上皮和骨髓是次要来源
上皮细胞向间充质状态的转分化，通常称为上皮-间充质转化(EMT ),是一个基本的胚胎发育过程，也与癌症进展有关16。先前的工作表明，一些胰腺肿瘤细胞表达成纤维细胞标记物17。因此，我们首先试图评估EMT是否有助于PDAC的CAFs。为此，我们进行了掺入FlpO依赖的细胞追踪实验R26绿色荧光蛋白记者18进入KPF模型(称为KPFG型号)(图。1a).这利用了FlpO的上皮特异性表达来重组R26绿色荧光蛋白报告等位基因，导致上皮细胞及其后代永久表达GFP。在目前的研究中，成人胰腺中的成纤维细胞被定义为位于间质或间质中的细胞，对包括波形蛋白(VIM)、PDGFRα、PDGFRβ、PDPN或αSMA在内的标记物呈阳性，对其他谱系标记物呈阴性。尽管上皮细胞有很强的GFP标记，但在肿瘤间质中很少观察到GFP +细胞。这一观察结果不同于以前的报告17，可能是由于小鼠模型系统的差异。与这一观察结果一致，免疫组织化学(IHC)染色显示少数细胞共表达GFP和成纤维细胞标记物PDGFRβ和αSMA(图。1b–d，补充图。1a、b).我们还将胰腺分离成单细胞，并用细胞类型特异性标记物进行流式细胞术分析(图。1e–h补充图。1e–k，8a).这一分析表明，虽然80%以上的EpCAM+上皮细胞被GFP标记，但是很少的PDPN+或ppdgfrα+caf(< 5%)被GFP标记。不出所料，造血细胞(CD45+)和内皮细胞(CD31 +)也很少被GFP标记。在正常胰腺中进行的类似的IHC和流式细胞术分析仅包含FlpO和R26绿色荧光蛋白报道等位基因显示了相似的结果(图。1h，补充图。1c，d).总之，这些数据表明，上皮细胞很少分别在正常和荷瘤小鼠中产生常驻成纤维细胞和caf。
骨髓来源的细胞已经被建议在包括胰腺癌在内的多种癌症类型中迁移、繁殖并产生caf19。因此，我们考虑了骨髓细胞是否是caf的一个重要来源KPF模型。为此，骨髓细胞从UBC绿色和平组织GFP普遍表达的供体小鼠20被移植到受辐射的KPF老鼠(图。1i).这种移植方法在补充骨髓方面得到了很好的确立21,22,23,24。小鼠长期存活(数据现已显示)和GFP +血细胞的持久性(补充图。1u)在我们目前的研究中证实了骨髓移植的成功。然后从这些建立了PDAC的嵌合小鼠中收获胰腺。GFP标记的细胞在KPF胰腺中比在同窝出生的正常胰腺中更丰富(补充图。1m，n).尽管如此丰富，只有少数细胞共表达GFP和成纤维细胞标记物αSMA和PDGFRβ(图。1j–l，补充图。1o，q–r).此外，使用附加细胞标记物的IHC和流式细胞术分析显示，绝大多数GFP +细胞是造血细胞(图。1m–p和补充图。1l，p，s–t，8b).从这些数据中，我们得出结论，骨髓也是常驻成纤维细胞和caf的较小(小于10%)组织来源。
ISL1 +间充质细胞产生TRFs
正常胰腺中的成纤维细胞可以是非脂质储存的25或脂质储存，后者通常被称为星状细胞26。在目前的研究中，正常胰腺中的所有成纤维细胞都被称为组织常驻成纤维细胞(TRFs)。基于计算模型，TRF已经被建议产生CAFs27和体外培养28。最近，谱系追踪研究表明，一个TRFs的子集贡献了大约一半的CAF库25而星状细胞构成胰腺caf的一个小的子集29。我们试图首先确定胎儿TRFs的祖细胞。通常认为成纤维细胞来源于胎儿发育过程中的中胚层。原肠胚形成后，中胚层经历一系列分化，形成不同的谱系，包括内脏间充质30。内脏间充质是在胎儿发育期间与前肠内胚层相邻的一层中胚层，并且先前已经显示产生前肠衍生器官的基质细胞31, 32。由于胰腺也是前肠来源的器官，我们假设内脏间充质细胞是成人胰腺中TRFs的胚胎来源。通过分析先前发表的发育中前肠的单细胞RNA测序数据集33，我们注意到转录因子Isl Lim同源结构域1 (ISL1)的表达，以及其他已建立的内脏标记，在内脏间充质群中富集(图。2a，b，补充图。2a，b).