LY6D标志着预先存在的耐药基底鳞状细胞肿瘤亚群

靶向治疗已被证明对治疗癌症有益，但动态肿瘤异质性和一系列预先存在和诱导的耐药机制会规避治疗。越来越多的证据表明，固有的细胞可塑性或表型转换是最具挑战性的耐药机制之一。虽然上皮干细胞的可塑性赋予了细胞切换其行为和细胞特性的显著能力，但目前缺乏改变与不良临床结果相关的群体的表型和标记的驱动因素1.

非黑色素瘤皮肤癌或角化癌如基底细胞癌(BCCs)和鳞状细胞癌(SCCs)代表了研究动态肿瘤异质性和可塑性的理想模型系统，因为它们可用于系列活检和皮肤内明确定义的谱系关系2,3。BCC的生长依赖于Hedgehog (HH)信号通路的规范激活，主要通过基因的各种突变来驱动，如Patched(PTCH1)或平滑的G蛋白偶联受体(高年资军医(senior medical officer))4。而针对SMO (SMO)的HH途径抑制剂i)是晚期非手术可切除病例的主要治疗，60%已经耐药2。此外，最初对SMO有反应的约20%的患者出现获得性耐药i，加强了描述肿瘤进化机制的需要2.

尽管它们的分子驱动力不同，但临床观察指出了基底细胞癌和鳞状细胞癌之间的流体关系，这对于治疗策略具有明确的意义。首先，通常观察到用SMO处理的基底细胞癌i在再次活检后，可能会以向SCC转变的形式产生耐药性5,6。与具有毛囊(HF)上皮祖细胞特征的基底细胞癌相反，鳞状细胞癌不是HH驱动的，类似于毛囊间表皮(IFE)2,3。根据这一临床观察，一些基底细胞癌小鼠模型指向SMOi-依赖性谱系转换抗性机制，产生以HH依赖性丧失为特征的持续细胞群，并向分化的IFE样细胞命运转变7。第二，散发性基底鳞状细胞癌(BSCs)的存在，显示了基底鳞状细胞癌和鳞状细胞癌的特征，进一步指出了基底鳞状细胞转变(BST)在角化癌中的存在8,9。进一步的研究发现BSC的SCC部分是BCC衍生的，但是失去了对HH信号的依赖性9。根据偶发性和诱导性观察，BST的病因仍然复杂，有各种驱动因素和诱导因素，如SMOi转录诱导剂如c-FOS，或随后的突变如ARID1A5,6,9,10.

一个关键的未解决的问题是，经历BST的群体是来自于选择的小的预先存在的耐药群体，还是在对治疗的反应中被诱导的。目前尚不清楚这些观察到的群体之间的关系，驱动其积累的机制，定义和跟踪它们的关键标记，以及它们是否存在于其他上皮肿瘤中。

在这里，我们利用已鉴定的干细胞表面标记淋巴细胞抗原6家族成员D (LY6D)去卷积BST机制，其标记并追踪基底squamous群体。LY6D标志着SMOi-诱导的IFE样耐药群体，但重要的是，它也标志着原始人类散发性基底细胞癌中预先存在的群体。我们证明了LY6D+肿瘤细胞位于基底细胞癌和鳞状细胞癌之间的分化谱上，类似于基底鳞状细胞癌(BSC)，突出了作为细胞可塑性介导的抗性机制的途径转换。此外，我们展示了SMOi加速向LY6D的过渡+陈述并证明LY6D+群体标记可以识别上皮肿瘤中其他预后不良的基底鳞状状态。

LY6D标志着预先存在的空间定位的基底鳞状细胞癌群体

我们去卷积BST相关可塑性的方法旨在定义BCCs中的群体和标记，识别BST的潜在迹象，然后询问促进相互转化的因素。我们通过合并7个现有的和新的(BCC19、BCC20和BCC21)来自具有不同组织学特征的原始人类基底细胞癌肿瘤的数据集，生成了一个综合数据集，然后使用适当的典型相关分析(CCA)来减轻患者之间的差异(图。1a、b，补充图。1a–c，e)11。CopyKAT通过拷贝数变异(CNVs)特异性区分肿瘤和正常组织，验证了我们区分肿瘤和正常组织的能力(补充图。1d)12。结果，我们发现了七个不同的聚类，每个聚类都有其独特的标记基因和相应的基因本体(GO)相关术语(图。1b，补充图。1e–h，补充数据1).

