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使用深层组织可活化的半导体聚合物免疫调节纳米颗粒的精确癌症超声免疫疗法

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发表时间:2022-07-15 11:15作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

纳米医学有望增强癌症免疫疗法;然而,其引发高度特异性抗肿瘤免疫而不损害免疫耐受性的潜力尚未完全释放。这项研究基于产生声动力单线态氧(1O2)大大高于其他声敏剂。两种免疫调节剂通过以下方式结合1O2这种聚合物上的可裂解接头提供了半导体聚合物免疫调节纳米颗粒(SPINs ),其免疫治疗作用被大大抑制。在超声波照射下,会产生自旋1O2不仅直接切除肿瘤和重新编程肿瘤微环境以增强肿瘤免疫原性,而且在肿瘤部位特异性地远程释放免疫调节剂。这种精确的超声免疫疗法在胰腺小鼠肿瘤模型中消除了肿瘤并防止了复发。SPINs甚至在兔肿瘤模型中也显示出有效的抗肿瘤功效。此外,SPINs的声动力激活将免疫治疗作用主要限制在肿瘤,减少了免疫相关不良事件的迹象。

介绍

针对宿主免疫系统进行抗癌治疗干预的癌症免疫疗法已经彻底改变了肿瘤学的范式1,2,3。特别是,干扰适应性免疫中抑制性途径的检查点阻断免疫疗法已经改善了多种癌症类型的患者存活率4如美国美国食品药品监督管理局(FDA)批准的抗体的临床实践所例证的,所述抗体拮抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)/程序性死亡配体1 (PD-L1)5,6。然而,由于治疗指数很大程度上取决于预先存在的免疫状况,许多非免疫原性“冷”肿瘤(如胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌)通常表现为少量肿瘤浸润淋巴细胞,对免疫检查点免疫疗法的反应不佳(临床患者中约10–30%)7。为了克服这一问题,能够引发免疫原性细胞死亡(ICD)的其他治疗模式(如化疗、光疗和放疗)可以与检查点阻断免疫疗法相结合,将“冷”肿瘤转化为免疫原性“热”表型,并使肿瘤敏化,从而改善免疫疗法8.然而,这些联合免疫疗法不可避免地遇到免疫相关不良事件(irAEs)的风险增加,这是由于相对于单一疗法,体内稳态免疫耐受的破坏增加9,10.

纳米医学有可能增强免疫疗法,同时减少irAEs11.免疫治疗水凝胶的局部给药允许在肿瘤微环境中缓慢释放免疫检查点阻断剂、细胞因子或免疫细胞,以诱导局部反应12,13,14,15然而,这难以治疗不可见或不可触及的肿瘤16.或者,可以全身施用响应于肿瘤生物标志物释放免疫治疗剂的纳米颗粒,这仍然允许对肿瘤部位进行相对受控的免疫治疗17,18,19,20.然而,它们对肿瘤和正常组织之间所选生物标记的不同水平的强烈依赖限制了免疫作用的区域选择性,并限制了肿瘤特异性生物标记可用性的设计灵活性21.与内源性生物标记相反,外源性刺激绕过了这两个限制22,并可以提供一种更精确的方法来远程控制肿瘤中的免疫激活。尽管已经开发了响应近红外(NIR)光的免疫治疗纳米制剂用于以更安全和有效的方式进行免疫治疗23,24,25,26,光通常显示浅的组织穿透(< 1 cm)27,28.相比之下,超声(US)具有深层组织穿透性,并能够诱导声敏剂产生活性氧(ROS)用于癌症治疗29,30,31,32.然而,这种声动力学过程还没有被整合到纳米医学中作为外源性刺激,以获得临床前免疫治疗的时空控制。

我们在此报告了半导体聚合物纳米粒子(SPNs)的发展,用于深层组织可激活的癌症超声免疫治疗。通过筛选试剂库,理想的SPN被识别为具有最高的声动力单线态氧(1O2)生成效率。这种SPN用于进一步构建半导体聚合物免疫调节纳米颗粒(SPINs)1O2SPNs骨架的可切割接头(图。1a).SPINs的抗肿瘤免疫针对皮下胰腺小鼠肿瘤进行测试,因为胰腺肿瘤是具有低免疫原性、高转移和低存活率的最具侵袭性的肿瘤之一33.全身给药后,SPINs能有效地积聚到小鼠皮下胰腺肿瘤和兔原位胰腺肿瘤中。在指向肿瘤区域的US照射下,产生自旋1O2其可以(I)消除肿瘤组织,(ii)通过上调PD-L1和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达水平来重新编程肿瘤微环境,以及(iii)剪切肿瘤组织中的肿瘤细胞1O2-远程释放免疫调节剂、NLG919和抗PD-L1抗体(aPD-L1)的可切割接头。NLG919是一种有效的IDO抑制剂,可以促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的增殖并抑制调节性T细胞(T车辆注册号)34.aPD-L1可以与癌细胞表面的PD-L1结合,从而阻断其与PD-1表面的PD-1的结合+t细胞35,从而抑制T细胞衰竭,并进而促进T细胞免疫的杀肿瘤功能36.此外,NLG919已经显示出提高aPD-L1功效的巨大潜力,实现了协同效应37.这样,声动力激活级联精确地将免疫治疗作用限制在肿瘤区域。因此,SPIN介导的可活化sono免疫疗法不仅引发高抗肿瘤免疫以排斥原发性和转移性远处胰腺肿瘤并防止肿瘤复发,而且降低irAEs的可能性(图。1b).还实现了对覆盖有5cm组织的胰腺肿瘤和深层兔原位胰腺肿瘤的自旋介导的深层组织治疗。

