肝组织的拉曼分析 532 nm的激发波长用于本文报道的拉曼测量，而更长的波长通常被推荐用于生物样品分析，以避免荧光背景信号并获得更深的光穿透。然而，与较长的波长(例如分别为633或785 nm)相比，较短的波长为拉曼光谱提供了更高的数据质量和信噪比(补充图)。 1 )，这部分是由于特定蛋白质和类胡萝卜素相关带的共振扩增 32
从120名肝癌患者获得匹配的肝癌组织和邻近非肿瘤组织的拉曼光谱。详细的患者信息在补充表中列出 1 。由于癌症组织的异质性和复杂性(补充图。 2 )，从每个组织样品表面上随机选择的点收集至少50个光谱。从癌和癌旁组织样品获得的平均拉曼光谱的比较示于图。 2a 。从大多数组织样品中观察到19个特征拉曼峰。两组的拉曼峰大部分重叠，但是癌旁组织组中每个峰的强度明显高于癌组织组(学生的 t -测试， P < 0.05). Hierarchically clustered heatmaps of characteristic Raman peaks were plotted to pre-discriminate the closely related Raman peaks (Supplementary Fig. 3 ).补充表格 2 给出了文献中报道的主要拉曼振动模式的峰位置和相应的代表性化合物 33
图2:基于深度学习的肝脏组织拉曼分析和组织病理学诊断。 a–d 120个癌和120个癌旁组织样品的平均拉曼光谱( a )，HCC和ICC患者的癌组织样本( b )，不同肿瘤阶段的HCC组织样本( c )，以及不同癌细胞分化等级的HCC组织样本( d ).阴影区域代表平均值的标准偏差。 e 和 f 癌旁组织(左)和肝癌组织样本(右)的典型照片( e )和H&E染色组织的相应图像( f )来自本研究中的120个测试样本。 g 显微拉曼光谱仪对肝组织的拉曼检测。 h 基于VGG 16的深度学习模型的架构。由12，000个光谱组成的拉曼数据被送入具有64个过滤器的初始卷积层。每个卷积层的核大小为3，与一个ReLU激活层相连。在基本块之后，在全连接层中使用了一个脱离层。在块之间采用最大池(大小为2，步幅为2)来减少数据长度。每个模块下面的数字分别表示输出的通道长度和数量。 i , j 交叉熵损失( i )和准确性( j )在CNN的迭代训练中。交叉熵表示预测值和真实值之间的均方误差。 k 基于CNN算法的四个组织类别分类的二元混淆矩阵，以百分比(%)表示。 l ROC曲线和相应的AUC值。源数据作为源数据文件提供。
大多数峰可归因于芳香族氨基酸、蛋白质和类胡萝卜素。具体地说，峰值在大约749、1212、1393、1547、1586和1602厘米处 −1 分别与色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸相关。1637厘米的带子 −1 对应于酰胺I带的C = O伸展。在1003、1156和1519厘米处的拉曼谱线 −1 代表类胡萝卜素的C-C和C-N链。峰值在1003厘米 −1 也有报道称与甲胎蛋白(一种肝细胞癌的生物标志物)有关(HCC) 34 。此外，拉曼特征出现在1081、1130和1304厘米处 −1 主要与脂类或脂肪酸有关。674、974、1336和1356厘米处的谱带 −1 可以归属于核酸。此外，835厘米附近的拉曼信号 −1 与糖类有关。癌旁组织和癌组织之间拉曼光谱的这种差异反映了由癌发生引起的肝组织生化成分的变化，这为区分癌组织和正常组织提供了基础。
