MiT家族tRCC的分子图谱 我们从首次接受治疗的中国患者中收集了86例麻省理工学院家族tRCC样本。实验设计的示意图如图2所示。 1a 。对84对样本进行了全外显子组测序(WES ),以检测MiT家族中的任何tRCC遗传变异。2名患者的样本因DNA质量低而被排除。在74个肿瘤和57个正常邻近组织(NATs)，以及28个肿瘤和21个NATs上分别进行了无标记蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学方法。对26个肿瘤和16个NAT进行了RNA测序(RNA-seq)。所有组学实验，包括WES、转录组、蛋白质组、磷酸蛋白质组，都在相同的患者和对照组上进行。
图MiT家族tRCC的分子图谱。 a tRCC多组学分析示意图，包括WES、RNA-seq、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学。 b Circos图显示TFE3/TFEB基因融合事件。 c 70例体细胞突变tRCC肿瘤的基因组图谱。SMG、TSG和癌基因以不同的形状表示。 d tRCC样本的蛋白质组概况。 e tRCC样本的磷酸化蛋白质组概况。 f 基因水平的mRNA-蛋白相关性和功能富集。
这一群体包括33.7%( n = 29)男性和66.3%( n = 57)女性，平均年龄34岁。49名患者(57.0%)患有I/II期肿瘤，36名患者(41.9%)患有III/IV期肿瘤。大多数tRCC病例显示国际泌尿病理学会(ISUP)2级( n = 36，41.9%)和三级( n = 40例，占46.5%)，其余均为4级( n = 10，11.6%)(补充数据 1 ).所有病例均由组织病理学专家进行初步筛查，并通过荧光原位杂交(FISH)进行诊断 31 ，68例(79.1%)采用新一代测序技术(NGS)确认了基因融合类型(补充数据 1 ，方法)。有五个案例 TFEB -tRCC，比 TFE3 -tRCC( n = 63)例，与之前的报告一致 1 。我们确定了4个融合伙伴 TFEB ，包括 CLTC , ACTB , NEAT1 ，以及 EIF4A2 。十五个融合伙伴 TFE3 在这个队列中被发现，其中 ASPSCR1 (n = 21), SFPQ (n = 14), 禁忌 (n = 6), PRCC (n = 6), MED15 (n = 4)，并且 LUC7L3 (n = 3)正在复发 TFE3 融合伙伴(图 1b PTPN12 , ZNF627 , EWSR1 , PARP14 , KHSRP , MATR3 , RBM10 , U2AF2 ，以及 VCP 是罕见的 TFE3 在该队列中观察到的融合伴侣。这 PTPN12 -TFE3 , ZNF627-TFE3 , U2AF2-TFE3 和 EIF4A2-TFEB 还观察到tRCC的融合类型(补充图 1a、b ).此外，我们发现两例tRCC有两种融合类型(图。 1b ，补充数据 1 ).
NATs的WES数据被用作检测该队列中遗传变异的参考。hg38参考基因组中肿瘤组织的平均测序覆盖率为118.91倍，NATs的平均测序覆盖率为60.96倍(补充图。 1c ).在86个肿瘤和84对NAT中，我们检测到2563个非沉默突变和19616个沉默突变。穆特西格夫 32 用于鉴定tRCC中显著突变的基因(SMG)。 BCDIN3D , NDRG1 , ZNF668 ，以及 GNPTG 被确定为tRCC中的SMG(图。 1c ).在tRCC的SMG中， NDRG1 作为一种肿瘤抑制因子并在p53介导的胱天蛋白酶激活和凋亡中起重要作用。的功能 BCDIN3D , ZNF668 ，以及 GNPTG 对肿瘤的研究很少。其他RCC中常见的突变基因，如 VHL , PBRM1 , BAP1 ，以及 遇见了 在我们的tRCC样本中没有检测到。此外，我们发现了肿瘤抑制基因 TP53 (n = 3), BRCA1 (n = 3), TSC2 (n = 3), 集合2 (n = 3), KMT2D (n = 3)，和癌基因 IRS2 (n = 3)在tRCC中反复突变(补充数据 2 ).
