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一个改进的波动检验框架描述了结直肠癌持续细胞的群体动态和突变率

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发表时间:2022-07-18 10:52作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

令人信服的证据表明,癌症持久性细胞是靶向治疗长期疗效的主要限制。然而,癌症持续细胞的表型和种群动态仍不清楚。我们开发了一个定量框架,通过结合实验表征和数学建模来研究持久性。我们发现,在结肠直肠癌中,一部分持续基因缓慢复制。临床批准的靶向治疗诱导向耐药持续体的转变,并使其突变率暂时增加7-50倍,从而增加了持续体衍生的耐药细胞的数量。这些发现表明,治疗可能影响癌细胞的持久性和突变性,并精确抑制易错DNA聚合酶作为限制肿瘤复发的策略。

主要的

当用靶向药物治疗癌症患者时,通常在初始反应后观察到肿瘤复发1,2。在长期反应和疾病稳定后出现耐药性也很常见3,4。事实上,当癌细胞暴露于致命剂量的靶向治疗时,耐药性“持久性”细胞亚群的出现会阻止肿瘤的根除5,6,7,8,9,10。与基因耐药细胞不同,持久耐药细胞通过可逆、非遗传、不可遗传的耐药机制来耐受药物压力5,10,11。然而,还不清楚持久细胞是进入静止状态还是缓慢地经历细胞周期。也不知道持久表型是药物诱导的还是预先存在的。此外,控制抗药性持续进化的种群动态只是部分得到阐明8.

结肠直肠癌(CRC)细胞暴露于靶向治疗诱导DNA损伤和DNA修复能力受损,这是最近在多项研究中证实的一种表型12,13。药物治疗导致癌细胞中容易出错的DNA复制,这表明在治疗诱导的压力下,持久细胞的可变性会增加14.

由于肿瘤的异质性和追踪谱系的困难,通过DNA测序测量突变过程具有挑战性12。一个补充策略是由卢里亚和德尔布吕克开发的“波动试验”,以描述细菌种群中耐药性的开始15。这种分析利用克隆群体的多次复制来绕过谱系追踪问题,并提供了一种估计突变率的优雅策略。

波动检验先前已被修改以推断肿瘤对治疗的获得抗性16,17,18,19,特别是用于治疗开始前预先存在的抗性细胞的进化和基础条件下癌细胞突变率的估计20。然而,它并不是用来量化药物治疗期间癌症持续者的突变率。

在目前的研究中,我们提出了一种通用的定量方法来表征癌细胞向持久性细胞的转变,并测量它们在药物治疗期间的群体动态。我们采用两步波动测试来量化CRC细胞的表型突变率。重要的是,我们的试验区分了预先存在的耐药克隆和持久衍生的克隆,允许定量自发(即,在未经治疗的条件下)和药物诱导的突变率。

结果

结直肠癌细胞的生长动力学

我们首先旨在量化CRC生长动力学参数是如何受药物治疗影响的。我们的实验包括:(1)标准条件下的生长率,(2)处理下的种群动态,以及(3)持久性(补充说明).

我们使用了两种微卫星稳定(MSS) CRC细胞模型,肾素血管紧张素系统/英国皇家空军野生型DiFi和黑色素瘤V600E-突变的WiDr,它们分别对单独的抗上皮生长因子受体(EGFR)抗体西妥昔单抗敏感13,21或者与BRAF抑制剂联合使用13,两种经临床批准的CRC方案22,23,24。为了降低分析开始时群体中存在预先存在的耐药细胞的可能性,我们分离了每个细胞模型的单个克隆,其生长和药物敏感性特征与亲代群体相当(补充图。1a、b).

