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阻断甘氨酸利用通过破坏谷胱甘肽平衡抑制多发性骨髓瘤进展

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发表时间:2022-07-15 10:32作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肿瘤微环境中的代谢物是肿瘤进展的关键因素。然而,对多发性骨髓瘤(MM)骨髓(BM)微环境中的代谢特征缺乏了解,限制了我们对MM进展的了解。在这里,我们表明,由于MM细胞分泌的基质金属肽酶13 (MMP13)介导的骨胶原降解,BM微环境中的甘氨酸浓度升高,而升高的甘氨酸水平与MM进展相关。MM细胞利用通道蛋白溶质载体家族6成员9 (SLC6A9)吸收外源性甘氨酸,随后参与谷胱甘肽(GSH)和嘌呤的合成。通过SLC6A9敲除抑制甘氨酸利用或用甜菜碱处理抑制MM细胞增殖并增强硼替佐米对MM细胞的作用。总之,我们确定甘氨酸是多发性骨髓瘤的关键代谢调节剂,揭示了控制多发性骨髓瘤进展的分子机制,并为多发性骨髓瘤的治疗提供了一个有希望的治疗策略。

介绍

多发性骨髓瘤(MM)的特征是骨髓(BM)微环境中的转化克隆性浆细胞和血液或尿液中的单克隆免疫球蛋白积聚1。我们组和其他组的最新发现表明,遗传变异和骨髓微环境导致多发性骨髓瘤的恶性进展和抗癌治疗耐药1,2。据报道,肿瘤微环境中的代谢重编程促进了各种类型癌症中的肿瘤进展3,4,5。最近,我们证明了肠道细菌通过提高MM中BM谷氨酰胺水平来促进MM进展6,表明BM微环境中代谢物水平的改变可以影响MM。

病理变化强烈地影响着代谢特征。肿瘤的发生导致肿瘤微环境中代谢物的改变,这反过来促进了肿瘤的发展7,8,9,10.最近,已经表明肿瘤相关代谢物可以潜在地用于癌症的临床诊断和治疗。例如,Tan等人发现一组五种血浆代谢物可以作为胰腺癌的非侵入性诊断标记11和陈等报道阻断果糖利用可减弱急性髓系白血病的增殖和耐药性12.然而,仍然缺乏对MM BM微环境中代谢物谱的详细了解。代谢物在MM进展中的作用更是知之甚少。

在这项工作中,我们试图填补我们在MM代谢物知识方面的空白。我们对来自MM患者和健康供体(HDs)的骨髓液和外周血(PB)血浆进行了代谢组学分析。最后,我们研究了MM诱导的代谢物的改变及其对MM的治疗潜力。

结果

甘氨酸在骨髓微环境中上调,并与MM预后不良相关

我们使用来自HDs和MM患者的PB血浆和BM液体进行了非靶向代谢组学研究。用于这些分析的粪便排泄物液体样本被分为训练集和验证集。为了筛选HDs和MM患者之间差异调节的代谢物,我们使用SIMCA-P 14.1软件和MetaboAnalyst 5.0分析了代谢物的光谱强度。建立了正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型,并显示出在所有数据集中区分多发性骨髓瘤患者和HDs患者的令人满意的建模和预测能力(图。1a).阈值小于零的Q2Y截距(模型的预测精度)表示所有集合中的有效模型(补充图。1a).从这些OPLS-达模型中获得代谢物的可变重要性投影(VIP)值,以及倍数变化(FC)和p基于光谱的强度,使用MetaboAnalyst 5.0获得代谢物的-值。详细的VIP值、FCs和p-补充数据中显示了代谢物的值1.与HDs相比,MM患者中大多数氨基酸上调,而脂肪酸下调(补充图。1b).在训练集和验证集中,总共有10种代谢物被鉴定为BM液体中的差异代谢物(VIP > 1,FC > 1.2,p < 0.05). The identified metabolites in BM liquid included glycine, L-脯氨酸、肌酸酐、鸟氨酸、L-谷氨酸,L-缬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、岩芹酸和亚油酸,其中七种代谢物在铅血浆中也发生了显著变化(图。1b和补充数据2).有趣的是,甘氨酸在BM验证组和PB血浆中显示出最高的VIP值,提示在MM中的重要作用。

图1:甘氨酸在骨髓微环境中升高,并与MM的不良预后相关。
figure 1

a, b(a)来源于MM患者和HDs的BM液体和PB血浆的OPLS-DA评分图(BM-训练集:n= 10在HD组,nMM组中= 20;BM-验证集:n= 11在HD组,nMM组中= 30;PB:n= 26在HD组,nMM组中= 31),和(b)基于VIP、FC和的所有组中的差异代谢物p-value (MetaboAnalyst 5.0软件,具有不成对的双面t-测试)。c左图:HDs衍生的BM液体中甘氨酸的靶向代谢组学分析(n= 31)和新诊断的MM患者(n= 110);右图:HDs来源的PB血浆中甘氨酸的靶向代谢组学分析(n= 31)和新诊断的MM患者(n= 110).结果表示平均值±SD;不成对的双面t-已应用测试。d来自BM液体和PB血浆的甘氨酸浓度的相关性(n= 110;双边皮尔逊相关分析)。e使用来自HDs和新诊断的MM患者的受试者基于甘氨酸浓度绘制的ROC曲线(n= 110).源数据作为源数据文件提供。

