局部进展期胃癌的免疫关卡阻断、抗血管生成和化疗新辅助治疗

胃癌仍然是全球的主要杀手，发病率排名第五，死亡率排名第四1。根治性切除是治愈和延长生存期的最佳治疗选择2。在之前的三期魔法中3还有FFCD4临床试验显示，围手术期化疗比单纯手术有更高的5年生存率。与不含紫杉醇的方案相比，FLOT方案进一步提高了R0切除率并延长了总生存期(OS)5。然而，cT4患者在该试验中仅占不到10%5。在最近的PRODIGY研究中6新辅助DOS方案(多西他赛、奥沙利铂和S-1[替加氟/吉美司他/氧嗪酸])和辅助S-1显著提高了术后3年无进展生存率(PFS )( 66.3相对。59.8个月)，并导致10.4%的病理完全反应。虽然在这个试验中70%的患者是cT4，但是cT4a占到了89%。此外，cT4N+组显示出比cT4N-和cT2-3N+患者差的结果，并且没有单独针对cT4bN+患者的亚组分析6.

最近，在III期随机对照试验中，免疫检查点抑制剂(ICIs)在晚期胃癌的三线治疗中取得了优于安慰剂的结果7。在一线环境中，与单纯化疗相比，ICI联合化疗显示出延长的OS和PFS，并且在CheckMate 649中PD-L1 CPS ≥ 5的患者中死亡风险降低20-35%8和东方-169。理论上，由于完整的免疫系统、充足的新抗原和低肿瘤克隆性，新辅助疗法是免疫疗法的最佳选择10。对基于ICI的新辅助疗法的研究已成功用于可切除的非小细胞肺癌11,12。它是否对胃癌有效，尤其是对局部晚期胃癌，仍未完全研究清楚。

肿瘤血管生成在肿瘤进展中起重要作用。像ICIs一样，抗血管生成剂靶向肿瘤细胞以外的肿瘤微环境(TME)成分，并通过促进CD8与ICIs协同作用+t淋巴细胞浸润和激活13。Ramucirumab，一种抗VEGFR2抗体14和阿帕替尼，一种VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂15，已被证明可延长OS，并分别被批准用于晚期胃癌的二线和三线治疗。在几项I/II期研究中，它们已被证明可对TME进行重新编程，逆转炎症状态的免疫抑制，并增强ICIs的功效16,17,18。因此，在ICIs加化疗方案中加入抗血管生成药物可能会增强新辅助疗效。

在这项II期试验中，我们探讨了新辅助/常规联合治疗(抗PD1抗体(camrelizumab)、抗血管生成药(apatinib)和化疗(S-1奥沙利铂)对T4a/bN+M0期胃癌患者的疗效和安全性。完全缓解率和主要病理缓解率分别为15.8%和26.3%。连续多组学测试，包括全外显子组测序(WES)、转录组测序和T细胞受体(TCR)测序，揭示了新辅助免疫治疗期间显性肿瘤亚克隆、免疫微环境和T细胞受体库的病理反应和动态变化的几个推定生物标志物。

患者特征

在2019年5月至2021年8月期间，有25名患者入选，年龄在48至70岁之间，其中19名为男性，11名为cT4aN+和14名为cT4bN+(表1)。所有患者都完成了新辅助治疗和重新评估手术(图。1b).补充表中列出了详细的治疗方案和周期数1。其中，4例不可切除，2例拒绝手术，剩下19例患者接受了切除，可评估其病理反应(补充图。1).中位随访时间为24.7个月(四分位数，20.9-31.8个月；图。1b).

a研究的试验方案。cT4N+患者接受新辅助camrelizumab、阿帕替尼、S-1联合或不联合奥沙利铂，随后进行手术切除。主要终点是病理反应及其潜在的生物标志物。在基线和手术时收集肿瘤和血液样本用于多组学分析。b参与本试验的25名患者的游泳图。c根据放射学影像，肿瘤大小从基线改变。d根据临床T分期(左图2)和病理反应(右图2)分层的无病生存率和总生存率的Kaplan-Meier曲线。采用对数秩检验。*代表微卫星不稳定性高的肿瘤患者b和c。源数据作为源数据文件提供。

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临床疗效

在11例cT4aN+胃癌患者中，9例(81.8%)实现了放射降级。3名(27.3%)患者有部分缓解，8名(72.7%)患者病情稳定(图。1c).其中9例接受了R0切除手术。两次切除被认为是姑息性的，因为在手术中发现了腹膜转移(图。1b).在平均26.7(四分位数，25.0–36.4)个月的随访中，9名接受根治性切除术的患者中有7名(77.8%)存活，5名(55.6%)无复发(图。1d).