对于蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据分析，对HEK293T细胞样品的所有质量控制(QC)运行计算皮尔逊相关系数。蛋白质组学QC和磷酸蛋白质组学QC的QC样本中值相关系数分别为0.91和0.96(补充图。 1d，e )，证明了质谱平台的一致性和稳定性。所有样本的蛋白质组学分析共检测到14，073种蛋白质(图。 1d )，其中11，471个蛋白在肿瘤组织和NAT之间是共有的，而1487个和1115个蛋白分别在肿瘤组织和NAT中特异性检测到。平均而言，我们在每个样品中鉴定了5607种蛋白质，范围从2837到8120，其中超过90%的样品鉴定的蛋白质数量超过4000。使用iBAQ算法进行蛋白质组定量，随后如先前报道的那样归一化为总分数(FOT )(补充图。 1f，g ).此外，共鉴定了33，853个磷位点，相当于6469个磷蛋白(图。 1e
RNA测序(RNA-seq)分析鉴定了13，313个基因，每千碱基转录物每百万片段作图的片段数(FPKM)大于1(补充图。 1h，我 )，使我们能够探索转录组和全蛋白质组之间的关系。mRNA-蛋白相关性中等，样本的Spearman相关中值为0.39(补充图。 1j )，与上次报告一致 33 。对于肿瘤组织，检测到7206个mRNA-蛋白对，蛋白和mRNA之间的中位数基因相关为0.059。基因集合富集分析(GSEA)揭示，mRNA-蛋白正相关的基因富集于肾脏升高蛋白(肾脏标记)、Gly/Ser/Thr代谢和细胞外基质(ECM)受体相互作用，而负相关的基因富集于蛋白酶体和氧化磷酸化(OXPHOS)(图。 1f ).OXPHOS中mRNA-蛋白对的弱相关性也在其他各种肿瘤中观察到，如ccRCC 34
在以前的报告中，转录组相似性被用来推断肾恶性肿瘤的起源，包括嫌色细胞肾细胞癌和肾髓质癌 35 ,36 。我们计算了肾细胞癌、乳头状肾细胞癌(PRCC)、肾细胞癌、肾细胞癌和不同显微解剖的肾单位区域的整体轮廓间相关性。结果显示tRCC mRNA表达与近端小管高度相关(补充图。 1k )，表明tRCC与ccRCC和PRCC类似，起源于近端小管。
总之，我们的研究在基因组、转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组水平上建立了MiT家族tRCC的综合景观。
tRCC肿瘤与邻近组织相比的分子改变 主成分分析(PCA)揭示了肿瘤和邻近组织在转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的明显区别(图。 2a，b ，补充图。 2a ).有趣的是，我们发现在tRCC肿瘤组织中，上调的TFE3仅在蛋白质水平观察到，而在mRNA水平没有观察到(图。 2c ).估计 TFE3 在tRCC样品中的活性，我们收集了转录因子靶标 TFE3 来自多萝西娅 37 。单样本GSEA 38 显示推断 TFE3 活动，基于 TFE3 使用mRNA和蛋白质组数据的靶丰度在肿瘤中显著上调(补充图。 2b，c TFE3 活性与肾脏特征呈负相关(补充图。 2d ).相应地，肾脏标记分数在肿瘤中下调，这表明 TFE3 在tRCC癌变过程中，活性在肾脏身份丧失中起着重要作用。
图2:与邻近组织相比，tRCC肿瘤中的分子改变。 a –b 全球转录组和蛋白质组PCA图。红色，肿瘤；蓝色，NATs。 c 显示不一致mRNA的TFE3基因产物水平的箱线图( N , n = 16;t， n = 26)-蛋白质( N , n = 57;t， n = 74)表达式。箱线图显示了中位数(中心线)、25–75%的四分位数范围(IQR)(箱型界限)、1.5 × IQR(胡须)。 P 数值来自双边Wilcoxon秩和检验。 d 火山图显示DEPs(Benjamini–hoch Berg-调整 p 值< 0.05，FC > 2)。 e 肿瘤和邻近组织中的dep及其丰富的生物学途径。 f 描绘mRNA表达的散点图( x 轴)和蛋白质( y 轴)。涉及BCAA降解、脂肪酸代谢、糖酵解和糖异生、MTOR信号、OXPHOS和TCR信号的基因用不同的颜色表示。 g 在mRNA和蛋白质水平解偶联MTOR途径的模式。 h tRCC生物标志物鉴定的途径。 i 肿瘤和匹配的NATs之间的Log2倍变化( n = 54)显示了22种tRCC生物标志物。