我们测量了标准细胞培养条件下克隆的出生率和死亡率。2,补充表1补充说明).我们从两组药物反应生长试验中收集数据(图。1a).第一个是剂量反应分析,其中CRC克隆暴露于浓度增加的靶向治疗(图。1b和扩展数据图。1a),用于分析定义为活细胞数量对时间和药物浓度的生长曲线(图。1c和扩展数据图。1b)并对药物治疗中生长和向持久状态转变的交织过程进行量化。补充图3显示了用于获得生长曲线的剂量反应分析数据的标准化过程(补充说明).第二个是单剂量试验,包括暴露于恒定药物浓度3周,强调了双相(两个时间尺度)杀灭曲线(图。1d和扩展数据图。1c),其特征是敏感细胞快速下降,然后是较慢的下降25,26,这是细菌中出现持久细菌的标志25。存活的持续体部分显示细胞数量缓慢但可测量的衰减(扩展数据图)。2),表明坚持者有随着时间推移慢慢死亡的趋势。

图1:响应靶向治疗的CRC克隆的群体动态。
figure 1

a,对CRC克隆进行的药物筛选生长曲线分析的示意图。b在剂量反应分析中,用递增浓度的dabrafenib(Dab)+50μg/ml处理WiDr细胞−1西妥昔单抗(CTX),而DiFi细胞接受浓度增加的CTX。在指定的时间点通过ATP试验测量细胞活力。结果代表平均标准差(n= 3个针对WiDr的生物学独立实验;nDiFi的5个生物学独立实验)。c治疗中指定细胞的生长曲线,报告为活细胞的倍数变化(对数标度)对药物暴露时间,通过使用第0天测量的存活力在指定时间点标准化细胞存活力,从剂量反应分析数据计算。每个克隆的三种不同药物浓度的生长曲线显示为平均标准差(n= 3表示WiDrn对于DiFi = 5)。d在单剂量试验中,活细胞的倍数变化(对数标度,通过ATP试验评估)对指示细胞的药物暴露时间。活细胞的总数符合具有两个时间尺度的指数衰减,支持持久细胞的生长(虚线表示初始斜率)。符号表示手段(n= 2个生物学上独立的实验)。

CRC持久性细胞在药物治疗期间缓慢复制

我们接下来试图阐明在药物治疗下持续增殖和死亡的动力学。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)对CRC持久体进行染色,羧基荧光素琥珀酰亚胺酯是一种细胞渗透性荧光染料,允许对细胞分裂进行流式细胞术监测27,和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU),一种在活性DNA复制过程中有效整合到DNA中的修饰胸苷类似物,揭示了0.2%和2.5%之间的部分持续体在治疗过程中缓慢复制(扩展数据图)。3a–c补充说明),符合最近的数据28。我们接下来使用活细胞显微成像分析(补充说明).尽管大多数CRC持久体是非复制性的,但在所有分析的CRC克隆中细胞分裂事件是可见的(扩展数据图。三维(three dimension的缩写)和补充视频14).细胞分裂偶尔是成功的和可行的(扩展数据图。三维(three dimension的缩写)).我们还检测了细胞分裂后和未分裂细胞中的细胞死亡事件(扩展数据图。3e、f).

持续表型是由CRC中的靶向治疗诱导的

为了量化药物治疗期间的细胞群体动态,我们开发了一个CRC细胞向持久状态转变的数学模型,我们称之为“转变为持久状态”(TP)模型。该模型将出生-死亡参数和表型转换纳入确定性极限(即忽略随机人口效应引起的波动,参见补充说明)29,30。数字2a总结了TP模型的动力学。我们利用该模型来量化转换率,并评估持续存在的亚群是否先于药物施用,或者持续存在的表型是否在药物治疗中出现。TP模型考虑了药物处理的细胞的三种可能的命运:(1)死亡,(2)复制和(3)以一定的速率转换到持续状态,λ在药物存在的情况下;它进一步考虑预先存在的任意稳定分数f0持久者(图。2a).

