN在CD34中+志愿者的祖细胞(C，n= 32)和患者(AML、n= 21;MDS，n= 2).dqRT-PCR mRNA表达IL1RN在CD34中+志愿者的祖细胞(n= 32)和AML亚型M0-M3(n= 16)和M4-M5 (n = 4)。MDS与反洗钱M4-M5集团(n= 2).eqRT-PCR mRNA表达IL1B对抗IL1RN，在CD34中+志愿者的祖细胞(n= 19)和AML患者(n= 12).FC，折换。fCD34细胞中IL-1β与IL-1RN蛋白水平的比较+志愿者的祖细胞(n= 10)和AML患者(n= 5).gCD34细胞中NFκB的核转位+志愿者的祖细胞(n= 5)和AML患者(n= 4)(左)。代表性直方图(中)和代表性图像(右)。比例尺，10米(h–k)AML异种移植。h，我用IL-1β或载体(Veh)进行体内治疗。h人类CD45的数量+用赋形剂处理的小鼠外周血(PB)中的造血细胞(n= 8)或IL-1β(n= 10)，超过2次独立实验。i人类CD45的数量+来自用载体处理的小鼠的总骨髓(TBM)中的造血细胞(n= 5)或IL-1β(n= 6)和代表性的荧光激活细胞分选直方图(TBM中的细胞，%)。j，k体内IL-1RN增强或IL-1β阻断与赋形剂。j人CD11b的扩增+来自用载体处理的小鼠的PB中的造血细胞(n= 8)、IL-1RN(n= 6)或canakinumab(可以，n= 7)，超过3次独立实验。k人类CD45的频率+，CD33+和CD34+来自用载体处理的小鼠的TBM中的造血细胞(n= 3)或IL-1RN(n= 4).数据是生物学上独立的样本或动物，条形图表示SEM，小提琴图表示中位数。采用双尾Cox比例风险回归进行统计分析，根据年龄进行调整，并根据细胞遗传风险进行分层(a)，双尾曼恩–惠特尼U测试(b–e, h)还是双尾学生的t-测试(f、g、I–k). p报告值≤ 0.05。源数据作为源数据文件提供。
我们研究了CD34的潜在贡献+AML中不平衡IL-1RN的祖细胞，以细胞固有的方式。的表达水平IL1RN循环CD34减少+患者与健康对照的祖细胞(图。1c)，这在未分化的FAB类别AML(M0-M3)中尤为明显(图)。1d).所有人的基因表达比率IL1B, CASP1和IRAK1，到IL1RN在急性髓细胞白血病患者中更高(图。1e；补充图S1D)，表明减少的IL-1RN与IL-1β途径的激活有关。这在CD34中IL-1β与IL-1RN的比率较高的蛋白质水平上得到证实+AML患者的祖细胞与健康供体的对比(图。1f).如前所述，我们证实了IL1RAP基因和更高频率的CD34+与健康供体相比，AML患者中表达IL-1RAP的祖细胞13(补充图S1E, F).
作为IL-1β信号通路激活的替代物，我们研究了CD34细胞中NFκB通过磷流和核转位的激活+AML患者和健康对照的祖细胞。外周血CD34百分比+通过NFκB激活的祖细胞在AML患者中更高(补充图。S1G)，以及p50/p65 NFκB异二聚体的核转位(图。第一代；补充图S1H).为了证实增加的IL-1β信号传导在人类AML发病机制中的功能作用，免疫缺陷的NSG-SGM3小鼠被移植CD34+从AML患者的骨髓中分离出的祖细胞，并在体内用人IL-1β或载体进行处理。IL-1β治疗促进了NSG-SGM3小鼠的PB和BM中人AML细胞的扩增(图。1h，我).我们比较了NSG-SGM3异种移植物中增强IL-1RN和阻断IL-1β对AML患者的治疗潜力。在移植了CD34的NSG-SGM3小鼠的PB中，用IL-1RN或人IL-1β单克隆抗体canakinumab的短期治疗在减少人白血病细胞(即骨髓细胞)的扩增方面是有效的，达到相似的程度+从AML患者样本的骨髓中分离出的祖细胞(图。1j；补充图S1I).对用IL-1RN进行的长期治疗进行了跟踪，并证实了人白血病细胞(即CD45)数量的减少+白细胞，CD33+髓母细胞和CD34+IL-1RN处理的NSG-SGM3小鼠骨髓中的祖细胞(图。1k；补充图S1J).因此，IL-1RN加强对AML患者具有治疗潜力。
在没有免疫原性刺激的情况下，IL-1rn的缺失诱导骨髓生成
为了确定IL-1rn缺陷在造血中的作用，我们对IL-1rn-KO小鼠品系进行了表征，该品系以前未用于造血。成年IL-1rn-KO小鼠在BM中有较高的细胞密度，循环中性粒细胞增加，脾脏中无异常(图。2a；补充图S2A，B)。Lin的丰度、分数和增殖−Sca-1+c套件+野生型和IL-1rn-KO小鼠的LSK细胞相似(补充图。S2C).对应于HSC和多能祖细胞MPP1-MPP5的干细胞和祖细胞亚群的荧光激活细胞分选(FACS)分析27,28,29显示IL-1rn-KO小鼠BM中HSC和MPP5减少，MPP2增加(图。2b；补充图S2D).与WT小鼠相比，IL-1rn-KO小鼠BM中的普通淋巴祖细胞(CLP)和普通骨髓祖细胞(CMP)的绝对数量没有变化，而巨核细胞红系祖细胞(MEP)和粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)减少(补充图。S3A).IL-1rn-KO小鼠体内造血干细胞和祖细胞(HSPC)形成的集落数量较高(图。2c).对IL-1rn-KO小鼠的分析也揭示了总BM中凋亡细胞数量的增加(补充图。S3B)但在HSPC没有(补充图。S3C).我们发现IL-1rn的消除对B淋巴细胞发育显著受损的骨髓系造血分化的影响(图。2d；补充图S3D, E).这些结果表明，在稳态条件下，IL-1rn抑制HSPC分化为骨髓系，并使B细胞能够分化。