箱线图显示了中间值(中心线)、25–75% IQR(箱线图界限)、1.5 × IQR(胡须)。这些生物标记被标注了潜在的临床效用和由HPA定义的IHC染色分数。 j 磷酸化位点及其相应蛋白质丰度变化的比较。红点表示磷位点增加2倍以上(Benjamini–hoch Berg调整 p < 0.05) and change stronger than in the corresponding protein. Phosphosites with functional annotations are indicated. k 显著活化激酶的激酶-底物连接(在蛋白丰度和激酶活性方面)。
在蛋白质组水平，我们鉴定出1727个蛋白质显示出显著的差异表达(倍数变化[FC]> 2；本杰明-霍克伯格调整 p < 0.05), with 836 proteins downregulated and 891 upregulated in tRCC tumors compared to adjacent tissues (Fig. 2d ；补充数据 4 ).富集分析显示，中性粒细胞脱粒、胰岛素信号通路、糖原代谢、膜运输、mTOR信号和溶酶体功能在肿瘤中上调。发现细胞外基质组织、近端小管碳酸氢盐回收和多种代谢途径(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、脂肪酸降解、生物氧化、柠檬酸[TCA]循环和呼吸链)下调( q < 0.05) (Fig. 2e
在转录组水平，1626个肿瘤上调基因在免疫反应、细胞外基质组织、细胞周期和细胞凋亡中富集。1247个肿瘤下调基因在多种代谢途径中富集(补充图。 2e，f ).对肿瘤和邻近组织之间mRNA和蛋白质水平差异丰度的分析揭示了在mRNA和蛋白质水平上多种代谢途径(包括氨基酸、脂肪酸和葡萄糖代谢)的一致变化(图。 2f ，补充图。 2g ).然而，在mTOR信号和OXPHOS中，mRNA和蛋白表达存在显著的解偶联(图。 2f，g ).值得注意的是，在ccRCC中也观察到OXPHOS的mRNA和蛋白表达的解偶联 34 。许多研究表明tRCC中mTOR信号的激活 39 ,40 强调使用蛋白质组学方法研究tRCC的重要性。在对蛋白质组数据进行严格筛选后，我们提名了22个候选tRCC生物标志物(图。 2h，我 ，补充数据 4 )，这可能有助于tRCC诊断。这些蛋白标记物的潜在临床应用在图中有注释。 2i 和人类蛋白质图谱(HPA)中的免疫组织化学(IHC)染色数据用于帮助消除非特异性RCC标记。在22个候选生物标志物中，10个在HPA数据集中不到20%的常见肾癌样品中显示高或中等IHC评分，7个是血浆蛋白，3个是分泌蛋白。糖蛋白非转移B (GPNMB)被确定为胃癌的诊断标志 TFE3 -tRCC在之前的研究中 41 ，支持我们数据的可靠性。此外，这十个蛋白中的两个候选蛋白(DST，TBK1)在肾癌样品中表达较少，通过IHC染色进行验证。结果显示tRCC肿瘤比ccRCC、PRCC、ChRCC和正常肾组织呈现更强的DST和TBK1 IHC染色(补充图。 2h )，表明DST和TBK1是区分tRCC和其他肾脏恶性肿瘤的潜在生物标志物。
至于磷酸化位点，与邻近组织相比，221个在肿瘤组织中显著上调(FC > 2，Benjamini–hoch Berg校正 p < 0.05). Among these, 182 changed stronger than in the corresponding protein (Fig. 2j )，只有6个站点有已知的功能注释 42 。CAD S1859磷酸化通过控制嘧啶的从头合成促进细胞增殖 43 。MAP4 S1073的磷酸化导致微管明显的动态不稳定性 44 。LCP1 S5磷酸化增加了细胞的侵袭能力 45 。激酶活性也通过激酶-底物富集分析(KSEA)基于底物磷酸化水平进行推断 46 。三种激酶(AKT2、RPS6KB1、CDK5)显示活性和蛋白质丰度显著增加(补充图。 2i ，补充数据 4 ).激酶-底物连接如图所示。 2k 。RPS6KB1是mTOR信号传导的重要效应子，它的激活进一步支持了mTOR通路作为tRCC的潜在治疗靶点。Trilaciclib，FDA批准的药物 47 靶向CDK5是治疗tRCC的潜在方法。
