MYCN驱动的脂肪酸摄取是神经母细胞瘤的一个代谢弱点

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发表时间：2022-07-01 10:46作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

神经母细胞瘤(NB)是一种起源于交感-肾上腺神经嵴细胞的儿童癌症。MYCN在一半的高危NB患者中发现扩增；然而，没有直接针对MYCN的有效疗法。在MYCN表达系统和原发性患者肿瘤中使用多维代谢谱，我们全面描述了NB中由MYCN驱动的代谢景观。MYCN扩增通过促进脂肪酸(FA)摄取和生物合成导致甘油脂类积累。我们发现表达扩增的细胞MYCN生存高度依赖于FA吸收。机制上，MYCN直接上调FA转运蛋白2 (FATP2 ),由SLC27A2。的遗传损耗SLC27A2损害NB存活率和药理学SLC27A2在多个临床前NB模型中，当与常规化疗组合时，抑制选择性地抑制肿瘤生长，延长动物存活，并发挥协同抗肿瘤作用。这项研究确定FA摄取是一个关键的代谢依赖MYCN放大的肿瘤。抑制FA的摄取是改善目前治疗方案的有效途径。

介绍

神经母细胞瘤(NB)，一种交感神经系统的儿童实体瘤，占儿童癌症总死亡率的15%1。尽管采用了多模式治疗，高危NB患者的5年生存率仍低于50%1。几乎一半的高危NB患者都有扩增的MYCN癌基因，NB的主要致癌驱动因素，导致对治疗的抵抗和不良的临床结果2,3。多效性效应和酶活性的缺乏4使得直接靶向MYCN癌蛋白具有挑战性。因此，破坏MYCN癌基因编程的新策略对于开发有效的NB疗法是至关重要的。MYCN通过抑制缺氧诱导因子(HIF1α)介导的细胞周期停滞和促进肿瘤内血管发育来促进内部肿瘤区域的营养获取，从而促进NB在营养有限的复杂微环境中的生长5,6。然而，NB肿瘤MYCN重编程允许从微环境中补充营养的机制仍然未知。

与正常细胞相比，肿瘤细胞的代谢被重新编程，以促进生物量和能量的产生，从而支持细胞的快速生长7。这些代谢变化是由致癌刺激(如磷脂酰肌醇3-激酶[PI3K]–AKT–雷帕霉素复合物1的机制靶标[mTORC1])驱动的8,9，MYC10、和RAS11)，肿瘤抑制因子(p53)的缺失12和代谢酶失调(如异柠檬酸脱氢酶1，IDH1)13。在具有激活的MYC的肿瘤中，增加的生长需求通过代谢重编程来维持14，包括刺激葡萄糖和谷氨酰胺的消耗15,16，线粒体生物发生17以及脂类、蛋白质和核苷酸的生物合成18,19,20。MYCN似乎发挥类似的代谢功能，促进糖酵解21，脂肪生成22,23和谷氨酰胺的代谢21,24，丝氨酸25和多胺26以增强大分子生物合成和能量产生。然而，我们对如何做到这一点缺乏全面的了解MYCN-扩增肿瘤重新连接其代谢，以及如何将这些发现纳入新的治疗方法。为了填补这些知识空白，我们在主要患者样本和多种体外诱导系统中全面表征了MYCN驱动的代谢景观。