图1:用于深层组织可激活的超声免疫疗法的自旋的设计和机制。
figure 1

aUS触发的深层组织激活SPINs释放免疫调节剂的示意图。bSPINs的声动力激活以缩小肿瘤、增强肿瘤免疫原性和原位释放免疫调节剂的示意图,以及IDO抑制和PD-L1阻断对增强抗肿瘤免疫的协同作用,相对于游离药物给药,具有减轻的irAEs。

结果

声动力学用SPN的筛选1O2产生

疏水半导体聚合物(SPs)库(图。2a)在两亲性三嵌段共聚物聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)(PEG-b-PPG-b-PEG)的帮助下,通过纳米沉淀转化为水溶性纳米粒子(图。2b).如透射电子显微镜(TEM)图像所示,所制备的SPNs表现出具有均匀尺寸分布的球形形态(图。2c).动态光散射(DLS)测量显示,SPNs的流体动力学直径范围为~24至40 nm(补充图。1).由于不同的分子结构,这些SPN在320-680nm范围内具有最大吸收(图。2d),荧光发射最大值范围为430-840nm(补充图。2).

图2:用于声动力疗法的SPN的筛选。
figure 2

aSPs和小分子声敏剂的化学结构。b通过纳米沉淀合成SPNs的示意图。cSPN7的代表性TEM图像。实验独立重复了三次,结果相似。dSPNs在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH = 7.4)中的紫外-可见吸收光谱。eSPN7、PpIX和TiO的ESR谱2纳米粒子(20克/毫升)在US照射后使用TEMP作为陷阱。f声动力学的量化1O2每个样品的生成量(20克/毫升) (n= 3).g在以TEMP为陷阱的US辐射的1、2、3和4个循环后,SPN7 (20 g/mL)的ESR光谱。h亲戚1O2经过不同周期的美国辐照后,SPN7、ICG、PpIX和AO (20 g/mL)的生成量(n= 3).美国辐照条件:1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,每个周期5分钟。数据以平均值±SD表示。源数据作为源数据文件提供。

声动力学1O2研究了SPNs的产生特性,并与其他常用的声敏剂进行了比较,包括硅2,3-萘酞菁双(三己基氧化硅)(NCBS)、吲哚菁绿(ICG)、原卟啉IX (PpIX)、吖啶橙(AO)、姜黄素(CUR)和无机二氧化钛(TiO2)相同质量浓度的纳米粒子。电子自旋共振(ESR)用于测量的产生1O2在US辐射下,使用2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)作为自由基捕集剂。的特征ESR峰1O2对所有样品都进行了观察(图。2e和补充图。3);然而,SPN7产生了最高量的1O2(34.5纳摩尔/微克),相对于其他浓度至少高三倍(图。2f).排名与1O2白光照射下的发电效率(补充图。4).这意味着声致发光诱导的1O2生成可能是SPNs涉及的主要机制:US诱导水在350-650nm范围内的声致发光38,随后激发代理产生1O2以类似于光动力过程的方式。

除了高效之外1O2代,的强度1O2SPN7的峰值几乎保持不变(图。2g)在US照射的四个循环之后(每个循环5分钟);相比之下,生成的能力1O2对于ICG而言,PpIX和AO几乎被完全摧毁(分别下降了95.8%、100%和91.7%)(图)。2h和补充图。5).这归因于SPN7在US辐射下的高稳定性,正如其吸收不变所证明的,而ICG、PpIX和AO在US辐射后受到分子破坏(补充图。6).这些数据证实了SPN7是体内应用的最佳声敏剂。

自旋的构建和深层组织声动力激活

自旋是基于SP7构建的,因为它的最高1O2测试的SPN之间的生成效率和SPN7的优异的声动力学稳定性。通过铃木缩聚法合成了侧链含溴基团的SP7(SP7-Br ),然后与叠氮化钠反应得到叠氮基团连接的聚合物(SP7-N3)(补充图710).合成的SP7-N的分子量3被测量为7200 Da,并且分别在574和770 nm处观察到最大吸收和荧光发射(补充图。11).为了构造旋转,一个1O2-可裂解的接头被合成并用于笼住NLG919的羟基,随后与炔基PEG (Mw = 2000)的羧基共价缀合,提供前调节剂PEG-NLG919缀合物(定义为PEG-N)(补充图。1215).A1O2根据我们以前的报道,合成了反应性接头(2,2’-(丙烷-2,2-二(硫代二苯基)二乙酸,PSDA)-共轭PEG链(定义为PEG-PSDA)25。SP7-N3然后被嫁接上了mPEG-炔烃(Mw = 2000)、PEG-N、PEG-PSDA或炔烃-PEG-COOH,以获得两亲性半导体聚合物共轭物(补充图1620),它会自组装成纳米粒子(定义为自旋0,旋转N分别为SPN-PEG1、SPN-PEG2和SPN-PEG3)的水溶液(图。3a).SPN-PEG1、SPN-PEG2和SPN-PEG3在其表面上用aPD-L1的进一步修饰提供了自旋A,旋转D1,并旋转D2,分别为。不同自旋的NLG919/aPD-L1的摩尔比如图所示。3b.