突变特征和蛋白质组影响的前景 我们将tRCC的肿瘤突变负荷(TMB)和染色体不稳定性(CIN)评分与其他主要RCC亚型进行了比较，包括ccRCC、PRCC和ChRCC(补充图。 3a，b ).结果显示，tRCC的TMB低于ccRCC和PRCC，而TMB高于ChRCC(补充图。 3a ).有趣的是，在所有的肾细胞癌中，肾细胞癌的染色体不稳定性最低。 3b ).为了确定内源性和外源性诱变剂对tRCC遗传改变的作用，我们使用非负矩阵分解法分解了突变谱，发现了四个突变特征(图。 3a ).进行余弦相似性分析以匹配提取的特征和宇宙参考特征 48 。与tRCC肿瘤最匹配的突变信号是SBS26、SBS6、SBS40和SBS22。签名SBS6和SBS26与缺陷DNA错配修复(MMR)相关。SBS22与接触马兜铃酸有关，马兜铃酸是一种来自传统中草药的致癌物质 49 ,50 。所有四个突变信号与TMB显著相关，而只有Sig2 (SBS6)与CIN显著相关(图。 3b ).发现SBS6和CIN与不良无进展生存期(PFS)相关(图。 3c ).为了在蛋白质水平上研究SBS6的原因，我们发现DNA修复相关蛋白ATM、DDB1、PARP1、XRCC5和CUL4A在患有SBS6的肿瘤中显著下调(图。 三维（three dimension的缩写） )，而不是通常报道的MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH3和MSH6(补充图。 3c ).此外，DDB1丰度与CIN呈负相关(补充图。 三维（three dimension的缩写） )并与PFS呈正相关(补充图。 3e )，表明DDB1减少可能是SBS6相关CIN的重要原因。
图3:突变信号和相关信号通路的识别。 a tRCC队列中四个突变信号的分解。 b 突变特征与TMB和CIN的相关性。 c TMB、CIN和突变特征的Cox回归分析。 d 显示有和没有SBS6的tRCC之间差异表达的DNA修复分子的热图(双侧Wilcoxon秩和检验)。 e 散点图显示了SBS6和Wikipathway ssGSEA分数的相关性。 f 氧化损伤和氧化磷酸化显示出很强的负相关性。 g SBS6中的相对蛋白质丰度( n = 30)和非SBS6( n = 31)活性氧防御蛋白GSR (** p = 0.0065)、GSS (* p = 0.019)，和GCLC (* p = 0.044).箱线图显示了中间值(中心线)、25–75% IQR(箱线图界限)、1.5 × IQR(胡须)。 P 数值来自双边Wilcoxon秩和检验。GSR谷胱甘肽-二硫还原酶，GSS谷胱甘肽合成酶，GCLC谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚单位。 h 具有SBS6签名的tRCC的分子特征的示意图。
接下来，我们在蛋白质组水平研究了SBS6信号的影响。我们发现SBS6与OXPHOS负相关，与氧化损伤正相关(图。 3e ).线粒体的一个主要功能是通过OXPHOS合成三磷酸腺苷(ATP)，OXPHOS受损是线粒体功能障碍的重要标志。因此，我们使用OXPHOS作为线粒体功能的指标。据报道，线粒体功能障碍导致活性氧(ROS)水平升高，从而诱导细胞氧化损伤 51 。我们一致发现OXPHOS受损与tRCC肿瘤中氧化损伤增加相关(图。 3f ).SBS6肿瘤中受损的谷胱甘肽(GSH)合成相关酶(GSR，GSS，GCLC)进一步加强了SBS6与tRCC中氧化损伤的相关性(图。 3g ).此外，谷胱甘肽二硫还原酶(GSR)表达较高的患者似乎预后较好(补充图。 3f ).因为SBS6也与几种免疫途径正相关，如DNA损伤旁路、胞质DNA感应和干扰素-α反应途径(图。 3e )，我们使用xCell对肿瘤微环境成分进行解卷积 52 。sb6与CD8的浸润呈正相关 + 透射电镜，Tgd细胞，CD4 + 幼稚T细胞和CD4 + Tcm单元(补充图。 3g ).CD4抗艾滋病药（Cluster of Differentiation 4） + Tcm细胞也与OXPHOS和PFS呈负相关(补充图。 3h，我 ).总之，在具有SBS6信号的tRCC肿瘤中，线粒体功能障碍诱导的ROS、GSH合成受损、DNA修复缺陷和DNA损伤增加导致了进一步损伤的潜在自我传播循环(图。 3h