图2:在没有免疫原性刺激的情况下，IL-1rn的缺失触发了IL-1β诱导的骨髓生成。
a来自C57BL/6J野生型(WT，n= 8)和IL-1rn敲除(IL-1rn-KO，n= 10)小鼠；比例尺、100微米和总BM (TBM)有核细胞(WT，n= 16;IL-1rn-KO，n= 23).b林隧道掘进机编号−Sca-1+c套件+(LSK)亚组:LSK CD34−Flt3−CD48−CD150+、造血干细胞(HSC)；LSK CD34+Flt3−CD48−CD150+多能祖细胞1(MP P1)；LSK CD34+Flt3−CD48+CD150+，MPP2LSK CD34+Flt3−CD48+CD150−，MPP3LSK CD34+Flt3+CD48+CD150−，MPP4LSK CD34+Flt3−CD48−CD150−，MPP5(n=每组9个)。cBM集落形成单位细胞(CFU-C) (WT，n= 6;IL-1rn-KO，n= 10).dCD11b的TBM编号+骨髓细胞和B220+淋巴细胞(重量，n= 6;IL-1rn-KO，n= 7).e骨髓细胞外液(WT，n= 9;IL-1rn-KO，n= 12).fBM的代表性IL-1受体(IL-1r1)染色(红色)；用DAPI复染的细胞核(蓝色)；比例尺、20微米和TBM IL-1r1表达细胞的频率(n=每组7个)。g，h用载体治疗的IL-1rn-KO小鼠(n= 5)或IL-1RN(n= 4).gCD11b数量+外周血(PB)中的髓样细胞和中性粒细胞。hCD11b的频率+骨髓细胞和B220+TBM中的淋巴细胞。我，j用同种型(n = 5)或小鼠IL-1β单克隆抗体(IL-1β mAb)治疗的IL-1rn-KO小鼠(n= 4).iCD11b的频率+髓样细胞和CD11b+Gr-1你好f4/80−PB中的粒细胞。j有核细胞，CD11b+骨髓细胞和B220+淋巴细胞。k–mqRT-PCR mRNA表达于kLSK亚群:LSK CD34−Flt3−、长期HSC(LT-HSC)；LSK CD34+Flt3−、短期HSC(ST-HSC)；LSK CD34+Flt3+MPP ofIl1b (n=每组3个)，Il1r1(LT-HSC，MPP，n= 7;ST-HSC，n= 6，每组)和Il1rap (n=每组4个)。lCD11b+Gr-1你好f4/80−粒细胞Il1b (n=每组8个)，Il1r1(WT，n= 12;IL-1rn-KO，n= 11)和Il1rap (n=每组4个)和CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞Il1b (n=每组11个)，Il1r1 (n=每组15个)和Il1rap (n=每组4个)。mCD11b+Gr-1你好f4/80−粒细胞(n=每组8个)，CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞(WT，n= 7;IL-1rn-KO，n= 8)和LSK细胞(n=每组4个)Il1rn。数据是生物学上独立的动物，对于条形图来说意味着SEM，对于小提琴图来说意味着中位数。统计分析是用双尾学生的t-测试(a–d、f–h，我左边的，j–m)或双尾曼恩–惠特尼U测试(我对)。p报告值≤ 0.05。源数据作为源数据文件提供。
描述了在损伤或感染条件下骨髓中IL-1β的产生2。我们的数据显示，在稳态条件下，健康BM中存在IL-1β，IL-1rn-KO小鼠的IL-1β BM水平高于WT小鼠，这是由于IL-1rn的缺失所致(图。2e).其他骨髓细胞因子没有变化(补充图。S3F).然后我们询问IL-1rn基因缺失是否导致IL-1r1的整体增强。骨髓中表达IL-1r1的细胞很少，但在IL-1rn-KO小鼠中表达频率增加(图。2f).来自IL-1rn-KO小鼠的祖细胞的骨髓偏向性可以在体外被阻止(补充图。S3G)和在体内用IL-1RN处理(图。2g，h)或抗IL-1β的单克隆抗体(图。2i，j)，但不是抗IL-1α的单克隆抗体(补充图。S3H).因此，在稳态条件下，IL-1rn阻止IL-1β驱动的HSPC以淋巴样发育为代价分化为髓系。
IL-1rn-KO长期(LT)-HSC和短期(ST)-HSC均上调细胞因子的表达。Il1b吉恩，同时Il1r1由HSPC表达，并且在来自IL-1rn-KO小鼠的LT-HSC中比野生型小鼠高(图。2k).这表明IL-1β的表达参与了IL-1β的正反馈环30在HSPC没有任何免疫原性触发的情况下，由于IL-1rn的丢失。Il1rap与野生型小鼠相比，LT-HSC和ST-HSC的基因表达没有变化，但IL-1rn-KO小鼠的MPP基因表达降低(图。2k).骨髓细胞，选择性粒细胞，在IL-1rn-KO小鼠的BM中扩增(图。2d；补充图S3E)但是，与HSPC不同，与单核细胞相似，它们没有通过IL-1r1参与IL-1β正反馈环(图。2l). Il1rap来自IL-1rn-KO和WT小鼠的粒细胞和单核细胞中的基因表达相似(图。2l).与野生型HSPC相比Il1rn分别是野生型粒细胞和单核细胞的170倍和20倍(图。2m).
