使用superRCA突变检测试验对白血病患者进行超灵敏监测

患者样本中罕见的肿瘤特异性突变是监测恶性疾病病程和临床常规治疗反应的良好标记，需要改进的检测技术才能广泛采用。我们在此描述了一种高灵敏度和高选择性的分子扩增技术- superRCA测定-用于快速和高度特异性地检测DNA样品中以极低频率存在的DNA序列变体。使用标准流式细胞仪，我们证明了对来自骨髓或外周血中正常细胞的高达100，000倍过量DNA的恶性细胞单核苷酸突变序列的精确、超灵敏检测，以跟踪急性髓性白血病(AML)患者的治疗过程。我们还证明了位于高GC区域的序列变异可以被敏感地检测到，我们说明了该技术在疾病复发早期检测中的潜力，作为迅速改变治疗的基础。

肿瘤特异性突变DNA可以作为一类高度特异性的生物标志物，用于监测恶性疾病和对治疗的反应1。越来越多的频繁突变的基因或全基因组在肿瘤中作为常规事项被测序，提供了表征个体肿瘤的肿瘤特异性体细胞突变的列表1,2,3,4。对这种序列变异体的分析对所用的技术提出了严格的要求。只要有足够灵敏、特异和廉价的技术来检测罕见的点突变，就有可能对几乎任何肿瘤患者的病程和治疗反应进行监测。用于研究对患者恶性克隆特异的微量体细胞突变的合适材料包括体液中的无细胞DNA和来自血液或骨髓(BM)的细胞。

虽然隐性癌基因的功能缺失突变可能是个别患者独有的，但其他突变在许多患者中会复发。这种突变通常会增加其基因产物的活性并刺激肿瘤生长，并且它们可能会通过对靶向药物治疗的信号反应而被证明是可操作的5。由于它们在患者中的流行，即使是有限的特定复发性突变的分析库也可以用来监测许多患者的恶性疾病的进程。

一个恰当的例子是急性髓性白血病(AML)，一种预后不良的严重血液病，其特征是早期髓性母细胞的克隆性扩增。尽管强化联合化疗使大多数患者病情缓解，但这些患者中的大多数最终会复发并在两年内死于该疾病6,7。基因异常是急性髓细胞白血病和几种复发性突变的重要预后因素，包括NPM1, FLT3和TP53，用于疾病风险分层。此外，对AML分子基础的深入了解使得近年来出现了几种针对这些复发性遗传异常的靶向疗法7.

AML中许多最常见的突变发生在与表观遗传基因调控相关的基因中，其中一些被报道为白血病发生过程中的早期关键事件8，包括影响DNMT3A异柠檬酸脱氢酶1和2(IDH1和2)，以及染色质修饰剂，例如ASXL1。这些基因中导致表观遗传变化的突变也常见于其他血液系统疾病，如骨髓增生异常综合征(MDS)，以及实体瘤，包括结直肠癌和脑肿瘤9,10,11.

IDHs是正常柠檬酸代谢的重要调节剂IDH1/2在15–33%的AML病例中，基因发生突变，导致从正常的α-酮戊二酸生成转变为致癌代谢产物2-羟基戊二酸生成8。FDA最近批准了两种靶向疗法(伊维替尼和依那西替尼)用于AML的治疗IDH1表示“…人”IDH2-分别是突变。

治疗后疾病复发是当今AML面临的主要挑战之一，加强对其原因的了解以及预测复发风险或尽早检测复发的新技术都是非常必要的。多项研究一致表明，评估可测量残留疾病(MRD)对于估计治疗后残留白血病细胞的预后重要性，MRD阴性对有益疾病结果具有高度预测性12。最广泛使用的技术是用于识别抗体染色的恶性细胞的多参数流式细胞术和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)12,13对于融合转录物，应用于BM样品。这种MRD分析的结果可以指导AML患者的治疗决策，特别是决定患者是否应该接受同种异体干细胞移植7。虽然在过去的40年里，化疗一直是急性髓细胞白血病治疗的主要标准，但我们现在正朝着更有针对性的治疗方向发展，目标是为每位患者量身定制精确治疗。随着更多的靶向治疗方案可供选择，MRD的准确检测对于指导治疗决策将具有越来越大的价值。如果MRD的生物标志物可以在容易获得的外周血液样品中而不是在骨髓中以超高的灵敏度检测，这将具有显著的实际优势，尤其是对患者而言。

