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实体瘤细胞谷氨酰胺缺乏导致对核糖体RNA合成抑制剂的抗性

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发表时间:2022-07-01 14:33作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

核糖体生物发生是一个能量昂贵的计划,由营养的可用性决定。在这里,我们报道营养剥夺严重损害前体核糖体RNA(前rRNA)的加工,并导致未加工rRNA的积累。营养恢复后,饥饿状态下储存的前rrna被加工成成熟rrna,用于核糖体生物发生。营养胁迫下未能积累前rRNAs导致营养恢复时核糖体装配紊乱,随后通过uL5/uL18介导的p53激活导致细胞凋亡。单独恢复谷氨酰胺通过触发uL5/uL18翻译激活p53。谷氨酰胺对uL5/uL18蛋白合成的诱导依赖于翻译因子真核延伸因子2 (eEF2),后者又依赖于Raf/MEK/ERK信号传导。剥夺细胞的谷氨酰胺可防止rRNA合成抑制剂激活p53。我们的数据揭示了一种机制,肿瘤细胞可以利用这种机制在环境养分有效性波动期间抑制p53介导的凋亡。

介绍

实体瘤超过了它们的血液供应,并形成缺氧和缺乏营养的组织微环境1,2。这种微环境的特征是慢性缺氧,并且通常位于距离血管180米以上的地方3,4。另一种类型的缺氧——称为“循环缺氧”——源于未成熟脉管系统的短暂关闭,可导致“复氧损伤”,即自由基合成增加导致氧化应激和组织损伤5,6。随着缺氧,不稳定的血液供应也导致肿瘤微环境中营养可用性的大幅波动7。营养剥夺严重抑制肿瘤细胞增殖,但选择显示增加的血管生成和转移能力的侵袭性细胞8,9.

为了在代谢应激期间保持能量平衡,肿瘤细胞进化出适应性机制,以减弱营养缺乏下消耗ATP的过程10,11,12。这些适应包括抑制蛋白质合成,这是细胞中最耗能的过程12。例如,真核延伸因子2激酶(eEF2K)在营养限制下被激活并抑制翻译延伸因子eEF2,从而抑制整体蛋白质合成并促进营养耗尽下的细胞存活2。代谢应激抑制哺乳动物雷帕霉素复合物1的靶标13。这通过激活eIF4E结合蛋白1 (4E-BP1)来抑制帽结合翻译起始因子eIF4E,从而削弱mRNA翻译起始13。营养胁迫还触发整合应激反应(ISR),导致翻译因子eIF2α失活,从而抑制翻译起始并促进包括ATF4在内的胁迫适应性蛋白的合成14。另一个关键的适应是RNA聚合酶I (Pol I)对rRNA合成的抑制,它占总细胞转录的60%15,16。mTORC1和AMP活化蛋白激酶(AMPK)通过磷酸化TIF-IA相互调节前rRNA生物合成,后者是将Pol I锚定在rDNA启动子上的蛋白质复合物15,16。虽然对营养剥夺的致癌适应已经被很好地表征,但是还不知道饥饿的肿瘤细胞如何在营养恢复后恢复增殖能力。

核糖体生物发生是一个高度复杂的途径,需要产生4个rRNAs和80个核糖体蛋白17,18。数百种蛋白质反式-作用因子和小核仁RNA有助于装配过程17,18。该过程始于核仁,在核仁中Pol I合成一个长的多顺反子前rRNA,它经历快速折叠、修饰、加工和与核糖体蛋白结合19,20。在未受应激的细胞中,肿瘤抑制因子p53通过由MDM2(人类中的HDM2,以下表示为MDM2)促进的组成型蛋白酶体降解而保持在低水平21。当核糖体生物合成受到损害时,核糖体成分自由积累,包括核糖体蛋白uL5(以前称为RPL11)和uL18 (RPL5),它们与5S rRNA一起形成稳定的三聚体复合物,结合并抑制MDM2,导致p53稳定和随后的p53介导的细胞周期停滞或凋亡22,23,24.

鉴于核糖体生物发生在癌细胞生长中的重要性,已经开发了高效的第一类Pol I抑制剂,如CX-5461和BMH-21,以阻断rRNA合成并稳定p5325,26。这些抑制剂具有稳定p53而不诱导严重DNA损伤的优点,这优于主要的基因毒性化疗。令人惊讶的是,尽管核糖体生物发生对所有细胞类型都很重要,但CX-5461的单药治疗已被证明对p53野生型血液恶性肿瘤比p53野生型实体瘤更有效25,27,28,29。值得注意的是,CX-5461已显示出对选定的实体瘤细胞系具有抗肿瘤活性30。然而,由于缺乏证明体内靶向药物活性(前rRNA耗竭,p53稳定)的数据,尚不完全清楚抗肿瘤活性是由于靶向效应还是继发效应。