在14例cT4bN+患者中，10例(71.4%)实现了放射降级。4名(28.6%)患者部分缓解，10名(71.4%)患者病情稳定(图。1c).在12名符合方案的患者中，8名(72.7%)接受了根治性切除术，1名在手术中发现腹膜转移，3名经外科医生评估不可切除(图。1b).在中位数为23.7(四分位数，21.1–31.6)个月的随访中，8名接受根治性切除术的患者中有4名(50.0%)无复发，其中5名(62.5%)存活(图。1d).

病理学发现

总共有19名患者可评估病理反应。微卫星不稳定性基线频率-高(MSI-H)，PD-L1阳性(CPS ≥ 1)，ERBB2扩增型和劳伦氏弥漫型分别为15.8% (3/19)、16.7% (3/18)、21.1% (4/19)和52.6%(10/19；图。2a).中位病理回归为40%(四分位数，7–93%；图。2a).

aT4a中的病理反应(n= 11)和T4b(n= 8)胃癌患者。基线特征显示在顶部面板中，而病理退化的百分比显示在底部。虚线表示部分病理反应(PPR)、PPR+和主要病理反应(MPR)的临界值。b影像学检查和MPR部分反应的重叠。cPD-L1表达阳性的动态变化。d从获得MPR的患者P18获得的肿瘤标本的代表性苏木精和曙红染色切片。e两名接受MPR的患者的淋巴结(上)和胃壁(下)的代表性计算机断层成像。f接受MPR的P18患者的多重免疫荧光染色。可见结构包括细胞角蛋白阳性肿瘤细胞(白色)，PD-L1+细胞(青色)，FoxP3+调节性T细胞(绿色)，PD-1+细胞(黄色)，CD68+巨噬细胞(橙色)，CD8+t细胞(洋红色)和细胞核(蓝色)。仅在中进行了一次染色d和f. g患者P01和P18 MPR肿瘤突变负荷(TMB)和肿瘤新抗原负荷(TNB)的变化。hP18患者外周TCR克隆的变化。源数据作为源数据文件提供。

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其中，3例(15.8%，95%可信区间3.4–39.6%)达到完全病理缓解(CPR)，5例(26.3%，95%可信区间9.1–51.2%)达到主要病理缓解(MPR)，8例(42.1%，95%可信区间20.0–66.5%)达到部分病理缓解+(PPR+；图。2a和桌子2).根据Becker回归标准，3名患者(15.8%，95%可信区间3.4–39.6%)达到了TRG1a，2名患者(10.5%，95%可信区间1.3–33.1%)达到了TRG1b(表2).TRG1a/b的合并发生率为26.3% (95%可信区间为9.1–51.2%)。MPR治疗后样本的形态学变化包括细胞外粘蛋白池、纤维化和淋巴细胞浸润(图。2d).病理反应与放射学反应重叠良好，4/5(80%)MPR患者有放射学部分反应(图。2b).CT扫描图像如图。2e显示两个患者在新辅助治疗后MPR的部分反应(P1和P18)。

5例MPR患者中，2例MSI-H和PD-L1阳性，1例MSI-H和PD-L1阴性，1例微卫星稳定(MSS)和PD-L1阳性ERBB2扩增，1是MSS和PD-L1阴性基线(图。2a).相比之下，非MPR患者都是MSS和基线PD-L1阴性。新辅助治疗后，2例PD-L1阴性MPR (100%)和4例非MPR (30.8%)肿瘤转为PD-L1阳性(图。2c).

我们通过多重免疫荧光进一步研究了1例MSS和PD-L1阴性的MPR病例(P18)和2例非MPR病例(P10和P20 )(图。2f和补充图2).在P18的预处理样本中，肿瘤细胞密集分布，具有罕见的PD-L1表达(图。2f)。Most CD8+t细胞呈PD-1阳性。监管T (T车辆注册号)细胞和巨噬细胞呈散在分布。治疗后，肿瘤细胞变性，呈松散的巢状结构。免疫细胞的涌入，尤其是CD8+细胞，在粘蛋白池周围被观察到。许多基质细胞是PD-L1阳性，而肿瘤细胞仍然是PD-L1阴性。此外，一些巨噬细胞和肿瘤细胞相互靠近。在2名非MPR患者(P10和P20)中，也有CD8+治疗后t细胞浸润，但程度低于P18(补充图。2).在P20，巨噬细胞在治疗后和T车辆注册号在处理前和处理后的标本中均发现细胞富集(补充图。2).WES和TCR测序显示肿瘤突变负荷(TMB)和肿瘤新抗原负荷(TNB)下降(图。2g–h)和过度扩增的T细胞克隆的扩增(图。2i)在使用MPR的后处理样本中。