随后,我们证实,与HDs患者相比,MM患者骨髓液和外周血中甘氨酸浓度显著升高(图。1c).同一MM患者外周血和骨髓液中甘氨酸浓度也呈正相关(r2= 0.2197,p < 0.0001) (Fig. 1d),这意味着甘氨酸是MM潜在的有价值的诊断生物标志物。我们随后通过制作甘氨酸浓度的受试者操作者特征曲线(ROC)来评估这种可能性。ROC分析显示,在BM液体和PB血浆中的甘氨酸有效地区分新诊断的MM患者和HDs,曲线下面积(AUC)值分别为1和0.94(图。1e).为了探索甘氨酸是否在MM中起作用,我们评估了BM甘氨酸浓度和MM临床特征之间的潜在相关性。我们发现甘氨酸浓度与浆细胞百分比(p= 0.043),杜里-鲑鱼(DS)阶段(p= 0.018),血清中存在的免疫球蛋白的亚型(p= 0.04),以及贫血(p= 0.008)(表1).这些发现表明甘氨酸与MM患者的不良预后和恶性进展有关。

甘氨酸浓度与多发性骨髓瘤患者临床特征的相关性。

甘氨酸剥夺抑制体内外骨髓瘤细胞增殖

与代谢分析一致,人MM细胞系(包括ARP1,MM1。s,RPMI-8226,OCI-My5和KMS28-PE)都表现出比GM12878,人B细胞系更高的细胞内甘氨酸浓度(补充图。2a).此外,甘氨酸转运蛋白溶质载体家族6,成员9(SLC6A9)在ARP1、OCI-My5和KMS28-PE中的表达,而另一种甘氨酸转运蛋白(SLC6A5)相对于GM12878细胞并未在所有MM细胞系中观察到(补充图。2b).因此,我们假设相对于GM12878对照细胞,MM细胞从培养基中吸收了更多的甘氨酸。

正如所料,在甘氨酸存在下培养的MM细胞系显示出较高的细胞内甘氨酸浓度(图。2a),而剥夺外源性甘氨酸显著抑制了MM细胞的增殖并减少了集落数量(图。2b,c).为了测试外源性甘氨酸剥夺是否也抑制了体内MM进展,我们给有MM倾向的C57BL/KalwRijHsd小鼠喂食正常或不含甘氨酸的饮食一周,然后静脉注射表达荧光素酶的5TGM1小鼠骨髓瘤细胞。我们通过整体动物活体成像和测量IgG2b浓度和骨损伤来监测这些小鼠(称为“5TGM1 MM小鼠”)的MM发展和肿瘤负荷参数(图。2d).在第6周,对照小鼠的血清甘氨酸浓度远高于无甘氨酸小鼠的血清甘氨酸浓度(图。2e).与对照组小鼠相比,在注射5TGM1细胞后第8周,喂食无甘氨酸饮食的小鼠显示出显著降低的肿瘤相关发光强度(图。2f,g).此外,在第4周和第8周,对照小鼠的血清IgG2b浓度显著高于无甘氨酸小鼠的血清IgG2b浓度(图。2h).

图2:外源性甘氨酸的剥夺抑制了体外和体内的MM细胞生长。
figure 2

aARP1,MM1中甘氨酸的靶向分析。在添加或不添加甘氨酸(10毫克/升)的RPMI 1640培养基中培养的s和5TGM1细胞。bARP1,MM1的生长曲线。在添加或不添加甘氨酸(10毫克/升)的RPMI 1640培养基中培养的s和5TGM1细胞。n= 3个独立实验;结果表示平均值±SD;用不成对的双侧分析显著性t-测试输入(a, b). cARP1,MM1的克隆原性分析。在添加或不添加甘氨酸(10毫克/升)的RPMI 1640培养基中培养的s和5TGM1细胞(n= 3个独立实验;结果表示平均值±SD)。d体内实验示意图。e来自用对照饮食喂养的5TGM1 MM小鼠的血清中甘氨酸的靶向测定(n= 6在第0周,n= 4在第6周)或无甘氨酸饮食(n=第0周和第6周的6)。f用对照饮食或不含甘氨酸饮食喂养的5TGM1 MM活小鼠中的肿瘤相关发光强度。g在第2、4、6和8周用对照饮食或不含甘氨酸的饮食喂养的5TGM1 MM小鼠中发光强度的量化。h用ELISA检测小鼠血清中IgG2b的浓度(第0周:n=每组6人,第2周:n=每组6人,第4周:n= 4在控制饮食组中,n= 6在无甘氨酸组,第8周:n= 2在控制饮食组中,n无甘氨酸组中= 6)。i来自用对照饮食或无甘氨酸饮食喂养的5TGM1 MM小鼠的股骨的显微CT图像。j量化骨微结构参数,即BV/TV、Tb。n,Tb。Sp和Tb。Th(n=每组5个)。k, l骨吸收标记物CTX-1和骨形成标记物PINP的定量(n= 4在控制饮食组中,n无甘氨酸饮食组= 6)。结果表示平均值±SD;用不成对的双侧分析显著性t-测试输入(e, g, h, jl). m用对照饮食或无甘氨酸饮食喂养的5TGM1 MM小鼠的存活曲线(对数秩检验)。源数据作为源数据文件提供。