为了确定由IL-1rn缺失引起的HSPC的特定变化，我们接下来通过对WT和IL-1rn-KO LT-HSC、ST-HSC和MPP的RNA测序(RNA-Seq)进行基因表达谱分析。我们确定了IL-1rn消除对LT-HSC和ST-HSC区室转录程序的影响，分别有1433和2612个差异表达基因(调整p < 0.05). The effect on MPP was smaller, with 181 genes differentially expressed (Supplementary Fig. S4A).LT-HSC的基因集合富集分析(GSEA)揭示了与免疫系统、免疫反应和白细胞分化相关的多种基因的协同变化(补充图。S4B, C).ST-HSC失调基因的GSEA确定了相似基因程序中的变化(补充图。S4D, E).这些变化与NFκB转录因子活性增加有关(图。3a，b)，以及骨髓分化基因的激活，包括转录因子PU.1(串行外设接口（Serial Peripheral Interface的缩写）1)和它的一些目标基因如Cebpa和Csf2rb(图。3a，c)在IL-1rn-KO HSPC与WT HSPC相比，特别是在LT-HSC和ST-HSC中。涉及骨髓分化相关基因的各种RNA-Seq命中(串行外设接口（Serial Peripheral Interface的缩写）1, Csf2rb)和以前发现在髓样肿瘤中异常表达的基因(Axl, Stat3, Tlr1)被qRT-PCR证实(补充图。S4F–H)31,32,33。来自IL-1rn-KO小鼠的祖细胞的骨髓偏向性可以通过用硼替佐米(一种阻止NFκB活化的蛋白酶体抑制剂)治疗而在体内逆转(图。三维（three dimension的缩写）).
图3:IL-1rn缺失后IL-1β诱导的骨髓生成是由NFκB激活介导的。a–cLSK CD34的RNA测序−Flt3−、长期HSC(LT-HSC)；LSK CD34+Flt3−、短期造血干细胞(ST-HSC)和LSK CD34+Flt3+来自IL-1rn敲除(IL-1rn-KO)与C57BL/6J野生型(WT)小鼠的MPP(n=每组3个)。a火山图显示了从突触ID syn4956655鉴定的差异表达基因(红点)和差异表达NFκB靶基因(蓝点),https://bioinfo.lifl.fr/NF-KB和https://www.bu.edu/nf-kb/gene-resources/target-genes(补充数据1).这些图描绘了前15个差异表达的NFκB靶基因、感兴趣的NFκB靶基因和来自另一个子集共享的那些列表的基因。调整过的p < 0.05; fold change (FC), −0.5 > log2FC > 0.5。b根据NFκB靶基因表达水平计算的NFκB转录因子活性，从Synapse ID syn4956655中鉴定(补充数据1). c骨髓分化基因的表达。dCD11b的频率+髓样细胞，CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞和B220+用载体处理的IL-1rn-KO小鼠外周血(PB)中的淋巴细胞(n= 7)或硼替佐米(n= 6).数据是生物学上独立的动物，意味着SEM。，除了(a).使用双尾Wald检验进行统计分析，使用Benjamini-Hochberg校正进行多重比较(a, c)还是双尾学生的t-测试(b，d).调整过的p < 0.05 (甲，丙)或者p值≤ 0.05(b, d)被举报。源数据作为源数据文件提供。
以B细胞发育为代价的骨髓分化偏向、原始HSC自我更新的减少和承诺MPP的扩展似乎与长期(20天)高剂量(0.5 μg) IL-1β治疗的造血效应一致，尽管存在差异2,3,4，并且体内IL-1rn的缺失在稳态下复制了这些结果(图。2b，d).IL-1β诱导的造血效应依赖于转录程序串行外设接口（Serial Peripheral Interface的缩写）1和Cebpa2,3,4。我们将我们的RNA-Seq数据集与这些先前公开可用的数据集进行了比较，这些数据集使用LSK Flt3研究了C57BL/6 WT小鼠中IL-1β治疗激活的转录程序−CD48−CD150+天然微环境中的HSC(GSE 165810)3或者LSK Flt3−CD48+CD150−白消安调节和移植中的MPP3，有或无YFP表达(GSE166629)4。我们发现了部分细胞类型特异性重叠，在LT-HSC和ST-HSC中由IL-1rn缺失和在LSK Flt3中由IL-1β处理诱导的共享基因的转录激活特别显著−CD48−CD150+HSC(补充图。S4I, J).值得注意的是，所有细胞亚群和实验条件下的上调基因都富含NFκB靶点，包括Cebpd, Csf2rb, Csf2rb2或者串行外设接口（Serial Peripheral Interface的缩写）1(补充图S4I, J).
综上所述，这些结果表明，IL-1β和IL-1rn主要通过LT-HSC和ST-HSC区室控制骨髓输出，并转录控制至少部分依赖于NFκB激活的骨髓分化途径，这些细胞对骨髓输出的贡献主要来自于nfκB的激活。Il1b在缺乏免疫原性刺激的情况下产生。IL-1rn-KO小鼠出现IL-1β诱导的表型，使人想起早期造血系统疾病。
在缺乏免疫原性刺激的情况下，IL-1rn的缺失导致骨髓基质的损伤
成年IL-1rn-KO小鼠表现出早期网织蛋白纤维化，尽管在BM中未检测到胶原沉积的变化(图。4a；补充图S5A).骨髓间充质干细胞数量，确定为基质细胞(CD45−CD31−Ter119−)CD63阳性细胞34CD105或CD105 Vcam-135，以及巢蛋白表示21,36，它们部分重叠21,34,35,36，在IL-1rn-KO小鼠中减少(图。4b；补充图S5B, C).小鼠骨髓基质细胞群的公开单细胞转录数据的再分析(GSE108892)34显示出Cd63表达式与的表达式有很大重叠麻风病人, Cxcl12, Kitl和Il1rn(补充图S5D).因此，BM CD63+大多数随访研究选择基质细胞。BM CD63数量减少+细胞与膜IL-1r1水平的增加相一致(图。4c)，提示IL-1β的潜在作用。用IL-1RN或抗IL-1β单克隆抗体体内治疗证实了IL-1β诱导的间质室损伤，拯救了大量BM CD63+IL-1rn-KO小鼠的基质细胞(图。4d，e).