可行性和安全性

所有患者平均接受2.6个周期的新辅助治疗。所有患者都发生了不良事件，但只有两起事件为3级或以上(中性粒细胞减少症；补充图3).最常见的不良事件是恶心(56%)、厌食(48%)、疲劳(40%)、中性粒细胞减少症(36%)、甲状腺功能减退(20%)、甲状腺炎(20%)、输液反应(16%)和头痛(16%；补充图3).没有以前未报告的毒性作用。没有因毒性而停止新辅助治疗。

在20名接受手术的患者中，阿帕替尼末次给药和手术之间的中位间隔为16天(四分位数，14-19天；图。1b).一次手术延迟(93天)是由于治疗相关的肺炎，在肺炎缓解后进行了完全切除，病理结果为PPR+。

7名患者(35%)出现1级或2级术后并发症，没有出现3级或更高级别的并发症(补充图。4).最常见的并发症是胸腔积液(15%)、呼吸道感染(10%)和肺不张(10%)。1例发生吻合口漏(5%)。住院时间的中位数是12.0天(四分位数，10.5-13.0天)。30天内无再次手术和死亡。

基因突变与新辅助治疗疗效的关系

与TCGA·STAD队列一致19，最频繁的突变发生在TTN, TP53, SPTA1等。(图。3a和补充数据1).一些突变在同一患者新辅助治疗前后共存，可能导致对治疗的抵抗(图。3a).基线时，MPR肿瘤的TMB和TNB明显高于非MPR肿瘤(图。3a，b).由于MSI-H和高突变负荷之间的联系，我们排除了MSI-H患者进行进一步分析，发现MPR肿瘤的TMB和TNB高于非MPR肿瘤，但没有统计学意义(图。3c).治疗后，TMB在整个人群中显著下降，当排除MSI-H或MPR患者时也是如此(图。三维（three dimension的缩写）).考虑到TMB和纯度之间的可能联系，我们进行了模拟以平衡处理前和处理后样品之间的纯度。模拟后，这些患者的纯度调整TMB仍有显著下降(图。3e).为了更好地理解治疗下进化过程中的突变选择，我们使用了一个“dNdScv”软件包来估计非同义突变和同义突变的相对比率(dN/dS)20。我们发现PPR+患者治疗后dN/dS显著下降，提示阴性选择和亚克隆多样性减少(补充图。5b).

a19名患者治疗前/后样本的突变情况。TMB、TNB、MSI评分和肿瘤纯度的值显示在上图中。bMPR在TMB和TNB的差异(名词= 5)和非MPR患者(n= 14).cMPR在TMB和TNB的差异(n= 2)和非MPR(n当排除MSI-H患者时= 14名患者。中心、方框和胡须分别表示中值、分位数和最小值/最大值b和c并采用双侧Wilcoxon秩和检验进行比较。d-e所有配对标本中的TMB变化(n= 15)，排除MSI-H的患者(n= 14)，而非MPR患者(n= 13)之前(d)和之后(e)纯度调整。双侧Wilcoxon符号秩检验用于比较d和e. f有和没有的总生存曲线SSPOTCGA STAD (n = 433)和泛癌(n= 9034)队列。对数秩检验用于曲线比较。g根据VAF变化分类的突变类型的频率。“丢失”和“获得”分别表示治疗前和治疗后样品中的独特突变。“增加”和“减少”分别表示在治疗后样品中VAF增加和减少的突变。h通过Spearman等级相关系数(rho)评估不同患者间“丢失”变异比率和病理退化百分比之间的相关性。回归线是蓝色的，阴影表示95%的置信区间。i肿瘤亚克隆细胞患病率的变化。误差线表示标准偏差。源数据作为源数据文件提供。

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RREB1和SSPO在80% (4/5)和80% (4/5)的MPR基线样本中发现了突变，但在0和7% (1/14)的非MPR样本中分别发现了突变，这可能预示着作为推定的生物标志物的良好反应(图。3a). SSPO是人类的一个假基因，在癌症中的作用未知21。患有SSPO突变在TCGA STAD队列中显示了显著延长的生存期，但在泛癌队列中没有(图。3f).其他几个基因，包括ADAMTS12 (5/5)、KIAA1549 (4/5)、PITX2 (4/5)、RECQL4 (4/5)和TRPS1 (4/5)也在MPR患者中频繁突变，但在非MPR患者中很少(补充数据2).