在这里,我们报告营养剥夺严重损害前rRNA加工,并导致未加工rRNA的积累。在营养物再补料时,蛋白质合成恢复,新合成的核糖体蛋白质(包括uL5/uL18)与储存的前rRNAs结合用于核糖体装配。在营养缺乏的情况下不能积累前rRNAs导致细胞致死性p53稳定,这是由uL5/uL18介导的MDM2抑制引起的。我们还表明,uL5/uL18对p53的激活依赖于谷氨酰胺的可用性。谷氨酰胺通过激活Ras/Raf/MEK/ERK信号传导介导未装配uL5/uL18的产生,这抑制eEF2K以允许整体eEF2介导的翻译。我们的研究将前rRNA积累确定为一种机制,通过这种机制,细胞在环境养分可用性波动期间保持存活。最后,我们发现谷氨酰胺的缺乏阻止了rRNA合成抑制剂对p53的激活,这强烈表明谷氨酰胺缺乏的实体瘤对靶向Pol I的小分子表现出固有的抗性。

结果

营养剥夺上调前rRNA表达

我们首先试图通过Pol I了解营养应激如何影响前rRNA合成速率。我们使用5-氟尿苷(5FU)标记试验来测量新生前rRNA合成(见“方法”)。5FU是掺入新生RNA的核苷类似物,然而,由于大多数新合成的RNA是前rRNA,5FU标记主要发生在核仁中(补充图。1a).值得注意的是,该试验测量前rRNA合成的速率(。Pol I活性)而不是总的前rRNA表达。为了研究营养应激,一组细胞系(结肠直肠HCT116、黑色素瘤A375、肺腺癌A549、骨肉瘤U2OS、胃MKN45)在缺乏葡萄糖、氨基酸和血清的培养基中培养。饥饿24小时后,用5FU脉冲细胞并进行免疫荧光处理。在所有测试的细胞系中,营养剥夺(ND)显著抑制5FU掺入(图。1a).因此,Pol I介导的前rRNA合成被代谢应激取消。

图1:营养剥夺上调前rRNA表达。
figure 1

a营养剥夺下的5FU标记(24小时)。癌细胞系在ND(-葡萄糖-氨基酸FBS)下培养24小时,通过5FU代谢标记测量前rRNA合成。数据代表三幅图像的平均值±SD。P值(从左到右):< 0.0001,2 × 10−4, <0.0001, <0.0001, 0.0001 (p < 0.001; p < 0.0001, statistical analysis by two-way ANOVA). Scale bar, 10 μm. brRNA前处理示意图。47S加工产生成熟为18S、28S和5.8S rRNAs的中间前体。初级47S前rRNA包含两个外部转录间隔区(5’ETS和3’ETS)和两个内部转录间隔区(ITS1和ITS2)。c左:使用northern印迹(ITS1探针)在用CX-5461或ND处理的HCT116中的前rRNA表达。右图:响应CX-5461(10 M) /ND的47S/45S和30S中间体的定量完整的northern印迹显示在补充图中。1b. d左:使用northern印迹(ITS1探针)在用CX-5461或ND处理的3T3-L1细胞中的前rRNA表达。右图:根据CX-5461/ND对47S/45S和34S中间体进行定量。完整的northern印迹显示在补充图中。1c. eCX-5461 (10 M,8 h)暴露后前rrna(47S/45S/30s物种)的表达。数据代表平均值±标准差n= 5次技术复制。P值(从左到右):< 0.0001、< 0.0001、< 0.0001、< 0.0001(p < 0.0001, statistical analysis by one-way ANOVA). f使用qRT-PCR评估24小时后HCT116、A549、U2OS和MKN45细胞中前rrna(47S/45S/30S物种)的表达。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。P值(从左到右):0.0132,0.0213,0.0115,0.0040(p < 0.05; p < 0.01, statistical analysis by two-way ANOVA).

我们接下来测试了ND对每个前rRNA物种表达的影响(图。1b).HCT116细胞接受ND处理24小时,通过northern印迹分析前rRNA表达。Pol I抑制剂CX-5461用作抑制前rRNA合成的阳性对照。正如所料,CX-5461在2小时内迅速耗尽了所有前rRNA中间体的表达(图。1c).这种急性效应是由于前rRNAs的半衰期短(约30分钟),而这又是由快速加工引起的30。令人惊讶的是,尽管ND对前rRNA合成有抑制作用,但大前体(47S,45S)的表达在24小时ND后并没有减少(图。1c).ND还诱导下游30S物种的强烈上调约两倍(图。1c).其他前体(21S,18S-E)在ND处理24小时后轻微下调,但没有降低到在CX-5461处理的细胞中观察到的程度(图。1c,补充图。1b).类似地,在小鼠3T3-L1成纤维细胞中,ND不影响47 S/45S水平,并上调34S中间体(相当于人类30S)(图。1d).总之,这些结果表明在ND条件下抑制前rRNA合成不会导致前rRNA表达降低。

我们接下来使用qRT-PCR来定量ND对前rRNA水平的影响。假设30 S中间体被ND上调(图。1c),我们选择了测量47S、45S和30S前体总丰度的引物。这些引物跨越前rRNA的5′-外部转录序列(5′ETS)的切割位点结合(补充图。1d).CX-5461显著降低前rRNA表达(图。1e).相反,24小时ND显著上调HCT116、A549和MKN45细胞中的前rRNA水平(图。1f).