骨损伤是多发性骨髓瘤最重要的特征之一。因此,我们使用micro-CT扫描来检测小鼠股骨的骨损伤,发现与无甘氨酸小鼠相比,对照组小鼠的股骨小梁骨量明显较低(图。2i).骨微结构参数的量化显示骨小梁体积分数(Tb。BV/TV)和小梁数量(Tb。n)远低于无甘氨酸小鼠,而小梁分离(Tb。Sp)和小梁板厚度(Tb。Th)与无甘氨酸的小鼠相比在对照小鼠中升高(图。2j).此外,骨吸收标记物CTX-I(I型胶原的C-末端肽)和骨形成标记物PINP(I型前胶原的N-末端前肽)在骨质疏松症患者中升高13,进行mcie血清检测。与不含甘氨酸的小鼠相比,对照小鼠中的CTX-1和PINP均较高,进一步揭示了对照小鼠中更严重的骨损伤(图。2k,l).此外,对存活曲线的分析表明,与对照饮食相比,无甘氨酸饮食显著延长了小鼠存活时间(图。2m).因此,外源性甘氨酸剥夺减缓了体内MM的进展。

甘氨酸剥夺通过破坏骨髓瘤细胞内谷胱甘肽平衡抑制细胞增殖

为了探索外源性甘氨酸调节MM细胞增殖的潜在机制,我们在补充了5%透析的FBS和同位素标记的甘氨酸(10 mg/L)的无甘氨酸RPMI 1640培养基中培养ARP1细胞。为了消除天然同位素引起的干扰,在0小时收集的细胞用作分析的参考。然后对细胞进行处理,检测有或没有甘氨酸、丝氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸、肌苷-5′-一磷酸(IMP)、鸟苷-5-一磷酸(GMP)、腺苷-5-一磷酸(AMP)、腺嘌呤和鸟嘌呤的水平13c标签(图3a).代谢追踪13C2-甘氨酸表明,在ARP1细胞中甘氨酸被整合到丝氨酸(m + 2)、GSH (m + 1和m + 2)、IMP (m + 2和m + 3)、GMP (m + 2和m + 3)、AMP (m + 2和m + 3)、腺嘌呤(m + 2)和鸟嘌呤(m + 2)中(补充图。3a).因此,外源性甘氨酸被MM细胞吸收,随后通过提供碳代谢成这些代谢物(图。3b).的质量分布向量13还发现c标记的代谢物随着时间的推移而增加(补充图。3b–d).为了探索外源性甘氨酸是否通过GSH或嘌呤促进MM细胞中的细胞增殖,我们用补充了GSH (10微米)或次黄嘌呤(50微米)的无甘氨酸培养基培养ARP1细胞,三天后使用比色细胞活力测定(细胞计数试剂盒-8,CCK-8)来测量细胞增殖。如补充图所示。3eGSH和次黄嘌呤都可以挽救在无甘氨酸培养基中培养的ARP1细胞的增殖。以前的出版物表明,外源甘氨酸有助于黑色素瘤细胞中嘌呤的合成,而不是GSH的合成14.因此,在这项研究中,我们重点研究了来源于外源性甘氨酸的谷胱甘肽在多发性骨髓瘤中的作用。3c),并且增加的外源甘氨酸相应地增加了细胞内GSH水平(图。三维(three dimension的缩写)).在5TGM1细胞中观察到相同的模式(补充图。3f).增加外源甘氨酸也降低了ARP1和5TGM1细胞中的活性氧(ROS)水平(补充图。3g).我们进一步发现,在来源于无甘氨酸饮食喂养的异种移植MM小鼠的肿瘤中,GSH水平显著低于那些来自正常饮食喂养的小鼠(图。3e).在无甘氨酸小鼠中形成的肿瘤也明显小于对照组小鼠(补充图。3h).

图3:甘氨酸来源的谷胱甘肽有助于MM细胞的增殖。
figure 3

a甘氨酸代谢流实验示意图。bMM细胞中甘氨酸代谢示意图。c在有或没有GSH的无甘氨酸培养基处理下培养的ARP1细胞的生长曲线。d用不同剂量的甘氨酸培养24小时的ARP1细胞中的GSH水平n= 3个独立实验;结果表示平均值±SD;不成对的双边t-测试用于(c, d). e来自用对照饮食或无甘氨酸饮食喂养的B-NDG小鼠的肿瘤结中的GSH水平(n= 3只老鼠;不成对的双边t-测试)。f5TGM1 MM小鼠肿瘤相关发光强度的实时成像。g在图中显示的5TGM1 MM小鼠群中肿瘤相关发光强度的定量(f). h用ELISA检测的小鼠血清中IgG2b的浓度(第0周和第2周:n=每组6人,第4周:n= 5在对照组+ GSH组,n= 6在其他组中,第6周:n在对照组和无甘氨酸组中= 6,n= 2在对照组+ GSH组,n= 5在无甘氨酸+ GSH组,p1代表对照组与对照组+ GSH组之间的显著性,p2代表无甘氨酸组和无甘氨酸+ GSH组之间的显著性)。结果表示平均值±SD;不成对的双边t-测试用于(g, h). i用含有或不含GSH的对照或不含甘氨酸的饮食喂养的5TGM1 MM小鼠的存活曲线(n=每组6个;对数秩检验)。j甘氨酸代谢相关基因在有或无甘氨酸培养的ARP1细胞中的表达谱。k甘氨酸代谢示意图。lγ-H免疫荧光分析的代表性图像2在有或没有甘氨酸培养48小时的ARP1细胞中AX(红色)蛋白的表达(n=每组50张图像;结果表示平均值±SD;不成对的双边t-测试)。mγ-H的蛋白质印迹2AX、p-ATR、p-ATM、p-CHK1、p-CHK2、CDC25A和β-肌动蛋白在加或不加甘氨酸和/或GSH培养48小时的ARP1细胞中的表达。源数据以源数据文件的形式提供。