图4:在缺乏免疫原性刺激的情况下，IL-1rn的缺失导致IL-1β诱导的骨髓基质损伤。a来自C57BL/6J野生型(WT，n= 5)和IL-1rn敲除(IL-1rn-KO，n= 5)老鼠；比例尺、100微米和骨基质骨干网织蛋白纤维的定量(箭头)。b代表性荧光激活细胞分类(FACS)分析(TBM中的细胞，%)和免疫表型的总BM (TBM)数通常定义为CD45−CD31−Ter119−CD63+基质细胞(WT，n= 11;IL-1rn-KO，n= 15).cTBM CD45的频率−CD31−Ter119−CD63+表达IL-1受体的基质细胞(IL-1r1，每组n = 12)和代表性FACS分析(BM CD63中的细胞+基质细胞，%)。dTBM CD45的频率−CD31−Ter119−CD63+用载体处理的IL-1rn-KO小鼠的基质细胞(n= 5)或IL-1RN(n= 6).eTBM CD45的频率−CD31−Ter119−CD63+用同种型(n = 4)或小鼠IL-1β单克隆抗体(IL-1β mAb)处理的IL-1rn-KO小鼠中的基质细胞(n= 5).f骨髓CD45的RNA测序−CD31−Ter119−CD63+基质细胞(n=每组3个)。火山图显示了差异表达的基因(红点)并描绘了感兴趣的基因。调整过的p < 0.01; fold change (FC), −0.5 > log2FC > 0.5。g所选RNA-Seq hits的qRT-PCR mRNA表达(Cxcl12, Vcam1、Angpt1、Lepr、Adipoq), Il1b和Ilrn在独立的生物样本中(n=每组3个，除了麻风病人，WT，n= 5;IL-1rn-KO，n= 6).数据是生物学上独立的动物，对于柱状图意味着SEM，对于小提琴图意味着中位数，除了(f).使用双尾Mann-Whitney进行统计分析U测试(a–中、英、格 麻风病人)，双尾学生的t-测试(d，g除...之外麻风病人)或采用Benjamini–hoch Berg多重比较校正的双尾Wald检验(f). p≤ 0.05 (a–例如)或调整p值< 0.05(f)被举报。源数据作为源数据文件提供。
为了更好地理解骨髓间充质干细胞的改变，在分选的CD45中通过RNA-Seq分析全基因组表达−CD31−Ter119−CD63+细胞。BM CD63中一些最下调的基因+来自IL-1rn-KO小鼠的细胞包括MSC-(麻风病人, Adipoq)和HSC监管-(Cxcl12、Vcam1、Angpt1)基因(图。4f).qRT-PCR证实了这些变化(图。第四代移动通信技术).qRT-PCR数据也揭示了BM CD63中IL-1β正反馈环的参与+IL-1rn-KO小鼠的基质细胞Il1b与WT BM CD63相比的表达+基质细胞和这些细胞产生高水平的Il1rn在成年WT小鼠的BM中(图。第四代移动通信技术);比野生型粒细胞高2.7倍(图。2m).综上所述，缺乏IL-1rn导致IL-1β诱导的BM间质室损伤，BM CD63也有贡献+基质细胞Il1b生产。
在单细胞水平上鉴定骨髓中IL-1β和IL-1rn的来源
为了从单细胞水平进一步了解小鼠骨髓中IL-1β和IL-1rn的主要来源，我们在分选的细胞中进行了单细胞(sc)RNA-Seq和RNA荧光原位杂交(FISH)。在整合来自FACS分选的CD11b的WT和IL-1rn-KO scRNA-Seq数据后+通过Seurat的典型交叉相关分析(CCA)算法，进行无偏细胞聚类分析(图。5a).然后根据ImmGen将WT细胞用于注释37随后应用最大富集分数0.02来标记聚类29使用从GSE137539数据集导入的嗜中性粒细胞样亚群的细胞类型特征38根据单核细胞样簇的GSE131834数据集39以及随后的手动固化。这产生了10个簇，其包含从G0到G4的不同成熟阶段的中性粒细胞、普通单核细胞祖细胞(CMoP I)、单核细胞I和II的两个亚群以及HSC和树突细胞前体的小部分(PreDC II)(图。5a).CD11b+野生型和IL-1rn-KO小鼠骨髓中的骨髓细胞比例相似(图。5a)，G3中性粒细胞和CMoP仅轻微扩增，G4中性粒细胞和II型单核细胞减少(图。5a).不同CD11b“疾病和功能”的独创性途径分析(IPA)+与野生型小鼠相比，IL-1rn-KO小鼠的髓样簇在炎症、增殖、迁移、内吞作用和存活相关的途径中显著富集(补充图。S6A).炎症是CD11b激活的主要途径+来自IL-1rn-KO与WT小鼠的髓样簇，除了G1中性粒细胞没有变化和I型单核细胞显示炎症标记减少(补充图。S6A).在负责这些富集信号的差异表达基因中，我们发现几个主要的促炎基因(Hif1a, Csf2rb, Myd88, Cxcr2, Lmo4)40,41,42,43,44以及抗炎基因的下调(Nfkbia, Cebpb)45,46。一些控制炎症的基因(李世珍)47CD11b表达上调+来自IL-1rn-KO与WT小鼠的髓样簇(补充图。S6B).