图3:自旋的合成、表征和声动力激活。
figure 3

a两亲性半导体聚合物调制器的化学结构及其自组装和表面改性形成自旋的示意图。b不同自旋中各组分的摩尔比。c不同自旋在1× PBS缓冲液(pH = 7.4)中的Zeta电位和流体动力学尺寸(n= 4).d用1× PBS缓冲液(阴性对照)、1% Triton X-100(阳性对照)和1× PBS缓冲液(含有浓度为100 g/mL的SPINs)孵育2小时,然后离心后的红细胞照片。e用不同浓度的SPINs孵育2 h后,红细胞的溶血百分比(n= 4).f美国辐照自旋示意图D2用猪肉薄纸覆盖的溶液。g的ESR光谱1O2为了旋转D2(20克/毫升)在美国辐照后(1.2瓦/厘米23分钟),有或没有不同厚度的猪肉组织覆盖。haPD-L1和NLG919从SPIN的释放曲线D2(40克/毫升)在US照射不同时间后(n= 4).i用游离aPD-L1或SPIN处理后的PD-L1/PD-1结合活性测定D2(40克/毫升)有或没有用户照射(n= 4).旋转D2我们对自旋D2+美国:P < 0.0001. Statistical significance was calculated via a two-tailed Student’s t测试。***P < 0.001. In (gi),US照射的功率强度为1.2 W/cm2(1.0兆赫,50%占空比)。数据以平均值±SD表示。源数据作为源数据文件提供。

对于所有自旋,观察到具有均匀尺寸分布的球形形态(补充图。21).自旋的流体动力学尺寸A,旋转D1旋转D2(从62.9到75.0纳米)比自旋的大0旋转N(~25 nm),所有自旋都显示负ζ电位,范围从14.3到4.9 mV(图。3c).它们在盐水缓冲溶液中表现出优异的胶体稳定性,这可以通过储存21天后可忽略的尺寸变化来证明(补充图。22).SPINs显示了相似的吸收曲线,在约360和553 nm处有两个SP7的特征峰,在约810 nm处有几乎相同的荧光发射峰(补充图。23).自旋的NIR荧光允许体内荧光成像和跟踪它们的肿瘤累积。即使在100 g/mL的高孵育浓度下,所有自旋都表现出可忽略不计的细胞毒性(补充图。24).更重要的是,在与SPINs孵育后,几乎没有观察到红细胞溶血(图。3d-e),证明它们适合全身给药。

1O2US处理下的自旋生成特性与通过纳米沉淀制备的SPN7几乎相同(补充图。25).为了研究组织穿透深度对超声诱发的肿瘤的影响1O2自旋的产生D2将猪肉组织覆盖的溶液暴露在US辐射下进行ESR测量(图。3f).的ESR特征峰1O2随着组织厚度(0、2、4、6、8和10 cm)的增加而略微降低,在10 cm的厚度下,其仍然是其原始的65%(图。3g).这种设想认为自旋应该能够有效地产生1O2打破僵局1O2-可切割接头,即使在深层组织中也能释放免疫调节剂。

通过对US治疗下释放的免疫调节剂的量进行量化,评估了无10cm猪肉组织覆盖和有10cm猪肉组织覆盖的SPINs的深层组织声动力激活。在功率强度为1.2 W/cm的US辐照下2自旋中aPD-L1和NLG919的释放量D2不管组织的覆盖情况如何,包含溶液的浓度随着处理时间的变化而逐渐增加(图。3h).US处理30分钟后,测得aPD-L1和NLG919的释放量分别为76.9%和90.6%,在用10-cm组织覆盖后略微下降至70.9%和84.8%。注意,当用10厘米的组织覆盖时,在白光照射下,aPD-L1和NLG919的释放可以忽略不计(补充图。26).这些结果表明,深层组织激活自旋来控制免疫调节剂的释放使用我们,然而,这是不可能的白光。对于自旋,PD-L1/PD-1结合活性仅被轻微抑制D2没有US照射的治疗,而US照射后抑制了3.8倍(图。3i),进一步证实了自旋的声动力学激活D2.

皮下胰腺肿瘤的可激活超声免疫疗法

使用双侧Panc02荷瘤小鼠模型评估自旋介导的sono免疫疗法的治疗效果。体内NIR荧光成像用于证实通过尾静脉给药后SPINs在肿瘤中的累积。肿瘤的荧光信号逐渐增加,同样在SPINs注射后24小时达到最大值,比肿瘤的背景信号高约5.3-7.2倍(补充图。27).此外,在SPINs注射后24小时,在肿瘤组织中观察到纳米颗粒的强烈红色荧光信号(补充图。28).在肿瘤(15-17% ID/g)和肝脏(21-23% ID/g)中发现了SPINs的主要累积,在其他器官中发现了相当低的累积,如心脏(< 3% ID/g)、脾脏(< 6% ID/g)、肺(< 4% ID/g)和肾脏(< 5% ID/g)(补充图)。29).相比之下,游离药物(NLG919)在肝脏中显示出非常高的累积百分比(16% ID/g),但在肿瘤中的累积有限。