前rRNA加工在ND下受损

我们假设ND下rRNA前体水平上调是rRNA前体加工受损的直接结果。我们用了L-(甲基-3h)-甲硫氨酸代谢标记试验来评估前rRNA加工31。对照和ND HCT116细胞用L-(甲基-3h)-甲硫氨酸30分钟,然后用过量的冷甲硫氨酸追赶(图2a).L-(甲基-的成熟3在对照细胞中,大前体(47S,45S)和下游中间体(32S,30S)的表达随时间快速下降,表明这些前体代谢成成熟的18S/28S rrna(图。2a).相反,钕导致47S、45S、32S和30S前体的大量积累(图。2a),证明这些中间体没有成熟为18S/28S rrna。因此,18S和28S rRNAs的产生在nd下受到严重损害(图。2b).值得注意的是,将非必需氨基酸谷氨酰胺单独添加回饥饿细胞中,完全挽救了18S和28S rRNA的产生(图。2b).这表明在营养恢复过程中,积累在ND下的未加工rRNAs被用于核糖体生物合成。

图2:前rRNA加工在ND下受损。
figure 2

a对照或ND HCT116细胞中前rRNA加工动力学分析。经3.5小时ND预处理的HCT116细胞随后用L-(甲基-3H)-甲硫氨酸脉冲标记30分钟,并用过量的冷甲硫氨酸追赶。为了评估营养物恢复对在ND下积累的前rRNAs的影响,在冷甲硫氨酸追逐后2 h,将Gln加回到ND培养基中(“ND + Gln”)。b图1中28S/18S带的定量分析。1f(如红色三角形所示)。2 h时间点的黑色箭头表示向饥饿(ND)细胞中加入谷氨酰胺的时间。c使用qRT-PCR评估,ND增加rRNA前半衰期(λ)。将HCT116细胞用(24小时)ND预处理,用(20米)放线菌素D终止转录,并在指定的时间点提取总RNA用于qRT-PCR分析。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。P数值(从左到右):0.006,0.0007,3.2 × 10−6 (p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001). dND减缓A375、A549、U2OS和MKN45细胞中前rRNA的加工。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。P数值(从左到右):A375,0.00081,7.2 × 10−6,A549,0.0035,9.4 × 10−5,U2OS,0.0015,0.0031,MKN45,0.00025,0.00031(p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001). e使用qRT-PCR测定的HCT116肿瘤前rRNA半衰期。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。f放线菌素D (1.33 mM)瘤内注射后HCT116肿瘤中前rRNAs、18S和28S的表达。数据代表平均值±标准差n= 4次技术复制。P数值(从左到右):6.5 × 10−5,0.20,0.12 (ns,不显著;p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001). g已建立的HCT116肿瘤的核心和外围区域的示意图(大小约为1000 mm3). h使用蛋白质印迹法评估HIF-1α在HCT116外周和核心组织中的表达。i如使用qRT-PCR所确定的,与核心组织相比,外周组织中的前rRNA加工更快。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。P值(从左到右):0.046,0.00064,0.00016(p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001).

为了严格证实ND减缓前rRNA加工,我们使用qRT-PCR和5’ETS引物测量了前rRNA半衰期(补充图。1d).使用放线菌素D (20微米)阻断对照和ND HCT116细胞中的转录,并在1小时内监测前rRNA表达(见“方法”)。在对照HCT116细胞中,rRNA前半衰期约为28分钟,而经历ND的细胞显示出明显更长的半衰期78分钟(图。2c).类似地,在A375、A549、U2OS和MKN45细胞中,ND显著增加rRNA前半衰期至少两倍(图。2d).

实体瘤的微环境严重缺乏营养,血管化不充分7。因此,我们试图估计前rRNAs在体内的半衰期。为了研究这一点,我们将高浓度的放线菌素D溶液(1.33 mM)直接注射到HCT116肿瘤中,以急性停止转录。注射后,发现肿瘤组织含有> 100微米放线菌素D,表明药物充分扩散(补充图。1e).此外,由于Pol I转录的抑制导致核仁蛋白转移到核质,这一过程称为核仁破坏32,33我们评估了核仁素在肿瘤冰冻切片中的定位。事实上,对照肿瘤显示了许多完整的核仁素阳性核仁,但放线菌素D治疗的肿瘤显示胞质中的核仁素染色(补充图。2a).接下来,为了评估前rRNA在体内的稳定性,用放线菌素D瘤内注射HCT116肿瘤并在8小时内收集组织。从组织中提取RNA并通过qRT-PCR分析前rRNA表达。肿瘤前rRNAs的半衰期约为3.8小时(图。2e).此外,放线菌素D对18S和28S表达没有显著影响(图。2f).其次,由于已经表明实体瘤的核心与外围相比营养消耗更严重34,我们推断核心肿瘤细胞将显示比周围细胞更慢的前rRNA加工动力学。为了测试这一点,大的HCT116肿瘤(> 1000 mm3)注射放线菌素D,并解剖外周和核心组织以分别在高或低营养条件下分化肿瘤细胞(图。2g)34。核心组织表达较高水平的HIF-1α,与实体瘤核心区域缺氧的概念一致(图。2h).此外,代谢组学分析显示,核心组织的几种代谢物水平明显较低,包括谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸和组氨酸(补充图。2e).最后,与我们的假设一致,外周前rrna的半衰期为3.5小时,而核心前rrna的半衰期明显更长,为8.3小时(图。2i).