有几种方法用于检测DNA样品中低频率存在的序列变异体14,15,16。例如，基本PCR方法的变体可以为单核苷酸变体提供极高的选择性，因此相对于大量过量的正常序列，也可以检测非常少量的突变DNA序列，但是这些方法不能提供定量结果17,18,19。罕见的突变分子可以通过划分许多用于液滴数字PCR (ddPCR)的单分子扩增反应来精确计数16,20,21,22。通过对每个突变位点进行数百万次读取，已经使用DNA分子的深度DNA测序来估计患者样品中丰度水平低至100，000分之一的突变序列的数量，所述DNA分子已经在一条链或两条链上标记有独特分子标识符(UMIs)以排除人工引入的序列变化14,23,24,25。见补充表格S1来比较这些方法。

在这里，我们展示了一种方法，能够以一种方便的方式超灵敏、精确地定量突变DNA序列——super RCA——我们用它来监测恶性血液病患者。感兴趣的DNA序列，已知在患者的恶性细胞中发生突变，首先通过靶向PCR扩增从患者样品中富集(图。1).扩增的序列接着被转换成DNA环，进行滚环扩增(RCA)。然后使用对突变体或野生型序列特异的挂锁探针以高度特异性探测RCA产物的重复序列，随后是环化探针的RCA。从每个起始DNA环产生的大DNA簇被称为superRCA产物。可以使用荧光团标记的杂交探针观察它们，并使用标准流式细胞仪或通过显微镜将它们计数为单独的、明亮荧光的突变体或野生型特异性物体。尽管基因分型的保真度一般为0.1-0.5%，但单个RCA产品中数百个串联拷贝的基于多数投票的基因分型是解释基因分型高保真度的关键特征26连接酶介导的基因分型方法中每个靶序列拷贝的错误率27,28.

A通过PCR扩增样品中感兴趣的DNA序列。B通过模板连接它们的5ʹ和3ʹ末端，扩增的链被转化为单链DNA环。C模板化环化反应的寡核苷酸接下来用作RCA反应的引物。D然后用对突变体或野生型序列特异的挂锁探针询问RCA产物。E连接的挂锁探针，缠绕在RCA产物周围，然后模板化二次RCA反应，由加入的寡核苷酸引发。F对于每一个起始的DNA环，该反应产生主要是单链DNA物体的大簇，称为superRCA产物。多达一百万个荧光标记的杂交探针可以结合每一种突变型或野生型特异性产物，允许通过例如标准流式细胞术进行有效计数。

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我们通过研究血液恶性肿瘤患者的样本，证明了superRCA方法适用于对非常罕见的突变DNA序列进行数字检测，包括缺失、插入和单核苷酸交换，也适用于具有挑战性的序列环境，例如高GC%片段。我们证明，突变序列的高度敏感性有可能在非常低的水平上检测MRD，从而允许早期检测复发性疾病。

单个单链DNA环通过两个连续的RCA反应产生大的DNA簇- superRCA产物

为了产生superRCA产物，首先通过PCR富集感兴趣的DNA序列，并连接扩增的链以形成单链DNA环(图。1，另请参见图。S1).通过RCA从起始DNA环产生长串联产物。接下来，添加成对的挂锁探针，与每个初级RCA产物中数百个拷贝的突变体或野生型序列互补，以靶特异性方式连接。成功识别目标后，挂锁探针形成环状DNA链，缠绕在RCA产物周围，然后进行第二次RCA反应。

对初级RCA产物的探测，每个产物含有几百个拷贝的正常或突变靶序列，产生了极端程度的序列选择性。这是因为只要任何初级RCA产物中的绝大多数拷贝被准确地分型，等位基因特异性挂锁探针偶尔的靶错误识别仍然是检测不到的。

在初始PCR后，通过向微量滴定孔中加入一系列物质并进行孵育来进行上述操作。对于每个起始DNA环，这产生了一个大的DNA簇，称为superRCA产物。在本文所示的实验中，用于基因分型的起始DNA环和挂锁探针的长度约为100 nt。给定Phi29聚合酶的聚合速率，1 h RCA反应产生由每个起始DNA环的几百到一千个互补序列组成的RCA产物。因此，通过两个连续的RCA反应产生的每个容易检测的克隆superRCA产物包含多达1000 × 1000个单体序列或大约100兆碱基的DNA，并且它们每个的分子量可以达到几十千兆道尔顿。