令人惊讶的是，原始BCC数据集已经包含了BST产生的SCC样耐药群体。我们使用BCC和SCC基因信号对不同的细胞群体进行评分，并在不同的聚类中发现了BCC-和SCC-like状态谱，其中来自我们的合并数据集(合并-胡-C6)的C6显著富集了SCC相关的基因信号，从而确定了初始BCC中SCC-like肿瘤的聚类(图。1b，c)10。与鳞状细胞癌样状态一致，合并的Hu-C6富含表皮相关GO术语、角质细胞分化基因评分和分化相关细胞类型，如棘状和颗粒状IFE，但不含HH反应性HF上皮(图。1d，e，补充图。1h–I)13。这一观察表明，合并的胡C6代表了介于基底细胞癌和鳞状细胞癌之间的一种中间状态，类似于基底细胞癌/基底鳞状细胞癌状态，这可能是对SMO的抵抗i9。为了评估这一人群在初发基底细胞癌中的发生率，我们调查了所有7例初发基底细胞癌中合并的胡-C6人群。我们发现basosquamous人群存在于所有人群中，尽管频率不同，支持这种先存人群的共同性(图。1f).此外，我们注意到，代表中间SCC样簇的其他簇(簇2)和非SCC样簇(簇3)也分布在所有7个初始bcc中，这表明了肿瘤细胞状态谱(图。1f).

为了前瞻性地分离合并的胡-C6 basosquamous群体，我们使用了合并的胡-C6特异的高表达标记基因，随后通过彗星试验验证，以探测我们的scRNA-Seq寻找相关的表面标记并鉴定LY6D，CLDN4, LYPD3，以及TACSTD2(图。第一代，补充图。1j)14。我们发现表面标记可以互换，特别是在随后的染色实验中，但是我们发现LY6D具有最大的合并胡-C6特异性(图。第一代).LY6D是淋巴细胞谱系和干细胞标记物的Ly6家族的一部分，也在标记实体器官谱系中起作用15。值得注意的是，LY6D在分化良好的人SCC群中表达也很丰富，并标志着人BCC和SCC scRNA-Seq数据与人包皮IFE基底细胞scRNA-Seq数据之间的重叠，进一步与在原始人BCC中观察到的基底鳞状细胞状态相似(补充图。2a–g)16,17。然后我们检测了来自小鼠的原始BCCsPtch1+/−；k14-creER；p53fl/fl菌株，以确定相同的标记是否可用于小鼠肿瘤生物学(图。1a、h).强调其实用性，Ly6d也标记了原始鼠BCC肿瘤中的基底鳞状细胞群(图。1j).虽然多个集群表达了Ly6d，也许暗示增加Ly6d与更大和更晚期的肿瘤相关(我们将回到这一点)，只有C5(小鼠-C5)表达所有的基底鳞状标记(Ly6d, Cldn4, Lypd3，以及Tacstd2)并且最富集IFE/角质细胞分化相关基因(图。1h–j，补充图。2h，我，补充数据2).此外，人类合并的人类-C6和小鼠-小鼠-C5聚类之间的交集揭示了77个基因组，包括LY6D，表明物种间相似的保守basosquamous状态(图。1k；补充数据3).我们的结论是LY6D/Ly6d标志着人类和小鼠肿瘤中的基底鳞状细胞群。

使用我们的表面标记作为基底读数，我们发现这些群体在肿瘤内占据独特的空间定位。RNAScope描绘了人口，与LY6D标记肿瘤结节最中心部分的细胞(图。1l，补充图。2j).像正常人表皮中的基底上细胞一样，这些细胞群明显与基底膜区(BMZ)分离，并且不与基质接触(图。1l，补充图。2j).老鼠的基底细胞癌有类似的模式Ly6d发现表达集中在结节中(图。1m).在分化良好的人类鳞状细胞癌和与基底细胞癌样区域相比更具鳞状细胞癌样部分的基底细胞癌中也观察到广泛表达(图。1m).