为了评估自旋介导的声动力学治疗后的ICD生物标志物,研究了在静脉注射相似剂量的自旋或NLG919和aPD-L1的游离药物混合物(有或无us照射)后,小鼠肿瘤中钙网蛋白(CRT)和高迁移率族蛋白1 (HMGB1)的表达水平以及三磷酸腺苷(ATP)的分泌。在自旋注入组和us照射组的肿瘤中观察到明显的单线态氧传感器绿色(SOSG)荧光信号(补充图。30),验证生成1O2。如免疫荧光染色图像所示,在自旋注射和US照射后,CRT和HMGB1的表达水平大大增加,分别是对照组的至少6.1倍和4.3倍(补充图。31a–c).与对照组相比,SPINs加us照射的治疗也将肿瘤中的ATP水平增加了1.8倍以上(补充图。31d).相比之下,无论US照射与否,注射游离药物组的CRT、HMGB1和ATP水平没有显著变化。此外,自旋注射和US照射后肿瘤中PD-L1的表达水平相对于对照组至少高2.2倍(补充图。32),而治疗自旋D2而未经超声照射的游离药物并没有明显改变PD-L1的表达水平。免疫组织化学染色图像显示,注射盐水的对照组几乎没有CD3+和CD8+肿瘤组织内的肿瘤浸润淋巴细胞(补充图。33),这应该是由于Panc02胰腺肿瘤固有的低免疫原性。CD3的数量+和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞在US照射自旋注射后明显增加,而在单独自旋时增加不多D2无US照射的注射和不考虑US照射的自由药物注射。结果表明,自旋介导的治疗可以有效地触发肿瘤细胞的ICD,从而增强肿瘤微环境中的肿瘤免疫原性。

为了评估自旋介导的超声免疫疗法的治疗效果,通过三联治疗注射(在第0、3和6天)和US照射(在第1、4和7天)治疗双侧Panc02肿瘤小鼠(图。4a).在没有US照射的情况下,在游离药物和自旋后的肿瘤的H&E和免疫荧光末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色图像中没有观察到明显的细胞凋亡/坏死D2注射(补充图34),与注射生理盐水的对照组相似。原发肿瘤和远处肿瘤的生长D2没有US照射的注射组没有任何变化,而没有US照射的游离药物注射组中的那些与对照组相比稍微受到抑制(图。4b,c).没有US照射,游离药物和SPIN的平均存活率D2注射小鼠分别为36天和35天,比对照组小鼠(27天)略长(图。4d).在US照射下,如H&E和TUNEL染色图像所示,在注射SPINs后,可以在小鼠的原发性和远处肿瘤中观察到细胞凋亡/坏死(补充图。34).特别是在SPIN中发现了原发性和远处肿瘤的最高程度的细胞凋亡/坏死D2注射组和US照射组。原发性肿瘤在游离药物中的生长,自旋0,旋转N,旋转A,旋转D1,并旋转D2与对照组相比,US照射的注射组分别被抑制22.3%、35.1%、68.9%、76.8%、78.6%和98.9%(图。4b和补充图。35a).对于远处肿瘤,这些组的肿瘤生长抑制率分别为25.6%、30.1%、56.9%、68.1%、69.5%和97.1%(图。4c和补充图。35b).自旋的中值存活率0,旋转N,旋转A,并旋转D1注射和US照射的小鼠分别为33、35、39和46天(图。4d和补充图。36).更重要的是,旋转后小鼠的存活率仍然是100%D2注射和美国照射80天。这些结果表明自旋D2-介导的治疗在抑制原发性和远处转移肿瘤的生长和延长小鼠存活方面显示出最高的功效。

图4:在Panc02肿瘤小鼠模型中评价自旋介导的超声免疫疗法。
figure 4

a建立原发性和远处肿瘤的时间表,经尾静脉三次全身注射SPINs (0.2毫升,0.6毫克/毫升),US照射(1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,10分钟),并分析免疫反应。b, c原发肿瘤的相对体积(b)和遥远的(c2)pan C02荷瘤C57BL/6小鼠的肿瘤(n= 6)全身注射盐水、游离药物混合物(在第0、3和6天,NLG919和aPD-L1为4 mg/kg体重)或SPIN后D2(0.2毫升,0.6毫克/毫升),有或没有美国辐射(1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,10分钟)。旋转D2+我们对药物+我们:P < 0.0001 for primary tumors (b);旋转D2+美国与毒品:P < 0.0001 for distant tumors (c). dPanc02荷瘤C57BL/6小鼠的存活曲线(n= 10)按照指示接受不同的治疗。e使用SPINs治疗再次攻击的肿瘤小鼠模型的示意图。f在注射盐水或SPIN后,在Panc02荷瘤小鼠中再攻击肿瘤的生长D2(0.2毫升,0.6毫克/毫升),使用US辐射(1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,10分钟) (n= 5).盐水对自旋D2+美国:P < 0.0001. gPanc02荷瘤C57BL/6小鼠在不同治疗后接着进行肿瘤再攻击(n= 10).h在不同治疗后接着进行肿瘤再攻击的Panc02荷瘤C57BL/6小鼠脾脏中效应记忆T细胞群的流式细胞术分析(n= 4).盐水对自旋D2+美国:P= 0.0059.i不同治疗方法对小鼠肿瘤组织差异表达基因数量的影响。j的相对表达卡尔, Hmgb1-ps1, Hmgb1-ps2, Cd80, Cd86, Cd40, Pdcd1, Cd3e, Cd8a, 干扰素, Gzmb, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11, 四氯化碳, Ccl5, Il1b, Il2, Il6, Il7, Il15, Ido1,以及Cd274在不同处理后的Panc02荷瘤小鼠的肿瘤中(该实验独立重复五次,具有相似的结果)。k在不同治疗后,Panc02荷瘤C57BL/6小鼠的肿瘤中相关基因表达的无监督分级聚类(n= 5).数据以平均值±SD表示。统计显著性通过双尾学生的t测试;**P < 0.01, ***P < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.