数字2A显示了第一代RCA产品和经过两代RCA的superRCA产品，通过扫描电子显微镜观察。该图像说明了superRCA产品达到了人类细胞数量级的几微米的尺寸。数字2B展示了一项实验的结果，其中通过监测分子信标的荧光来实时测量不同浓度的第一代和第二代RCA产物的复制29加入到扩增反应中。实验表明，在第一次和第二次1 h RCA反应中确实可以实现完整的千倍扩增，导致每个superRCA产物总共一百万个标签序列拷贝。

A扫描电子显微照片显示了第一代RCA产品(插图)和经历了两代RCA的superRCA产品的相对尺寸。B对第一代和第二代RCA反应的实时监测说明了每一代的扩增程度。5 pM superRCA产物的RCA复制以与第一代RCA产物相同的速率积累荧光，第一代RCA产物以5 nM环状挂锁探针为模板。该实验证明，在superRCA中单体重复的生成速率比第一次RCA快约1000倍，这证明每个第一代DNA环产生约1000个第二代DNA环。C单个superRCA产物，来源于单个起始DNA环，通过三个不同反应产物的荧光染色可见，起始于两个DNA环，产生1∶0比例的绿色或红色superRCA产物。10:1或0:1。没有观察到混色产品，将其识别为数字对象。

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我们使用荧光显微镜来研究单个superRCA产物是否确实来源于单个起始DNA环，而不需要将反应区室化。从两种起始DNA环产生的superRCA产物被染色成两种不同的颜色，显示没有混合颜色的产物，从而证实每种superRCA产物都来自单一的起始DNA环(图。2C).突出、明亮的荧光反应产物允许在低放大倍数(20倍)下在宽视野内计数和区分单个分子的单个扩增产物。对于纯野生型或突变型样品，仅分别观察到绿色和红色信号，表明野生型或突变型样品的明确识别。在图中10:1的条件下观察到一些黄色产物。2C是由于沉积在玻璃表面的高浓度野生型和突变型扩增产物的随机共定位。

superRCA产物可以通过流式细胞术进行计数

我们发现单个superRCA反应产物足够大和亮，可以用标准流式细胞仪记录，通常用于分析荧光标记的细胞。该方法允许superRCA产物(每一个都代表一个单一的起始DNA环)被方便地计数到任何导致DNA环形成的分子分析中，并且存在许多这样的分析30,31,32,33。通过这种方式，数以百万计的产品可以在几分钟内使用一般可用的仪器进行数字化评分，从而在较宽的动态范围内提供出色的定量精度(图。3A补充图。2和3).我们还说明了次级RCA产物的重复序列允许对用两种荧光团的不同组合标记的superRCA产物进行流式细胞术分析(图。3C).

A使用两种杂交探针对superRCA产物进行流式细胞术分析，一种用荧光团AL488标记，另一种用AL647标记。B对来自Y染色体SRY基因的靶序列的superRCA产物与来自常染色体β-珠蛋白基因序列的superRCA产物进行流式细胞术分析。实心圆( )表示两个基因序列的输入比率的superRCA产物的记录比例。空心圆(o)表示三次测量的变异系数(cv)。y染色体特异性superRCA产物在100，000分之一的稀释度下仍被检测到高于背景。n=对该数据集进行了3次生物重复分析，数据以平均值±SD表示。C每个superRCA产物的大量重复序列允许用两种荧光标记的杂交探针的组合对单个物体进行染色，如用假色绘制的superRCA产物结果所示，所述super RCA产物用指定比例的用AL488或AL647标记的两种寡核苷酸染色，然后合并用于流式细胞仪分析。

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急性髓系白血病超低频点突变的检测

在AML患者中常见的IDH突变，以及其他8种AML相关突变，被一个superRCA 12-plex面板靶向，包括9种单核苷酸突变(IDH1页（page的缩写）R132C，IDH1页（page的缩写）R132H，IDH2页（page的缩写）R140Q，IDH2页（page的缩写）R172K，TP53页（page的缩写）R248Q，PTPN11页（page的缩写）A72T，DNMT3A页（page的缩写）S714C，DNMT3A页（page的缩写）R882C和BCORL1页（page的缩写）Q1039*)，2次插入(NPM1页（page的缩写）W288fs和ASXL1页（page的缩写）G646fs*12)和1个缺失(洁净手术室页（page的缩写）M1641fs*50)来监测AML患者的MRD。AML和MDS中常见突变的基因、不同类型的突变、具有预后影响的异常以及靶向治疗可用或正在进行的突变都包括在分析中。设计了10个共扩增的PCR扩增子，允许平行检测来自相同DNA样品的9个基因中存在的12个突变。然后将反应产物分开，并在单独的superRCA反应中对12个突变中的每一个进行询问。