rRNA前积累是对营养恢复的适应性反应

因为在营养(谷氨酰胺)反馈期间,ND下积累的前rRNAs被用于核糖体生物合成(图。2b),我们假设前rRNA积累可能对营养恢复期间核糖体装配的恢复很重要。为了解决这个问题,我们测试了在ND条件下抑制前rRNA表达是否会导致代谢恢复过程中核糖体装配紊乱。首先,为了防止前rRNA积累,将HCT116或A375细胞置于ND下,用赋形剂、CX-5461或BMH-21(第二种Pol I抑制剂)共同处理。用CX-5461或BMH-21抑制前rRNA合成有效地阻断了ND下前rRNA的积累(图。3a).值得注意的是,ND单独引起大量细胞死亡,但这并没有因CX-5461或BMH-21联合治疗而加剧(图。3b).接下来,为了诱导代谢恢复,将“前rRNA耗尽”细胞(ND + CX-5461或ND + BMH-21)转移到无药物的营养丰富的培养基中8小时(图。3c).通过评估未装配核糖体蛋白的表达来评估核糖体装配的保真度,未装配核糖体蛋白在有缺陷的核糖体生物发生时积累35。为了评估无核糖体蛋白质,使用蔗糖缓冲超速离心去除蛋白质裂解物中的大核糖体,并通过蛋白质印迹分析所得的无核糖体裂解物(图。三维(three dimension的缩写)).我们重点研究了关键核糖体蛋白uL5(以前称为RPL11)和uL18 (RPL5)的表达,因为这两种蛋白已被证明在核糖体生物合成受损时特异性积聚在无核糖体部分35。在接受营养恢复(NR)的ND载体细胞中未检测到无核糖体uL5/uL18,表明新翻译的uL5/uL18在代谢恢复期间有效地整合到核糖体中(图。3e).相反,未装配的uL5/uL18在经历NR的前rRNA缺失细胞(ND + CX-5461)中表达(图。3e).这表明这些核糖体蛋白没有整合到核糖体中。此外,用环己酰亚胺(CHX)终止翻译防止了未装配uL5/uL18的积累(图。3e).这与提出的模型一致,即未装配的uL5/uL18的积累需要持续的蛋白质合成35。我们进一步评估了受干扰的核糖体装配是否与核仁破坏有关。事实上,核仁素存在于暴露于NR的rRNA缺失前细胞的核质中,而染色仅限于对照组细胞的核仁(补充图。3a).

图3:前rRNA积累是对营养恢复的适应性反应。
figure 3

a用载体处理后的前rRNA表达(NaH24),CX-5461 (10米),或BMH-21 (1米)在24小时内。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。P数值(从左到右):HCT116,< 0.0001,< 0.0001,A375,< 0.0001,< 0.0001,采用双向ANOVA进行统计分析。b在对照或含载体(NaH)的ND培养基中培养的HCT116细胞中的细胞死亡百分比24),CX-5461 (10 M)或BMH-21 (1 M),如使用台盼蓝排斥试验所评估的。数据代表平均值±标准差n= 3次生物复制。(ns:不显著)。P数值(从左到右):ND,< 0.0001,< 0.0001,采用双向ANOVA进行统计分析。c显示ND和营养恢复(NR)处理的示意图。为了抑制前rRNA的表达,首先将HCT116或A375细胞置于有载体、CX-5461或BMH-21存在的ND下。用ND + CX-5461 (10 M)/ND + BMH-21 (1 M)预处理的细胞代表“前rRNA-耗尽”细胞。为了诱导代谢恢复,用PBS洗涤预饥饿的细胞三次,并使其在无药物的DMEM (10% FBS)中静置。d为了评估无核糖体蛋白的表达,使用蔗糖缓冲超速离心澄清输入裂解物中的大核糖体。使用蛋白质印迹分析所得的不含核糖体的裂解物。e代谢恢复的HCT116细胞中无核糖体r蛋白的表达。fNR诱导rRNA缺失前的HCT116和A375细胞死亡。在NR 24小时后拍摄代表性的显微镜图像。比例尺,100 μmg使用台盼蓝排斥试验测定的代谢恢复细胞的细胞死亡百分比。数据代表平均值±标准差n= 3次生物复制。P-值(从左到右):HCT116,< 0.0001,< 0.0001,A375,< 0.0001,< 0.0001,通过双向ANOVA进行统计分析。hNR诱导rRNA缺失前细胞的凋亡,这被泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-FMK (1 M)抑制。i在CX-5461 (10 M)/BMH-21 (1 M)药物洗脱和NR后,rRNA前体合成恢复。数据代表平均值±标准差n= 3个独立的图像。P数值(从左到右):0.077,0.0422,用双向ANOVA进行统计分析。比例尺,10 μm。用于a, b, g, i,ns,不显著;p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001.