为了进一步证实SPIN优越的抗肿瘤功效D2-介导的超声免疫疗法,用Panc02肿瘤细胞在对侧再次攻击治疗后的荷瘤小鼠(图。4e).注意,在注射盐水的对照小鼠中,再次攻击的肿瘤的体积逐渐增加,而在旋转后,在小鼠中没有观察到再次攻击的肿瘤D2US辐照注射(图。4f).肿瘤再次攻击后,所有注射盐水的对照小鼠在40天内死亡(图。第四代移动通信技术).相反,旋转D2-注射和US-辐照的小鼠显示出80天的100%存活率,即使在肿瘤再次攻击后。自旋脾脏中效应记忆T细胞的数量D2注射和US照射的小鼠为25.5%,比对照小鼠高1.9倍(图。4h和补充图。37).这证实了那个旋转D2介导的超声免疫疗法可以建立长期的免疫记忆,防止肿瘤的再次攻击。

我们使用多重基因表达分析评估了不同治疗后肿瘤组织的基因表达谱。在没有US照射的情况下,在盐水对照、游离药物和SPIN中,差异表达基因的数量少于180D2注射组(图4i).76个免疫相关基因在游离药物和SPIN中的表达水平D2注射组与对照组相比没有明显变化(图。4j,k).用US照射,发现261个基因在SPIN中差异表达D2-注射组(图4i).自旋中76个免疫相关基因的表达水平D2-注射组和US-辐照组总体上高于其他组(图。4j,k).上调的基因与几个关键的免疫途径相关,如MHCⅱ类蛋白复合物结合和淋巴细胞共刺激(补充图。38).在旋转中D2注射组和US照射组,ICD相关基因的表达水平(卡尔, Hmgb1-ps1,以及Hmgb1-ps2,> 5倍)、DC激活和T细胞引发相关基因(Cd80, Cd86, Cd40, Pdcd1, Cd3e, Cd8a, 干扰素,以及Gzmb,> 1.2倍),趋化因子编码的基因(Cxcl1, Cxcl2, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11, 四氯化碳,以及Ccl5,> 2.5倍),以及细胞因子编码的基因(Il1b, Il2, Il6, Il7,以及Il15,> 2.4倍)明显上调(图。4j).更重要的是,免疫抑制基因的表达水平(Ido1Cd274)也分别增加了1.6倍和4.0倍。这进一步证实了SPIN介导的US治疗可以通过上调癌细胞中IDO和PD-L1的表达,将无免疫原性的“冷”肿瘤微环境转化为免疫原性的“热”肿瘤微环境。

旋转D2用流式细胞仪和免疫荧光染色法检测其抗肿瘤免疫激活作用。免费药物和旋转D2注射没有明显增加成熟树突状细胞的数量(CD80+CD86+)在肿瘤引流淋巴结(TDLNs)中的表达(补充图。39, 40).CTL群体(CD3+CD8+)在原发性和远处的SPIN肿瘤中D2与对照组相比,注射的小鼠略有增加,但相对于注射游离药物的小鼠而言,其减少了1.2倍(补充图。41).游离药物注射减少了肿瘤内结核分枝杆菌的数量车辆注册号细胞(CD25+Foxp3+)的2.6倍,但自旋的处理D2对T的种群没有显著的影响车辆注册号细胞(补充图。42).免疫荧光染色图像显示,游离药物和自旋后小鼠肿瘤组织中CD8、IFN-γ和颗粒酶B的表达D2无US照射的注射与对照组相似或略高(补充图。43, 44).使用US照射的SPINs治疗总体上增加了TDLNs中成熟DC的数量,以及原发性和远处肿瘤中CTL的数量,但是减少了T。车辆注册号细胞(补充图。4042).在SPIN中观察到最高数量的成熟树突状细胞(36.4%)和原发性肿瘤(24.3%)和远处肿瘤(23.4%)中的CTLD2-注射组和US-辐照组,分别是游离药物注射组和US-辐照组的2.4倍、1.6倍和1.8倍。肿瘤内结核分枝杆菌的最低数量车辆注册号对于自旋,还观察到原发性肿瘤(2.8%)和远处肿瘤(4.2%)中的细胞D2-注射组和US-照射组分别比游离药物注射加US-照射组低2.4倍和1.8倍。此外,与对照组相比,肿瘤组织中CD8、IFN-γ和颗粒酶B的表达水平在自旋注射和US照射后总体上增加(补充图。43和44)。特别是旋转D2-注射组和US-照射组显示肿瘤内CD8、IFN-γ和颗粒酶b的最高表达水平D2介导的超声免疫疗法引发了最高的抗肿瘤功效。