体细胞拷贝数改变及其蛋白质组学后果 tRCC中的体细胞拷贝数改变(SCNAs)用GISTIC鉴定 53 (补充数据 2 ).我们鉴定了14个重要的臂水平SCNAs，包括tRCC中1q、5p和5q的扩增，以及1p、3p、4q、6q、9p、9q、18p、18q、19p、19q和22q的缺失(图。 4a ).焦点SCNAs如图所示。 4b 。染色体1p中的细胞带(1p13.2，1p36.12，1p36.21)包含最频繁缺失的焦点区域，1q21.1是唯一的焦点扩增事件(图。 4b ).在臂和病灶水平，缺失事件比扩增事件更频繁(补充图。 4a、b
图tRCC群组中的体细胞拷贝数改变分析。 a 武装级别的SCNA事件。红色表示扩增，蓝色表示缺失。重大事件用红色和蓝色突出显示( q < 0.10). b SCNA焦点事件。具有显著拷贝数扩增(红色)和缺失(蓝色)的焦点峰( q < 0.05) are shown. c 显著的臂级CNA和局灶性CNA事件的Cox回归分析。 d 识别 表示“在这一边” 和 反式 -3p缺失的影响。基于蛋白质丰度和3p CN之间的相关性对蛋白质进行排序。 e 反式 -3p缺失对ULK1 S469磷酸化水平的影响。箱线图显示了中间值(中心线)、25–75% IQR(箱线图界限)、1.5 × IQR(胡须)。 P 数值来自双边Wilcoxon秩和检验。 f ATG7蛋白丰度与MHC分子的相关性。 g 独联体 和 反式 CTNNB1缺失对钙粘蛋白-连环蛋白复合物丰度的影响。左侧显示了钙粘蛋白-连环蛋白复合物丰度的Cox回归分析。 h 一个描述tRCC中3p缺失和不良预后关系的模型。
接下来，我们检查了SCNAs与mRNA和蛋白质丰度的相关性(补充图。 4c，d ).这 反式 -在蛋白质组水平上，在1p、2q、3p、8p、12q、14q上鉴定了作用的SCNA热点(补充图。 4d ).mRNA表达水平显示出显著性 独联体 -脂肪酸β-氧化作用增强。显示有意义的蛋白质 独联体 -缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、嗜中性粒细胞脱粒、酮生成和脂肪酸β-氧化作用增强(补充图。 4e ).我们使用Cox回归来确定显著的CNA事件和临床结果之间的联系(图。 4c ).6q、18p、18q、3p、16p和1p的缺失以及1q和5p的扩增与较差的PFS相关。使用这些臂水平CNA进行多变量分析，显示6q和3p的缺失和1q的扩增是与不良PFS相关的主要CNA事件(补充图。 4f，g ，补充数据 2 ).此外，6q和3p的缺失与总生存率下降相关(补充图。 4f，g ).tRCC的早期基因组研究表明17q获得和9p丢失与不良结果显著相关 29 ,30 。我们比较了17q增加和9p减少患者的生存曲线，发现我们的结果与以前的报道一致 ( 补充图 4h
因为染色体3p是一个 反式 -作用SCNA热点和3p缺失与较差的临床结果相关(补充图。 4f )，进一步调查3p缺失的蛋白质组影响。GSEA揭示了与3p拷贝数(CN)正相关的蛋白质聚集在聚集吞噬上，而与3p CN负相关的蛋白质聚集在补体和凝血级联上(图。 4d ，补充图。 4i ).至于那个 独联体 -效应，ATG7(一种自噬所必需的E1样激活酶)的丰度与3p CN显著相关(Spearman相关， p = 7.87E-4)。此外，参与自噬的蛋白质，如ATG4B、PIK3C3、HSPA8、PARK7和泛素，在3p缺失的tRCC肿瘤中也下调(补充图。 4i ).ULK1 S469磷酸化，据报道减少了自噬的发生 54 ，在3p缺失肿瘤中上调( p = 0.0381)(图。 4e )，表明tRCC肿瘤中3p的缺失可能导致自噬的损害。因为据报道自噬在抗原呈递中起重要作用 55 ,56 ，我们研究了ATG7和抗原呈递机制之间的相关性。我们观察到ATG7丰度与MHC-II分子丰度正相关，而与MHC-I分子丰度不相关(图。 4f ).另一个重要的 独联体 -3p中的效应发生在 CTNNB1 钙粘蛋白-连环蛋白复合体的一部分。CTNNB1的丰度与钙粘蛋白-连环蛋白复合物的其他成分显著相关(Spearman相关， p < 0.05). Downregulation of most components of the cadherin-catenin complex was associated with poorer PFS (Fig. 第四代移动通信技术 ).据报道，钙粘蛋白-连环蛋白复合物在细胞粘附中起关键作用。细胞粘附的丧失被视为肿瘤转移发展中的关键步骤。总之，3p缺失与免疫逃避和转移相关，因为 独联体 -动作元件开启 ATG7 和 CTNNB1 分别为(图。 4h