我们接下来询问了LY6D中HH信号通路的状态+通过检查是否LY6D+与途径靶基因重叠的细胞GLI1。与先前发现的合并的Hu-C6并不富含HH相关基因相一致，LY6D并且相关联的表面标记未能与GLI1(图。1n补充图。1i, 2k).此外，scATAC-Seq(我们将在后面详细讨论)谱系轨迹表明GLI1和LY6D(补充图2l).最后，我们通过RNAScope证实LY6D+原始bcc和BSC中的集群都不与共存GLI1(图。1o).

总的来说，我们的结论是LY6D标志着一个先前未鉴定的缺乏GLI信号的空间定位的basosquamous样群体，它在SMO之前就存在了i治疗。这个群体缺乏GLI1表达，在空间上是局部的，由TACSTD2, LYPD3，更具体地说是由LY6D(图。1p).我们对多个初始基底细胞癌、基底细胞癌和鳞状细胞癌的分析表明LY6D可能因肿瘤而异，但沿着BST谱向SCC方向显著增加(图。1q).

BCCs向LY6D过渡+同时保持增殖能力

LY6D的空间定位−和LY6D+肿瘤群体引起了极大的兴趣，促使对它们之间的潜在关系进行进一步的研究。我们利用了几种计算方法来支持LY6D的谱系进展−至LY6D+肿瘤状态。首先，合并的人类BCC scRNA-seq数据集的主成分分析(PCA)表明LY6D+合并的胡C6是一个BCC谱系端点(图。2a).此外，BCC21的PCA和单片分析(其中BCC21 C5表达高水平的LY6D称为BCC21-Hu-C5)加强了从anLY6D−国家对安LY6D+状态(图。2b，c，补充图。2l，m，补充数据4).这些观察结果被我们的小鼠scRNA-Seq数据的单倍假时分析进一步验证，揭示了Ly6d−到Ly6d+过渡(补充图。2n).

第二，单细胞ATAC序列(scATAC-Seq)支持LY6D之间的连续染色质可及性变化−和LY6D+人口。我们分析了三个人体基底细胞癌肿瘤及其伴随的scRNA-Seq数据，并使用ArchR算法来定义聚类关系(图。2d，补充图。3a–d，补充数据5)18。对BCC21肿瘤上皮亚群的实例分析发现了至少四个不同的簇，它们在不同标记基因附近的染色质可及性不同(图。2e补充图3e–k，补充数据6–8).BCC21 scRNA-Seq数据的整合鉴定出scATAC-Seq C1与BCC21-Hu-C5高度相似(图。2e，补充图。3l).scATAC-Seq C1显示出增强的可及性LY6D随着减少GLI1和来自scRNA-Seq的谱系预测一样，scATAC-Seq谱系预测工具通过ArchR预测scATAC-Seq C1作为终点(图。2f，g).观察scATAC-Seq轨迹，我们注意到与scATAC-Seq C1相关的不同峰位于LY6D(图。2h).最后，与连续的簇转变一致，我们注意到不同的转录因子基序出现并关闭(图。2i，补充图。北部3m公司).先前的工作暗示AP-1家族基序参与了从基底细胞癌到鳞状细胞癌的转变10。我们发现AP-1家族基序在转变的早期阶段是富集的(scATAC-Seq C3到C4和C4到C2)，但是富集的基序如RUNX1和各种转录因子的叉头盒家族参与LY6D的调节+状态(图。2i).我们的染色质动力学分析强烈支持向LY6D的自发转变+人口。

第三，从功能上确认从LY6D到−至LY6D+状态是肿瘤细胞自主和自发的，我们产生了SMOi敏感的小鼠BCC类器官系统，以培养基于特定表面标记的大量或分选的肿瘤上皮细胞群体(图。2j，补充图。5a–c).我们整理了Ly6d−细胞，将它们作为类器官培养14天，发现在培养14天后，细胞的表达水平Ly6d与初始电镀时的水平相比，中的类有机物明显更高，并且与来自Ly6d的类有机物相当+细胞生长14天(图。2j，k，m补充图4d).另外，当我们培养Ly6d时−类器官，我们检测到Ly6d+细胞在D14通过流动分析，提示Ly6d的能力−过渡到Ly6d−到Ly6d+状态(图。2n).总的来说，这些数据加强了Ly6d细胞的自主性−至Ly6d+过渡。此外，我们注意到Ly6d的显著增长优势+类有机化合物与其Ly6d相比−副本(图2k，l).重要的是，这种生长优势是肿瘤Ly6d所特有的+单元格为Ly6d+与正常Ly6d相比，来自正常表皮的细胞生长停滞−细胞(图2k，l，补充图。5g).我们得出结论，尽管LY6D自发基底上转化−至LY6D+肿瘤细胞，LY6D+BCC细胞不会退出细胞周期并保持其增殖潜能。