图CRC持久细胞的出现主要是药物依赖性的。
figure 2

a,恒定药物处理下细胞群体动态的示意图。当癌细胞接受靶向治疗时,存活细胞的数量开始下降。敏感细胞(灰色细胞)的同质群体将呈指数缩小直至消失(灰色虚线)。一些细胞在药物治疗后存活下来,因为它们以一定的速度转变为持久表型(暗黄色细胞,暗黄色线)λ残留细胞(黑色实线)显示出双相衰减。有限部分的持久单元(f0)可能在药物治疗前存在于人群中(f0>0,暗黄色虚线)或不(f0= 0,深黄色实线)。持续细胞在治疗期间表现出降低的死亡率,这导致细胞群体缓慢的指数下降(暗黄色虚线)。b,治疗下CRC克隆的生长曲线,由剂量-反应分析计算。黑色符号和条形代表剂量反应数据集的平均标准差(nWiDr的3个生物学独立实验,nDiFi的5个生物学独立实验)。实线表示TP模型适合于不同持续细胞初始分数值的实验数据(f0颜色编码)。c根据单剂量数据集评估的所示细胞的活细胞相对于药物暴露时间的倍数变化。黑色符号代表实验数据的平均值(n= 2个生物学上独立的实验)。黑色虚线表示TP模型与数据的拟合,而暗黄色实线表示持久细胞的预期比例。d描述持续细胞动力学的TP参数的联合后验分布(等值线图,用归一化似然函数进行颜色编码)和边缘化后验分布(左图和下图,灰色区域表示概率密度函数):(1)持续细胞的初始分数(f0下图)和(2)对持久细胞敏感的转换率(λ)诱导的药物治疗。似然函数测量模型与实验数据的一致性,作为所考虑参数值的函数。

下面的等式定义了敏感(X(t))和persister(Z(t))根据TP模型的细胞(在药物治疗下):

$ $ \ left \ { { \ begin { array } { * { 20 } { l } } { { \ mathrm { D } } } { { \ mathrm { D } t } } { { X } } \ left({ t } \ right)} \ h fill & = \ h fill & { \ left({ B-D \ left({ \ left[{ { M } } \ right } } \ right)} \ right){ { X } } \ left({ { t } } \ right)-\ lambda \ left({ \ left[{ { M } } \ right$$
(1)

在哪里BD([M])分别是敏感细胞的出生依赖性和药物依赖性死亡率,而[M]为药物浓度。持续存在者以药物依赖的转换率出现λ([M]).在药物治疗下,顽固者会以一定的速度死亡Dp>0(扩展数据图23).该模型假设在获得抗药性突变之前试图分裂的持续体会死亡;因此,在药物存在的情况下,从持久性到敏感性的可能回切将有效地增加死亡率(补充说明).

指定等式(1)的解的初始条件是量化药物治疗诱导向持久状态转变的程度的关键。具体地说,如果敏感到持久的转变完全是药物诱导的,那么未治疗的群体将不含有任何持久的,也就是说,\(f _ 0 = \ frac { { Z \ left({ t _ 0 } \ right)} } { { N { \ left({ t _ 0 } \ right)} } = 0 \).

相反,如果一些持久化细胞预先存在,那么最初部分的持久化细胞具有有限的正值(f0> 0).如果f0是非常小的,一些持续者可能预先存在,但过渡主要是药物诱导的。如果f0实际上相当于几周治疗后的残留持久性的分数,那么向持久性的转变不是药物诱导的。

为了确定最可能的情况,我们使用了从药物反应分析中收集的实验数据(图。1).使用剂量反应分析的结果,我们定义了在短时间内控制模型动态的参数,例如持久性的初始分数f0和被处理细胞的有效生长率。类似地,单剂量测定用于量化影响长期动力学的模型参数,例如对持久性细胞(λ)和持续者的有效死亡率(Dp).通过约束来自实验数据的模型参数,我们建立了最能描述基于细胞的结果的方案。推断的参数与通过活细胞显微镜检测获得的值一致,支持增殖和细胞死亡之间的平衡稍微偏向后者(扩展数据图。3g补充说明).

在治疗过程中,细胞数量在1-3天内开始下降(t0),取决于初始播种密度(补充图。4).一旦生长曲线被缩放(在时间上和在测量的存活力上)到达到的最大值,在具有不同接种密度的实验中观察到的细胞动力学是一致的t = t0(补充图4).

TP模型的参数用两种细胞系的标准贝叶斯推断框架进行推断(补充表2补充说明).与WiDr相比,DiFi显示出较慢的“死亡”动态。有鉴于此,在WiDr中,我们对剂量反应和单剂量数据集进行了联合拟合,而在DiFi中,我们评估了长达19天的多剂量靶向治疗的生长曲线,这允许仅基于剂量反应数据集进行模型拟合(补充说明).