接下来，进一步探索基于拉曼光谱的肝癌的精细组织病理学分化。原发性肝癌是世界上最常见的癌症之一，其中75-85%和10-15%分别是肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(ICC) 35 。如图所示。 2b HCC和ICC组之间拉曼信号强度的主要差异在类胡萝卜素相关的拉曼峰(1003，1156和1519 cm −1 )，明显高于ICC组。相反，大多数氨基酸、脂质和核酸相关的峰，如749、974、1304、1356、1393和1586 cm −1 ，分别在HCC组较高。此外，对肿瘤分期和分化程度的准确判断可能有助于治疗策略的选择和预后评估。如图所示。 2c 在1003、1156、1519厘米处发现早期和晚期之间的主要光谱差异 −1 (类胡萝卜素)，1130厘米 −1 (脂肪酸)，749和1547厘米 −1 (色氨酸)，其在早期组中具有较高的强度，而峰与674和974 cm处的核酸相关 −1 和糖在835厘米处 −1 在晚期组更高。此外，补充图。 4 显示了不同种类的癌症分化的拉曼光谱。中分化组和低分化组之间的总体光谱差异比高分化组和中分化组更显著。与癌症组和癌旁组之间的差异相似，分化良好和中等的组也表现出更高的总光谱强度，尤其是在类胡萝卜素相关的峰中(图。 2d ).拉曼测试后，病理学家根据H&E染色再次确认每个组织块的病理类型(图。 2e–g
基于深度学习的肝脏组织病理学诊断 为了使用拉曼光谱对不同类型的肝组织进行分类，使用了基于VGG-16网络的CNN模型。模型架构由13个一维卷积层、5个汇集层和3个全连接层组成(如图所示)。 2h )，利用小规模卷积核叠加而不是大规模卷积核来减少计算所需的参数 36 。建立肝组织拉曼数据库，每个组织样品有50个光谱，从120对肝组织样品中获得总共12，000个光谱。光谱数据范围从500到2000厘米 −1 有889个一维浮点数据。建立二元分类模型来分类肝癌组织和癌旁组织，它们分别被指定为1和0。光谱数据通过基线扣除和平滑进行预处理，然后通过随机洗牌输入CNN模型。softmax函数用作输出层中的激活函数，它输出两个类的概率，其中较高的值被认为是预测的类。
准确性和交叉熵损失是经常用于评估CNN模型的性能和可靠性的两个指标。随着学习迭代，验证集的准确性和交叉熵损失曲线逐渐趋于收敛，表明模型没有过拟合(图。 2i，j ).结果，获得了估计癌组织面积的92.6%的准确度，伴随着分别为90.8%和94.6%的灵敏度和特异性。
此外，建立了另外三种CNN模型以区分HCC和ICC组织，以及不同癌症阶段和分化等级的组织。四个二元模型的性能在图1的混淆矩阵中示出。 2k 。肿瘤的异质性对区分肿瘤组织的不同阶段和分化程度提出了挑战，准确率分别为78.3%和72.3%。但对肝癌亚型HCC和ICC的分类效果较好，识别准确率为82.4%。绘制了四条接收机工作特性(ROC)曲线，以定量验证分类器的性能(图。 2l )，曲线下面积(AUC)值在0.783和0.965之间。此外，与其他常见的机器学习算法(包括PLS-DA、random forest和XGBoost)相比，深度学习方法在不同病理类型的组织识别中，尤其是在处理不平衡数据时，显示出更高的计算性能和更高的准确性(补充表 3 ).