图5:在骨髓腔室的单细胞水平上鉴定骨髓中IL-1β和IL-1rn的来源。a–c骨髓CD11b单细胞RNA测序+来自C57BL/6J野生型(WT，n=来自2只生物学上独立的动物的1个样品)和IL-1rn敲除(IL-1rn-KO，n=来自2只生物学上独立的动物的1个样品)小鼠。at-SNE图显示了用Immgen数据库注释的彩色聚类分配，随后对从GSE137539数据集导入的嗜中性粒细胞样亚群的基因签名和从GSE131834数据集导入的单核细胞样聚类的基因签名进行评分。使用最大富集分数0.2和随后的手动固化获得每种细胞类型的聚类分配。带有聚类分布的饼图显示在t-SNE图的右侧。普通单核细胞祖细胞I；树突状细胞前体II；造血干细胞。bt-SNE图可视化表达水平Il1b和Il1rn。彩条，log1p(TP10K)。c细胞比例表示的饼图Il1rn和/或Il1b或者没有，在来自WT小鼠BM的嗜中性粒细胞(N)和单核细胞(M)簇中。d骨髓CD11b的RNA荧光原位杂交+Gr-1你好f4/80−粒细胞和CD11b+Gr-1+f4/80+来自C57BL/6J WT和IL-1rn-KO小鼠的单核细胞(n=每组4只生物学上独立的动物)。细胞表达的代表性图像Il1b(绿色)和/或Il1rn(红色)。用DAPI复染的细胞核。比例尺，10 m。源数据以源数据文件的形式提供。
中性粒细胞，尤其是最成熟的G4细胞是CD11b最丰富的细胞+细胞亚群表达Il1b和Il1rn，并表达最高水平的两种细胞因子，其次是单核细胞(图。5a、b).表达细胞因子的中性粒细胞和单核细胞主要表达Il1b或者Il1rn如scRNA-Seq两者所证明的(图5b，c)和RNA荧光原位杂交(FISH)(图。5d；补充图S7A)，其中小部分细胞特别是G4嗜中性粒细胞中的细胞表达两种细胞因子(图。5c).
类似地，使用Seurat的CCA算法整合来自FACS分选的LSK细胞的WT和IL-1rn-KO scRNA-Seq数据，随后进行无偏细胞聚类(图。6a).来自每个聚类的WT细胞用于注释。从E-MTAB-9208数据集导入的基因模块在LSK聚类上评分29，如前所述，使用最大富集分数0.2获得每种细胞类型的聚类分配29以及随后的人工固化。这产生了6个带注释的聚类，即HSC、HSC-MPP1、MPP2、MPP3、MPP4和MPP5(图。6a).scRNA-Seq数据聚类后的BM LSK细胞的比例显示了与IL-1rn-KO与WT小鼠中BM LSK的免疫表型分析总体相似的变化(图。2b)，HSC和MPP5定性减少，MPP2扩大(图。6a).与FACS定量不同，与WT相比，scRNA-Seq数据显示IL-1rn-KO小鼠BM LSK区室中MPP3转录状态的定性扩展和淋巴样偏向性MPP4的减少(图。6a).来自IL-1rn-KO与WT小鼠的不同LSK簇的“疾病和功能”的IPA显示了与HSC、HSC-MPP1、MPP4和MPP5中激活的肿瘤发生和细胞死亡相关的途径的显著富集(补充图。S8A).MPP2和MPP3表现不同，表现出与存活相关的通路的显著激活(补充图。S8A).此外，致瘤途径在MPP2中被激活，但在MPP3中略有减少(补充图。S8A).通过研究负责这些富集信号的差异表达基因，我们发现已知参与AML的重要基因上调(Nmt1, Ifitm3, 脚本1, Cd52)48,49,50,51和基因的下调，所述基因的表达降低是急性髓性白血病发生的共同特征(Junb)52。我们还发现具有抗增殖作用的基因的上调(Ifitm1)53以及基因的下调，这些基因的缺失会促进细胞衰竭(HeartandLungFoundation心肺基金会)54在来自IL-1rn-KO与WT小鼠的LSK群中(补充图。S8B).
图6:在造血干细胞和祖细胞区室的单细胞水平上鉴定骨髓中IL-1β和IL-1rn的来源。a骨髓单细胞RNA测序−Sca-1+c套件+(LSK)来自C57BL/6J野生型(WT，n=来自2只生物学上独立的动物的1个样品)和IL-1rn敲除(IL-1rn-KO，n=来自2只生物学上独立的动物的1个样品)小鼠。使用最大富集分数0.2和随后的手动处理，用E-MTAB-9208数据集标注的t-SNE图可视化有色聚类分配。带有聚类分布的饼图显示在t-SNE图的右侧。HSC，造血干细胞；多能祖细胞。b骨髓LSK CD34的RNA荧光原位杂交−Flt3−、长期HSC(LT-HSC)；LSK CD34+Flt3−、短期造血干细胞(ST-HSC)和LSK CD34+Flt3+MPP，来自C57BL/6J WT和IL-1rn-KO小鼠(n=每组3只生物学上独立的动物)。细胞表达的代表性图像Il1b(绿色)和/或Il1rn(红色)。用DAPI复染的细胞核。比例尺，10 m。源数据以源数据文件的形式提供。
的表达Il1b和Il1rn在LSK细胞中未被scRNA-Seq检测到(补充图。S8C)，但是RNA-FISH显示LT-HSC表达最高水平的Il1b在LSK亚群中，其次是ST-HSC和MPP(图。6b；补充图S9A).一些Il1b-表达LT-HSC也有可检测的水平。Il1rn表情(图。6b；补充图S9A).