根据纯度校正的VAF从治疗前到治疗后肿瘤的变化，将非同义突变分为四个亚型，“获得”(仅发生在治疗后样本中)、“丢失”(仅发生在治疗前样本中)、“增加”(治疗后VAF增加)和“减少”(治疗后VAF减少；图。3g和补充图6).病理退化与“丢失”突变的比例显著相关(图。3h).

新辅助治疗中的克隆进化与耐药性

治疗性干预可以摧毁敏感的癌症克隆，但为耐药变异体的扩张提供了选择性压力22。我们使用PyClone研究新辅助治疗对肿瘤克隆进化的影响(图。3i和补充图7).在新辅助治疗后，在许多患者中观察到亚克隆收缩(图。3i).在一些患者中观察到扩增，例如P03、P04和P07(图。3i).

不同反应患者的差异基因表达和TME

接下来，分析转录组数据及其与反应的关联。我们在MPR和非MPR患者的基线样本中发现了209个差异表达基因。这些deg主要富含维生素和脂肪代谢、细胞与细胞/基质粘附以及多种信号通路，包括PI3K-Akt、MAPK、Ras和Wnt通路(图。4a、b).然后，我们研究了治疗前和治疗后样本之间的DEGs(补充图。8a、b)。新辅助治疗影响了多平面重建和非多平面重建患者的IL-17和TNF途径(补充图。8c，d).基线MPR和非MPR样品之间的许多差异途径，包括维生素和脂肪的代谢，细胞与细胞/基质的粘附，以及多种(PI3K-Akt，MAPK，Ras，Wnt等。)信号通路，被MPR患者的治疗改变(补充图。8c)，但在非MPR患者中没有(补充图。8d).

a火山图显示基线MPR(n= 2)与非MPR(n= 10)组。彩色点表示通过p值和倍数变化阈值的基因。b基线差异表达基因的功能途径富集。相似的路径聚集在一起，用相同的颜色染色。c15名患者样本中免疫相关基因表达的热图。d免疫相关基因的基线水平在PPR+(n= 3)和非PPR+ (n = 9)组。e免疫相关基因在发病前(n= 3)和后处理(n= 4) PPR+患者。f15名患者样本中免疫相关信号的热图。g在PPR+(n= 3)和非PPR+(n= 9)组。h前(n= 3)和后处理(n= 4)患者。中心、方框和胡须分别表示中值、分位数和最小值/最大值d-e和g-h。双边Wilcoxon秩和检验用于比较d-e和g-h。源数据作为源数据文件提供。

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在基线水平，存在显著更高水平的免疫检查点基因(例如CD274和CTLA4)和溶细胞基因(例如，GZMB, NKG7，以及PRF1)比非PPR+样本(图。4c，d和补充图。9a).在PPR+患者中，新辅助治疗抑制了免疫抑制基因，如CD274, FOXP3，以及IDO1和上调的溶细胞基因，包括CD8A和GZMH，但这些差异没有统计学意义(图。4e和补充图。10a).当排除MSI-H患者时，我们发现了相似的趋势(补充图。9b和10b).下降了CD274mRNA似乎不同于IHC的数据(图。2c)，可能是由于其表达的翻译后调节或由于这两个实验中样品之间的重叠较差。此外，一些溶细胞基因(例如., GZMH, NKG7，以及GZMA)在非PPR+患者的治疗后样本中显著升高(补充图。10c).