值得注意的是，在这项研究中，基于单一血清学生物标志物(如AFP)的HCC常规诊断灵敏度很低。当甲胎蛋白阈值为200 ng/ml时，92例HCC患者中有25例为阳性，敏感性仅为27.2%(补充图。 5 )，远低于我们基于拉曼测量的方法。此外，影像学检查如CT和MRI被推荐作为鉴别或预测HCC不同病理状态的一线诊断方法 37 ,38 。例如，HCC的临床分期主要基于影像学特征进行诊断，包括HCC结节的数量和大小，以及血管侵犯的存在。这里，拉曼光谱也显示了基于84名患者以67%的准确度和0.694的AUC值确定微血管侵袭的可行性(补充图。 6 ).随着样本数量和光谱收集的进一步增加，结果可能会得到改善。总之，就准确性而言，拉曼光谱在识别当前研究中不同病理类型方面与传统成像方式(如CT、MRI和US)相当或更好(补充表 4 )，为现有的病理学诊断技术提供了有力的补充。
组织代谢组学和血清学分析 为了进一步证实肝癌组织生化组成的变化，采用了基于液相色谱-质谱(LC-MS)的非靶向代谢组学策略。组织代谢组学广泛应用于基于代谢特征的疾病发病机制研究 39 ,40 ，它可以提供有关目标位点代谢变化的直接信息，并揭示相关的肿瘤生物标志物。在这项研究中，总共评估了25对匹配的HCC组织和邻近的非肿瘤组织。1995和2228个离子保留在正负电喷雾电离源(ESI + 和ESI − )模式，分别为(补充数据 1 )，去除偏差和缺失值后。ESI中共有57种代谢物 + ESI中的模式和51 − 模式被鉴定并选择作为候选差异代谢物(补充数据 2 ).九种主要代谢物之间的差异和HCC组织和邻近非肿瘤组织之间108种特定代谢生物标志物的分级聚类热图绘制在图中。 3a和b 。大多数代谢物在HCC组织中表现出下降趋势，这与HCC组织中较低的拉曼强度一致。
图3:HCC组织和邻近非肿瘤组织的非靶向代谢组学分析。 a HCC组织样本和匹配的邻近非肿瘤组织样本之间九种差异代谢物的相对丰度分布，作为非肿瘤组织中相对丰度中值的比率。I–ix代表酪氨酸(I)、非芳香族氨基酸(ii)、脂肪酸(iii)、用PUFA标记的PCs(iv)、用SFA和MUFA标记的PCs(v)、肉碱(vi)、核苷(vii)、碱基及其衍生物(viii)和糖类(IX)的代谢物。 b 基于欧几里得距离，HCC组织和邻近非肿瘤组织之间的108种显著差异代谢物的分级聚类热图。根据代谢物的相对表达水平给块着色。紫色表示高表达；浅橙色表示低表达。 c HCC组织和邻近非肿瘤组织中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)含量的差异。在副癌组中观察到酪氨酸的显著增加(双尾学生组 t -测试， P < 0.05), and higher levels of tryptophan and phenylalanine were also observed, but the changes were not significant (two-tailed Student’s t -测试， P > 0.05).箱线图显示平均值、中间值和下/上四分位数；胡须显示内部栅栏。 d HCC组织和邻近组织之间具有显著差异的代表性磷脂酰胆碱(I)、核苷、碱基和糖类(ii)的含量。数据以平均值±SD表示。HCC纸巾， n = 25，相邻组织， n = 25.源数据作为源数据文件提供。
例如，在HCC组织中观察到酪氨酸的显著下调，而其他两种芳香族氨基酸(ArAAs)，苯丙氨酸和色氨酸，没有显著变化(图。 第3a㈠段 和图。 3c ).然而，我们发现HCC组织中其他芳香化合物的减少，包括多巴，3-羟基邻氨基苯甲酸和苯胺，这表明肝脏组织中苯环相关拉曼谱带的变化也可能来自ArAA衍生物或其他芳香代谢物。此外，大多数非芳香族氨基酸，如β-丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷胱甘肽和苏氨酸，在HCC组织中也减少了(图。 3a(二) ).然而，精氨酸在HCC组中增加，这可能归因于精氨酸降解酶精氨酸酶I (ARG1)的抑制，并且精氨酸也被报道促进肿瘤生长 41