这与先前证明ISL1是内脏间充质细胞标志之一的研究一致33,34,35,36,37。我们通过免疫染色证实ISL1蛋白在小鼠胚胎第9.5天的胰腺内胚层周围的间充质中表达(图。2c，d)，与公布的结果一致35。受到先前研究的鼓舞Isl1贷方（即credit）谱系追踪前肠衍生器官(肺和食管)的基质成分36, 37我们假设Isl1贷方（即credit）可用于靶向胰腺周围的内脏间质。为了测试这一点，我们构建了一个I贷方（即credit）T记者鼠标模型，结合了Isl1贷方（即credit）等位基因38和一个依赖cre的人R26番茄等位基因(图。2g).这种遗传方法允许重组R26番茄ISL1表达细胞中的等位基因，从而不可逆地用番茄表达标记它们的所有后代。I贷方（即credit）T在E12.5标记胰腺上皮周围内脏间充质的等位基因(图。2e，f，补充图。2c–e).这些番茄+细胞的谱系追踪显示标记细胞在成人胰腺中持续存在。番茄+细胞散布在胰腺的实质和血管周围区域。它们缺乏上皮标记物ECAD的表达，而是表达成纤维细胞标记物VIM和PDGFRβ，表明它们具有成纤维细胞特性(图。2h–k，补充图。2f).分离的成人胰腺的流式细胞仪分析显示约80%重叠的番茄和两个额外的成纤维细胞标记物PDPN和PDGFRα(图。2l–n，补充图。8c).这种重叠明显高于胰腺中任何其他主要细胞类型(图。2n).这与显示番茄和巨噬细胞标记F4/80之间最小重叠的组织切片上的免疫染色一致(补充图。3a–c).此外，我们体外培养了这些胰腺的成纤维细胞，绝大多数成纤维细胞表达番茄蛋白(补充图。2g–j).总之，这些数据表明，在正常成人胰腺中，表达ISL1的内脏间充质细胞是TRFs的胚胎来源。
图2:成人胰腺中的组织常驻成纤维细胞来自胎儿发育期间表达ISL1的内脏间充质细胞。aE9.5小鼠前肠细胞单细胞转录组谱的聚类分析。b Isl1投影到簇上的表达式(a).虚线描绘了内脏间充质簇。cE9.5小鼠胚胎的侧视图。虚线表示胰腺水平的横切面。d对小鼠前肠的免疫染色显示在(c). n= 3个胚胎。e, f解剖胰腺的整体免疫染色。黄色虚线描绘上皮，而黄色和白色线描绘内脏间充质。n= 3胰脏。gI的原理图贷方（即credit）t鼠模型。h–k成人胰腺的共免疫染色和对确定标记物的单阳性或双阳性细胞的定量。n= 5只老鼠。l–n流式细胞术分析I贷方（即credit）t成人胰腺和由标记确定的群体中番茄+细胞的定量。番茄，n= 5只老鼠；我贷方（即credit）t，n= 9只老鼠。数据为平均值±标准差。使用Tukey多重比较进行双向ANOVA检验。**表示p < 0.0001. ns, not significant, p= 0.547.e、胚胎日；epi，上皮；中胚层，中胚层；spl，内脏间质。箭头表示番茄+细胞。比例尺在(c–f):100微米；在(h–j):30 μm。源数据作为源数据文件提供。
ISL1 +间充质细胞产生caf
我们接下来研究了ISL1 +内脏间充质细胞也可能引起胰腺CAFs的可能性。为了测试这个假设，我们结合了I贷方（即credit）T报告基因与KPF等位基因(图。3a).这种方法利用了FlpO/Frt和Cre/LoxP作为独立的DNA重组酶系统的独立功能，允许我们对示踪番茄标记的间充质细胞(通过I贷方（即credit）T)在肿瘤发生期间(通过KPF).我们将这种双重DNA重组酶模型称为“KPFI贷方（即credit）T".当30天大的时候KPFI贷方（即credit）T小鼠主要表现为胰腺上皮内肿瘤(PanIN)病变，50日龄小鼠表现为PDAC。我们检查了解剖的胰腺中番茄的表面荧光。在胰腺的主体中，我们观察到正常胰腺中的最小信号，在潘宁阶段的局部点状信号，以及在PDAC阶段遍及整个胰腺的显著增加的信号(图。3b，c).这些胰腺的切片和染色证实了早期胰腺病变周围的番茄+细胞的局部扩增，以及PDAC番茄+细胞的普遍扩增(图。3d，e，补充图。3g，h)，表明伴随肿瘤进展的番茄标记细胞的逐渐扩大。进行已知标记的共染色以严格检测表达报道基因的细胞类型。这表明番茄+细胞表达成纤维细胞标记VIM、PDGFRβ和αSMA，并构成CAFs的大部分(图。3f–I).肿瘤组织薄片的整体染色和分离的胰腺的流式细胞术分析都显示了相似的结果(图。3j–l，补充图。3d–f，补充图。8c，e).因此，这些数据表明caf来源于胎儿内脏间充质细胞。