相同的程序用于注释来自FACS分选的CD63的scRNA-Seq数据+具有从GSE128423数据集获得的基因签名的基质细胞35。我们鉴定了5个簇，即小动脉细胞、成纤维细胞、MSC、周细胞和窦细胞(图。7a).CD63内小动脉和窦细胞减少，而周细胞增加+IL-1rn-KO小鼠与野生型小鼠的基质区室(图。7a).CD63的“疾病和功能”的IPA+与MSC相反，来自IL-1rn-KO与WT小鼠的基质簇成纤维细胞显示与分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞相关的途径显著富集，这些细胞被激活，而协调增殖和炎症等功能的基因组减少(补充图。S10A).在负责丰富分化信号的差异表达基因中，我们发现脂肪细胞(Nr1d1, Zbtb16, Nfia)55,56,57软骨细胞(Hspg2, Bmp4, Col3a1)58,59,60和骨细胞谱系分化(Fbn1, 扭曲1, 简化并行过程（Simplified Parallel Process的缩写）1)61,62,63(补充图S10B).所有小动脉、窦状细胞和周细胞簇在与血管生成相关的途径中显示出显著的富集和激活(补充图。S10C).此外，正弦曲线簇显示了炎症、动脉粥样硬化和白细胞募集相关通路的激活(补充图。S10C).我们检查了负责这些富集标记的差异表达基因，发现CD63中主要促炎基因上调。+IL-1rn-KO小鼠相对于WT的正弦曲线簇(Il1b, Il6, Nlrp3, Csf1, 四氯化碳, Ccl6, Ccl9, Osm)(补充图。S10D).
图7:在CD63内的单细胞水平上鉴定骨髓中IL-1β和IL-1rn的来源+基质细胞区室。甲，乙骨髓(BM) BM CD45单细胞RNA测序-CD31-Ter119-CD63+来自C57BL/6J野生型(WT，n=来自2只生物学上独立的动物的1个样品)和IL-1rn敲除(IL-1rn-KO，n=来自2只生物学上独立的动物的1个样品)小鼠。a使用最大富集分数0.2和随后的手动处理，用GSE128423数据集标注的t-SNE图可视化有色聚类分配。带有聚类分布的饼图显示在t-SNE图的右侧。间质基质细胞。bt-SNE图可视化表达水平Il1b和Il1rn。彩条，log1p(TP10K)。c细胞比例表示的饼图Il1rn和/或Il1b或者CD63中没有+来自WT小鼠骨髓的基质细胞团。d骨髓CD45的RNA荧光原位杂交−CD31−Ter119−CD63+来自C57BL/6J WT和IL-1rn-KO小鼠的基质细胞(n=每组4只生物学上独立的动物)。细胞表达的代表性图像Il1b(绿色)和/或Il1rn(红色)。用DAPI复染的细胞核。比例尺，10 m。源数据以源数据文件的形式提供。
我们发现细胞表达Il1b, Il1rn或者两者都在CD63内+基质细胞区室均通过scRNA-Seq(图。7b-c)和RNA-FISH(图。7d；补充图S11A).scRNA-Seq能够解决这个问题Il1b/Il1rn主要由CD63内的MSC和小动脉细胞产生+基质细胞区室和大多数表达细胞因子MSC表达Il1rn只有小动脉细胞主要表达Il1b或者两者都有，一小部分表达Il1rn仅(图。7a–c).一小部分正弦细胞也表达Il1b仅(图。7a–c；补充图S11A).
总之，这些数据强调了IL-1rn主要通过CD63亚群的特异性表达来缓冲旁分泌IL-1β前馈环+MSC、中性粒细胞和单核细胞以及一小部分CD63+稳态条件下野生型健康小鼠骨髓中的小动脉细胞。自分泌反应是罕见的，主要在LT-HSC和CD63亚群中观察到+小动脉细胞和小部分主要在G4内的嗜中性粒细胞，同时表达两种细胞因子。
低IL-1rn是体内白血病前期骨髓生成的标志
AML患者中IL-1RN的减少和HSPC IL-1RN缺失的影响提示其在血液疾病中的作用。为了解决这种可能性，我们使用了mx1-中铁快运NRAS分公司G12D异常白血病前骨髓生成的小鼠模型64,65，从此简称为NRAS-G12D+。如前所述，白血病前期NRAS-G12D+HSPC胜过野生型细胞(补充图。S12A)65。初级NRAS-G12D+小鼠表现出轻度造血表型，特征为慢性粒单核细胞白血病66,67循环白细胞增加，特别是骨髓细胞。在BM中，c-Kit的数量+祖细胞和LSK HSPC在NRAS-G12D中较高+所有LSK亚群相对数量异常的小鼠(补充图。S12B–E)64。详细的分析显示，NRAS-G12D小鼠BM中HSC、MPP5和MPP1减少，MPP4增加+小鼠(补充图。S12F).更多的CLP和GMP祖细胞在NRAS-G12D的骨髓中扩增+对比对照小鼠(补充图S12G).