与肿瘤上皮细胞相关的不同表观遗传调控和生物学过程

因为LY6D+正常IFE的基底层上的细胞通常一致地导致增殖停滞和终末分化，我们研究了来自LY6D的相互转化之间的差异−至LY6D+在正常和密件抄送的上下文中。我们利用了在我们的人类scATAC-Seq和scRNA-Seq数据中通过染色质可及性和表达来区分正常和肿瘤细胞的能力GLI1，分别为(图。3a–c，补充数据9).使用由正常和BCC细胞以及LY6D定义的四个scRNA-Seq簇−和LY6D+分数(正常:LY6D低的，正常:LY6D你好，肿瘤:LY6D低的、和肿瘤:LY6D你好)，我们能够将这些聚类估算并整合到scATAC-Seq聚类中，以便进行后续分析(图。三维（three dimension的缩写）).我们假设这些关键细胞差异的基础来源于肿瘤和正常上皮之间突变的巨大差异。我们之前通过CNV推论使用CopyKat来区分肿瘤和正常上皮组织(补充图。1d).正常之间CNVs改变的可视化:LY6D你好和肿瘤:LY6D你好表明CNVs的广泛改变，可能反映了改变的突变状态(补充图。3o)12.

为了进一步理解LY6D中丰富的潜在生物过程+与LY6D相比的BCC细胞+正常细胞，我们分析了LY6D之间的scRNA-Seq的差异标记基因和scATAC-Seq的峰(在基因附近)+(C1)和LY6D−(C2)。我们确定了与分化、增殖、运动和粘附相关的类似术语(图。3e).与观察到的增殖差异增加一致，我们注意到显著的Mki67+/Ly6d+细胞在我们的小鼠scRNA-Seq数据，随后发现Edu掺入Ly6d+来自肿瘤的细胞比来自正常表皮的细胞更有意义(图。3f，补充图。5e，f).

与正常细胞相比，这四个簇的基序分析允许发现BCC内转录因子的叉头盒家族(例如FOXN3)的显著富集(图。3g).有趣的是，我们发现尽管在LY6D中丰富了你好与LY6D相比的BCC细胞低的与BCC细胞相比，BCC细胞、AP-1基序(如JUNB)和SMARCC1在很大程度上对正常细胞具有特异性(图。3g，h).进一步的研究发现，RUNX1基序在LY6D中独特地富集你好BCC的一部分，表明这种肿瘤特异性基序可能调节基底鳞状状态转换(图。3g，h).尽管存在基序富集特异性，但已鉴定的转录因子的表达在整个肿瘤和正常组织中基本一致(图。3i).为了从功能上测试FOXN3和RUNX1是否促进或抑制不同的肿瘤状态，我们进行了两个独立的实验。首先，我们测试了Runx1分子抑制剂(Runx1i)有和没有Smoi在我们的小鼠肿瘤器官样模型中(图。3j，补充图。4a).我们发现两种Smoi和Runx1i对类器官的生长有显著的影响，并且一起，抑制剂没有显示出协同作用，表明Runx1通过相同的下游机制对BCC生长起积极作用(图。3j，k，补充图。4a).第二，我们生成了Foxn3(fon3-KO)和Runx1(Runx1-KO)突变鼠BCC细胞系(图。3l，补充图。4b).与野生型对照相比，fonx 3-KO和Runx1-KO细胞的细胞因子水平都降低了。Gli1(图。3m).此外，我们注意到随着Gli1我们发现BST相关表面标记的表达水平增加Lypd3和Tacstd2(图。3m).总之，这些数据支持Runx1和Foxn3在维持LY6D中的作用−BCC状态通过抑制BST跃迁。