图3:大多数胰腺癌相关的成纤维细胞在KPFI被靶向贷方（即credit）t型。a的原理图KPFI贷方（即credit）T老鼠模型。b, c解剖的胰腺和脾脏的亮视野和红色荧光面视图。正常，n= 3只老鼠；潘宁，n= 6只小鼠；PDAC，n= 3只老鼠。箭头表示红色荧光点。d–f对胰腺组织进行共免疫染色，并对确定标志物的单阳性或双阳性细胞进行定量。潘宁，n= 4只老鼠；PDAC，n= 5只老鼠。g–I对胰腺组织进行共免疫染色，并对确定标志物的单阳性或双阳性细胞进行定量。PDGFRβ，n= 5只老鼠；αSMA，n= 4只老鼠。j–l流式细胞术分析KPFI贷方（即credit）T胰腺和由标记确定的群体中番茄+细胞的定量。番茄，n= 5只老鼠；KPFI贷方（即credit）T, n= 7只老鼠。数据为平均值±标准差。使用Tukey多重比较进行双向ANOVA检验。****表示p < 0.0001; ns, not significant, p= 0.379.胰腺上皮内瘤形成；PDAC，胰腺导管腺癌；spl，脾脏；潘，胰腺。箭头表示番茄+细胞。比例尺在(b, c):1000微米；在(d, e):50微米；在d’, e’, g, h:30 μm。源数据作为源数据文件提供。
ISL1 +间充质细胞的脉冲标记
上述分析还揭示了番茄在胰头上皮细胞中的区域化表达，与癌症阶段无关(图。4a、b).这表明ISL1可能在胎儿发育期间在间质和上皮前体细胞中动态表达。为了测试这个假设，我们利用了一个诱导型Isl1筒子架等位基因39和R26番茄报告人暂时限制cre活动。用这个I筒子架T模型中，我们通过在E8.5、E9.5或E10.5(胰腺上皮细胞特定的时期)给怀孕小鼠提供单脉冲的他莫昔芬(Tam)管饲法激活了creER。我们发现激活I筒子架T通过Tam在所有三个时间点导致胰腺成纤维细胞的靶向(图。4c–我，补充图。4a–c).有趣的是，胰头的一些上皮细胞被E8.5 Tam靶向；基本上没有上皮细胞被E9.5 Tam靶向；并且用E10.5 Tam靶向少量胰岛内分泌细胞(图。4c–我).总之，这些实验表明E9.5处的Tam脉冲靶向内脏间充质细胞，并且专门标记正常成人胰腺中具有番茄表达的成纤维细胞。
图4:KPFI筒子架T模型专门针对胰腺中的成纤维细胞。a–h胰腺组织的联合免疫染色(集中在胰岛区或腺泡区)比较I贷方（即credit）T模型和I筒子架T在指定时间点用他莫昔芬治疗的模型。箭头表示番茄+上皮细胞。i对图像中定义的标记物呈单阳性或双阳性的细胞进行量化，以(a–h). I贷方（即credit）T, n= 5只老鼠；I筒子架T+ Tam E8，n= 5只老鼠；I筒子架T+ Tam E9，n= 6只小鼠；I筒子架T+ Tam E10，n= 4只老鼠。j示意图KPFI筒子架T老鼠模型。k, l解剖的胰腺和脾脏的亮视野和红色荧光面视图。I筒子架T, n= 6只小鼠；KPFI筒子架T, n= 7只老鼠。m通过流式细胞术鉴定的PDPN+、PDGFRα+、CD45+、EpCAM+或CD31+细胞中番茄+细胞的定量。番茄，n= 5只老鼠；I筒子架T, n= 8只小鼠；KPFI筒子架t，n= 7只老鼠。n–q正常和PDAC胰腺组织中番茄、VIM和PDGFRβ的联合免疫染色。箭头表示双阳性细胞。数据为平均值±标准差。使用Tukey多重比较进行双向ANOVA检验。****表示p < 0.0001; ns, not significant, p> 0.9999.Spl，脾脏；潘，胰腺。放大比例尺a–h和n–q:30 μm Sca勒巴内斯k, l:1000 μm。源数据作为源数据文件提供。