肿瘤模型的自旋介导的深层组织治疗

为了验证SPIN介导的深层组织治疗效果,在全身注射SPIN后,对覆盖有5cm猪肉组织的肿瘤进行US照射(第1、4和7天)D2(在第0、3和6天)移植入Panc02荷瘤小鼠(图。5a).没有US照射,原发和远处肿瘤的生长为自旋D2注射组与盐水对照组相似,游离药物治疗略微降低了两种肿瘤的生长(图。5b,c).游离药物和SPIN的中位生存期D2未经US照射的注射小鼠分别为35天和32天,与对照组(34天)几乎相同(图。5d).尽管非药物治疗使肿瘤中CTL的数量略微增加了1.9倍,但唯一的结果是D2与盐水对照组相比,注射没有明显改变CTL的数量(补充图。45).在US照射下,原发性和远处肿瘤的生长在游离药物中旋转0,并旋转D2注射组受到抑制(图。5b,c).特别是,肿瘤在旋转生长D2注射和US照射组对原发性肿瘤的抑制率为100%,对远处肿瘤的抑制率为96.4%。在旋转中D2注射和US-照射组,60天的动物存活率仍为100%,而游离药物和自旋的小鼠的存活中值0注射和超声辐照组仅37天(图。5d).SPIN中肿瘤内CTL的数量D2注射和超声辐照组为23.6%,分别是游离药物和自旋的2.1倍和1.6倍0分别注射US-辐照组(补充图。45).这些结果证实了自旋D2-介导的治疗对覆盖有5cm组织的肿瘤显示出优异的治疗效果。

图5:使用SPINs的肿瘤模型的深层组织治疗。
figure 5

a覆盖有5cm组织的皮下胰腺小鼠肿瘤的超声免疫疗法示意图。b, c原发肿瘤的相对体积(b)和遥远的(c2)pan C02荷瘤C57BL/6小鼠的肿瘤(n= 5)全身注射生理盐水、游离药物混合物(在第0、3和6天,NLG919和aPD-L1为4 mg/kg体重)后,旋转0或者旋转D2(0.2毫升,0.6毫克/毫升),有或没有美国辐射(1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,10分钟)。在US照射下,原发肿瘤被5厘米厚的组织覆盖。旋转D2+ US对SPIN0+美国:P < 0.0001 for primary tumors (b);旋转D2+ US对SPIN0+美国:P < 0.0001 for distant tumors (c). dPanc02荷瘤C57BL/6小鼠的存活曲线(n= 10)不同处理60天后。e超声介导的兔原位胰腺肿瘤深层组织声动力学治疗示意图。f放射性标记稳定性131I型旋转0在37℃的盐水或50%血清中储存不同时间后(n= 3).g, hSPECT成像(g)和信号强度(h)的原位胰腺兔肿瘤131I型旋转0(1.0毫升、1.5毫克/毫升)不同时间(n= 4).白色圆点表示肿瘤。i全身注射盐水或SPIN后原位胰腺兔肿瘤的计算机断层扫描(CT)成像0(1.0毫升,1.5毫克/毫升),有或没有美国辐射(1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,30分钟)。白色圆点表示肿瘤。j原位胰腺兔肿瘤的肿瘤体积(n= 3)在不同天数的指定治疗后。盐水+我们对旋转0+美国:P= 0.0108.k不同方法治疗后兔原位胰腺肿瘤的H&E染色图像。实验独立重复了三次,结果相似。l原位胰腺荷瘤兔的存活曲线(n= 4)不同处理20天后。数据以平均值±SD表示。统计显著性通过双尾学生的t测试;*P < 0.05, ***P  <  0.001. Source data are provided as a Source Data file.

然后使用原位胰腺兔肿瘤评估自旋介导的深层组织治疗(图。5e).由于抗兔PD-L1的抗体尚未被证明对体内免疫治疗有效,我们只进行了声动力学治疗。为了跟踪原位胰腺兔肿瘤中自旋的累积,放射性核素131我被用来给旋转贴标签0对于单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像,碘可以通过质子的亲电取代共价固定在芳香主链上39,40.获得的131I型旋转0在37℃的盐水和50%血清溶液中显示出优异的放射性标记稳定性(图。5f).全身注射后131I型旋转0在原位胰腺肿瘤兔中,肿瘤的信号强度逐渐增加,并在注射后12小时达到最大值,如SPECT图像所示(图。5g,h),确认自旋的有效累积0在原位胰腺兔肿瘤中。通过三联治疗注射(在第0、3和6天)和US照射(在第1、4和7天)治疗兔的肿瘤,以评价治疗效果。没有我们的照射,肿瘤的生长为自旋0注射的兔子与注射生理盐水的对照组相似(图。5i,j),并且从肿瘤组织的组织学苏木精和曙红(H&E)和TUNEL染色图像中没有观察到明显的肿瘤细胞凋亡/坏死(图。5k和补充图。46).生理盐水和旋转后兔子的平均存活时间0无US照射的注射分别为12天和14天(图。5l).随着我们的照射,肿瘤旋转生长0-注射的兔子在治疗15天后与盐水注射组相比抑制了2.4倍(图。5i,j).如H&E和TUNEL染色图像所示,在SPIN中观察到明显的肿瘤凋亡/坏死0-注射和US照射组(图。5k和补充图。46).兔子在旋转中的平均存活率0注射和US照射组为17天,长于盐水组(图。5l).结果表明,自旋介导疗法可用于治疗原位胰腺兔肿瘤,因为超声可穿透深层组织。