为了评估核糖体装配受损的后果,将去除了前rRNAs的细胞暴露于延长的NR (24小时),并使用光学显微镜初步评估细胞恢复。饥饿对照(ND +载体)HCT116和A375细胞在NR后恢复增殖,如汇合增加所示。与此形成鲜明对比的是,暴露于NR的饥饿的前rRNA耗尽的细胞没有恢复增殖,并且进一步表现出凋亡的特征,例如细胞尺寸减小和形态变圆(图。3f).台盼蓝排斥试验揭示了经历NR的前rRNA缺失细胞中细胞死亡的深度水平,但对照细胞中没有(图。3g).裂解的胱天蛋白酶-3和PARP的存在表明NR介导的细胞死亡是凋亡,其检测通过加入泛胱天蛋白酶抑制剂zVAD-FMK而消除(图。3h).此外,我们观察到前rRNA缺失的细胞在NR上恢复前rRNA合成(图。3i),表明CX-5461和BMH-21的作用是可逆的。综上所述,这些结果表明,在ND条件下未能积累前rRNAs导致NR期间核糖体亚单位装配紊乱和细胞凋亡。

核仁监视驱动NR介导的细胞凋亡

核糖体装配的破坏导致未装配的uL5/uL18积聚并以抑制方式与MDM2结合,导致p53的稳定和p53依赖性凋亡的激活22,23,24,25,35,36,37。被称为核仁监视途径,我们假设这种模式的细胞死亡是NR诱导rRNA缺失前细胞凋亡的主要机制。与此一致,接受NR处理的前rRNA缺失(ND + CX-5461/ND + BMH-21)细胞积累了高水平的p53,而这在饥饿的载体(ND +载体)细胞中没有观察到(图。4a,补充图。3b).值得注意的是,p53在ND + CX-5461或ND + BMH-21下不稳定,可能是由于uL5/uL18翻译减少(补充图。3c).我们接下来免疫沉淀MDM2来评估相关uL5/uL18的表达。MDM2在对照ND细胞中检测不到,但在暴露于NR的前rRNA缺失细胞中上调(图。4b).这种上调是由于MDM2是p53的下游转录靶标。重要的是,在前rRNA缺失的细胞中,MDM2的沉淀显示高水平的免疫共沉淀uL5/uL18(图。4b).

图4:核仁监视驱动NR介导的凋亡。
figure 4

a使用蛋白质印迹法评估NR诱导rRNA缺失前HCT116细胞中的p53。bp53、uL5和uL18与MDM2的免疫共沉淀。csiRNA对uL5和uL18的双重敲低抑制了NR介导的p53和凋亡标记的激活。dNR诱导HCT116 p53+/+细胞凋亡,但不诱导p53-细胞凋亡。e使用膜联蛋白V-PI流式细胞仪测定,NR诱导rRNA缺失前的HCT116 p53+/+细胞凋亡,但不诱导HCT 116 p53-细胞凋亡。数据代表平均值±标准差n= 3次技术复制。P值(从左到右):p53+/+,7.6 × 10−7, 7.9 × 10−5、p53、< 0.0001、< 0.0001 (ns,不显著;p < 0.0001, statistical analysis by two-way ANOVA). f(I)rRNA前体中间体在营养缺乏的癌细胞中积累。同时,ND抑制全局mRNA翻译。营养添加(NR)后,积累的前rRNAs被新翻译的uL5和uL18结合,进行核糖体装配。(II)用CX-5461 (1 M)治疗防止癌细胞在ND下积累前rRNAs。NR后,在缺乏内源性前rRNAs的情况下,uL5和uL18结合MDM2,导致p53稳定和营养诱导的凋亡。

我们接下来测试了损害uL5/uL18依赖的核仁监视通路是否可以减轻NR介导的凋亡。因此,我们使用两组独立的siRNAs对uL5和uL18进行了双重敲除,并评估了p53和凋亡标记的激活。uL5和uL18的双重缺失完全阻断了p53的稳定,并大大减少了PARP和Caspase 3的裂解(图。4c).同样,uL5和uL18的双重敲除也降低了A375和A549细胞中NR介导的p53活化(补充图。三维(three dimension的缩写)).单独沉默uL5或uL18也强烈抑制p53(补充图。3e).使用p53野生型或敲除的HCT116细胞获得了对p53在NR介导的凋亡中的作用的进一步支持。与野生型细胞相比,暴露于NR的rRNA前缺失的HCT116 p53细胞表现出较低水平的凋亡,如凋亡标记物和膜联蛋白V染色活性降低所示(图。4d,e).最后,靶向p53或PUMA(p53的下游效应子)的siRNAs也强烈减轻了HCT116和A375细胞中NR诱导的凋亡(补充图。4a–c,5a).

总之,这些数据表明,癌细胞在饥饿状态下积累未加工的rRNAs,以逃避营养物再供给过程中p53介导的凋亡(图。4f).饥饿期间积累的前rRNAs在代谢恢复时用于核糖体生物合成(参见脉冲追踪标记图)。2a,b).饥饿状态下未能积累前rRNAs导致未装配的uL5/uL18与MDM2结合,导致营养诱导的p53介导的凋亡(图。4f).