据报道,GSH合成的抑制抑制了各种类型癌症中的肿瘤细胞增殖15,16,17.我们发现,通过阻止GSH合成或添加外源性GSH来破坏细胞内GSH平衡会抑制ARP1和5TGM1细胞的增殖(补充图。3i,j).因此,我们研究了添加GSH是否能恢复喂食无甘氨酸饮食的5TGM1 MM小鼠的肿瘤进展。肿瘤负荷分析显示,肿瘤相关的发光强度(图。3f,g)和血清IgG2b浓度(图。3h)显著高于对照组小鼠。用GSH处理的小鼠也显示出显著缩短的存活时间(图。3i).因此,GSH作为甘氨酸的下游效应物介导MM进展。

使用有或没有甘氨酸培养的ARP1细胞的RNA测序显示SLC6A9,甘氨酸脱羧酶(甘氨酸脱氢酶),丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2),以及谷胱甘肽合成酶(稳态测地卫星(Geodetic Stationary Satellite))在外源甘氨酸存在下显著上调(图。3j和补充数据3).这表明外源性甘氨酸剥夺诱导了甘氨酸转运、甘氨酸裂解、甘氨酸和丝氨酸之间的相互转化以及谷胱甘肽合成的改变,这与甘氨酸代谢流分析一致(图。3k).基于差异表达基因的富集信号通路分析显示,前10个富集通路中有一半与细胞有丝分裂和DNA损伤有关(补充图。3k和补充数据4).随后的细胞周期和DNA损伤分析显示,外源性甘氨酸剥夺诱导的S期停滞(补充图。3l)和γ-H的上调2AX,DNA损伤的标志(图。3l和补充图。3m).因为活性氧诱导的DNA损伤可以激活DNA修复途径,导致细胞周期停滞(补充图。3n),我们进行蛋白质印迹来检测γ-H的表达2这些细胞中的AX和DNA修复相关蛋白。我们发现GSH处理降低了γ-H的水平2AX、p-ATR和p-CHK1,同时在甘氨酸缺乏培养基中培养的ARP1细胞中上调CDC25A。相反,ATM和CHK2的磷酸化不受GSH的影响(图。3m).这些发现表明,外源性甘氨酸剥夺诱导DNA损伤,随后激活ATR-CHK1 DNA修复途径,导致MM细胞S期停滞。

抑制GLDC可抑制MM细胞的增殖

甘氨酸裂解系统(GCS)由几种蛋白质组成,包括甘氨酸脱氢酶(GLDC)、GCS蛋白H (GCSH)、氨基甲基转移酶(AMT)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD),它们催化下列可逆反应:甘氨酸+ H4叶酸+ NAD+ 5,10-亚甲基-H4叶酸+一氧化碳2+ NH3+ NADH + H+(图。4a)18。我们发现外源性甘氨酸剥夺降低了NADH / NAD的比值+在ARP1和5TGM1细胞中(图。4b),表明外源甘氨酸可以被GCS系统切割。上述RNA测序数据显示,GLDC在ARP1细胞中被外源性甘氨酸剥夺下调,这通过蛋白质印迹进一步证实(图。4c).为了确定GLDC是否在多发性骨髓瘤中起作用,我们在ARP1细胞中敲除了GLDC。4d).我们发现GLDC敲低抑制增殖(图。4e),GSH水平降低(图。4f),并降低NADH / NAD的比值+(图。第四代移动通信技术)在ARP1细胞中。