我们确定了给定实验数据的最佳TP模型参数,考虑了不同的持久化器初始数量值(f0).推断的TP模型和实验数据之间的最佳拟合出现在f0= 0,而当f0增加;我们注意到值f010%的误差已经导致了与数据的巨大偏差(图。2b).因此,TP模型与主要由药物诱导的持续表型是一致的。此外,该模型恰当地描述了单剂量分析的动力学(图。2c).

为了进一步证实TP模型的有效性,我们接下来将重点放在描述持续者动态的两个模型参数的贝叶斯统计上:转移率λ和持久者的初始分数f0。这两个参数的贝叶斯推断的联合后验分布如图。2d和补充图。5。我们发现持续的转换率λ当考虑持续者的初始分数的不同值时,模型拟合的估计值不变f0(图。2d).的边缘化后验概率f0峰值为零(图。2d下图),其上限远小于持续种群大小(在所有持续细胞出现后)与治疗开始时的总种群大小之比。这意味着转换率的推断值λ独立于f0TP模型与实验数据的一致性最好f0= 0.

最后,为了比较这些场景f0= 0且f0> 0,我们使用了贝叶斯信息标准(BIC)和赤池的信息标准(AIC),这是用于模型选择的标准贝叶斯标准。根据这两者,TP模式与f0= 0优先于f0> 0(扩展数据图。4,补充表3补充说明).我们在补充表中总结了最适合的TP模型参数4。有趣的是,我们发现WiDr和DiFi细胞向持久细胞的转换率是药物依赖性的(扩展数据图。4和补充图。6).这些结果表明,即使在药物治疗前人群中存在很少的持续者,但他们中的大多数在药物暴露后一定已经转变为持续表型。我们发现WiDr细胞表现出随药物浓度增加而持续的转换率,这一发现可用于设计创新策略来限制持续进化。值得注意的是,我们的分析预测,与恒定剂量相比,药物浓度的线性增加可能会减少持久性的数量(扩展数据图。5).

持久分布支持药物诱导的情况

然后,我们测量了多孔中持续体的数量如何变化,因为该参数的分布在药物诱导和预先存在的情况下预计是不同的31。我们播种了DiFi cl。B6和韦德cl。在多个96孔板中进行B7,并在3周的药物治疗后,在> 400个独立的孔中定量化持久细胞的分布(残余细胞活力)(扩展数据图。6a).观察到的井间丰度分布符合泊松分布(扩展数据图。6b),支持药物诱导的情况,如计算模拟所证实的(参见参考文献。31一个类似的方法被用于突变过程和扩展数据图。6c).这些数值模拟表明,假设在药物治疗前不存在持续体,在治疗下从敏感细胞中出现的持续体的数量是泊松分布的。相反,在治疗实施之前,先存在的持续者将以恒定的速率从指数增长的人群中产生。因此,预先存在的细胞数量不是泊松分布,而是由卢里亚-德尔布吕克描述的15分布(有方差均值)。我们发现,持续体在各孔中的最终分布是泊松分布,与药物治疗后的出现一致。

波动分析量化了持续者的突变率

在不存在或存在抗癌药物的情况下测量突变率需要开发第二个模型,此后称为“哺乳动物细胞-鲁利亚-德尔布吕克”或“MC-LD”模型。MC–LD模型是一个完全随机的出生-死亡分支过程,描述了药物治疗前和治疗期间耐药细胞的生长(图。3a).我们指定μ一个个体(细胞)产生抗性的有效速率μsμp分别显示敏感(未处理)和持久细胞的突变率(图。3b补充说明).