tRCC融合类型的蛋白质组差异 尽管两者都被归类为麻省理工学院tRCC家族， TFE3 融合肿瘤相对更具侵袭性，而 TFEB 融合性肿瘤预后较好 1 ,57 。通过比较这两种TFE融合类型，鉴定出20种蛋白在 TFE3 融合肿瘤，518个蛋白在 TFEB -tRCC(图 5a ，补充数据 5 ). TFEB 特别是在 TFEB -tRCC (FC = 27.34， p = 0.0029)(图。 5a、b ).相应地，TFEB推断的活动在 TFEB -tRCC比in TFE3 -tRCC(图 5b ).然而，TFE3的丰度和推断的活性没有显示出显著差异(图。 5c ).富集分析揭示了上调的糖酵解、糖异生、中性粒细胞脱颗粒、内吞作用、坏死性下垂和细胞膜运输。 TFEB tRCC。钙-钙调素依赖性蛋白激酶激活在 TFE3 -tRCC(图 5d
图tRCC不同融合类型的分子异质性。 a 火山图显示DEPs(双边Wilcoxon秩和检验， p 值< 0.05，FC > 2) TFEB -tRCC和 TFE3 tRCC肿瘤。 b , c TFEB和TFE3产品水平和活性的比较 TFEB -tRCC( n = 5)和 TFE3 -tRCC( n = 54)肿瘤。 d DEPs in TFEB -tRCC和 TFE3 -tRCC肿瘤丰富了生物途径。 e 不同人群中蛋白质水平升高 TFE3 -tRCC融合类型和涉及的生物学过程。 f 不同个体间TFE3活性和肾脏特征评分的比较 TFE3 -tRCC融合类型( APSCR1 , n = 18; LUC7L3 , n = 3; PRCC , n = 4, MED15 , n = 4; SFPQ , n = 11;罕见的， n = 9; 禁忌 , n = 5). P 数值来自双边Wilcoxon秩和检验。 g 不同TFE3活性和肾脏特征评分患者的PFS Kaplan-Meier曲线(双侧对数秩检验)。 h PFS的卡普兰-迈耶曲线 ASPSCR1 和 LUC7L3 TFE3 -tRCC肿瘤相对于其他 TFE3 -该队列中的tRCC肿瘤(双侧对数秩检验)。 i ISUP等级的比例 ASPSCR1 和 LUC7L3 TFE3 -tRCC肿瘤相对于其他 TFE3 -tRCC肿瘤(单侧Fisher精确检验)。数据输入 b , c , f 用箱线图显示。箱线图显示了中间值(中心线)、25–75% IQR(箱线图界限)、1.5 × IQR(胡须)。 P 数值来自双边Wilcoxon秩和检验。
不同的 TFE3 在过去的几十年里，融合伴侣相继被发现 1 ，然而不同的分子特征 TFE3 融合类型在很大程度上保持不变。我们比较了 TFE3 和 TFE3 融合不同的伙伴 TFE3 融合类型。结果表明，在以下方面没有显著差异 TFE3 不同融合类型的丰度(补充图。 5a ).我们接下来比较了不同的相应融合配偶体的丰度，其中只有 LUC7L3 -TFE3 融合上调了LUC7L3的丰度(补充图。 5a、b TFE3 tRCC的融合类型，我们确定了与 TFE3 融合(图 5e ).在…里 ASPSCR1 -TFE3 tRCC，我们观察到急性期反应(C1S，C1QC)和抗原呈递(TAP1，TAP2)的上调。 SFPQ -TFE3 tRCC显示泛素-蛋白体系统升高(UBB，UBC，PSMB7)。 NONO-TFE3 tRCC上调氧化还原和药物代谢过程(DDO，ACOX2)。 PRCC -TFE3 具有最少特异性上调的蛋白质，富含铁离子转运。 LUC7L3 -TFE3 tRCC过度表达参与细胞周期的蛋白质(CDK9，PCNA，MCM2)。 TFE3 -tRCC 与一个罕见的融合伴侣，并显示出高凋亡过程(PIK3CA)。