图4:GLDC的敲除削弱了MM细胞的增殖。
figure 4

a甘氨酸裂解系统示意图。b用或不用外源甘氨酸培养的ARP1和5TGM1细胞中NADH/NAD +的比率。c在有或没有甘氨酸培养24小时的ARP1细胞中GLDC、GCSH、DLD、AMT和β-肌动蛋白的蛋白质印迹d用Scramble (Scr)、GLDC shRNA1 (GLDCsh1)和GLDCsh2对ARP1细胞中的GLDC和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹。e具有Scr、GLDCsh1或GLDCsh2的ARP1细胞的生长曲线。f具有Scr和GLDCsh1的ARP1细胞中的GSH水平。gNADH / NAD的比值+在具有Scr或GLDCsh1的ARP1细胞中。h用Scr或GLDCsh1处理或不用GSH处理的ARP1细胞的生长曲线。i用Scr或GLDCsh1处理或不用GSH处理的ARP1细胞的克隆形成分析。n= 3个独立实验;结果表示平均值±SD;用非配对双侧分析显著性t-测试输入(b, fh) (p1代表Scr和GLDCsh1之间的显著性,p2代表GLDCsh1和GLDCsh1 + GSH之间的显著性),用ANOVA单向检验在(e). jGLDC,p-ATR,p-CHK1,CDC25A,γ-H的蛋白质印迹2ARP1细胞中的AX和β-肌动蛋白。k在注射了具有Scr的ARP1细胞的B-NDG小鼠中形成的肿瘤结(n= 3只小鼠)、未经GSH处理的GLDCsh1(n= 3只小鼠),或用GSH处理的GLDCsh1细胞(2 mg/kg)(n= 3只老鼠)。lScr、ARP1 GLDCsh1和ARP1 GLDCsh1 + GSH小鼠的肿瘤体积分析。m来源于Scr、ARP1 GLDCsh1和ARP1 GLDCsh1 + GSH小鼠的肿瘤结中的GSH水平。n= 3只老鼠;结果表示平均值±SD;用不成对的双侧分析显著性t-测试输入(l) (p1代表Scr和GLDCsh1之间的显著性,p2代表GLDCsh1和GLDCsh1 + GSH之间的显著性),m. nGLDC、p-ATR、p-CHK1、CDC25A、γ-H2AX和β-肌动蛋白在来源于Scr、ARP1 GLDCsh1和ARP1 GLDCsh1 + GSH小鼠的肿瘤结中的蛋白质印迹。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们向GLDC缺失的细胞提供外源性GSH,发现这恢复了GLDC敲除后ARP1细胞的增殖和细胞集落形成(图。4h,我).敲除GCSH或AMT也能抑制ARP1细胞的增殖,然而,敲除催化NAD之间相互转化的DLD+和NADH没有显著影响ARP1细胞增殖(补充图。4a–f).此外,我们发现GLDC的敲除增加了γ-H2AX、p-ATR和p-CHK1,并降低ARP1细胞中CDC25A蛋白水平,而添加GSH逆转了这些变化(图。4j).因此,GLDC促进GSH的产生,而GLDC的敲除诱导DNA损伤并因此抑制MM细胞的增殖。

我们接下来使用免疫缺陷的B-NDG小鼠在体内检测GLDC敲除的效果。我们给B-NDG小鼠皮下注射表达GLDC shRNA1或混杂shRNA的ARP1细胞,并在肿瘤细胞植入一周后,通过在饮用水中加入多西环素(2 mg/mL)诱导shRNA表达。我们还向一半移植了ARP1 GLDC shRNA1细胞的小鼠提供了GSH (2 mg/kg)。如图所示。4k,l,GLDC敲除肿瘤比那些表达混乱shRNA的肿瘤小,添加谷胱甘肽增加了GLDC shRNA1小鼠的肿瘤大小。GSH测定显示,GLDC的缺失降低了肿瘤中的GSH水平,而GSH的添加预期地恢复了含有GLDC shRNA1的肿瘤中的GSH水平(图。4m).与体外实验的结果一致,GDLC敲除提高了γ-H的表达2AX,p-ATR,p-CHK1,并降低肿瘤中CDC25A的表达,而用GSH治疗恢复正常表达水平(图。4n).除了甘氨酸裂解代谢19,GLDC也参与糖酵解20,21,22嘌呤合成23谷胱甘肽合成24,25,自噬26等。代谢通量实验的结果表明,GSH (m + 1)在总GSH中的比例远低于GSH (m + 2 ),表明来自部分GCS的GSH产量少于作为直接底物的甘氨酸。因此,我们认为甘氨酸裂解代谢只是GLDC促进MM细胞GSH合成和细胞增殖的机制之一。

甘氨酸剥夺增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的作用

我们接下来检查了新诊断和复发MM患者BM和PB中的甘氨酸和葡萄糖水平,发现与新诊断患者相比,复发患者表现出低得多的甘氨酸浓度,但葡萄糖浓度相似(补充图。5a).而复发的MM患者比新诊断的患者具有更高的细胞内甘氨酸(在MM细胞中)和更低的骨髓甘氨酸(补充图。5b).ROC曲线分析表明,甘氨酸可能有助于区分复发和新诊断的MM患者(补充图。5c).有趣的是,添加甘氨酸,而不是葡萄糖,增加了ARP1细胞对硼替佐米(BTZ)的抗性(补充图。5d).我们还发现BTZ处理提高了ARP1细胞的胞内甘氨酸浓度(图。5a).这些发现使我们假设抑制甘氨酸的利用可以增强BTZ对MM细胞的作用。为了证实我们的假设,将含有(10 mg/L)或不含外源甘氨酸的ARP1细胞暴露于不同剂量的BTZ (0、2.5、5、10或20 nM)中48小时,然后进行CCK-8分析。CCK-8结果显示甘氨酸剥夺显著使ARP1对BTZ敏感(图。5b),而添加活性氧清除剂Trolox (100微米)降低了无外源甘氨酸培养的ARP1细胞的BTZ敏感性(图。5c).这些发现表明外源性甘氨酸剥夺可以通过提高ROS水平使MM细胞对BTZ敏感。