身体特征和遗传影响LY6D+细胞积累

虽然我们已经展示了LY6D+与正常组织相比，基底细胞癌缺乏HH/GLI信号，不经治疗自发形成，并保持增殖，我们进一步研究了影响LY6D的决定因素+肿瘤细胞积聚。如前所述，我们注意到与人类肿瘤相比，Ly6d在小鼠模型中的大量表达更高。根据定量分析，我们注意到Ly6d与成对的较小肿瘤相比，较大小鼠肿瘤中的大量表达(图。4a).这些结果表明Ly6d的量随着肿瘤的发展和变大而增加。此外，在BCC21中，表达式LY6D与大结节相关(图。4b).此外，基底鳞状区域通常在距离BMZ 2-3个细胞处发现，这表明肿瘤的整体大小、瘤内结节大小以及与BMZ的距离是影响肿瘤生长的主要因素LY6D/Ly6d级别(图4c).

随着肿瘤的大小，药物治疗也影响LY6D的比例+细胞。当SMO后重新活检耐药的基底细胞癌时i，许多呈现广泛的鳞状细胞癌样表型(图。4d)5。通过RNAScope检查具有SCC样特征的rBCCs揭示LY6D不与同域的表达式GLI1(图。4d).相反，没有SCC样特征的rBCCs缺乏LY6D表达但保持GLI1整个肿瘤的水平(图。4d).在rBCC scRNA-Seq数据中可以看到类似的观察结果，一些肿瘤均匀表达LY6D或者GLI1(图。4e，补充图。5h)19。总的来说，这证实了在初始基底细胞癌肿瘤中，通过SMO的靶向治疗i为LY6D选择+人口。

以前的工作已经确定了一个持续的细胞群体，保持对SMO的抗性i，具有类似生命的特征20。我们发现我们的LY6D+/Ly6d+在我们的人类和小鼠原始数据集中，这些细胞与这些细胞群有相当大的重叠。4f).此外，具有高水平LY6D的rBCCs随后具有高的持续性得分(图。第四代移动通信技术)19。与以前的观察结果相反，该数据表明持久性群体是在初始散发肿瘤中自发产生的，这提供了一种BCC对SMO的抗性模式i.

并非所有rBCCs快递LY6D所以我们假设变异可能是基于产生不同抗性的不同突变景观。与这个想法一致，我们注意到缺乏LY6D在那些具有SMO激活突变的肿瘤中的表达，不考虑大小(图。第四代移动通信技术).此外，我们注意到LY6D具有NOTCH1和NOTCH2突变的rBCCs的表达，通常见于鳞状细胞癌(图。第四代移动通信技术)9。基底细胞痣综合征患者，也称为Gorlin综合征，有一种罕见的可遗传的PTCH1，使他们易患背景突变相对较少的基底细胞癌21。临床试验数据表明，虽然SMOi治疗缩小了综合征性基底细胞癌，它们通常在SMO之后在同一位置重新形成i从持续细胞群中消失22。审视天真和SMOi-治疗的肿瘤，我们发现初始综合征肿瘤表达很少LY6D但是高水平的GLI1(图。4h).相比之下，SMO的持续细胞群i-经治疗的肿瘤富含LY6D和缺乏GLI1表达，增强这些肿瘤中的治疗依赖性LY6D基底鳞状状态(图。4h).总之，这些观察表明，没有SMO激活突变的肿瘤采用自发和药物诱导的转化策略向LY6D转化+持续状态。

治疗干预可以改变SMOi抗性LY6D+细胞积累

为了更好地理解SMO是如何i和其他药物干预调节向LY6D的过渡+状态，我们利用我们的类器官系统，接种大量肿瘤并使其接受各种抑制剂，以检测它们如何影响Ly6d的水平(图。5a).为了测试SMOi选择性地，我们用SMO处理类器官i然后检查两个Ly6d中的凋亡水平−和Ly6d+流式细胞仪检测细胞(图。5b，补充图。5i).我们发现Ly6d中细胞死亡增加−细胞表明，正如人们可能预测的，SMOi靶向用HH信号增强的细胞(图。5c).用MRTF抑制剂CCG治疗，该抑制剂已被证明与LY6D相关+nMRTF状态转换，没有显示类似的急性选择性(图。5c)10,11.