肝脏是脂类和脂肪酸合成的主要场所。肝细胞损伤会损害肝功能，并可能导致脂质代谢功能障碍 42 。例如，除了二十碳二烯酸和神经酸，大多数脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸(PUFAs)在HCC组织中下调(图。 3a(三) ).此外，磷脂酰胆碱(PC)是细胞膜的重要成分，可被活性氧氧化 43 。在这项研究中，HCC组中标记有PUFAs的PCs水平显著降低(图。 3a(四) )，这可能归因于在癌症组织中存在高氧化应激时PUFAs的氧化，导致用饱和脂肪酸(SFA)或单不饱和脂肪酸(MUFAs)标记的PCs进一步增加(图。 3a(v) 和图。 三维(一) ).此外，观察到长链酰基肉碱的增加和短链或中链酰基肉碱如丙酰基肉碱和己酰基肉碱的减少(图。 3a(六)
肝细胞在核苷酸代谢中起着重要的作用。还观察到一些核苷、碱基和相关代谢物的紊乱(图。 3a(七至八) )，主要与嘌呤代谢有关。参与DNA和RNA合成的嘌呤代谢物在促进细胞存活和增殖中是至关重要的 44 。除了肌苷，大多数嘌呤代谢物在HCC组显示下调，包括黄嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤核苷、脱氧肌苷、尿苷、尿酸和腺嘌呤(图。 三维(二) )，这可能归因于相关代谢酶的活性降低 45
大多数糖类和相关代谢物，如 D -核糖， D -景天庚糖， D -葡萄糖醛酸， D -塔格糖和蔗糖在HCC组织中显著下调(图。 3a(九) 和d(二))。然而，在HCC组中观察到高水平的糖酵解代谢产物葡萄糖6-磷酸，而三羧酸循环(TCA)代谢产物，包括富马酸和琥珀酸，如先前报道的那样，被下调 46 。这些与能量相关的代谢物的变化表明，癌细胞通过增加有氧糖酵解快速消耗葡萄糖，这可能是由于Warburg效应 47
此外，还观察到几种代谢物在HCC组织中显著增加，包括谷胱甘肽、5’-甲硫腺苷、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、氧代己二酸和2-氧代精氨酸，它们有可能成为肝癌筛查的生物标志物(图。 3b 和补充数据 2 ).为了更直观地比较上述代谢物的差异，HCC样品在各个相邻组织上的相对变化表示见补充图。 7 。此外，还通过用于光谱分析的CNN模型研究了代谢组学的预测能力，以区分HCC组织和邻近的非肿瘤组织。准确率在70%-80%之间，低于光谱分析结果，但增加样本数可能会提高准确率。
肝脏组织中肿瘤边缘的拉曼成像 由于肿瘤组织的异质性和患者之间的差异，组织样本之间的拉曼数据差异是不可避免的(补充图。 2 )，对于不同组织的整体区分度是有挑战性的。然而，对于来自同一患者的成对的肝癌和邻近的非肿瘤组织，在大多数样品中很容易观察到拉曼强度的差异。因此，我们建议此处描述的无标记光谱技术可以结合适当的图像分析算法，以可视化癌边缘并促进术中肿瘤描绘。