脂质作为膜成分、能量储存体和信号介质，在支持肿瘤存活中发挥重要作用27。甘油脂类，如二酰基甘油(DGs)，作为次级信使直接结合蛋白激酶C、RAS鸟苷酸释放蛋白和嵌合体来调节下游致癌信号28。DGs和脂肪酸(FAs)组装成三酰甘油(TGs)，储存在脂滴(LDs)中作为FA库。在营养缺乏的情况下，甘油三酯被水解，释放出脂肪酸来维持脂质稳态和满足能量需求(通过β-氧化)29。癌细胞通过内源性生物合成和从微环境中摄取来主动获得FAs27。内源性脂肪生成机制包括乙酰辅酶a的从头合成、FA去饱和和延伸。大量研究支持在肿瘤发生过程中新脂肪生成的作用27,30。我们和其他人已经证明，MYC或MYCN [MYC(N)]通过与Mondo A-甾醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)合作或直接激活关键脂肪生成酶的转录来促进FA合成，这些酶包括乙酰辅酶a羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(FASN)和硬脂酰辅酶a去饱和酶(SCD1)18,23,31。最近开发的FA合成抑制剂(例如ACC抑制剂ND-64632；FASN抑制剂TVB-2640和奥利司他22,33；和SCD1抑制剂A93957234)在临床前模型中显示出不同程度的抗肿瘤活性。然而，很少有进展到临床试验，包括TVB-2640 (NCT03808558、NCT03179904和NCT03032484)和奥利司他(非癌症试验)。这些抑制剂有限的临床疗效可能是由于有限的化合物特异性或由致癌信号(如HIF1α)介导的补偿性FA摄取机制的激活35，mTOR36、和RAS11。FAs通过细胞膜CD36 FA转位酶和FA转运蛋白(fat P1–6，由编码SLC27A1–6)并通过FA结合蛋白(fabp 1–12)在细胞内运输37。新的证据支持FA转运蛋白在肿瘤发生和化疗耐药中的作用。CD36促进前列腺癌生长和口腔癌转移38,39，并导致HER2阳性乳腺癌患者对拉帕替尼产生获得性耐药40。FATP1(SLC27A1)加速黑色素瘤起始，而FATP2(SLC27A2)通过促进从微环境中摄取FA来赋予黑色素瘤对BRAF和MEK抑制的抗性41,42。然而，MYC(N)调控FA转运在增殖、疾病进展和治疗抵抗中的潜在机制仍不清楚。

利用体外模型和患者样本中的非靶向代谢组学，我们表征了NB中MYCN驱动的代谢景观，并确定了与NB患者相关并适合治疗干预的关键代谢节点。我们发现MYCN促进了甘油脂类的积累，这一发现得到了多个系统的验证，并得到了靶向脂质组学研究的支持。脂肪酸是合成甘油脂类所必需的。我们发现MYCN增强FA的摄取以支持细胞存活。从机理上讲，我们确定了FATP2编码SLC27A2作为NB生长所需的新的MYCN转录靶标。通过靶向抑制脂肪酸摄取SLC27A2在多个临床前NB模型中阻断肿瘤生长，延长动物存活，并增强常规化疗的疗效。在MYCN推动的NBs中发现的这种代谢依赖性表明，靶向FA摄取代表了一种有希望的策略，可以改善目前高危疾病的治疗。

结果

MYCN重新编程铌代谢和促进甘油脂类积累

MYCN促进各种代谢适应，以支持肿瘤生长21,22,23,24,25,26,43,44。然而，这些适应是否与NB患者直接相关或者是否可以作为治疗干预的目标仍然不完全清楚。为了填补这一知识空白，我们进行了非靶向代谢组学(Metabolon Inc .，Discovery HD4™platform)在两种NB细胞系中，这两种细胞系具有受干扰的MYCN表达(LAN5 shMYCN和MYCN3 Tet-On)和NB原发性肿瘤(MYCN放大的n= 18;非MYCN放大的[非多边核方案]n= 18，补充数据1).在shMYCN模型中，在MNA LAN5细胞中，使用小发夹RNA (shRNA)介导的基因沉默(1 g/mL多西环素[DOX]0–96h)条件性敲除MYCN(KD)。在MYCN3 Tet-On模型(MYCN-ON)中，在非MNA SHEP亚克隆细胞中，MYCN被有条件地打开(1 g/mL DOX，0-72h )(图。1a、顶部和补充图。1a，左)。总共，在细胞和原发性肿瘤中分别分析了580和789种代谢物(补充数据2).不同模型中MYCN诱导的代谢变化呈现在路径分类网络中(图。1b).蓝色和红色圆圈表示明显下调和上调的代谢物(p≤ 0.05)。圆圈大小代表绝对对数2折叠变化(FC)。值得注意的是，MYCN不同程度地改变了脂质、氨基酸、碳水化合物和核苷酸超级途径中的代谢物水平(p≤ 0.05)，脂质代谢是最具代表性的类别(> 35%的差异代谢物，中值对数2FC > 0.56，补充图1a右侧和底部)。这些发现表明，MYCN在全球范围内重新编程NB代谢，特别是脂质代谢。