RAS通过MyD88转导IL-1β信号，致癌RAS通过在其他类型的癌症中持续激活自分泌反馈环导致IL-1β扩增68。NRAS-G12D患者白细胞介素-1β水平+BM增加，而患病小鼠BM中的IL-1rn水平降低(图。8a、b).在这个阶段，骨髓细胞增生显著，先前描述的产生IL-1-β的细胞亚群扩增，包括中性粒细胞、单核细胞和LSK细胞(图。8c).的表达Il1b在来自NRAS-G12D骨髓的粒细胞或单核细胞中没有被诱导+小鼠与健康对照组相比，这些造血细胞并没有表现出减少的表达Il1rn要么(图。8d).相比之下，所有的HSPC亚群表达更高水平的Il1b通过qRT-PCR测量，以及Il1rn在NRAS减少了-G12D+对比仅对照MPP(图。8e). Il1rap在研究的任何造血细胞群体中，基因表达都没有变化(图。8d，e)，但是表达膜IL-1RAP的细胞比例在NRAS-G12D中更高+对比对照LT-HSC、MPP和单核细胞(图。8f；补充图S12H).为了更好地了解HSPC在IL-1β诱导的NRAS-G12D骨髓炎症环境中的特殊作用+小鼠，在LT-HSC、ST-HSC和MPP中通过RNA-Seq进行基因表达谱分析。LT-HSC和MPP的转录程序都受到NRAS-G12D表达的影响，分别有894和651个差异表达基因。NRAS-G12D表达对ST-HSC的影响较小，有340个基因差异表达(补充图。S12I).PCA显示重复的一致聚类，并揭示LT-HSC受NRAS-G12D表达的影响最大(补充图。S12J).全NRAS-G12D+HSPC亚群表现出NFκB转录因子计算活性增加(图。8g).NRAS-G12D祖细胞的骨髓偏向性+通过用硼替佐米治疗可以改善小鼠的体内状况(图。8h).综上所述，NRAS-G12D中的偏向性骨髓生成+在HSPC，小鼠至少部分依赖于NFκB的激活，而HSPC通过增加IL-1β的表达，导致IL-1β通路抑制的丧失Il1b和膜IL-1RAP的表达降低Il1rn以MPP为例。
图8:低IL-1rn存在于白血病前骨髓生成的小鼠模型中。
a对照的骨髓(BM)细胞外液(BMEF)中的细胞因子水平(Mx1-Cre− NRASG12D)和NRAS-G12D+ (Mx1-Cre+ NRASG12D)老鼠。IL-1β(对照，n= 6;NRAS-G12D+, n= 5)、IL-6(对照、n= 4;NRAS-G12D+, n= 3)、白介素-10(n=每组5个)、IFN-γ(对照、n= 6;NRAS-G12D+, n= 5)和TNF-α(对照，n= 6;NRAS-G12D+, n= 5)级。bBMEF的IL-1rn水平(对照，n= 17;NRAS-G12D+, n= 16).c总BM (TBM)中的细胞数和CD11b的TBM数+Ly6G+中性粒细胞，CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞和Lin−Sca-1+c套件+(LSK)细胞(n=每组3个)。d、eqRT-PCR mRNA在(d)CD11b+Gr-1你好f4/80−粒细胞Il1b(控制，n= 11;NRAS-G12D+, n= 9),Il1rn(对照，n = 16NRAS-G12D+, n= 9)和Il1rap(控制，n= 3;NRAS-G12D+, n= 5)和CD11b中+Gr-1+f4/80+单核细胞Il1b(控制，n= 13;NRAS-G12D+, n= 11),Il1rn(控制，n= 17;NRAS-G12D+, n= 16)和Il1rap(控制，n= 3;NRAS-G12D+, n= 5).eLSK亚群:LSK CD34−Flt3−、长期造血干细胞(LT-HSC)；LSK CD34+Flt3−、短期HSC(ST-HSC)；LSK CD34+Flt3+，多能祖细胞(MPP)Il1b(LT-HSC控制，n= 7;NRAS-G12D+, n= 8;ST-HSC对照，n = 8；NRAS-G12D+, n= 7;MPP，n=每组8个)，Il1rn(LT-HSC控制，n= 4;NRAS-G12D+, n= 6;ST-HSC，MPP控制，n= 4;NRAS-G12D+, n= 8)和伊尔拉普 (n=每组4个)。fTBM CD34的频率−Flt3−造血干细胞，CD34+Flt3−造血干细胞，CD34+Flt3+MPP，CD11b+Gr-1你好f4/80−粒细胞和CD11b+Gr-1+f4/80+表达IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAP，每组n = 4)的单核细胞。g根据NFκB靶基因表达水平计算的NFκB转录因子活性，从Synapse ID syn4956655中鉴定(补充数据1)，来自LT-HSC、ST-HSC和MPP中的RNA测序数据(n=每组3个)。hNRAS-G12D外周血(PB)中单核细胞的数量+用赋形剂治疗的小鼠(n= 3)或硼替佐米(n= 4).数据是生物学上独立的动物，对于条形图来说是均值±标准差，对于小提琴图来说是中位数。统计分析是用双尾学生的t-测试(a–d、fLT-HSC，g，h)或双尾曼恩–惠特尼U测试(英、法LT-HSC除外)。p报告值≤ 0.05。源数据作为源数据文件提供。
然后我们研究了间质区室，发现BM CD63减少+基质细胞数量(图。9a)以及NRAS-G12D中凋亡率的增加+老鼠(图。9b).BM CD63+对基质细胞进行分类，qRT-PCR分析显示Il1b和Il1rap但是减少了Il1rn在BM CD63中+来自患病小鼠的基质细胞(图。9c).巢蛋白数量减少+基质细胞和转录组水平的凋亡激活通过使用Nes-gfp先前接受NRAS-G12D的小鼠+与对照BM的接受者相比(补充图。S13A, B).因此，在NRAS-G12D中存在对微环境的破坏+白血病前骨髓生成的小鼠模型和MSC导致骨髓中低IL-1rn。
图9:白血病前期骨髓生成的小鼠模型中骨髓基质的损伤。a代表性荧光激活细胞分选(FACS)分析(全骨髓中的细胞；TBM，%)和CD45的TBM数−CD31−Ter119−CD63+来自对照的基质细胞(Mx1-Cre− NRASG12D)和NRAS-G12D+ (Mx1-Cre+ NRASG12D)老鼠(n=每组3个)。b代表性FACS分析(BM CD63中的细胞+基质细胞，%)和CD45内活细胞、早期凋亡细胞(E.A .)和晚期凋亡细胞(L.A .)的频率−CD31−Ter119−CD63+对照的TBM中的基质区室(n= 8)和NRAS-G12D+ (n= 5)老鼠。cqRT-PCR mRNA在CD45中的表达−CD31−Ter119−CD63+基质细胞Il1b(控制，n= 15;NRAS-G12D+, n= 18),Ilrn(控制，n= 16;NRAS-G12D+, n= 18)和Il1rap(控制，n= 4;NRAS-G12D+, n= 5).数据是生物学上独立的动物，对于条形图来说意味着SEM，对于小提琴图来说意味着中位数。统计分析是用双尾学生的t-测试(甲、乙、丙除...之外Il1rn)或双尾曼-惠特尼U检验(c Il1rn). p报告值≤ 0.05。源数据作为源数据文件提供。
最大限度地减少潜在的混淆效应贷方（即credit）在骨系细胞中的表达69以及通过注射polyI:polyC瞬时激活IFNα信号70，我们使用了一个条件模型，它组成性地表达了NRASG12D在造血系统的控制下Vav-Cre67。该小鼠模型复制了主要的造血异常mx1-中铁快运NRAS分公司G12D小鼠包括循环白细胞增加，特别是单核细胞，骨髓细胞增多，免疫表型扩展，典型的LSK HSPC，特别是MPP4和CLP(补充图。S14A–F).通过Lin的RNA-Seq分析公开可获得的基因表达谱−c套件+Sca-1−(LK)祖细胞67显示NFκB转录因子计算活性较高Vav-Cre NRASG12D与对照小鼠相比(补充图。S14G).