图5:甘氨酸剥夺使MM细胞对BTZ敏感。
figure 5

a用不同剂量的BTZ (0、2.5或5 nM)处理24小时的ARP1细胞中的细胞内和细胞外甘氨酸浓度b用不同剂量的BTZ (0、2.5、5、10或20 nM)处理用(10 mg/L)或不用外源甘氨酸培养的ARP1细胞48小时,然后进行CCK-8分析。c用不同剂量的BTZ (0、2.5、5、10或20 nM)和用或不用Trolox (100微米)处理用(10 mg/L)或不用外源甘氨酸培养的ARP1细胞48小时,然后进行CCK-8分析。n= 3个独立实验;结果表示平均值±SD;用不成对的双侧非参数模型分析显著性t-测试输入(ac). d用对照饮食喂养的组中的5TGM1 MM小鼠的肿瘤相关发光强度的实时成像(n= 6只小鼠),用对照饮食喂养并用BTZ (1 mg/kg,每周3次,n= 6只小鼠),用不含甘氨酸的饮食(n= 6只小鼠),用不含甘氨酸的饮食喂养并用BTZ (1 mg/kg,每周3次,n= 6只小鼠),或用不含甘氨酸的饮食喂养并用BTZ (1 mg/kg,3次/周)加GSH (2 mg/kg,3次/周)治疗(n= 6只小鼠)。e, f5组5TGM1 MM小鼠的发光强度和血清IgG2b浓度。g骨吸收标记物CTX-I和形成标记物PINP的定量。结果表示平均值±SD;用不成对的双侧非参数模型分析显著性t-测试中e, f (p1代表控制和控制+ BTZ之间的意义,p2代表无甘氨酸和无甘氨酸+ BTZ之间的显著性,p3代表对照+ BTZ和无甘氨酸+ BTZ之间的显著性,p4代表无甘氨酸+ BTZ和无甘氨酸+ BTZ + GSH之间的显著性),g. h5组5TGM1 MM小鼠的存活曲线(对数秩检验)。源数据作为源数据文件提供。

我们随后研究了体内甘氨酸剥夺是否增强了BTZ对多发性骨髓瘤的作用。将30只5TGM1 MM小鼠随机等分为5组,其中2组用对照饮食喂养,另2组用不含甘氨酸的饮食喂养。一周后,给这些小鼠静脉注射5TGM1细胞。另一周后,用对照饮食喂养的组每周三次腹膜内注射BTZ (1 mg/kg)或生理盐水,用无甘氨酸饮食喂养的组每周三次注射BTZ (1 mg/kg)、BTZ加GSH(每隔一天一次,2 mg/kg)或生理盐水。每两周通过整体动物肝脏成像和IgG2b浓度测量来监测MM小鼠中肿瘤负荷。如图所示。5d,e在第6周BTZ治疗后,无甘氨酸组的肿瘤相关发光强度低于对照组。同时,在BTZ处理的无甘氨酸组中,加入谷胱甘肽显著增加了肿瘤相关的发光强度。此外,BTZ处理的无甘氨酸组的血清IgG2b浓度低于BTZ处理的对照组,但通过添加GSH显著增加(图。5f).与不含甘氨酸的小鼠相比,对照组小鼠的CTX-I和PINP血清浓度更高,此外,在用BTZ治疗的不含甘氨酸的小鼠中,用GSH治疗显著提高了CTX-I和PINP血清浓度(图。5g).此外,BTZ + GSH处理的无甘氨酸组比单独用BTZ处理的无甘氨酸组寿命更短(图。5h).

我们也用NDG小鼠来证实我们的假设。给15只NDG种小鼠皮下注射ARP1细胞,然后如上所述随机等分成5组。一周后,对照组用BTZ (1 mg/kg)或生理盐水每周处理三次,无甘氨酸组用BTZ (1 mg/kg)、BTZ加GSH (2 mg/kg)或生理盐水每周处理三次。BTZ显著降低了对照组和无甘氨酸组的肿瘤体积。然而,无甘氨酸组的肿瘤比BTZ处理的对照组的肿瘤小,而添加谷胱甘肽增加了BTZ处理的无甘氨酸组的肿瘤大小(补充图。5e).这些发现表明甘氨酸剥夺通过降低MM细胞中的GSH水平增强了BTZ对MM的作用。

阻断甘氨酸摄取抑制细胞增殖并增强BTZ对骨髓瘤细胞的作用

甘氨酸是人体必需的神经递质27因此可能不是可行的治疗目标。我们的RNA测序分析结果显示甘氨酸转运蛋白SLC6A9在ARP1细胞中甘氨酸剥夺后下调,这用蛋白质印迹进一步证实(补充图。6a).我们发现BTZ治疗显著增加SLC6A9表情却没有影响SLC6A5在ARP1细胞中的表达(图。6a).因此,SLC6A9可能介导MM细胞摄取甘氨酸。为了测试这一点,我们敲了敲SLC6A9在ARP1细胞中(补充图。6b),这导致甘氨酸浓度和谷胱甘肽水平下降(图。6b,c). SLC6A9敲除也显著使ARP1细胞对BTZ治疗敏感,并增加BTZ诱导的ROS水平,而添加Trolox逆转了这种效应SLC6A9敲低BTZ诱导的细胞死亡和活性氧水平(图。6d,e,补充图。6c–e).