为了测试药物干预的长期效果，我们在铺板后立即处理类有机化合物14天，为了测试急性效果，我们处理已经形成的类有机化合物48小时(图。5b).根据我们之前的观察预测，用SMO治疗i导致Ly6d的适度增加，表明长期治疗将选择Ly6d+状态(图。5d；补充图5j).相反，当用CCG处理类器官时，我们看到Ly6d水平显著下降(图。5d；补充图5k).

检验SMO的全球长期体内效应i在基底细胞癌中，我们移植相同的原发肿瘤，然后用DMSO或SMO处理同种异体移植肿瘤i(图。5a).经治疗的肿瘤的scRNA-Seq显示出明显的聚集，并具有增强的Ly6dSMO的水平i经治疗的肿瘤(图5e–f，补充数据10).此外，全局分析揭示了来自初级小鼠scRNA-Seq的Mu-C5标记基因的增强分化和富集(图。5h，我).最后，我们注意到在SMOi治疗的肿瘤中耐药持续细胞状态的富集(图。5j).这些数据支持了通过SMO进行靶向治疗的观点i可以诱导LY6D+持续的基础状态。

LY6D+群体是靶向的，存在于其他上皮肿瘤中，与不良临床结果相关

我们的研究表明，LY6D区分小鼠和人类皮肤BCC-和SCC-样状态，提高了它作为其他基底鳞状细胞癌的一般诊断和治疗生物标志物的可能性。检查LY6D在所有主要癌症中，我们注意到腺样囊性癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌(CESC)、食道癌(ESCA)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肺鳞癌(LUSC)和胰腺癌(PAAD)中的高水平(图。6a).与正常组织相比，LY6DCESC、LUSC和PAAD的肿瘤组织中的水平较高(图。6b，补充图。6a).较差的临床结果与高水平的LY6D在CESC和LUSC，但在PAAD要高得多。6c，补充图。6b).

了解…的范围LY6D在不同的胰腺肿瘤中表达，我们检查了来自包含正常和肿瘤样本的相当大的scRNA-Seq数据集的导管细胞，注意到LY6D表情(图。6d，补充图。6c，d)23。此外，我们注意到肿瘤导管细胞具有较高水平的。LY6D具有更高的持续性评分，增加了在基底细胞癌中观察到类似鳞状相关状态的可能性(图。6e).

鳞状特征有时在PAAD被发现，被称为胰腺腺鳞癌(ASCP)。被报道为一种普遍罕见的胰腺癌事件(发病率在0.3-10%之间)，与PAAD相比，ASCP通常具有非常差的临床结果24,25。该频率范围源于组织学上鉴别ASCP的困难，表明明显未满足临床上对区分PAAD和ASCP的标记物的需求。来确定是否LY6D是ASCP的读数，我们检查了常规PAAD和ASCP的组织学定义的患者肿瘤(图。6f).我们没有发现或发现很低水平的LY6D在K19中+PAAD样本的导管或炎症性胰腺炎状态(图。6f，g).然而，我们确实发现高LY6D与ASCP状态一致相关的表达式(图。6f，g).这些观察表明LY6D确定这一众所周知的挑战，以确定ASCP肿瘤状态。

为了确定Ly6d除了作为鳞状细胞状态的生物标志物的明确用途外，是否还有其他功能性作用，我们利用了我们的肿瘤器官样模型并引入了抗LY6D抗体(图。6小时).我们发现添加抗Ly6d抗体导致类器官体积减小，这表明靶向Ly6d实际上可能具有治疗意义(图。6小时).总的来说，这项工作突出表明LY6D在多种癌症中表达并且可以被靶向，这表明LY6D具有超出生物标记的功能相关性。

使用BCCs作为模型系统，我们已经确定了一种自发发生的耐药基底鳞状细胞状态，以LY6D表面表达为标志，并表明积聚可以通过肿瘤突变或药物治疗策略来增强或减少。我们展示了它的实用性LY6D在其他癌症中表达，如胰腺癌的ASCP亚型，其与极差的临床结果相关。