IDH突变用于测试我们方法的分析性能。我们首先从携带相应突变的细胞系中制备基因组DNA的4倍系列稀释液，加入到缺乏突变的野生型基因组DNA中。稀释系列中突变等位基因频率(MAFs)的总范围从10−2到10−5，最左侧数据点中的纯野生型基因组DNA样品代表阴性对照。按照制造商的建议，通过superRCA程序或使用商业液滴数字PCR (ddPCR)分析每个DNA稀释液(图。4).为了优化检测灵敏度，在superRCA分析中使用了330 ng基因组DNA，相当于50，000个二倍体细胞。在最初的ddPCR中，使用330 ng基因组DNA输入(从10个ddPCR反应中收集，每个ddPCR反应有33 ng gDNA)导致了与IDH分析中100 ng基因组DNA输入相似水平的假阳性事件(补充图。4和5).因此，我们选择在整个研究中使用100 ng输入进行ddPCR分析。superRCA分析成功地检测到了比正常DNA多100，000倍的突变DNA。ddPCR数据揭示了非常低频率突变的显著更大的可变性和不足的灵敏度。图中显示了在低MAF下添加突变IDH2 p.R172K的样品的代表性原始superRCA和ddPCR数据S6.我们还使用12-plex AML面板分析了来自UPN 113、UPN 125、UPN 130和UPN 131患者的四份诊断样本，以证明在每个患者样本中检测多个突变的可行性(补充图。8).

分析四倍系列稀释的细胞基因组DNAA IDH1页（page的缩写）R132C，B IDH1页（page的缩写）R132H(C) IDH2页（page的缩写）R140Q，以及D IDH2页（page的缩写）使用superRCA程序或ddPCR检测R172K突变。将含有突变基因组DNA的基因组DNA样品在野生型基因组DNA中连续稀释，并分成两份，每份用于superRCA或ddPCR分析。根据制造商的说明，对每个样品分析330 ng DNA，对应于100，000个人类单倍体基因组(或略少于50，000个细胞，考虑到细胞正在循环并可能部分复制了它们的基因组)，用于superRCA测定，同时将总共100 ng DNA分成两个复制反应，对应于15，100个人类单倍体基因组(对应于7，500个二倍体细胞)，用于ddPCR。n=对superRCA进行了3次生物复制分析，并且n=为ddPCR检测组分析了2个生物复本。数据以平均值±SD表示。对于每种分析物，ddPCR和superRCA检测的检测限(LoD)计算如下《牛津小词典》 = 平均值(野生型) + 3 × SD(野生型)并且在图中用水平虚线表示。

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对44例髓系恶性肿瘤患者的四种IDH突变的分析

我们继续分析图1所示的四种IDH突变。5骨髓抽吸物来自22名髓系恶性肿瘤患者队列，包括AML、MDS和骨髓增生性瘤形成。通过superRCA、ddPCR和新一代测序(NGS)对所有患者进行调查。这些样本是在诊断时收集的，当时所有患者都患有急性疾病，其骨髓中有高比例的恶性细胞。作为临床工作的一部分，使用靶向NGS试验记录所有患者的IDH基因突变。我们发现所有患者都携带至少一种被调查的突变，而两名患者还携带第二种IDH突变，频率较低。使用superRCA记录的这些诊断样品的MAF值与NGS和ddPCR分析的结果非常一致(补充图。7A–F).

来自22名患者的样本被选择用于基准研究，这些患者在BM中均具有高比例的恶性细胞。每位患者使用330 ng基因组DNA进行多重superRCA分析。在superRCA方案中的预扩增步骤后，对每个样品进行平行分析A IDH1第132页C，B IDH1页（page的缩写）R132H(C) IDH2页（page的缩写）R140Q和D IDH2对于ddPCR分析，对每个患者进行了四次独立的IDH突变分析，使用100 ng gDNA分成两次重复用于每个突变。在诊断患者时分析了NGS数据，揭示了该基准研究中包括的每个患者样本的IDH突变状态。在ddPCR和superRCA检测的检测阈值以下记录的值以浅色条显示。n= 1个生物重复分析该组的superRCA、ddPCR和NGS，数据以单次测量表示。所有三种分析方法的样本都是在患者诊断时收集的。