超声免疫治疗最小化irAEs的初步评价

相对于游离药物治疗,评价了自旋介导的可活化超声免疫治疗的最小化irAEs。在没有US照射的情况下,用于非药物治疗的血液和脾脏中的免疫细胞的百分比显著增加,其为1.7倍(CD3+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+血液中的Th细胞),1.8倍(CD3+CD8+血液中的CTL),1.6倍(CD3+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+脾中的Th细胞)和1.8倍(CD3+CD8+脾中的CTL)分别高于注射盐水的对照组(图。6a–d和补充图。47, 48).相反,CD3的百分比+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+Th细胞和CD3+CD8+旋转中的CTLsD2-治疗组与对照组相似,并且比无药物治疗组至少低1.6倍,这应归因于SPIN的最小药代动力学性质D2没有声动力激活。如H&E染色图像所示,对于无药物治疗,观察到肝脏(尤其是中央静脉周围)中淋巴细胞的明显积聚(图。6e和补充图。49),而这在控制和旋转中几乎没有发现D2治疗组。此外,CD3的浸润+,CD4+和CD8+游离药物治疗后小鼠肝脏和脾脏中的t细胞总体上高于对照组和SPIN组D2治疗组(补充图5055).游离药物治疗会导致严重的细胞因子风暴,因为该组中各种细胞因子(包括白细胞介素-23 (IL-23)、IL-1α、干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-27、IL-17A、IFN-β和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的血清水平与对照组相比增加了2.3倍以上6f和补充图。56).相反,这些细胞因子在自旋中的水平D2治疗组与对照组相似。与盐水对照组相比,还发现自由药物治疗增加了关键肝酶的血清水平,包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)(1.6倍)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)(1.6倍)和碱性磷酸酶(ALP)(1.4倍)(图。6克,高和补充图。57a).然而,这些肝酶的血清水平在自旋D2治疗组与对照组几乎相同。这些结果表明,非药物治疗可能导致肝脏irAEs,这在免疫检查点抑制剂治疗中很常见41;而对于自旋没有观察到D2治疗,因为笼状NLG919和aPD-L1的生物活性最小化。

图6:对尾旋最小irAEs的初步评估D2介导的声波免疫疗法。
figure 6

a, b流式细胞术分析CD3的百分比+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+Th细胞(a),以及CD3+CD8+CTLs(b)在老鼠的血液中(n= 4)在全身施用盐水后30天,旋转0,旋转D2(0.2毫升,1.2毫克/毫升)或游离药物混合物(对于NLG919和aPD-L1为8毫克/千克体重),有或没有美国辐射(1.0兆赫,1.2瓦/厘米250%占空比,10分钟)。盐水——美国与药物——美国:P= 0.0023;生理盐水US与药物+ US:P= 0.0006;毒品+我们对自旋D2+美国:P= 0.0071+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+Th细胞(a);生理盐水us与药物US:P= 0.0004;生理盐水US与药物+ US:P= 0.0001;毒品+我们对自旋D2+美国:P= 0.0093+CD8+CTLs(b). c, d流式细胞术分析CD3的百分比+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+Th细胞(c),以及CD3+CD8+CTLs(d)在小鼠脾脏中(n= 4)不同处理30天后。生理盐水us与药物US:P= 0.0008;生理盐水US与药物+ US:P= 0.0005;毒品+我们对自旋D2+美国:P= 0.0015+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+Th细胞(c);生理盐水us与药物US:P= 0.0001;生理盐水US与药物+ US:P= 0.0002;毒品+我们对自旋D2+美国:P= 0.0049+CD8+CTLs(d). e不同组治疗30天后肝脏的代表性H&E染色图像(白色箭头表示浸润的淋巴细胞)。实验独立重复了三次,结果相似。f热图显示不同处理30天后小鼠血清中细胞因子水平相对于盐水对照组的相对倍数。g, h血清ALT水平(g)和AST(h)在老鼠身上(n= 5)不同处理30天后。生理盐水us与药物US:P= 0.0010;生理盐水US与药物+ US:P= 0.0020;毒品+我们对自旋D2+美国:P= 0.0054代表ALT(g);生理盐水us与药物US:P= 0.0001;生理盐水US与药物+ US:P < 0.0001; drug + US versus SPIND2+美国:P= 0.0013代表AST(h). iSPIN抗肿瘤免疫和免疫抑制活性的比较D2介导的声波免疫疗法和免费药物治疗。数据以平均值±SD表示。统计显著性通过双尾学生的t测试;**P < 0.01, ***P < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.

使用US照射,CD3的百分比+CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+Th细胞和CD3+CD8+血液和脾脏中的CTLD2-注射组相对于自由药物治疗组低1.2倍以上(图。6a–d).用US治疗的游离药物治疗导致大量淋巴细胞在肝组织中积聚,而对于SPIN几乎没有观察到淋巴细胞在肝中积聚D2使用US辐照进行治疗(图。6e).此外,CD3的浸润+,CD4+和CD8+心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中的t细胞进行旋转D2-治疗组和US-辐照组总体上低于用US辐照进行非药物治疗后的那些(补充图。5055).虽然在游离药物和us照射治疗后小鼠观察到明显的细胞因子风暴,但是在SPIN中血清IL-23、IL-1α、IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-27、IL-17A、IFN-β和GM-CSF水平D2-治疗和US-辐照组总体上比游离药物治疗和US-辐照组低1.6倍(图。6f和补充图。56).旋转中的血清ALT、AST和ALP水平D2与对照组相比,治疗组和US照射组仅略有增加,但相对于用US照射进行非药物治疗后的患者,它们仍然低1.5倍、1.3倍和1.3倍(图。6克,高和补充图。57a).此外,在旋转中D2-治疗组和US照射组的血清肌酐(CRE)、尿素和γ-谷氨酰转移酶(GGT)水平(补充图。57b–d),几个重要的血液参数(补充图。58),小鼠体重(补充图。59),以及主要器官(心、肝、脾、肺和肾)的组织学形态(图)。6e和补充图。49)没有明显变化。这些结果证明了自旋D2治疗和US照射对破坏小鼠正常器官的稳态免疫耐受性的影响极小,表明无论US照射与否,相对于游离药物治疗,irAEs的概率降低(图。6i).