图3:测量哺乳动物细胞突变率的改良卢里亚-德尔布吕克波动试验。
figure 3

a,基于推断的群体动力学和MC–LD模型的修正波动检验允许估计自发(μs)和persister(μp)突变率。b,波动测试期间CRC细胞的细胞群体动态的示意图。在没有药物治疗的初始扩增期间,CRC细胞以自发突变率(μs).当细胞暴露于靶向治疗时,预先存在的耐药细胞被药物选择,并产生早期出现的耐药集落(红色虚线),而敏感细胞的数量开始下降(黑色实线),并转变为持久状态(暗黄色实线)。抗性细胞来源于具有突变率的持久细胞μp并产生晚生抗性菌落(蓝色虚线)。c,波动分析基础实验设计的示意图。将WiDr和DiFi细胞接种在20个96-多孔板中,总共1,920个孔,并允许在没有药物的情况下扩增约8代(达到约20,000个细胞/孔)。扩增后,所有的孔都用靶向治疗(100μg/ml−1用于DiFi的西妥昔单抗和1个微米达布拉芬尼+ 50 μg ml−1西妥昔单抗用于WiDr)。d,在MC–LD实验性测定中鉴定了两组抗性克隆:早期出现的抗性克隆在3–4周后生长(阶段1 ),晚期出现的抗性克隆在持续药物治疗> 10周后出现(阶段2)。比例尺,100 μme,柱状图列出了在MC–LD实验中每个CRC克隆的指定时间点计数的抗性克隆数。红色柱表示早期出现的抗性克隆(出现在药物治疗的前4周);蓝条表示晚期出现的抗性克隆(在≥10周的药物治疗后出现)。显示了每个克隆的两个独立生物重复的结果。

将WiDr和DiFi细胞分别接种在20个96-多孔板中,并允许其在无药物的标准培养条件下生长固定数量的细胞分裂(图。3c);之后,应用恒定的临床相关药物浓度(图。三维(three dimension的缩写)).孔的数量、每个孔中的初始群体大小和没有药物治疗时的细胞复制时间是通过理论上的考虑结合我们之前测量的群体动力学参数来设定的(补充表格14补充说明).

根据我们以前的工作6,在治疗3-4周后,检测到少量早期出现的耐药菌落(图。3d,e).相反,在绝大多数孔中,敏感细胞死亡,而药物耐受持续细胞存活,如通过测量剩余细胞存活力所检测的(扩展数据图。6)6。在持续处理残留的持久性细胞数周后(图。三维(three dimension的缩写)),晚出现的抗性菌落出现在先前检测到持续存在的孔的子集中(图。3d,e).

我们运行了多个MC–LD模型模拟,使用TP模型推断的输入参数,发现在晚期时间点出现的耐药克隆(> 4周的治疗)不太可能来源于预先存在的耐药细胞(图。4a和扩展数据图。7).根据以前的工作6,我们认为在药物治疗的前4周内显微镜下可见的耐药菌落(早期出现耐药)代表预先存在的耐药细胞,即在扩增期通过自发突变出现的突变细胞。我们还推断,在药物治疗≥10周后在含有持久性细菌的孔中缓慢出现的耐药菌落(晚期出现耐药)可能通过我们和其他人观察到的适应性突变过程产生了耐药突变12,13(图。4a和扩展数据图。7).

图4:持久细胞中突变率的定量。
figure 4

a图2中描述的试验的模拟数据。3。敏感细胞和持久细胞(暗黄色实线)的实验测量的MC–LD模型参数和模型衍生的突变率估计值用于模拟预先存在的(红色)和持久衍生的(蓝色)耐药细胞的出现时间。b,量化MC–LD实验中敏感(红色)和持久(蓝色)细胞的突变率。所示的细胞模型按照图1所述进行接种和处理。3。突变率由实验数据计算,基于群体参数和预先存在的(早期出现)和持久衍生的(晚期出现)抗性克隆的数量,如图。3。结果表示推断的突变率(对于敏感细胞和持久细胞的每个克隆),柱状图显示突变率的后验分布的平均值(n= 2个生物学上独立的实验)。这里,柱状图被用作推断突变率的图示(见补充表5对应的数值)。c通过模型模拟验证突变率估计值。箱线图代表了估计突变率的分布n=使用补充表格中报告的参数,对整个实验进行100次独立模拟14。红色和蓝色方框分别表示敏感和持久突变率估计值的四分位数范围(第25和第75个百分位数),而上下须代表分布的最大值和最小值。分布的中间值,报告为中间的黑线,与其95%的置信区间(细微差别区域)一起显示,由方框两侧的凹口表示。模拟中使用的突变率的分布平均值和输入值分别用白色虚线和黑色虚线表示。d联合后验分布(等高线图,用归一化似然函数进行颜色编码)和边缘化后验分布(左图和下图,灰色区域显示概率密度函数)( 1)持续细胞的初始部分(f0下图)和(2)与敏感细胞的突变率相比,持久细胞的突变率增加了1倍(μp/μs).似然函数测量模型与实验数据的一致性,作为所考虑参数值的函数。