从造血或间质区室中缺失IL-1rn可促进白血病前骨髓生成，而外源性IL-1rn可防止其发生
为了阐明IL-1rn在白血病前期骨髓生成中的作用，我们用WT和IL-1rn-KO小鼠建立了混合嵌合体系统；WT和NRAS-G12D+老鼠；或IL-1rn-KO和NRAS-G12D+小鼠，作为骨髓的供体给野生型受体(图。10a).造血细胞中IL-1rn的缺失与IL-1rn的存在有协同作用。NRASG12D以促进骨髓输出(图。10b).b细胞显示没有变化的存在NRASG12D不考虑WT或IL-1rn缺陷的竞争细胞(图。10c).
图10:从造血或基质区室中删除IL-1rn促进白血病前骨髓生成，并且它是治疗靶向的。a–cC57BL/6J野生型(WT)小鼠用作来自WT和IL-1rn敲除(IL-1rn-KO)小鼠的骨髓(BM)有核细胞的竞争性移植物(1∶1)的受体(n= 5)，WT和NRAS-G12D+老鼠(Mx1-Cre+ NRASG12D, n= 5)或IL-1rn-KO和NRAS-G12D+老鼠(n= 6).a实验设计的说明。r:收件人。d:供体细胞。bCD11b数量+髓样细胞，CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞和CD11b+Gr-1你好f4/80−外周血中的粒细胞。cB220的数量+PB中的淋巴细胞。（d–f)C57BL/6J WT小鼠被用作来自NRAS-G12D的BM有核细胞的受体+老鼠(n= 20;单核细胞n= 21)，并将IL-1rn-KO小鼠用作来自对照的BM有核细胞的受体(Mx1-Cre− NRASG12D, n= 19)和NRAS-G12D+老鼠(n= 19)，超过4次独立实验。d实验设计的说明。eCD11b数量+髓样细胞，CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞和CD11b+Gr-1你好f4/80−PB中的粒细胞。fB220的数量+PB中的淋巴细胞。g–iNRAS-G12D+小鼠用赋形剂(n= 9)或IL-1RN(n= 8).g实验设计的说明。多聚肌苷:多聚胞嘧啶。hCD11b数量+髓样细胞，CD11b+Gr-1+f4/80+单核细胞和CD11b+Gr-1你好f4/80−PB中的粒细胞。iB220的数量+PB中的淋巴细胞。数据是生物学上独立的动物，对于条形图来说意味着SEM，对于小提琴图来说意味着中位数。统计分析是用双尾学生的t-测试(b、c、e髓样D NRAS-G12D+:R IL-1rn-KO与R WT，单核细胞D NRAS-G12D+:R WT对D对照:R IL-1rn-KO，D NRAS-G12D+:R IL-1rn-KO对R WT，h)或双尾曼恩–惠特尼U测试(e髓样D NRAS-G12D+:R WT对D对照:R IL-1rn-KO，D NRAS-G12D+:R IL-1rn-KO与D对照，单核细胞D NRAS-G12D+:R IL-1rn-KO与D对照，粒细胞，f). p报告值≤ 0.05。源数据作为源数据文件提供。
为了研究IL-1rn缺乏在白血病前期骨髓生成中的作用，我们使用WT和IL-1rn-KO小鼠作为诱导无病骨髓的受体进行移植NRASG12D控制和mx1-中铁快运NRAS分公司G12D老鼠(图。10d).在移植了患病NRAS-G12D的IL-1rn-KO小鼠中，循环骨髓细胞，特别是单核细胞的数量较高+与WT受体相比的细胞(图。10e).b细胞仅在移植了患病NRAS-G12D的IL-1rn-KO小鼠中扩增+细胞(图10f).这些结果表明，通过骨髓造血或间质细胞中IL-1rn缺失而导致的IL-1β抑制的丧失可能在白血病前期疾病中起作用。这些数据进一步证明了骨髓间充质干细胞数量的减少和它们Il1rn诱导表达mx1-中铁快运NRAS分公司G12D老鼠(图。9a、c)贡献给NRAS-G12D+疾病。
相反，短期体内治疗诱导mx1-中铁快运NRAS分公司G12D具有IL-1RN的小鼠(图。10g)通过减少循环骨髓细胞，特别是单核细胞，改善了异常骨髓生成的早期迹象(图。10小时)，在B细胞中没有检测到变化(图。10i).因此，低IL-1rn水平有助于NRAS-G12D中的偏向性骨髓生成+老鼠。这些数据揭示了内源性IL-1阻遏物IL-1rn对白血病前期骨髓生成的保护作用。