为了测试这一点，选择两个肝癌组织块进行拉曼扫描。如图所示。 4a和b ，两个肝癌块和相应的H&E染色图像证实了肝细胞癌变的存在，其中肝索具有无序排列，细胞密度和核/质比增加。肝癌组织的绘图测试区域的明场图像如图2所示。 4c 。使用LiveTrack技术连续调整样品高度，以保持样品聚焦。拉曼测量过程中记录了表面高度数据，两个组织样本的三维(3D)表面轮廓图像如图2所示。 4c 最大高度差分别为38.2米和27.4米。拉曼图像用自建模曲线分辨率(SMCR)和系统聚类分析(HCA)算法进行分析。SMCR方法可以将未知的拉曼光谱数据集解析成纯组分的光谱，同时产生浓度图像和纯光谱(如“方法”部分所述)。基于SMCR方法获得了高质量的图像(图。 4d ).在第一个组织样本中可以看到癌变区域的明显边界，其中成功地区分了癌变区域和肝实质区域，如不同的伪彩色所示。拉曼成像中的肿瘤边界不平滑(图。 4d和e 上图)，可能是由于薄的肿瘤包膜和具有微米级扫描间隔(2微米)的小成像区域(50 × 50微米)。第二个组织在显示区域中显示相对差的癌边界(图。 4d和e 下图)，与肝实质混合，可能是由于癌浸润的存在，这在明视野图像中几乎检测不到。这些癌性病变通过H&E染色得到证实(图。 4b ).HCA是这里使用的另一种化学计量学方法，以更抽象的方式将一组光谱组合成具有相似光谱的簇。HCA衍生图像的结果(图。 4e )与用SMCR处理的一致(图。 4d )，表明图像处理算法的可靠性。
图4:用于癌边缘描绘的肝组织块的拉曼成像。 a 两个精选肝癌块的照片；箭头指向拉曼成像区域的位置。 b 两个肝组织的局部H&E染色图像和底行中的白色方框是近似的拉曼成像区域。 c 映射测试区域的明场图像(50 × 50 m )(左)和使用LiveTrack技术构建的两个样本的相应3D表面轮廓图像(右)。 d , e SMCR衍生的( d )，以及HCA衍生的( e )拉曼图像显示了肝组织样品的癌边缘。 f 从1-8点收集的典型光谱如( d );点1、2、5和6来自推定的副癌或非肿瘤区域，而点3、4、7和8来自推定的癌区域。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步证明不同肝组织表面区域的光谱变化，我们收集了光谱(图。 4f )从图中用箭头标记的几个位置。 4d 。点1、2、5和6是从推定的副癌和非肿瘤区域收集的，并且在两个组织块中显示出比从推定的癌区域(点3、4、7和8)收集的拉曼强度更高的拉曼强度。这种拉曼信号差异为图像算法识别提供了基础，支持了我们使用拉曼技术进行高精度肿瘤边缘检测的最初预期。此外，通过使用低放大率物镜和/或借助强大的图像算法增加扫描间隔，也可以获得更大的拉曼图像(补充图。 8 ).
不同形态肝脏组织切片的拉曼成像 为了验证拉曼光谱的临床病理和诊断能力，我们使用微型拉曼光谱仪对厚度为5 m的未染色人类肝组织切片进行成像。我们首先获取了2000–3400cm范围内的原始光谱 −1 (图。 5a ).组织光谱在2930 cm处包含一个主峰 −1 ，这与ch有关 3 蛋白质的拉伸 48 。此外，在2855、2885和3007 cm处有几个与脂质相关的特征拉曼峰 −1 被发现，这归因于对称ch 2 脂类的振动、费米共振或CH的不对称振动 2 在饱和的直长酰基链中，不饱和的=CH分别伸展在酰基链中 49 。在未染色的肝癌和邻近组织切片上以0.8 m的分辨率在两个轴向上进行StreamHR模式的拉曼图像采集。对拉曼映射数据进行多元分析，以重建组织的主要化学成分的空间分布图。纯蛋白质和脂质的拉曼光谱也通过SMCR算法进行解析(图。 5a ).正常肝组织中蛋白质和脂质的SMCR重建浓度图如图所示。 5b和c ，分别为。为了更好地理解它们的相对空间分布，图中显示了两者的彩色叠加图像。 5d