虽然基底细胞癌肿瘤可以通过基底细胞癌和鳞状细胞癌之间的细胞身份转换产生耐药性，但这种转换是自发发生还是在治疗后发生仍不清楚2,9,20,26。识别basosquamous状态，标记为LY6D和缺乏GLI1让我们能够追踪和描述这种抗药性种群，甚至在SMO病毒出现之前就证明了它的存在i治疗，这可以解释单一疗法的高失败率。此外，我们统一了以前的观察，并表明LY6D标记以前只在SMO之后发现的持久细胞i处理20。我们在SMO之前就确定了这个群体i但是表明SMOi可以进一步促进LY6D+肿瘤堆积。与驱动LY6D的低SMO活性一致+积累，通过激活突变含有高水平SMO活性的人RBC缺乏自发LY6D+肿瘤堆积。相比之下，格林综合征患者的自发LY6D基础水平较低+细胞，对SMO反应良好i，但诱导残留LY6D+复发于SMO的持续性肿瘤i停止21.

将LY6D进行对比是很有趣的+BCCs中的细胞，以及它们是否有可能作为SCC肿瘤干细胞(CSCs ),产生在多种情况下观察到的SCC相关肿瘤上皮，如rBCCs和BSCs27。这项工作和其他工作的数据表明，Gorlin患者的持续种群以及BCC肿瘤持续的小鼠模型进入LY6D+/与SMO的类似IFE的状态i但随后回到GLI1+/HH-停止治疗后的依赖状态，而不是SCC样状态20。这一证据表明，额外的因素可能驱动细胞从基底细胞癌相关的LY6D+状态到SCC相关的LY6D+有可能长出鳞状细胞癌样肿瘤上皮的状态。来自BSC的证据表明，需要额外的散发性突变如ARID1A来过渡到LY6D+能够产生SCC相关肿瘤上皮的状态9。就区域商业银行而言，这项工作表明，SMOi会导致LY6D的积累+细胞提示药物干预可能驱动LY6D+细胞进入能够产生SCC相关肿瘤上皮的类似状态。这些数据证明了SMO活性和背景基因突变在LY6D累积动力学中的关键作用+耐药肿瘤和提示动力学可能对其他治疗、遗传或环境决定因素敏感。

我们的工作也为可能促进LY6D的信号通路提供了额外的见解+基底细胞癌肿瘤。基底鳞状状态的肿瘤结节内的中心定位和与BMZ的距离提供了关于什么因素可能驱动这种内在抗性的洞察力和推测。随着肿瘤和肿瘤结节的生长，与特征性BCC肿瘤间质的距离变大，这表明缺乏间质(其接触和/或分泌因子)可能导致LY6D+状态。消除基底细胞癌间质对一般肿瘤生长和潜在耐药性的贡献已经变得具有明显的临床重要性，因为免疫疗法现在正被用于治疗晚期基底细胞癌19。此外，我们的研究依赖于以前的工作来确定也可以影响LY6D的信号通路+肿瘤积聚10,11。通过阻断MRTF或EGFR的转换途径减少LY6D的治疗减少了LY6D的积累，增加了这些药物与SMO联合使用的可能性i减少综合征和散发性基底细胞癌LY6D相关耐药累积的治疗。此外，我们的工作强调了靶向LY6D本身可能具有功能性作用的治疗意义，但是靶向肿瘤特异性LY6D需要额外的考虑+细胞。

LY6D表面表达在其他上皮癌中的存在表明BCCs的工作将适用于更致命的癌症，如胰腺癌中的ASCP发病率。随着对ASCP患病率的各种建议，LY6D表达现在可以用于快速鉴定ASCP，并允许更多的功能实验以更好地了解与PAAD的差异。这里分析的24个(45.8%) scRNA-Seq肿瘤数据集中大约有11个具有较高水平的LY6D，表明ASCP可能比最初认为的更广泛。此外，像BCC-SCC上皮可塑性谱一样，胰腺癌可能具有在非鳞状和鳞状状态之间切换的更大的可塑性。降低LY6D的EGFR抑制剂+我们的BCC系统中的累积，被批准用于治疗PDAC，表明它们可能对表达LY6D的ACSP更有效10,28。总的来说，这项工作证明了LY6D作为一种临床结果不佳的基底动脉粥样硬化状态的通用标记物的效用。