还分析了免疫相关的信号(图。4f).在基线水平，PPR+患者的细胞溶解、IFN-γ和T细胞耗竭显著高于非PPR+患者(图。第四代移动通信技术和补充图。11).新辅助治疗促进细胞溶解和CD8+PPR+和非PPR+患者中的效应信号，但没有显著性(图。4h和补充图。12).

xCell用于评估TME的23种免疫细胞类型(图。5a和补充图。13).在PPR+肿瘤中，DC、CD8+治疗后T细胞、T辅助细胞和M1巨噬细胞增加，而T车辆注册号细胞减少(图。5c).在非PPR+肿瘤中，DC、CD8+T细胞和M1巨噬细胞是相似的，但只有2/9的患者T细胞减少车辆注册号细胞和4显示上调的T车辆注册号细胞(图5d).Cibersort软件证实了上述细胞的动态变化，并提供了有关细胞亚型的信息(图。5b).例如，极化的巨噬细胞(M1和M2)显著增加，而幼稚细胞(M0)减少，反映了治疗期间从M0到M1/2的谱系分化(图。5b).

TME亚型由先前数据训练的KNN模型评估(图。5a)23。在治疗期间，所有PPR+和5/9非PPR+ (P03、P04、P08、P15和P20)肿瘤从“衰竭”或“纤维化”转变为“免疫”或“免疫/纤维化”类型(图。5e).我们还使用免疫表型评分在四个维度上比较局部免疫状态的演变，包括MHC分子(MHC)、免疫调节剂(CP)、效应细胞(EC)和抑制细胞(SC；图。5f和补充图。14).在新辅助治疗后，所有PPR+患者和一些非PPR+患者的EC和MHC评分增加(例如，P04、P08、P20、P21)(图。5f和补充图。14).然而，SC和CP在这些非PPR+患者中显著增加，但在PPR+患者中保持稳定(如图2所示)。5f).其他非PPR+肿瘤(例如P07、P08、P11、P12和P15)在治疗后没有明显变化。

治疗期间T细胞克隆和TCR库的动态变化

通过TCR测序，我们分析了这些患者外周血T细胞的TCR库。TCR谱图显示，来自相同患者的样本共享最多的TCR序列，而不同患者之间只有一小部分TCR是共享的(图。6a和补充图。15).使用丰富度和均匀度的分数来量化TCR多样性，但是在PPR+和非PPR+之间或者在治疗前和治疗后样品之间没有发现显著差异(补充图。16和补充表格2).

a显示16名患者样本间共享的克隆型总数的成对重叠圆形图。b每个患者治疗前后前20个最常见的TCR克隆型的丰度。c克隆扩增分数(CE分数)和病理退化百分比之间的相关性。通过Spearman等级相关系数(rho)评估相关性。回归线为红色，阴影表示95%的置信区间。d根据频率分类的四种TCR克隆型的比例(过度扩展，> 0.01且≤1；大，> 0.001且≤0.1；中，> 0.0001且≤0.001；小，≤0.0001)。黑线突出显示过度扩展克隆的比例变化。ePPR+(上图)四种TCR克隆型治疗前后的变化，n= 4)和非PPR+(底部，n= 6)患者。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行比较。f-gTRBV的差异(f)和TRBJ(g)从治疗前到治疗后样本的细分用途。源数据作为源数据文件提供。

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然后，我们比较了4名PPR+和6名非PPR+患者的TCR克隆性的动态变化(图。6b).基于前20个T细胞克隆的频率变化计算克隆扩增(CE)分数(CE分数=后处理样本中前20个克隆的频率 – 在预处理样品中).CE分数与病理退化显著相关；它们在四名PPR+患者中均为阳性，在六名非PPR+患者中为阴性(图。6c).这表明应答者中T细胞克隆的显著扩增，并且CE分数可以是病理应答的极好的生物标记。

我们还根据TCR频率将每个样本中的T细胞克隆分为四类，小(≤0.0001)、中(0.001–0.0001)、大(0.01–0.001)和过度扩增(> 0.01)(图)。6d).在PPR+患者中，治疗后过度扩增克隆的频率显著升高，而小克隆的频率降低(图。6e).在非PPR+患者中没有观察到这些差异。这些结果进一步表明T细胞克隆扩增的患者比其他人具有更好的病理反应。

此外，我们调查了TCR V和J段的使用情况(图。6f，g).治疗期间观察到不同程度的V和J用量变化。的显著扩张TRBV20-1(图。6f)和TRBJ2-5(图。6g)在两个MPR患者(P16和P18)中同时出现，但在其他患者中没有，表明TRBV20-1和TRBJ2-5可能有助于抗肿瘤免疫。