图6:通过抑制甘氨酸利用SLC6A9敲除或甜菜碱处理减少增殖并增强BTZ对MM细胞的作用。
figure 6

a SLC6A5SLC6A9用BTZ处理的ARP1中的表达。bARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2细胞中的甘氨酸浓度。cARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2细胞中的GSH水平。d用或不用BTZ处理的ARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2细胞的克隆形成分析。e用不同剂量的BTZ处理的ARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2细胞的CCK-8分析。f甘氨酸的化学结构,N,N二甲基甘氨酸和甜菜碱。g用以下物质处理的ARP1和5TGM1的细胞存活力N,N二甲基甘氨酸或甜菜碱。h用或不用甜菜碱处理的ARP1和5TGM1细胞中的甘氨酸水平。i用或不用甜菜碱处理的ARP1和5TGM1中的GSH水平。j用生理盐水、BTZ (1 mg/kg)或甜菜碱(500 mg/kg)处理的5TGM1 MM小鼠的活体成像发光强度(n=每组5个)。k在2(n=每组5个)、4个(n=每组5个),以及6个(n在对照组中= 4,n=其他组5)周。l用生理盐水、BTZ或甜菜碱处理的5TGM1 MM小鼠中的IgG2b浓度。m5TGM1 MM小鼠的存活曲线(对数秩检验)。n通过Chou–Talalay方法分析ARP1中甜菜碱和BTZ处理的组合指数。o用或不用BTZ和甜菜碱处理的ARP1细胞中的ROS水平。p用不同剂量的BTZ和有或没有甜菜碱和GSH处理的ARP1的CCK-8测定。q切割的caspase3,PARP,γ-H的蛋白质印迹2ARP1和5TGM1中的AX和β-肌动蛋白,含或不含BTZ、甜菜碱和GSH。n= 3个独立实验;结果表示平均值±标准差(ae, gi, o, p).不成对的双边t-测试用于(ac, e, h, i, 好的, p);成对双边t-测试用于应用于(l).源数据作为源数据文件提供。

我们随后探索了甘氨酸类似物的治疗潜力N,N-二甲基甘氨酸和甜菜碱,两者具有与甘氨酸相似的化学结构(图。6f).我们发现甜菜碱在减少活的ARP1和5TGM1细胞的数量方面比N,N二甲基甘氨酸(图6g)并且甜菜碱处理降低了MM细胞中甘氨酸摄取和GSH水平(图。6h,我).为了在体内测试甜菜碱的治疗潜力,我们使用5TGM1 MM小鼠,并将它们分成三组。注射5TGM1细胞一周后,三组小鼠分别用甜菜碱、BTZ或生理盐水处理。随着时间的推移,所有三个组的肿瘤相关发光强度都增加了(图。6j).然而,在第6周,甜菜碱和BTZ都降低了5TGM1 MM小鼠中肿瘤相关的发光强度和IgG2b浓度(图。6k,l).与对照组相比,甜菜碱和BTZ也显著延长了小鼠的存活时间(图。6m).

为了探索甜菜碱是否增强BTZ对MM细胞的作用,我们首先测定了ARP1和5TGM1细胞中甜菜碱和BTZ的IC50值(补充图。6f,g)然后通过使用Chou-Talalay方法评估ARP1细胞中甜菜碱和BTZ的结合指数(CI)。在ARP1细胞中,甜菜碱(4 mg/mL)加上BTZ (7 nM)的CI值小于1,表明甜菜碱在其对MM细胞的作用中与BTZ协同(图。6n).此外,用BTZ加甜菜碱的组合处理的ARP1细胞显示出比用单一药物单独处理的细胞更高的ROS水平(图。6o).此外,GSH的添加显著降低了甜菜碱和BTZ对细胞死亡诱导的联合作用(图。6p,补充图。6小时).甜菜碱和BTZ之间的协同作用通过提高γ-H2AX水平和半胱天冬酶-3和PARP的裂解在处理的ARP1细胞中得到进一步证明,这也可以通过GSH处理逆转(图。6q).这些发现表明,甜菜碱通过阻断甘氨酸摄取而降低GSH水平,从而增加MM细胞中ROS水平,从而增强BTZ对MM的作用

BM微环境中甘氨酸的积累是由MMP13诱导的骨胶原降解引起的

胶原蛋白由氨基酸组成,L-脯氨酸,L-谷氨酸,以及L-丙氨酸,其中甘氨酸约占总氨基酸的30%(图。7a)28。我们的非目标代谢组学研究表明甘氨酸,L-脯氨酸,L-谷氨酸,以及L与HDs患者相比,MM患者的β-丙氨酸均升高(图。7b).此外,伴有骨溶解的多发性骨髓瘤患者的血清甘氨酸水平高于不伴有骨溶解的多发性骨髓瘤患者(图。7c),特别是对于处于DS-III期的MM患者(补充图。7a,补充数据5),而患有骨转移的肺癌患者也显示出比没有骨转移的患者更高的血清甘氨酸浓度(补充图。7b).此外,MM患者中CTX-I和PINP的血清浓度与血清甘氨酸浓度呈正相关(图。7d).总之,这些结果表明骨胶原是MM患者甘氨酸的潜在来源。

图7:MM细胞分泌的MMP13介导的骨胶原降解增加了MM患者的甘氨酸水平。
figure 7

a骨基质成分示意图。b甘氨酸的非靶向代谢组学分析,L-脯氨酸,L-谷氨酸,以及L-来源于MM患者的骨髓液中的丙氨酸(n= 20在训练集组中,n=验证集组中的30;)和HDs(n= 10在训练集组中,n=验证集组中的11)。c多发性骨髓瘤患者血清甘氨酸浓度(n= 12)或没有(n= 24)骨质破坏。dMM患者血清甘氨酸浓度与血清CTX-I或PINP的相关性(n= 26).eMM患者血清MMP13与血清甘氨酸浓度的相关性(n= 87).双面皮尔逊相关分析应用于(d, e). f体内实验工作流程示意图。g用生理盐水(对照)或CL-82198 (2 mg/kg)处理的5TGM1 MM小鼠中的肿瘤相关发光强度(n=每组4个)。h图中显示了肿瘤相关发光强度的定量g (n=每组4个)。i来自用对照饮食或无甘氨酸饮食喂养的5TGM1 MM小鼠的股骨的显微CT图像。j量化骨微结构参数,包括BV/TV、Tb。n,Tb。Sp和Tb。Th(n=每组4个)。k用或不用CL-82198处理的小鼠中血清CTX-1和PINP的定量(n=每组4个)。l来自用生理盐水或CL-82198 (2 mg/kg)处理的5TGM1 MM小鼠的血清中的甘氨酸浓度(n=每组4个)。m我们工作假说的示意图。结果表示平均值±SD;用不成对的双侧分析显著性t-测试输入(b, c, j, h, k, l).源数据作为源数据文件提供。