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由于用于IDH突变的superRCA分析被配置为评估来自同一PCR反应的所有四种突变，每个患者总共使用330 ng DNA，以允许灵敏度低至100，000个单倍体基因组中的1个，而ddPCR分析需要总共400 ng DNA来研究具有较低灵敏度的四个独立反应中的相同四种靶。superRCA和ddPCR的绝对检测限(LoD)通过加标实验确定(图。4)最初的PCR循环用于扩大检测样品中突变DNA分子的机会，以便如本文所述平行或在多重反应中分析几个突变。对于掺入数据实验中100，000个MAF(突变等位基因频率)数据点中的一个(我们使用660 ng的总DNA输入，这对应于200，000个单倍体基因组中的2个突变分子)。

对于由24名AML患者组成的第二组，总共使用33 ng DNA来检测IDH突变。同样，对于这组患者，ddPCR和superRCA分析证实了与NGS所见相同的IDH突变的存在，并且频率相当。患者204和221的IDH1 p.R132H突变的ddPCR信号接近检测限(分别为0.14%和0.12%)，可能是不正确的，因为它们没有被superRCA观察到(补充图。9).

使用superRCA、NGS和ddPCR检测对AML患者进行长期监测

使用这三种方法在几个时间点分析了三名AML患者的连续样本，以探索superRCA探测法监测病程的适用性(图。6).第一例患者(UPN124)在AML诊断前三年半出现低血细胞计数，但当时的骨髓分析未能证实任何血液学诊断。这IDH2页（page的缩写）在AML诊断中使用靶向NGS检测法在骨髓样本中发现R172K突变，并开始强化化疗。白血病克隆在初始化疗后保持不变，但在改用阿扎胞苷和venetoclax的组合后实现了完全缓解(完全缓解，即形态学上< 5%的原始细胞)，通过使用流式细胞术分析抗体染色的细胞测量MRD < 0.1%(CD34+、CD117 +、CD33 +、CD13异源HLA-DR +和CD56 +)。同种异体干细胞移植(SCT)在第126天进行，患者在SCT后21个月的随访期内保持无症状。所有三种分析都报道了在诊断时采集的BM样本中IDH基因突变拷贝的相似比例(图。6A).IDH突变仍然以相当高的频率出现在SCT前6周采集的外周血样本中，通过ddPCR记录(1.66 × 10−3)和superca(1.27×10−3)即使通过抗体染色的骨髓细胞的流式细胞术测定，患者在临床上是MRD阴性的(MRD <0.1%)。干细胞移植后，通过ddPCR和superRCA重复分析血液和骨髓样本，并在某些时间点进行NGS，对患者进行监测。所有六个收集的样本都显示出检测不到的IDH2页（page的缩写）R172K突变，表明患者仍处于缓解状态。我们还找到了该患者的第一份骨髓样本，该样本是在该患者首次出现轻微血细胞计数降低时确诊AML的三年半前收集的。superRCA和ddPCR检测都记录了更高水平的IDH2页（page的缩写）与AML诊断时采集的样本相比，该样本中的R172K突变，证实了在该患者AML诊断之前，在外周血细胞减少(也称为意义不明的克隆性血细胞减少)的情况下存在克隆性造血。