在定义了胰腺成纤维细胞可以被creER激活标记的最佳发育窗口后，我们使用这种方法来检测内脏间充质细胞是否在胰腺成纤维细胞中产生CAFs。KPF老鼠。为此，在E9.5用单个Tam脉冲怀孕雌性，并追踪内脏间充质细胞的后代KPFI筒子架T后代(图。4j).胰腺如前所述进行分析。类似地，当与具有正常胰腺的同窝出生的小鼠相比时，荷瘤小鼠中的番茄+成纤维细胞大量扩增(图。4k，l).重要的是，与其他类型的细胞相比，番茄的表达对成纤维细胞具有高度的鲁棒性和特异性(图。4m–q补充图。4d–f， 5a–f, 8c).胰头尖端的番茄标记比主体稍弱。在肺和肝中没有观察到番茄+细胞的扩增(补充图。5j，k).与在胰腺肿瘤中观察到的扩张一致，这些番茄+成纤维细胞是增殖性的，如Ki67表达所证明的(补充图。5g–I).从这些数据中，我们得出结论，内脏间充质是正常和荷瘤胰腺中成纤维细胞的主要来源。
图5:的单细胞分析KPFI贷方（即credit）T模型表明在内脏谱系中有一个保守的基因标记。a单细胞RNA测序实验设计示意图。将胰腺分离成单细胞，并分类成造血细胞(CD45+)、内皮细胞(CD31+)/上皮细胞(EPCAM+)或成纤维细胞(PDPN+或PDGFRα+或番茄+)。造血细胞与内皮/上皮细胞以1∶1的比例结合。然后对细胞进行10X RNA测序。b合并UMAP空间中每个样本类型的拆分视图。c基于标记基因表达的细胞团UMAP注释。d投射到细胞簇上的番茄基因表达。c, d圆圈线描绘成纤维细胞群。e与TRFs相比，在内脏间充质和CAFs中高表达的基因的热图(上块)，以及与CAFs相比，在内脏间充质和TRFs中高表达的基因的热图(下块)。f与小鼠分析中鉴定的基因相关的顶级生物过程(e)和人体分析(g). g与人胰腺TRF相比，在内脏间充质和人胰腺caf中高表达的基因的热图(上块)，以及与人胰腺caf相比，在内脏间充质和人胰腺TRF中高表达的基因的热图(下块)。Spl内脏、中胚层、CAFs癌相关成纤维细胞、TRFs组织常驻成纤维细胞。
单细胞转录组分析
为了公正地检测番茄在不同类型细胞中的表达，我们进行了单细胞RNA测序I贷方（即credit）T(正常)和KPFI贷方（即credit）T(肿瘤)胰腺。胰腺中的不同细胞群通过基于细胞表面标记物表达的流式分选而富集(图。5a，补充图。8d).分离单细胞并对其转录组进行测序。单细胞表达数据被合并成一维缩减图(图。5b).我们根据标记基因表达和与已发表数据集的交叉检验，确定了胰腺中所有主要的细胞类型10(图。5c补充图。6, 7a–d).与之前的分析一致，与其他细胞群相比，成纤维细胞群中的番茄表达更丰富(图。5d).重要的是，炎性细胞因子和肌成纤维细胞因子10, 28有番茄表达(图。5c，d，补充图。7f–我)，表明这两种亚型都来源于内脏间充质细胞，这一发现与这些细胞类型导致的胰腺疾病显著相关。我们还注意到一部分iCAFs显示出较低的番茄信号(图。5c，d，补充数据1).然后，我们比较了正常胰腺成纤维细胞(TRFs)、PDAC胰腺成纤维细胞(CAFs)和E9.5前肠内脏间充质细胞的基因表达谱。该分析鉴定了一组在内脏间充质和TRFs中高表达的基因，以及另一组在内脏间充质和CAFs中高表达的基因(图。5e，补充数据2, 3，图。7e).对人胰腺TRFs进行了类似的分析40和胰腺咖啡馆41显示了相似的模式(图。5f，g，补充数据4).内脏间充质细胞和TRFs之间共享的基因组可能参与形态发生和体内平衡，内脏间充质细胞和CAFs之间共享的基因组可能代表在肿瘤发生过程中重新激活的胎儿程序。我们还发现了在小鼠和人类成人胰腺TRFs和CAFs中存在的胎儿内脏基因标记(补充图。7j，k).后一种数据表明，在小鼠和人类中，内脏基因标记在发育、成年和癌症过程中持续表达。维持这些细胞群的分化和功能可能需要这些基因的表达。