讨论

通过深层组织渗透和安全的非电离辐射,US可作为理想的外部刺激,在活体受试者体内原位精确激活癌症免疫疗法。尽管声动力学过程已经与化学疗法、化学动力学或光疗相结合以在临床前环境中治疗癌症,但是它很少被开发用于免疫疗法,只有几个例子,其中纳米敏化剂和免疫检查点抑制剂被独立地给予小鼠(补充表1)42,43。为了获得US诱导的免疫激活的特异性,我们合成了半导体聚合物免疫调节纳米颗粒(SPINs ),其经历了声动力学过程以产生1O2来专门切割1O2-敏感接头并释放共价连接的免疫调节剂。这种声动力激活机制不同于用于从纳米颗粒或微泡释放药物的常规US介导的空化44,45其中物理负载的药物分子仍然会遇到在正常组织中非特异性释放的问题。

尽管SPN已经用于光学成像和光线疗法46,47,48,49,它们的声动力学特性一直是未知的。SPNs的筛选导致了一种强有力的声敏剂(SPN7)的发现,其具有产生声动力的能力1O2比包括小分子染料和TiO在内的其他常用声敏剂至少强3.0倍2在相同质量浓度下(图。2f).更重要的是,SPNs本身具有出色的声动力稳定性(图。2g),优于结构上易受US辐射破坏的小分子声敏剂(图。2h和补充图6)。此外,声动力1O2甚至在10 cm的组织深度中也保持了SPNs的生成能力(图。3g),形成了深层组织可激活的声波免疫疗法的基础。这也通过使用自旋的单一声动力疗法得到了验证0,其将原位胰腺兔肿瘤的生长抑制了2.4倍(图。5j,k).

SPN7的分子改造使我们能够通过一个1O2-可切割的接头,形成前治疗系统(SPINs ),其中免疫调节剂的生物活性在本质上被沉默,并且仅在US照射时被触发(图。3a).尽管胰腺肿瘤具有过量的细胞外基质(ECM)蛋白,但在系统给药后,SPINs在皮下胰腺小鼠肿瘤中被动积累(补充图。27),这应该是由于有效的增强渗透和保留(EPR)效应50,51。在US照射下,自旋能够有效地产生1O2消融肿瘤细胞并诱导ICD(补充图。31),这导致淋巴细胞的肿瘤浸润增强(补充图。33)并因此引发用于免疫疗法的肿瘤。与此同时,一代1O2在肿瘤微环境中触发免疫调节剂的原位释放,远程激活局部免疫治疗。在五次旋转中,旋转D2在抑制原发性和远处肿瘤的生长、延长动物存活和防止肿瘤复发方面具有最高的超声免疫治疗功效(图。4b–h).还证明了对于覆盖有5cm猪肉组织的小鼠肿瘤可获得治疗益处,证实了体内深层组织可激活的超声免疫疗法(图。5b–d).

通过多重基因表达分析的潜在分子机制研究表明D2注射和US照射上调了肿瘤细胞的基因表达水平。Ido1Cd274在肿瘤中分别为1.6倍和4.0倍(图。4j,k).迄今为止,已经报道了光热和光动力效应诱导肿瘤细胞中IDO和PD-L1的上调表达52,53,54,而声动力效应对这些免疫抑制蛋白的影响尚未得到评估。这项研究表明,SPIN介导的超声治疗可以通过上调IDO和PD-L1的表达,重新编程肿瘤微环境,将无免疫原性的“冷”肿瘤转化为免疫原性的“热”肿瘤。因此,靶向IDO和PD-L1途径,然后进行US治疗应该是增强免疫反应的有效策略。注意即使NLG919和aPD-L1的注射剂量总体上低于先前研究中用于联合免疫疗法的剂量(补充表2),旋转D2几乎完全根除了原发性和远处肿瘤,并完全抑制了再次攻击的肿瘤。自旋引发的如此高的抗肿瘤免疫反应D2应归因于两种免疫调节剂(用于IDO抑制的NLG919和用于PD-L1阻断的aPD-L1)的共存,这两种免疫调节剂协同提高了CTL的杀肿瘤活性(补充图4144).

SPINs的声动力激活机制的高度特异性使得能够将免疫治疗作用精确地限制在活体小鼠的肿瘤上,潜在地降低了irAEs的发生率。这得到了多重观察的支持。自旋的管理D2没有US照射的单独使用甚至比游离药物给药具有更差的抗肿瘤效力,并且不像游离药物那样显著影响正常器官中的免疫细胞群体和血清细胞因子水平(图。6a–f).相反,自旋后定向US照射D2与游离药物给药相比,在肿瘤中的累积导致肿瘤组织中CTL的数量增加至少两倍;然而,在正常器官中,效应T细胞的数量仅略高于盐水组,比游离药物组低1.2倍(图。6a–d).这可以通过自旋内NLG919和aPD-L1的最小生物活性来解释D2没有用户照射。



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