图5:各种肝组织切片的拉曼成像。 a 2000–3400cm范围内的典型肝组织切片拉曼光谱 −1 (紫线)；纯蛋白质(蓝线)和脂质(黄线)的拉曼光谱也通过SMCR算法解析。拉曼峰在2930厘米处 −1 (箭头3)与蛋白质相关，峰值在2855 cm左右 −1 (箭头1)，2885厘米 −1 (箭头2)和3007厘米 −1 (箭头4)是脂质的特征。 b –d SMCR重建的脂质浓度图( b )和蛋白质( c )在正常肝组织中； d 是两者的叠加。为了合并两幅图像，调整黄色(脂质)的最小LUT值。 电子信息 映射测试区域的明场图像和相应的H&E染色的SMCR衍生拉曼图像，以及正常肝组织的相应3D表面轮廓图像( e ). f –i 显示具有典型形态的其他组织区域，包括癌变( f )，脂肪性肝炎( g )，纤维化( h )，以及连接词( i )纸巾。所有比例尺都是10米。
接下来，典型正常肝实质的拉曼图像(图。 5e )和癌变区域(图。 5f )进行了对比。蛋白质和脂质的叠加拉曼图像以及测试区域的相应3D表面轮廓图像、明视野图像和H&E染色图像如图所示。 5e和f 。SMCR算法得到的图像以假彩色显示了清晰的亚细胞结构，揭示了脂质和蛋白质浓度的变化。在正常肝组织中，蛋白质在细胞核区域浓度较高，脂质主要分布在肝细胞的外围区域。而在癌细胞中，蛋白质主要分布在细胞膜附近，细胞内较少。值得注意的是，在H&E染色的图像中，生化成分的空间分布的这种差异通常难以辨别。此外，癌细胞转化过程中的典型变化，如肝细胞的不规则排列和较大的核/质比，也在拉曼图像中观察到，与明场和H&E染色一致。除了平面成像之外，还获得了3D表面轮廓图像，其将关于化学成分的信息与组织表面的形貌相结合。
除了正常组织和癌组织，还对其他几个具有典型形态的组织区域进行了拉曼扫描，包括脂肪性肝炎、纤维化和结缔组织(图。 5g–I 9 。除了组织表面的二维(2D)组织化学成像，我们还通过拉曼光谱术生成了三维“z-stack”图像。补充图 10 显示了图1中五个组织切片的重建3D图像。 5 。这些图像是从六个z切片堆叠(5 m切片)重建的，每个平面覆盖50 m × 3 m，这提供了组织样本的更丰富的组织化学深度信息。在这项研究中，在532 nm激光下通过共焦拉曼光谱的肝组织的最大检测深度为约200 m(补充图。 11 ).对于更深的组织检测，可以应用空间偏移拉曼光谱(SORS)的集成来实现厘米级的深度检测 50
便携式拉曼系统在肝癌术中诊断中的应用 在体外验证了拉曼光谱在肝组织诊断和成像中的性能后，我们进一步研究了其用于实时术中肝癌诊断的可行性。术中使用定制的手持式便携式拉曼光谱系统检测肝癌。该系统由一个785 nm的光纤耦合激光器、一个手持探头和一个光纤光谱仪组成(详细内容见“方法”一节)。光谱仪连接到带有采集软件的个人计算机，输出目标组织的分子内容信息。在操作过程中，探针还被一次性无菌保护套覆盖，这对测量的拉曼光谱的影响可以忽略不计(补充图。 12 ).
数字 6 显示了从体内术中测量获得的肝组织的平均拉曼光谱。将探针保持在组织表面上方，以测量癌和邻近非肿瘤区域中几个随机选择的点处的拉曼信号。非肿瘤区域的总拉曼光谱强度明显高于肿瘤区域。这与体外测试结果一致，尽管便携式拉曼光谱仪和微型拉曼光谱仪收集的组织光谱之间存在差异(补充图。 13 ).肿瘤和非肿瘤区域之间的主要光谱差异在于640、976、1024、1540和1635 cm处的蛋白质相关峰 −1 ，脂质相关的峰位于413、775、1314、1381和1436厘米处 −1 以及与689、1094和1514 cm处的核酸相关的峰 −1 。随着更多术中光谱数据的采集，这些光谱差异结合合适的算法可以帮助在手术中区分肿瘤和肝实质区域，并且进一步的术中拉曼绘图技术可以使肿瘤边界可视化变得可行。
图6:手持光纤耦合拉曼光谱仪的术中检测。 从6名患者中收集癌和癌旁组织的体内术中测量的平均拉曼光谱。光谱由配备有785 nm NIR激光器和计算机化CCD光谱仪的手持便携式拉曼光谱仪系统收集。阴影区域代表平均值的标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