A患者UPN124在第0天被诊断为AML，其具有高水平的IDH2页（page的缩写）R172K突变，并开始药物治疗。在第126天进行SCT，此时通过superRCA和ddPCR记录的突变水平相当高，但SCT后的所有后续样本均为阴性，表明完全缓解。AML诊断前三年半采集的骨髓样本显示高水平的IDH2页（page的缩写）通过superRCA和ddPCR分析进行回顾性分析时发现R172K突变。B就以下方面对患者UPN125进行了随访IDH2页（page的缩写）R172K突变。对于UPN125，AML诊断时(第0天)采集的骨髓样本的NGS显示高水平的IDH2页（page的缩写）R172K突变，以及随后对同一样本的superRCA和ddPCR分析记录了相似的突变水平。经过3个月的治疗，NGS不再表现出IDH2页（page的缩写）R172K突变在临床缓解期间获得的BM样本中显著水平，而通过superRCA和ddPCR分析的后续分析揭示了该突变的显著水平。所有以下样本通过所有三种检测技术均呈阳性，与患者的临床复发相一致。C对患者UPN 125进行了以下分析BCORL1页（page的缩写）Q1039*突变。NGS和回顾性superRCA分析揭示了高水平的BCORL1页（page的缩写）Q1039*突变在第0天收集的诊断样品中，但是在从第97天开始的临床缓解期间收集的样品中，突变水平已经被NGS抑制到背景和10−4由superRCA。D对患者UPN 125进行了随访DNMT3A页（page的缩写）R882C突变。NGS和超级无线电公司的分析表明DNMT3A页（page的缩写）R882C突变最初以高频率出现(MAF分别为0.38和0.44)。然后在治疗后持续存在，尽管如前所述白血病前突变的形态学缓解影响DNMT3A突变。该患者随后复发至MDS期，但未出现blast过度。E在AML诊断前两年，UPN126被诊断为原发性骨髓纤维化。AML诊断时(第0天)的骨髓样本显示高水平的IDH2页（page的缩写）通过NGS、superRCA和ddPCR记录的R140Q突变。对骨髓纤维化阶段初始骨髓样本的回顾性分析显示IDH2页（page的缩写）用superRCA和ddPCR检测R140Q突变。在第139天进行SCT，此时仍有相当水平的突变。这IDH2页（page的缩写）SCT后约三个月，superRCA检测到低水平的R140Q突变，而ddPCR未能在该时间点检测到突变水平。所有后续样本的血液和骨髓superRCA和ddPCR均为阴性，表明完全缓解。

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另一名患者(UPN125)被诊断为AML，其恶性细胞表现出骨髓增生异常特征的形态学体征，在对单份DNA样本的回顾性研究中，对三种不同的突变进行了跟踪。诊断时对骨髓样本的NGS分析显示IDH2页（page的缩写）MAF为0.39的R172K突变，DNMT3A页（page的缩写）MAF为0.38时的R882C，以及BCORL1页（page的缩写）q 1039 * MAF为0.14。经过3个疗程的强化化疗治疗后，在第97天，NGS检测不到IDH2 p.R172K突变，患者处于临床缓解期。相比之下，通过superRCA和ddPCR分析对同一样本的回顾性分析记录了IDH2页（page的缩写）频率为1.79 × 10的R172K突变−3和2.39 × 10−3分别证明了疾病持续存在的早期检测。(图。6B).从第182天及以后采集的所有随后的样品通过所有三种测定都是阳性的，MAF值在0.01和0.1之间，即使患者的外周血细胞计数在第230天左右才开始下降。患者随后复发，但处于MDS期，无胚细胞过多。在最初诊断后的第565天，重新开始使用阿扎胞苷进行治疗。这BCORL1页（page的缩写）Q1039*突变最初由superRCA在第0天在诊断样品中以0.12的MAF检测到，然后降低到NGS的背景水平和低于10–4在3个疗程的强化治疗后第97天收集的缓解期BM样本的superRCA分析中。在随后收集的样本中，突变保持在相似的水平(图。6C).这DNMT3A页（page的缩写）R882C突变最初由superRCA在第0天诊断样本中MAF为0.44时检测到。NGS的MAF仍处于显著水平(MAF 2.1 × 10−2)和superca(MAF 2.1×10−2)在3个疗程的强化治疗后临床缓解期间(第97天)收集的BM样品中，与在形态学完全缓解中持续的白血病前克隆一致13。在进一步的回顾性监测中，这种突变继续以高水平存在(图。6D).

第三名患者(UPN126)先前被诊断为与JAK2突变相关的原发性骨髓纤维化，在首次诊断后2年转变为继发性AML(图。6E).AML诊断中心的NGS发现了IDH2页（page的缩写）R140Q突变和先前已知的JAK2突变。对骨髓纤维化阶段初始骨髓样本的回顾性分析显示IDH2页（page的缩写）当通过superRCA和ddPCR分析时，R140Q突变，表明AML转化后的克隆进化。该患者在第一个疗程的强化化疗后实现了完全缓解，但仍保持约2%的MRD阳性(通过流式细胞术对具有CD34、CD117、CD13和DR的骨髓细胞进行测量+标记)在3个疗程的强化化疗后。在第139天进行异基因SCT。随后通过ddPCR和NGS分析连续的血液和骨髓样本对患者进行监测，SCT后收集的所有六个样本均显示出检测不到的IDH2页（page的缩写）R140Q突变，表明患者在SCT后两年多的随访中仍处于缓解状态。SCT后3个月采集的血样经superRCA检测呈阳性，但低于ddPCR的检测限。在常规护理中，发现阳性结果IDH2页（page的缩写）R140Q突变很重要，因为它会促使停用免疫抑制剂以增强移植的免疫效果。