谷氨酰胺通过诱导uL5/uL18翻译代谢激活p53

p53通过核仁监视途径的激活需要uL5和uL18持续的从头蛋白质合成35,38。因此,p53的积聚作为活性uL5/uL18 mRNA翻译的替代标记。鉴于此,我们发现单独恢复谷氨酰胺就足以拯救rRNA缺失前的HCT116和A375细胞中的p53(图。5a,补充图。5b).相反,亮氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸的恢复对p53没有影响(补充图。5c).此外,uL5/uL18的双重敲除抑制了谷氨酰胺对p53的激活(补充图。5d).这些结果表明,谷氨酰胺通过诱导uL5/uL18蛋白合成,在rRNA前耗竭的细胞中代谢激活p53。最后,谷氨酰胺恢复也重新激活了mTORC1,如已知的mTORC1底物S6K (Thr 389)磷酸化的增加所示(图。5a).这一发现与谷氨酰胺在激活mTORC1中的作用一致39,40。这促使我们研究mTORC1是否是p53代谢稳定所必需的。为了测试这一点,在雷帕霉素或Torin1(两种高效和特异性的mTORC1抑制剂)存在下,将rRNA前缺失的细胞重新喂食谷氨酰胺。然而,雷帕霉素或Torin1对p53没有抑制作用(图。5b).因此,我们想知道调节蛋白质合成的其他途径,如Ras/Raf/MEK/ERK信号级联,是否可以调节谷氨酰胺介导的uL5/uL18的合成。为了支持这一点,谷氨酰胺修复拯救了rRNA缺失前A375细胞中的MEK和ERK磷酸化(图。5c).为了测试p53的代谢稳定性是否依赖于Raf/MEK/ERK信号传导,将预先rRNA缺失的细胞重新喂食谷氨酰胺和泛Raf抑制剂LY3009210 (400 nM)或AZ628 (500 nM)。引人注目的是,两种pan-Raf抑制剂都阻断了谷氨酰胺对p53的激活(图。5d).正如所料,LY3009210或AZ628治疗强烈降低ERK和MEK磷酸化(图。5d).

图5:谷氨酰胺通过诱导uL5/uL18翻译代谢激活p53。
figure 5

a通过蛋白质印迹评估,谷氨酰胺(gln)激活rRNA前体缺失的HCT116细胞中的p53。HCT116在含有载体(NaH)的ND培养基中培养24),CX-5461 (10 M)或BMH-21 (1 M)培养24小时。24小时后,用含有PBS或Gln (4 mM)的ND培养基替换旧的处理培养基8小时b用雷帕霉素(1 M)或Torin1 (1 M)抑制mTORC1不会降低谷氨酰胺对p53的稳定作用。c谷氨酰胺恢复拯救rRNA缺失前A375细胞的MEK和ERK磷酸化。d用LY3009210 (400 nM)或AZ628 (500 nM)抑制Raf抑制了谷氨酰胺(gln)对p53的代谢活化。e示意图:谷氨酰胺恢复激活Ras/Raf/MEK/ERK信号,抑制eEF2K。抑制eEF2K后,eEF2保持其活性形式以促进整体蛋白质合成(包括uL5/uL18翻译)。Raf/MEK/ERK的药理学抑制导致eEF2k激活,进而磷酸化和灭活eEF2。f抑制MEK (10 M U0126,50 M PD98059)或ERK (1 M LY3214996,0.1 M GDC-0994)抑制谷氨酰胺(gln)对p53的代谢激活。g抑制Raf (400 nM LY3009210)、MEK (10 M U0126)和ERK (1 M LY3214996)抑制A375细胞中谷氨酰胺(gln)对p53的代谢激活。h多聚体结合的r蛋白mRNAs的表达。将HCT116细胞置于ND下24小时。24小时后,用含有4 mM Gln、LY3009210 (400 nM)或Gln + LY3009210的ND培养基替换旧的处理培养基。通过在40%蔗糖缓冲液上超速离心收集多聚体,提取总RNA并使用qRT-PCR分析uL5、uL18、uL23和S3。数据代表平均值±标准差n= 4次技术复制。P-值(从左到右):uL5、< 0.0001、0.0003、< 0.0001、uL18、< 0.0001、0.0052、uL23、< 0.0001、0.0003、< 0.0001、S3、< 0.0001、< 0.0001、< 0.0001(p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001, statistical analysis by two-way ANOVA).

我们接下来试图了解ERK信号对uL5/uL18翻译的潜在调节作用。假定mTORC1主要调节翻译起始41,且mTORC1抑制不抑制p53(图。5b),我们推断ERK可能通过翻译的延伸步骤调节uL5/uL18。事实上,在非应激细胞中,ERK通过抑制真核延伸因子-2激酶(eEF2K)促进mRNA翻译,eEF2K是蛋白质合成的关键负调节因子(图。5e)42,43。eEF2K抑制后,其下游靶真核延伸因子-2 (eEF2)保持其活性非磷酸化形式,以介导整体翻译延伸(图。5e)42,43。因此,我们假设uL5/uL18翻译依赖于ERK介导的eEF2激活(图。5e).因此,我们检测了eEF2磷酸化水平;磷酸化的eEF2 (Thr56)是失活形式,导致一般蛋白质合成的停滞42,43。用LY3009210或AZ628抑制Raf增加了饥饿对照组和rRNA缺失前细胞的eEF2磷酸化(图。5d).我们还测试了抑制下游激酶MEK和ERK是否会对eEF2和p53产生同样的作用。MEK (U0126,PD98059)或ERK (LY3214996,GDC-0994)的药理学抑制同样诱导eEF2磷酸化和p53抑制(图。5f).同样,在A375细胞中,Raf (LY3009210)、MEK (U0126)和ERK (LY3214996)的抑制完全阻断了p53的表达(图。5g).接下来,为了评估Raf抑制对uL5/uL18 mRNA翻译的影响,我们测量了翻译活性多聚体结合mRNA的表达(见“方法”)。ND单独降低了多聚体结合的uL5/uL18 mrna的比例(图。5h).重要的是,谷氨酰胺恢复拯救了uL5/uL18 mRNA翻译,但通过与LY3009210共孵育而被抑制(图。5h).与eEF2在一般mRNA翻译中的作用一致42,43,用uL23和S3多聚体结合的mRNAs观察到类似的效果(图。5h).