胶原蛋白被各种肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)降解29,30,31,32。与早期的发现一致33我们发现ARP1细胞主要表达基质金属蛋白酶13(补充图7c),其浓度与骨溶解呈正相关(补充图。7d)和甘氨酸浓度(图。7e)在MM患者中。因此,甘氨酸积累可能是由MMP13诱导骨胶原降解引起的。

为了检查体内甘氨酸积累的来源,我们用MMP13的特异性抑制剂CL-82198 (2 mg/kg)处理5TGM1 MM小鼠34,然后评估肿瘤相关发光、骨损伤和甘氨酸浓度(图。7f).如图所示。7g–I,与对照小鼠相比,CL-82198处理的小鼠在股骨中表现出显著较低的肿瘤相关发光强度和较高的小梁骨量。此外,骨微结构参数的量化显示,CL-82198治疗增加了股骨BV/TV和Tb。n而不改变Tb。Sp和Tb。Th(图。7j).在CL-82198处理的小鼠中,CTX-I和PINP的血清浓度显著低于对照组小鼠(图。7k).此外,在第6周,用CL-82198处理的小鼠中的甘氨酸浓度显著低于用盐水处理的小鼠(图。7l).因此,MMP13诱导的骨胶原降解是BM中甘氨酸积累的来源。

讨论

我们的结果表明甘氨酸剥夺显著抑制MM细胞增殖。我们还表明,外源性甘氨酸被MM细胞吸收,随后代谢为谷胱甘肽、嘌呤和丝氨酸,这与以前的出版物相反,以前的出版物中发现外源性甘氨酸仅参与黑色素瘤中嘌呤的合成14。机制研究表明,甘氨酸剥夺抑制细胞增殖,通过增加DNA损伤,从而在MM细胞中细胞周期停滞。此外,敲低GLDC,这已被证明是驱动肿瘤发生的非小细胞肺癌21,导致MM细胞GSH降低,DNA损伤增加,增殖抑制。添加GSH可有效逆转MM中由甘氨酸剥夺或GLDC敲除引起的这些表型。甘氨酸的代谢通量分析显示,在MM细胞中,GCS产生的GSH少于作为直接底物的甘氨酸。因此,GLDC促进GSH合成和细胞增殖可能还有其他机制。众所周知,在HDs中,浆细胞占BM微环境中总细胞的比例不到1%;然而,恶性浆细胞的百分比在MM患者中上升到10%以上35。我们组和其他人以前的出版物表明,细胞内GSH降低了BTZ对MM细胞的作用36,37.因此,我们假设MM细胞需要外源性甘氨酸来维持细胞内GSH平衡和拮抗抗癌药物。在这项研究中,我们发现甘氨酸剥夺增强了BTZ在体外和体内对MM的作用。有趣的是,通过甜菜碱抑制甘氨酸的利用抑制了MM细胞的增殖并增强了BTZ的抗癌作用。已经表明,高甜菜碱摄入量与各种癌症类型的风险呈负相关,包括结肠直肠癌38,39,乳腺癌40,肝癌41和前列腺癌42.例如,Kar等人发现甜菜碱通过增加前列腺癌细胞中氧化应激介导的凋亡来抑制细胞增殖43.这些报道,以及我们目前的研究,使我们得出结论,甜菜碱与BTZ联合应用可能是一种有前途的多发性骨髓瘤治疗策略。

骨胶原是骨基质中最重要的成分之一,在多种癌症类型中可被MMPs降解,导致骨转移和肿瘤进展32.MM细胞诱导高水平的MMP13表达,促进骨溶解并降低MM的总存活率33,44.先前的研究表明,骨溶解与血清甘氨酸的升高呈正相关45.在目前的研究中,我们发现血清中甘氨酸浓度的增加与多发性骨髓瘤和肺癌的骨溶解有关。我们还表明,MM患者血清MMP13浓度与血清甘氨酸浓度和骨溶解相关。重要的是,用MMP13抑制剂治疗5TGM1 MM小鼠降低了血清甘氨酸浓度并抑制了肿瘤进展。因此,我们的数据支持MM患者BM微环境中甘氨酸水平升高是由MM细胞分泌的MMP13介导的骨胶原降解引起的理论。甘氨酸还可能导致多种癌症类型的骨转移和骨溶解介导的进展。这种潜在的机制应该在未来进一步研究。

总之,我们发现BM中甘氨酸水平的升高通过调节MM细胞中GSH的平衡促进了MM的进展。无论是单独使用还是与BTZ联合使用,甜菜碱处理对甘氨酸利用的抑制对MM都表现出很强的治疗效果(图。7m).总之,我们的发现强调了甘氨酸在MM进展中的机制作用,并揭示了针对甘氨酸代谢的MM治疗策略。


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