急性髓细胞白血病和MDS中一个位于GC富集区的突变分析

骨髓增生异常综合征(MDS)包括一组疾病，其中骨髓产生的健康血细胞数量不足。大约30%的MDS患者发展为急性髓细胞白血病。这ASXL1页（page的缩写）G646fs*12突变被认为是MDS和AML预后不良的标志7,34。这种突变的特征是在8G核苷酸序列中插入一个额外的G核苷酸(ggaggggggg[-/G]TGGCCCGGGTG)。插入位点周围20 bp的GC含量为87%,排除了商业ddPCR分析。内部NGS分析的检测阈值仅达到5%的最小MAF，文献中也报道了类似的结果35。为了研究使用superRCA分析来分析这种低频率突变的可行性，我们制备了一个四倍稀释的基因组DNA系列，其中含有野生型序列的基因组DNA中的这种突变(图。7A).superRCA试验成功地揭示了富含GC的突变，即使在最低的研究浓度2 × 10−4在33纳克的基因组DNA中。

A富含GC的基因组DNA标准曲线ASXL1页（page的缩写）G646fs*12突变，在野生型gDNA中连续稀释4倍并通过superRCA一式两份分析。B对4名AML和MDS患者的骨髓和血液样本进行superRCA分析，结果为阳性ASXL1页（page的缩写）NGS分析G646fs*12突变。

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我们对富含GC的应用了superRCA分析ASXL1页（page的缩写）G646fs*12突变，先前由NGS在4名髓系恶性肿瘤(AML或MDS)患者的样本中检测到(图。7B).来自两个患者UPN113和UPN127的BM样品分别在0.32和0.24的频率下对突变呈阳性，对应于来自诊断检查的NGS结果。对于剩下的两名分别被诊断为AML和急性早幼粒细胞白血病的患者(UPN128和upn 129 ), NGS检测到ASXL页（page的缩写）G646fs*12在检测限0.05附近的MAF处突变，但是当通过superRCA分析时没有观察到该突变，这表明测序结果可能是错误的。NGS的高背景为ASXL1页（page的缩写）先前已经报道了G646fs*12突变35,36.

患者UPN113被诊断为具有胚细胞过度的MDS，并接受了4个周期的氮杂胞苷治疗。剩余的约20%的高原始细胞百分比促使治疗转向强化化疗，随后在最初诊断后的第253天进行异基因SCT。SCT后一个月和三个月的superRCA分析显示了检测不到的ASXL1页（page的缩写）G646fs*12突变符合患者的临床缓解。尽管如此，该患者在第352天不幸死于治疗相关原因，这清楚地提醒了我们需要关于患者反应的数据来最佳地平衡治疗。

需要证明肿瘤特异性核酸序列变异体对抗大量非常相似的序列，这就对所用的检测技术提出了严格的要求。必须高效地检测稀有分子，正是因为它们是稀有的，因此在有限的样品中不能被忽略；并且极其精确，以便最小化对于更丰富的序列变体的交叉反应性的风险。同样重要的是，真实的反应产物不能被误认为任何形式的分析背景。我们提出了一种解决这些挑战的方法，使用一种方便的分子检测和普遍可用的仪器，并展示了其在高精度和高灵敏度监测白血病患者中的应用。

在未来的几年中，肿瘤患者将越来越多地对他们的恶性肿瘤进行测序并对突变进行编目，从而通过分析例如血浆、脑脊液或如本文所示的BM细胞和外周血中有核细胞提供优异的肿瘤特异性标记来监测疾病。我们证明，检测突变基因序列的足够精确和有效的方法可以指导肿瘤患者的治疗，允许在肿瘤负荷增加之前早期检测潜在的抵抗复发，或提供稳定缓解的更有把握的诊断。我们的研究表明，在急性髓细胞白血病和MDS相关疾病中，外周血可以为监测患者提供同样有效的样本，而较少获得的骨髓样本对患者来说更不愉快。外周血检测可以大大简化对患者的监测，允许以更短的时间间隔采样来指导患者管理。