值得注意的是，我们发现在不同的tRCC融合类型中，TFE3活性和肾脏特征评分不同(图。 5f，g ASPSCR1 -TFE3 和 LUC7L3 -TFE3 与其他类型的融合肿瘤相比，融合肿瘤具有较高的TFE3活性，但肾脏特征评分较低。 TFE3 -tRCC(图 5f ).由于TFE3活性和肾脏特征评分与患者预后显著相关(图。 5g ASPSCR1 和 LUC7L3 融合肿瘤比其他融合类型的肿瘤更具侵袭性(对数秩检验， p = 0.048)(图。 5h ).我们进一步纳入了tRCC案例的数据( n = 15)来自TCGA研究 58 用我们的数据，得到一个更显著的差异(对数秩检验， p = 0.033)(补充图。 5c ).我们一直发现 ASPSCR1 和 LUC7L3 融合型tRCC肿瘤的ISUP分级高于其他融合型 TFE3 -tRCC(图 5i ).为了研究TFE3如何影响临床结果，我们筛选了12种TFE3靶蛋白(补充图。 5d ).参与补体级联反应的C1S、C3和丝氨酸蛋白酶抑制剂1被TFE3上调。在酮分解代谢中起作用的ACAT1和BDH1被TFE3下调，表明恶性tRCC中的生酮饮食疗法 59 。总的来说， TFE3 与不同的伴侣融合，这些融合显示出不同的TFE3活性，进一步影响蛋白表达模式和临床结果。
tRCC的蛋白质组亚型 由于肿瘤间的高度异质性，对tRCC进行分子分型是很重要的。我们采用了共识聚类 60 鉴定tRCC蛋白质组亚型。tRCC病例被分为三个亚型，GP1、GP2和GP3，分别包括29、26和19例病例(图。 6a ，补充图。 6a–c TFEB -tRCC在GP3肿瘤中过度表达(图。 6a ，补充图。 6d ).GP1具有最高比例的III和IV期肿瘤，而GP2具有最高比例的I和II期肿瘤(图。 6a ).与GP2和gp3病例相比，GP1病例包含更多高级别(3级和4级)肿瘤(补充图。 6e ).值得注意的是，蛋白质组亚型在OS(对数秩检验， p = 0.0189)(图。 6b )和PFS(对数秩检验， p = 0.0007)(图。 6b ).在三种亚型中，GP1显示最短的OS和PFS，GP3显示相当短的PFS，但OS较长(图。 6b ).相应地，最终发展为复发或转移的86.5%的患者属于GP1和GP3(图。 6a ，补充数据 6 ).
图tRCC的蛋白质组亚型及其与遗传特征和临床结果的关系。 a 三种蛋白质组亚型中上调蛋白的相对丰度以及蛋白质组亚型与临床和遗传特征的相关性(Fisher精确检验或Kruskal–Wallis检验)。 b 三种亚型的OS和PFS的Kaplan-Meier曲线(双侧对数秩检验)。 c 富含三种蛋白质组亚型的上调途径。 d 显示三个蛋白质组亚型中重要臂水平事件分布的三元图。显示了三种蛋白质组亚型之间具有显著差异的CNA事件(Fisher精确检验)。 e GSEA图显示了 反式 -9q删除的影响。 f 独联体 tRCC中9q缺失的影响。 P 数值来源于双边Spearman相关检验。 g 不同ATP6V1G1丰度患者OS的Kaplan-Meier曲线(双侧对数秩检验)。
我们对每个亚型中升高的蛋白质进行了过度表达分析(图。 6c ).总的来说，GP1、GP2和GP3中分别有77、1009和630种蛋白质上调。GP1中上调的蛋白质在补体和凝血级联反应(C4A、C7、C8A、C9)、血小板脱颗粒(FGA、FGB、FGG)和先天免疫系统(图。 6c ，补充图。 6f ).GP2与代谢途径升高更相关，包括OXPHOS (COX4I1，UQCRB，SDHC)，氨基酸代谢，脂质代谢和葡萄糖代谢(图。 6c ，补充图。 6f ).因此，GP2在三种亚型中具有最高的肾脏特征分数(补充图。 6g ).GP3具有上调的蛋白质，这些蛋白质富含与肿瘤增殖和蛋白质稳态相关的途径，如核糖体功能、翻译和蛋白酶体降解(图。 6c ，补充图。 6f
接下来，我们比较了本研究中建立的蛋白质组亚型的基因组信息，以探索蛋白质组亚型中遗传改变的驱动效应。TMB显示三种亚型之间没有显著差异(补充图。 6小时 ).GP2的CIN最低(补充图。 6i ).三种亚型之间的突变特征也不同(补充图。 6j，k ).GP2具有最低水平的SBS6和SBS26(补充图。 6k ).至于手臂水平的CNA事件，GP1和GP2表现出最低的相似性(补充图。 6l )，表明臂水平的CNAs深刻地影响了tRCC的蛋白质组和临床结果。9q和14q的缺失在GP1中更频繁地发生，12p和12q的扩增在GP1和GP3中聚集(Fisher精确检验， p < 0.05) (Fig. 6a，d ).这四个臂级CNA事件与较短的PFS显著相关(补充图。 6m ).由于9q缺失是GP1最重要的CNA特征，我们分析了tRCC中9q缺失的蛋白质组学影响。GSEA表明，补体激活在9q缺失的肿瘤中富集，而OXPHOS在没有9q缺失的肿瘤中富集(图。 6e ATP6V1G1 (9q32)，编码ATP酶的一个组分，显示出显着的CNA 独联体 -效果(图 6f ).此外， ATP6V1G1 丰度与临床结果显著相关(图。 6g ).我们假设9q的缺失导致两者中OXPHOS的下调 独联体 表示“对象”: analysand 反式 -行为方式进一步影响了患者的临床结果。