在标准波动测试中,突变率可以从观察到的含有耐药细胞的孔的比例中推断出来。在该模型中,该分数对应于在给定时间间隔内在孔中观察到抗性克隆的预期概率[0,T].为了在MC–LD模型中计算这种概率,我们假设耐药细胞以一定的速率分裂b和死亡的速度d,就像未经处理的细胞一样。补充图7支持突变率推断值相对于耐药细胞分裂率变化的稳定性。作为繁殖波动(遗传漂变)的结果,携带抗药性突变的细胞仍然可能灭绝,并且只有一小部分突变体,我们称之为“已建立的突变体”,在随机漂变中存活。在一个时间间隔内幸存的随机漂移的概率∮t,此处表示为ψ(Δt),是一个众所周知的生灭过程的结果32,33 (补充说明).

通过考虑在时间间隔[0]内建立的突变细胞的数量,我们解析地导出了该模型的近似解,T]遵循具有期望值的泊松分布\({ { { \ mathcal { M } } } \ left(T \ right)\)。因此,具有至少一个突变体的概率由下式给出:

$ $ p \ left(t \ right)= 1-{\mathrm{e}}^{-{ { { { \ mathcal { m } } } \ left(t \ right)}。$$
(2)

为了量化给药前癌细胞的自发突变率,我们将重点放在当时建立的耐药细胞上T款待治疗前给药。在此时间间隔内从敏感细胞中出现的抗性细胞的预期数量为:

$ $ { { { \ mathcal { m } } } _ { { \ mathrm { sensitive } } } \ left({ t _ { { \ mathrm { treat } } } } \ right)= \ mu _ { \ mathrm { s } } \ mathop {\int}\limits_0^{t_{{\mathrm{treat}}}} x \ left(t \ right)\ psi \ left({ t _ { { \ mathrm { treat } }-t } \ right){ \ mathrm { d } } t { { { \ mathrm {,}}}}$$
(3)

在哪里μs就是敏感细胞的突变率。

为了量化持久细胞的突变率μp我们考虑当时出现的耐药细胞T从药物治疗开始。从持续细胞中出现的抗性细胞的预期数量为:

$ $ { { { \ mathcal { m } } } _ { { \ mathrm { persisters } } } \ left(t \ right)= \ mu _ { \ mathrm { p } } \ mathop {\int}\limits_0^t z \ left(t \ right)\ psi \ left({ t-t } \ right){ \ mathrm { d } } t . $ $
(4)

我们强调方程式(2)–(4)连接到TP模型的解,方程(1)。因此,MC–LD模型的解是根据用TP模型估计的相同参数定义的(补充说明).

我们使用MC–LD模型的这个解来推导敏感细胞突变率的估计值μs(包括具有早期出现的抗性细胞的孔的部分)和持久细胞μp(对应于具有晚出现抗性克隆的孔的分数)。

持续者在治疗中显示出突变率增加

通过两步MC–LD波动测试为每个克隆收集的数据允许推断敏感(μs)和persister(μp)细胞。我们保守地将突变过程评估为时序性的(以每天的突变数来衡量)而不是复制性的(每一代的突变数)。这种选择是安全的,因为显示两种表型的细胞的复制突变率之间的比率必须总是高于按时间排列的比率,因为(除了任何不确定性之外)持久细胞中测量的细胞分裂与未处理的细胞相比非常低。

我们发现,在存活并耐受了几周剂量的靶向治疗的细胞中,突变率增加了7-50倍,这些靶向治疗对大多数亲代群体是致命的(图。4b和补充表格5).在DiFi和WiDr细胞中,以及对EGFR阻断或EGFR/BRAF伴随抑制的临床相关浓度的反应中,该结果在多个生物重复中是一致的(图。4b和补充表格5).