为了确定每个子通道的代谢变化，我们使用了差异丰度分析45进行三次比较(MYCN KD对CTRL，MYCN ON对MYCN OFF，多国行动对非多国行动)。丰度分数为100表明100%的子通路代谢物显著上调(p≤ 0.05)，而100分表示100%的子通路代谢物显著下调(p≤ 0.05).显著丰富的子通道(FDR < 0.25，Benjamini–hoch Berg调整p-值)用星号“*”标记。具有相同数量的“*”标记的子通道通过平均绝对差异丰度分数进行排序。值得注意的是，DG组是差异最丰富的途径，在所有三个系统中均由MYCN持续上调(差异丰度得分:MYCN KD = 25；MYCN ON = 70；MNA = 56图。1c).其他MYCN改变的子途径包括:磷脂(PL)，谷氨酸，内源性大麻素，蛋氨酸，半胱氨酸，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和牛磺酸代谢，以及磷脂酰胆碱(PC) (FDR < 0.25，图。1c和补充图。1b).为了进一步支持我们的发现，我们进行了基因富集分析(GSEA；图。1d和补充数据2).与非MNA患者相比，在MNA患者中DG是最丰富的子途径，并且在两个体外系统中均由MYCN诱导(FDR < 0.25，图。1d).多胺代谢在MNA患者中也上调，这与先前的研究显示MYCN激活多胺代谢一致26。脂肪酰基肉碱组在MYCN激活时高度富集，表明FA氧化的上调，但在其他系统中没有观察到富集。总的来说，这些结果表明MYCN改变了脂质代谢并促进了NB肿瘤中DGs的积聚。

为了具体评估MYCN诱导的脂质代谢变化，我们在LAN5 shMYCN、MYCN3 Tet-On细胞和SK-N-AS MYCN-ER中进行了靶向脂质组学研究™细胞，其中MYCN介导的转录被4-羟基他莫昔芬(4-OHT)条件性激活23。热图中显示了显著改变的脂质(FDR < 0.25，图。1e和补充数据3).所有的TGs(DGs的下游)在MYCN基因缺失时都显著下调(FDR < 0.25，图。1e左)，而大多数DGs和TGs在MYCN诱导后上调(FDR < 0.25，图。1e中右)。因为脂肪酸是甘油脂类合成所必需的，我们分析了三个系统中MYCN上调的甘油脂类的脂肪酸链组成。FA链14:0、16:0、16:1和18:1是最常见的(> 30%，补充图。1c)，表明这些FAs有助于甘油酯的合成。为了检测MYCN是如何改变脂肪酸组成的，我们应用质谱分析了MYCN3四核苷酸序列细胞和TH-MYCN中的脂肪酸组成+/+转基因小鼠，其中神经嵴特异性MYCN表达驱动重演人类疾病的自发性NB形成3。表达高MYCN水平的NB细胞和肿瘤也含有14:0、16:1或18:1的高水平(FDR < 0.25，补充图。1d–e)，表明MYCN上调这些脂肪酸合成甘油脂类。此外，MYCN将比率从14:1提高到14:0，从16:1提高到16:0(补充图一)。1d–e)，因此MYCN也促进FA去饱和。总之，这些结果表明MYCN改变了甘油脂类积累所需的FAs的丰度。