tRCC中免疫浸润的特征 为了研究tRCC中免疫浸润的特征，我们使用xCell进行了细胞类型去卷积分析 52 。基于推断的肿瘤微环境(TME)中不同细胞类型的相对丰度，一致聚类确定了三种免疫亚型(图。 7a ，补充图。 7a，b ).免疫亚型显示出与蛋白质组簇的显著关联(Fisher精确检验， p = 4.43e-7)，反映了TME组成对蛋白质表达模式的影响(图。 7a ).与蛋白质组聚类一致，免疫亚型与临床结果显著相关(图。 7b ，补充图。 7c )，其中免疫亚型1 (IM1)的PFS和OS最低。
图tRCC肿瘤的免疫浸润。 a 三种免疫亚型中上调蛋白的相对丰度，以及免疫亚型与临床和遗传特征及蛋白质组亚型的相关性(Fisher精确检验)。 b 三种免疫亚型OS的Kaplan-Meier曲线(双侧对数秩检验)。 c 免疫亚型之间补体级联和EMT的途径得分的比较(IM1， n = 19;IM2， n = 27;IM3， n = 28).箱线图显示了中间值(中心线)、25–75%的IQR(箱线图限制)和1.5 × IQR(胡须)。 P 数值来自克鲁斯卡尔-沃利斯试验。 d 散点图显示EMT评分和xCell免疫信号的相关性。显示成纤维细胞。 e 显示三种免疫亚型中显著arm水平事件分布的三元图。指出了三种亚型之间有显著差异的CNA事件(Fisher精确检验)。 f 蛋白酶体与14q CN的相关性最高。 g 独联体 和 反式 14q缺失对蛋白酶体的影响。 h 蛋白酶体评分与EMT评分的相关性(双侧Spearman相关检验)。 i 一个描述tRCC中14q缺失和免疫信号关联的模型。
三种免疫亚型的间质浸润相似，而IM3的免疫浸润最低(补充图。 7d ).IM1的特征在于高比例的转移性肿瘤、升高水平的粒细胞、祖细胞、自然杀伤T (NKT)细胞、间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞和单核细胞。IM2具有最高的树突细胞，IM3具有最高的Th1细胞(图。 7a
我们发现IM1肿瘤中补体级联和上皮-间质转化(EMT)水平增强(图。 7c ，补充图。 7e ).据报道，TME中的成纤维细胞可以增强肿瘤细胞的EMT 61 ，这也在我们的数据中观察到(图。 7d ，补充图。 7f ).我们进行了免疫荧光(IF)分析来阐述成纤维细胞和肿瘤细胞的EMT状态之间的关系。结果显示，IM1 tRCC比tRCC的其他亚型表现出更强的泛细胞角蛋白(CK，上皮标记物)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，成纤维细胞标记物)的共染色，以及更强的α-SMA的单一染色(补充图。 7g )，反映了IM1肿瘤中增强的EMT和成纤维细胞浸润。此外，它表明，如果CK和α-SMA肿瘤的大子集的共同染色(补充图。 7g )，证明在IM1 tRCC肿瘤微环境中存在经历EMT的肿瘤细胞和一小部分成纤维细胞。
值得注意的是，IM1肿瘤具有更高频率的14q和9q缺失(Fisher精确检验， p < 0.05), which were both correlated with poor prognosis (Fig. 7e ，补充图。 6m ).由于75%的14q缺失事件集中在IM1，我们进一步分析了14q缺失的蛋白质组影响。蛋白体是14q CN最相关的途径(图。 7f )，这通过19种蛋白酶体组分和14q CN之间的显著相关性表现出来(图。 7g ).PSMA6 (14q13.2)的丰度，a 独联体 14q中的作用蛋白与更好的预后相关(补充图。 7h ).由于蛋白酶体在蛋白质周转中起重要作用，我们调查了蛋白酶体和tRCC中蛋白质丰度之间的关系(补充图。 7i ).结果显示，EMT相关蛋白的丰度和EMT评分与蛋白酶体呈负相关(补充图。 7i 7h )，表明在tRCC中EMT由蛋白酶体以翻译后机制调节。总之，14q缺失调节tRCC中EMT和IM1样微环境，这与不良预后相关(图。 7i