谷氨酰胺剥夺通过阻断核仁监视途径赋予癌细胞对RNA Pol I抑制剂的抗性

因为谷氨酰胺恢复稳定了前rRNA缺失细胞中的p53(图。5a),我们接下来测试了谷氨酰胺剥夺对CX-5461激活p53的影响。引人注目的是,谷氨酰胺的缺乏阻断了1微米CX-5461对p53的激活,而葡萄糖或其他氨基酸的缺乏没有影响(图。6a,补充图。6a).谷氨酰胺剥夺不会抑制MDM2抑制剂AMG 232对p53的稳定作用(补充图。6b).通过测量p21 mRNA证实了谷氨酰胺缺乏时p53转录活性的抑制(补充图。6c).p53的抑制不是由于uL5/uL18翻译的减少,因为谷氨酰胺的缺乏没有显著抑制uL5/uL18新生蛋白的合成(补充图。6d).有趣的是,在谷氨酰胺缺乏的情况下,1微米CX-5461不能降低前rRNA的表达(补充图。6e),然而,将剂量增加到10微米挽救了前rRNA抑制和p53激活(补充图。6f,g).在对照条件下,CX-5461导致uL5/uL18与MDM2免疫共沉淀,但在谷氨酰胺缺乏的条件下则没有(补充图。6小时).谷氨酰胺剥夺抑制了BMH-21和另外两种Pol I抑制剂CX-3543和放线菌素D对p53的激活(图。6b).谷氨酰胺剥夺也抑制A375、A549、U2OS、LNCaP和MKN45细胞中的p53(图。6c),并赋予HCT116细胞对CX-5461的抗性(图。6d)以及LNCaP和MKN45细胞(补充图。7a).葡萄糖剥夺,不抑制p53,不赋予CX-5461抗性(图。6d).谷氨酰胺剥夺下p53的过度表达挽救了CX-5461的生长抑制作用(补充图。7b).此外,用非基因毒性MDM2抑制剂AMG 232拯救p53也抑制了谷氨酰胺缺乏细胞的生存力(补充图。7c).

图6:谷氨酰胺剥夺通过阻断核仁监视途径赋予癌细胞对RNA Pol I抑制剂的抗性。
figure 6

a谷氨酰胺剥夺通过CX-5461治疗抑制p53的激活。HCT116细胞在各自的饥饿培养基中培养16小时,然后用CX-5461 (1 M)培养8小时b谷氨酰胺的缺乏抑制了BMH-21 (1 M)、CX-3543 (1 M)和ActD对p53的激活,如通过蛋白质印迹所评估的。c谷氨酰胺剥夺抑制A375、A549、U2OS、LNCaP和MKN45细胞中CX-5461 (1 M)对p53的激活。d如使用MTT试验所评估的,谷氨酰胺而非葡萄糖的剥夺赋予了对CX-5461 (1 M)的抗性。每个处理的数据点被标准化为各自的载体处理的代谢对照。数据代表平均值±标准差n= 6次生物复制。e通过蛋白质印迹评估,CX-5461对p53的激活在0.4 mM谷氨酰胺下被抑制。fCX-5461不能抑制HCT116肿瘤的生长。给小鼠口服赋形剂(NaH2PO4)、CX-5461 (50毫克/千克)或AMG 232 (50毫克/千克),每天一次,每周三次。在大约75 mm的肿瘤上植入后5天开始药物治疗3。数据代表平均值SEMn= 8只小鼠/组。P值:车辆/CX-5461,0.078,车辆/AMG 232,2.4 × 10−4 (p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001). gCX-5461不能急性稳定HCT116肿瘤中的p53。给小鼠IP注射赋形剂(NaH2PO4)、CX-5461 (50、100、200毫克/千克)或AMG 232 (50毫克/千克),8小时后收获肿瘤用于蛋白质印迹分析。(h)载体或药物IP给药后A375肿瘤中的p53 IHC染色。比例尺代表50米