为了进一步验证基于MC–LD模型的突变率推断的一致性,我们使用一组敏感的(μs)和persister(μp)突变率,然后我们对合成数据使用MC–LD估计量。数字4c比较模拟实验重复的估计突变率的箱线图,突变率的实际值用作模拟的输入。这些值之间的一致证实了我们的估计。

我们接下来评估了突变率的推断值是否以及在多大程度上受到不同数量的预存持续细胞的影响f0在贝叶斯框架内使用我们的估值器(图。4d).这种方法返回突变率,考虑一系列的实际值f0以及它们的概率。我们获得了持久细胞突变率的倍数增加,作为f0在与图1和图2中实验评估的生长曲线测定中观察到的动力学相容的整个值范围内。12。数字4d总结了这个推论的结果。我们发现,考虑到所有有代表性的f0这与我们的实验数据一致,持续细胞中突变率的增加仍然得到有力的支持。

为了证实这些结果,我们重复了全套实验,并为另外两个克隆运行了分析管道,每个细胞模型一个(WiDr cl。B5和DiFi cl。B3),从而证实了我们的发现,并排除了克隆偏倚效应(扩展数据图。89).从波动分析中分离出的持续衍生的抗性克隆的分子谱显示,在RAS-MEK途径中涉及的基因中获得了单核苷酸变异(SNVs)或拷贝数改变(CNAs ),这是CRC中对抗EGFR/抗BRAF抑制剂的抗性的已知驱动因素21,34,35(补充图8和补充表格6).

我们为暴露于靶向治疗的CRC细胞的进化动力学提出了一个定量模型(图。5a).未经治疗的癌细胞以复制突变率复制并自发获得可赋予靶向治疗抗性的突变(预先存在的抗性突变)μs。然而,当细胞暴露于靶向治疗时,大多数细胞会迅速死亡,而一部分亲代细胞会以一定的速度转变为长期存活的持续状态λ并且是以药物诱导的方式。先前和当前的发现表明,持续细胞在持续暴露于致命剂量的药物下,会启动影响DNA复制保真度的应激反应12,13,从而导致其突变率的显著增加(μp),因此增加了产生耐药性的可能性。

图5:抑制易错DNA聚合酶延迟了对靶向治疗的获得性抗性的发生。
figure 5

a,药物治疗期间CRC细胞突变动力学的示意图。未处理的细胞以复制自发突变率自发获得抗性突变μs。当癌细胞暴露于靶向药物时,以药物依赖的方式诱导存活的持久表型。持续药物暴露下的持续细胞降低了DNA复制保真度,并以一定的速率增加了它们的突变率μ页(page的缩写)这反过来又增加了遗传多样性,并有利于耐药克隆的出现,从而导致肿瘤复发和治疗失败。b所示的CRC细胞用抗EGFR抑制剂西妥昔单抗(CTX)单独治疗或与抗BRAF抑制剂dabrafenib (Dab)联合治疗;根据指示添加REV1抑制剂(REV1i)。在治疗期间监测细胞的数量,直到出现耐药性(n=每个细胞系1个生物学实验)。

诱变REV1的抑制扩展了靶向治疗的功效

我们以前报道过,作为对药物治疗的反应,癌细胞通过下调DNA修复基因和上调专门的易错DNA聚合酶,从高保真度DNA复制转变为低保真度DNA复制13。反过来,这可以促进在持续细胞中观察到的突变率的暂时增加,正如本研究中定量测量的那样。在靶向治疗的癌细胞中上调的DNA聚合酶中13,REV1进行跨损伤合成(TLS),这是一种诱变过程,允许细胞通过绕过阻断正常DNA复制的损伤来耐受DNA损伤,从而导致突变的引入36,37。使用REV1抑制剂干扰TLS已被证明可增强化疗效果并抑制体外和体内的肿瘤生长38,39。基于以上所述,我们假设对诱变TLS的抑制可能会增加靶向治疗诱导的DNA损伤的细胞毒性效应,从而延迟适应性突变过程中的抗性获得。

为了评估这种可能性,我们进行了进展时间(TTP)分析,这是我们以前建立的方法40以监测癌细胞中二次耐药性的发展。DiFi和WiDr CRC细胞,以及黑色素瘤V600E突变的细胞系(JVE207)用MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)途径抑制剂、REV1抑制剂或它们的组合进行处理。对REV1的药物阻断显著延迟或阻止了对EGFR/BRAF抑制剂的继发性耐药(图。5b和扩展数据图。10).