MNA细胞的存活高度依赖于FA的摄取

FAs可以在细胞中合成，也可以从微环境中输入。为了动态检测MYCN是如何调节脂肪酸合成的，我们加入了氘水(D2o)和[U-13C]16:0到SK-N-AS MYCN-ER™细胞培养基分别追踪从头FA合成和去饱和。MYCN激活(4-OHT作用24小时)通过增加氘标记的16:0促进FA从头合成，并通过增加[13C16]16:1对[13C16]16:0和[13C16]18:1对[13C16]18:0 (p < 0.05, Fig. 2a).为了确定MYCN对FA摄取的影响，我们追踪了补充有[13C16]16:0，哺乳动物细胞中最丰富的FA，作为摄取的指标。MYCN激活显著增强FA摄取(p < 0.05, Fig. 2a)，表明MYCN通过增强FA合成和摄取来促进脂质积累。这些发现在第二个MYCN系统(MYCN3 Tet-On细胞，p < 0.05, Supplementary Fig. 2a)，表明MYCN增强了细胞内FA对脂质合成的利用。

为了评估FA合成和摄取对细胞存活的影响，我们评估了NB细胞生存力[MNA: LAN5，IMR32，SK-N-BE(2c)；非MNA: SH-SY5Y，SHEP，SK-N-AS]和正常细胞(ARPE-19，C2C12和HS-5)经两种FA合成抑制剂(A939572，一种SCD1抑制剂和奥利司他，一种FASN抑制剂)处理后22,34或者两种FA摄取抑制剂(针对FATP2的CB16.2和CB5)46(图。2b).NB细胞对FA摄取抑制更敏感50:0.5–7.9米；非多国核集成电路50:1.4–10.4M)比FA合成抑制(MNA IC50:7.6–60.7米；非多国核集成电路50:9.2–77.5M)，提示NB细胞积极利用外源性FA存活。CB16.2对所有测试的正常细胞都是有毒的，尽管在NB细胞中具有最高的功效。相反，CB5在NB细胞中高度有效，并且不引发针对正常细胞的细胞毒性。MYCN增强SCD1活性(补充图。1d–e和2a)，而A939572抑制SCD1活性(p < 0.0001) and de novo FA synthesis (p < 0.05) in MNA cells (Supplementary Fig. 2b，左)。然而，SCD1抑制并不能有效地抑制细胞生长，并刺激来自培养基的补偿性剂量依赖性FA输入(p < 0.05; Supplementary Fig. 2b右)，表明外源FA摄取可能降低细胞对FA合成抑制的敏感性。为了验证这一假设，我们评估了MNA细胞在含和不含A939572的完全和去脂培养基中的存活力。去除外源性脂质显著增强了A939572的细胞毒性(IC50从41.0米到2.2米)，通过补充FAs得到部分挽救(补充图。2c).通过CB5对FA摄取的药理学抑制也增强了A939572 (IC50从39.3 M到0.4 M)和增加的细胞凋亡(p < 0.05, Supplementary Fig. 2d).这些结果表明，NB细胞输入外源性FAs作为逃避FA合成抑制的补偿机制。

为了确定MYCN驱动的FA摄取是否支持细胞存活，我们检测了三种MNA (LAN5，IMR32和SK-N-BE(2c))和两种非MNA (SHEP和SK-N-AS)细胞系和SK-N-AS MYCN-ER的生存能力™在完全和去脂培养基条件下有和没有MYCN活化的细胞。与非MNA和MYCN-ER对照细胞(4-OHT)相比，外源性脂质的剥夺更大程度地降低了MNA和MYCN-ER激活细胞(+4-OHT)的存活力(图。2c和补充图。2e).此外，补充FA部分恢复了MNA和MYCN ER激活细胞的活力(p < 0.05; Fig. 2c和补充图。2e)，表明外源性FAs支持MYCN驱动的细胞存活。类似地，脂质剥夺诱导MNA和MYCN ER激活细胞的细胞凋亡(图。2c和补充图。2e)，通过补充FA显著缓解(p < 0.05), suggesting that exogenous FAs selectively promote cell survival in MYCN-driven cells. Collectively, our data indicate that MYCN-driven cell growth depends on exogenous FAs.