对于局部晚期胃癌，IIIA、IIIB和IIIC患者的5年生存率仅为30.5%、20.1%和8.3%2。新辅助化疗已被广泛用于提高R0切除率和DFS24但是它的功效仍然受到低病理学退化的限制25。通过在新辅助/转换环境中联合使用ICI、抗血管生成药物和化疗，我们获得了15.8%的CPR、26.3%的MPR，以及令人满意的安全性和可行性。通过多组学技术，我们研究了与新辅助免疫治疗期间肿瘤的病理反应和演变、免疫TME和T细胞克隆相关的指标。

根据初步数据，基于ICI的新辅助治疗在病理反应方面取得了良好的结果，特别是在MSI-H或PD-L1阳性患者中。这与2021年ASCO年会上最近的几项I/II期单组研究一致，这些研究使用ICI加化疗治疗cT3-4或N+胃癌患者，并实现了> 90%的R0切除率，0-25%的CPR和22-42%的MPR26,27,28,29,30,31。与这些研究相比，我们的试验招募了更多晚期癌症患者，所有患者均为cT4N+，56%为最初不可切除的cT4bN+，64%为Lauren扩散型患者。因此，我们研究中的患者可能比上述试验中的患者结果差；cT4N+患者面临的复发风险几乎是cT4N0或cT2–3N+患者的两倍(40.1相对。25.0%和22.2%)6。FLOT4的新辅助化疗也达到了相似的CPR率，但cT4患者在该试验中仅占9%32。同时，虽然在FLOT4试验中弥散型患者很少发生心肺复苏(3%)，但在我们的研究中，这种病理类型的心肺复苏发生率为30%32。此外，我们接受转化治疗的cT4bN+患者接受了超过70%的降期和根治性切除，以及12.5%的MPR率。与之前关于肺癌的报告不同11，我们在放射学和病理学中观察到一致的反应。值得注意的是，在我们的研究中，MSI-H肿瘤患者显示了100% (3/3)的MPR率。即使MSI-H是一个很好的反应预测因子，晚期MSI-H胃癌患者从ICI单药治疗中仅获得47-57%的ORR33在CheckMate 649中，55%的ORR来自ICI加化疗34.

与其他基于ICI的新辅助化疗试验的另一个不同之处是，我们添加了抗血管生成药物。据报道，阻断VEGF/VEGFR可抑制TME的血管生成和免疫抑制，与ICI协同促进局部免疫反应13,35。另一项结合ICI和同步放化疗的II期试验在局部进展期胃癌中实现了极好的R0切除率(95.0%)、MPR (73.7%)和CPR (42.1%)，其中17.9%为T4bN+，无分子病理学报道36。这项研究和我们的研究表明，在ICI加化疗的基础上增加更多的治疗方法可能会使TME重新编程为“更热”，从而提高疗效。另一方面，这些数据来自小型试验。引入更多的治疗方法，尤其是放疗，可能会导致更高的毒性风险，因此需要进行大型随机对照试验，以探索一种协同组合方案，以优化有效性、手术可行性和耐受毒性。

围手术期抗血管生成可能与安全问题有关，因为它是伤口愈合的重要步骤37。在以前的试验中，新辅助贝伐单抗增加了食管胃切除术后吻合口瘘和伤口愈合并发症的发生率38。Ramucirumab加FLOT的手术发病率也高于FLOT (44相对. 37%)39。相比之下，我们的初步数据显示，阿帕替尼没有显示高发病率，包括吻合口漏(5%)和伤口愈合并发症(5%)。原因可能在于阿帕替尼是一种小分子酪氨酸激酶，其半衰期(约9 h)比抗体(例如。贝伐单抗约20天)40,41。与此相一致的是，在晚期胃癌患者中，将阿帕替尼加入转化化疗显示无吻合口漏或伤口愈合并发症42.

通过比较具有不同反应的患者之间的基线病理学和组学数据，我们确定了与病理学反应相关的潜在生物标志物。晚期癌症中已确定的生物标志物43,44，PD-L1阳性，MSI-H和TMB-H，出现在60-80%的MPR患者中。此外，RREB1和SSPO突变显示出与MPR相当或改善的相关性。SSPO突变，RREB1在PD-L1阴性MPR患者中观察到突变和TMB-H。特别是PD-L1表达和RREB1突变出现在100% MPR患者中，而在非MPR患者中没有(补充表3). SSPO是人类的一个假基因，在癌症中的作用未知21。RREB1是一种RAS转录效应器，在癌症中介导TGF-β激活的EMT45。关联下的生物学机制SSPO或者RREB1突变和反应尚不清楚，仍有待确定。此外，转录组显示反应良好的患者具有IFN-γ表达、细胞溶解信号和PD-L1表达的“热”肿瘤，与先前的报道一致46。这些“热门”肿瘤特征可能部分归因于占应答者三分之二的MSI-H患者47。相比之下，基线TCR测序没有提供预测病理反应的线索。值得注意的是，所有的生物标志物都是假定的，还没有在其他队列中得到验证。