在这里，我们将superRCA法与目前临床使用的NGS和ddPCR法进行了比较。NGS可以适用于检测比本文所示频率更低的突变，但成本更高，而且NGS的周转时间也更长。类似地，ddPCR并不局限于这里所针对的20，000个乳液液滴，但是与典型的superRCA反应中产生的大量产物相比，它在灵敏度方面仍然存在不足(见表S1, 表面抗原-5和支持材料)。在建立superRCA程序时，我们针对同一DNA样本中的一组12个突变，包括点突变和缺失，我们针对NGS和ddPCR对superRCA进行了基准测试。superRCA技术适用于调查已知存在于患者恶性细胞中的大量突变。除了本文所用的初始PCR步骤之外，可以使用间隙填充挂锁探针，也称为分子倒置探针，以环状形式平行捕获大量的靶序列37,38.挂锁探针有助于在靶捕获和基因分型中以非常高的倍数应用，因为只有分子内探针反应产生环状DNA产物，然后可以通过RCA记录，而探针对之间的连接反应不能产生可扩增的DNA环。

我们进一步说明在图。3C单个superRCA产物中高度重复的序列基序使得它们适合于用荧光团标记的检测探针进行组合标记以进行多重读出。在我们的图示中，仅使用了两种荧光团，但是使用标准流式细胞仪，在更多荧光团和标记比率的帮助下，更高水平的多重化应该是可能的。

superRCA分析建立在寡核苷酸连接反应的公认能力上，特别是挂锁探针在许多靶序列变体中进行区分，包括单核苷酸变体、插入和缺失以及重复序列的可变长度28,37,39,40.

superRCA的低检测限和高精度是重复靶序列的高选择性基因分型与可通过流式细胞术方便分析的大量产物相结合的结果。结合起来，这些特性呈现出重要的临床优势。如患者UPN125所示，NGS分析未能检测到剩余的IDH2页（page的缩写）初始治疗后的R172K突变因此暂停，尽管后来的superRCA和ddPCR分析都清楚地揭示了剩余的恶性克隆，随后导致该患者复发。在患者UPN126中，SCT后的第一次ddPCR分析报告为阴性IDH2页（page的缩写）R140Q，尽管通过superRCA分析仍可检测到低水平的突变。在SCT后，即使低水平的残留白血病标记物也会促使临床行动，主要是通过减少免疫抑制剂以增强SCT的免疫效果，从而根除具有引起白血病复发风险的残留恶性克隆。

同样重要的是白血病患者基因分类的高准确性。的存在ASXL1根据ELN风险分类，缺乏有利风险AML亚型的突变将患者置于不利遗传风险类别中7，从而影响治疗决策。高风险突变的假阴性检测，例如ASXL1如NGS对患者UPN128和UPN129的分析所示，可能因此显著影响患者管理和结果。

superRCA检测程序因其高灵敏度和简单性而适合常规使用。在使用标准流式细胞仪分析反应产物之前，3-hr方案仅需要向DNA样品中加入5次，通过孵育分离。自从完成这项研究以来，我们已经使用小型实验室机器人自动化了检测的添加和孵育步骤。我们证明了每一个起始的DNA环都会在一个精确的过程中产生一个独特的、易于检测的微米级数字对象。通常情况下，每次反应会产生超过500万个这样的物体，无需除流式细胞仪之外的专门设备，即可在几分钟内对每个样品中的产物进行计数，从而实现出色的定量精度。肿瘤中易于突变的靶序列，如富含GC的区域，可能对序列区分提出挑战，但我们证明superRCA程序提供了广泛的靶兼容性。

如前所述，基于挂锁探针的基因分型是在具有数百个待分析序列串联拷贝的RCA产物上进行的，这意味着偶然的错误分型不会影响单个RCA产物的整体基因分型，这解释了罕见突变序列的极高灵敏度。我们证明了检测与野生型序列比例为1:100，000的单核苷酸突变的能力。这相当于十分之一的正确基因分型15基因组DNA样本中的核苷酸。错误分型的其余风险与靶序列扩增过程中聚合酶错误的风险有关，但明智地选择高保真聚合酶将这种风险保持在我们报道的检测阈值以下(见补充讨论)。

超低频突变的分析需要获得大量的DNA，这些DNA很容易从骨髓和全血样品中获得。对于使用血浆DNA的液体活检应用，只有少量的DNA可用。在这里，superRCA分析可能在未来的应用中表现出优势，允许同时分析患者样品中的多个突变序列(图。S8)，带有联合或单独标签，用于根据需要通过流动进行检测(见图。3C)，从而提高检测灵敏度。

本文所展示的superRCA机制也有希望用于许多其他需要局部数字检测的应用，包括用于稀有突变DNA或RNA序列的原位检测，并且该技术因此可以改善在各种情况下分析少量突变核酸的前景。