由于被肿瘤细胞快速消耗,实体瘤含有低水平的谷氨酰胺34。因此,我们预测CX-5461在体内不能稳定p53。事实上,p53在0.4 mM谷氨酰胺下被抑制(图。6e),这大约是在肿瘤异种移植物中发现的谷氨酰胺浓度34。我们选择HCT116作为我们的模型细胞系,因为CX-5461已经显示在IC50为167 nM时有效抑制HCT116体外细胞增殖30。最高长期耐受剂量(50毫克/千克)的CX-5461的口服管饲未能显著抑制肿瘤生长(图。6f).我们使用AMG 232作为p53介导的肿瘤抑制的阳性对照。以与CX-5461相同的剂量和方案口服灌胃AMG 232 (50毫克/千克)显著抑制HCT116肿瘤生长(图。6f).此外,对HCT116肿瘤IP注射高达200 mg/kg的CX-5461不能激活p53,而AMG 232 (50 mg/kg)强烈诱导p53(图。6g).类似地,AMG 232而不是CX-5461稳定了A375肿瘤中的p53(图。6小时).这些结果表明,肿瘤谷氨酰胺缺乏通过阻断p53依赖的核仁监视途径而阻碍Pol I抑制剂的抗肿瘤活性。

讨论

实体瘤中不稳定的脉管系统导致营养有效性波动的组织微环境的发展7。驻留在这种环境中的肿瘤细胞通过抑制大量利用ATP的过程(如核糖体生物发生)来适应营养耗尽10,11,12,但营养恢复过程中细胞如何恢复仍有待阐明。在这里,我们报道了代谢应激的哺乳动物细胞积累未加工的rRNAs,以逃避营养应激终止时的核仁监视。我们首先观察到ND抑制前rRNA加工,导致营养缺乏细胞中前rRNA中间体的积累。在营养恢复时,恢复中的细胞恢复核糖体生物合成,并且在胁迫期间积累的前rrna转化为成熟rrna。在ND下未能积累前rRNAs的细胞在营养物再供给期间经历细胞致死性p53激活。从机理上讲,p53被未装配的uL5/uL18结合并抑制MDM2而激活。我们的数据表明,营养剥夺期间的前rRNA积累是一种应激适应,在营养可用性波动期间抑制uL5和uL18的MDM2结合活性。

在这篇手稿的制备过程中,据报道CX-5461对拓扑异构酶II具有额外的抑制活性44,45。由于我们使用CX-5461来抑制ND条件下的前rRNA积累,这给我们的论文带来了限制。我们通过在实验中使用BMH-21和CX-5461来解决这一限制。

我们进一步确定p53通过uL5/uL18依赖的核仁监视途径的激活依赖于外源性谷氨酰胺。在耗尽前rRNAs的预饥饿细胞中,重新喂食谷氨酰胺足以稳定p53,与uL5/uL18翻译的拯救相一致。令人惊讶的是,尽管已知mTORC1在5’顶端mRNAs(编码包括uL5和uL18在内的核糖体蛋白)的翻译控制中的重要性46,47雷帕霉素或Torin1处理不影响谷氨酰胺对p53的稳定作用。因为p53蛋白的积累是uL5和uL18合成的标志35,38这一观察表明uL5/uL18翻译不仅仅依赖于mTORC1。相反,我们发现药物抑制Raf/MEK/ERK完全阻断了p53的积聚。Raf/MEK/ERK抑制似乎通过灭活eEF2来阻止uL5和uL18的合成。总之,这些结果表明谷氨酰胺诱导的uL5和uL18的合成受到Ras/Raf/MEK/ERK-eEF2K-eEF2轴的促进。

最后,我们发现谷氨酰胺的剥夺通过阻断p53的稳定化而赋予对CX-5461的抗性。这一发现在体内得到了支持,其中CX-5461不能稳定p53,这可以解释对HCT116肿瘤生长几乎没有抑制作用,特别是考虑到报道的低谷氨酰胺肿瘤微环境34。与我们的发现一致,另一项研究观察到p53野生型HCT116肿瘤对CX-5461高度耐药48。尽管另一项研究表明HCT116细胞在体外对CX-5461非常敏感30。因此,这些结果表明,由于肿瘤谷氨酰胺缺乏,CX-5461对实体瘤的治疗效果有限。值得注意的是,谷氨酰胺剥夺没有减少uL5/uL18蛋白合成,表明p53抑制机制不依赖于uL5/uL18 mRNA翻译。总之,我们的数据表明,肿瘤谷氨酰胺缺乏通过阻断核仁监视途径而阻碍Pol I抑制剂的有效性。这些发现解释了为什么CX-5461的疗效与实体瘤类型中p53野生型状态无关。此外,这些结果可以解释为什么CX-5461对血液癌症高度有效25,27,28,29,其中不会发生严重的病理性营养缺乏。事实上,血浆谷氨酰胺浓度约为0.8 mM49这比在该研究中发现p53被抑制的浓度高两倍(图。4e).此外,由于核糖体生物发生的速率依赖于营养的可利用性,这意味着血液恶性肿瘤细胞比实体瘤细胞具有更高的核糖体生物发生速率,因此更易受Pol I抑制剂的影响。

总之,我们的研究揭示了一个压力适应程序,在营养有效性波动时抑制p53。未加工rRNAs的积累是一种关键的生存机制,饥饿的肿瘤细胞利用这种机制在营养恢复过程中完成代谢恢复。此外,实体瘤不会在Pol I抑制剂的作用下积聚p53,这可以解释为固有地缺乏谷氨酰胺,突出了肿瘤微环境的代谢状况如何能够深刻地影响对核仁功能破坏剂的治疗反应。


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