通过比较治疗前后的组学数据，我们揭示了新辅助治疗期间肿瘤亚克隆、TME和T细胞库的动态演变。类似于治疗诱导的克隆进化的描述48在有反应的肿瘤中，突变以“丢失”为主，而许多“持续”和“获得”突变存在于反应差的患者中。在大多数肿瘤中观察到亚克隆减少，但在反应差的患者中持续或新的显性亚克隆可能增加，这表明我们的新辅助治疗改变了有利于特定肿瘤亚克隆的前景49。转录组分析显示，基于免疫的新辅助疗法通过显著上调不同的免疫细胞亚群，如DC细胞、CD8，完全激活了PPR+ TME+t细胞和极化的巨噬细胞，与先前黑色素瘤的报道一致49。有趣的是，这种类型的免疫激活发生在有反应或无反应的肿瘤中。CD8+多重免疫荧光显示一名MPR患者和两名非MPR患者的t细胞浸润。在其中的两个中还观察到巨噬细胞的富集。相反，免疫抑制细胞，包括MDSC和T车辆注册号细胞，在有反应者和无反应者之间是不同的；通过细胞评估和T细胞的富集，这些细胞在许多非PPR+肿瘤中显著扩增车辆注册号免疫荧光显示非MPR患者的细胞。T车辆注册号细胞和MDSC是维持免疫抑制性TME的关键角色50,51并且是ICI抗性的原因52,53。在最近的一项研究中，化疗也显示了CD8的募集+晚期胃癌一线治疗应答者中的T细胞和M1巨噬细胞，但除了MDSC和T车辆注册号细胞，在无反应者中增加54。然而，我们的结果是有限的，因为免疫细胞是从大量转录组数据中去卷积的，样本大小可能不足以说明差异。此外，PD-L1表达在4例治疗后无反应者中变为阳性。虽然这些治疗诱导的“热”肿瘤对新辅助治疗没有反应，但术后辅助免疫疗法可能会使PD-L1表达受益。

外周血中T细胞克隆的动态扩增，而不是基线水平，与病理缓解密切相关。我们的CE评分准确地区分了4名有反应者和6名无反应者。与肿瘤活检相比，外周血TCR测序更加可行和方便，在预测新辅助治疗的疗效甚至区分假性进展和真性进展方面可能具有重要价值。同时，TRBV20-1和TRBJ2-5这表明这两个片段可能具有抗肿瘤活性，它们的扩增可能是对MSS胃癌新辅助免疫治疗反应的预测因子。虽然TCR分析仅来自外周T细胞，但它们可以部分代表肿瘤浸润细胞，因为可以在外周血中鉴定新抗原特异性T细胞55.

这项研究有几个局限性。由于其探索性质，样本量小，没有控制武器。基于ICI的新辅助疗法的几个III期试验正在招募中，如KEYNOTE-585(ClinicalTrials.gov标识符:NCT03221426)和DRAGON-IV/Ahead-G208(ClinicalTrials.gov标识符:NCT04208347)。此外，多组学分析可能会受到取样部位和肿瘤纯度的干扰。大型多组学研究对于确定新辅助治疗中病理反应和OS的最佳预测生物标志物是必要的。此外，这种联合治疗的单组设计使我们无法区分每种成分(ICI、阿帕替尼和化疗)对治疗效果和免疫激活的相对贡献。最后，本研究中的患者接受了相对较短的治疗持续时间，包括治疗周期的数量和阿帕替尼最后一次给药与手术之间的间隔，这可能不足以实现完全的物化免疫应答，特别是对于cT4疾病。延长治疗时间可能会改善结果，但最佳策略有待研究。

总之，我们的数据表明，基于ICI和抗血管生成的新辅助/转化疗法在cT4a/bN+胃癌中具有良好的疗效和可行性，尤其是MSI-H和PD-L1阳性患者。如何提高其对MSS和PD-L1阴性患者的疗效需要进一步探索。多组学的发现提供了一些候选的疗效相关生物标志物，并帮助我们理解治疗反应和耐药性的机制。