讨论

我们提出了一个实验框架,整合了生物测定和数学建模来研究暴露于环境扰动的细胞系的群体动力学。MC–LD分析允许对自发突变率和药物诱导突变率进行定量比较,并且原则上可用于测量在相当多的生物系统中,各种环境条件是否以及如何影响持续表型和哺乳动物细胞的突变率。

我们的技术的一个重要警告是波动测试测量“表型”突变率,即转化为表型(这里是对靶向治疗的抗性)的比率,这可能是由不同的突变途径引起的,包括SNVs和CNAs,我们发现这两种途径都在我们的持久耐药克隆中产生抗性。然而,我们的方法具有绕过与基于测序的突变率测量相关的几个障碍的优势。

虽然我们和其他人最近已经证明适应性突变通过增加存活的持续细胞的基因组不稳定性来促进二次抗性的获得12,13由于缺乏定量描述持续治疗者行为的模型,迄今为止还无法对持续治疗者的突变率进行可靠的量化。尽管受限于细胞系,我们的受控两步波动分析克服了这些问题。这些结果可用于推断更复杂系统的特征(如患者样本),在这些系统中,数学模型是假设的,不能进行类似的验证。

我们的结果表明,药物诱导的敏感到持久的转变是这种表型发展的主要途径。这与最近化疗诱导的CRC持续状态的证据一致41。虽然我们的结果可以用对持续细胞敏感的表型转换的存在来解释,但是还没有对这种转换的直接观察。增殖较慢的耐受细胞产生增殖较快的非耐受表型的替代模型也将产生双相杀伤曲线42,43。在我们的框架中,这将对应于以下情况f00,这是我们分析排除的。因此,将表型转变与持续治疗联系起来的解释似乎是最有可能的情况。

重要的是,即使是一小部分先前存在的持续体也不会影响我们的发现,即癌细胞的突变率在治疗下显著增加。持续几周的药物治疗后,持续产生的耐药克隆不断出现。在突变率没有增加的情况下,根据敏感(未处理)细胞的突变率,通常需要(保守估计)> 100–1000周,单孔中的细胞才会产生耐药性。相当于在2 × 10上进行的波动分析5–2 × 10610周后,要求wells观察一些抗性克隆。此外,敏感细胞对抗性的贡献在几周的治疗后耗尽,因为我们表明它们在几天内就灭绝了(图。1d).活跃的细胞周期进程的证据,以及持久性细胞中诱变率的增加,进一步支持了先前关于正在进行的适应性诱变促进获得抗性的发现13.

最近的一项研究得出结论,适应性突变对蛋白质编码基因组突变负荷的影响很小44。这与以前的发现一致,以前的发现表明获得治疗抗性的细胞中肿瘤突变负荷没有强烈增加12,13。在这些不精确控制的系统中有许多混淆因素。事实上,适应性突变表型可能在时间上受到限制(即,当细胞不适应新环境时13),局限于一个小的细胞亚群,并被预先存在的抗性细胞的生长所掩盖。复发时对肿瘤样本的批量分析无法理清这些因素。我们对持续者动态和突变率增加的描述具有潜在的临床相关性。首先,发现较高的药物浓度诱导敏感细胞的死亡率增加,并增加向持久性的转变,持久性是耐药性出现的储库,这为削弱持久性出现的治疗策略提供了理论基础。第二,易错DNA聚合酶在适应性突变中的参与13为限制耐药性的非显而易见的组合策略提供了机会。事实上,我们表明抑制诱变TLS有效地延缓了继发性耐药的获得。

我们的方法推断,临床批准的抗癌疗法可以诱导CRC细胞突变率的暂时增加。我们的框架可用于系统地测量暴露于各种环境应激源的哺乳动物细胞的突变率,并定义药物组合以限制治疗耐药性的出现。


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