FA传送器SLC27A2是MYCN的直接目标

为了进一步阐明MYCN是如何调节FA输入的，我们评估了细胞膜FA转运蛋白基因的表达(SLC27A1–6和CD36)在多个MYCN模型中。SLC27A2在SK-N-AS MYCN-ER中显著上调™MYCN激活后的细胞(48小时10倍，p= 0.0001，图。3a)和在MYCN诱导的MYCN3细胞中(p= 0.006，补充图3a).此外，SLC27A2是Tet-21/N细胞中MYCN关闭时唯一显著下调的转运蛋白(p= 0.01，图。3b)，暗示着SLC27A2是由MYCN有选择地管理的。

为了评估MYCN与膜FA转运蛋白启动子区域的结合(SLC27A1–6和CD36)，我们在MNA细胞和MYCN Tet-Off细胞(Tet-21/N)中进行了MYCN芯片qPCR分析。我们发现结合到启动子区域的MYCN显著富集(> 15倍)SLC27A2(chr15 [hg38]: 50，182，222-50，182，302)，其中包含MNA细胞中的非规范E盒(CAC ctg)(LAN 5和IMR32，补充图。3b–c和补充数据4).此外，关闭MYCN几乎完全废除了MYCN绑定。3c).然后我们问c-MYC是否也能结合到SLC27A2。在具有高c-MYC表达的SH-SY5Y NB细胞中的c-MYC芯片-qPCR分析显示，c-MYC与相同的启动子区域结合，但具有较低的亲和力(4倍富集；补充图3b–c).为了确定MYCN启动子结合是否导致基因转录，我们将一个下游荧光素酶基因融合到SLC27A1野生型和突变型SLC27A2，以及ODC1(一个已知的MYCN目标)47并评估荧光素酶活性。关闭MYCN大大减少了野生型SLC27A2融合荧光素酶活性(p= 0.01，补充图三维（three dimension的缩写）).然而，突变的非规范E盒(CACCTG到GAATTC)SLC27A2启动子消除了这种效应(补充图。三维（three dimension的缩写）)，暗示MYCN激活SLC27A2通过与该区域结合进行转录。虽然MYCN也绑定到SLC27A1启动子(图3c和补充图。3b)，没有变化SLC27A1当MYCN关闭时，检测到转录活性(补充图。三维（three dimension的缩写）).总之，我们的研究发现SLC27A2作为MYCN的直接转录靶标。

因为MYCN选择性上调SLC27A2表达，我们接下来问SLC27A2表达与...相关MYCNNB患者的表达、活性或扩增状态。SLC27A2表达与正相关MYCN表达和活性，如157个MYCN靶基因的总表达分数所示48 (p < 0.05, Fig. 三维（three dimension的缩写）)在大型患者群组(群组1:GSE45547, n= 649).相比之下，其他FA转运蛋白的mRNA水平并不相关。MYCN表情或活动，虽然CD36表达与c-呈正相关真菌学表情(p < 0.05, Fig. 三维（three dimension的缩写），左)。高表达SLC27A2也与MYCN放大(p= 8.1e−45)和第4阶段疾病(p < 0.01) (Fig. 三维（three dimension的缩写）)，并强烈预测所有阶段患者的不良总生存率(OS)和无事件生存率(EFS )( OS:p= 1.0e−8；EFS:p= 4.7e−6)和3-4期高危患者(OS:p= 2.7e−4；EFS:p= 4.2e−2，图。3e).与其他长链FA转运相关基因(去吧:0015909, n= 75),SLC27A2在预测不良临床结果方面排名第一(R2，图。3f，红点)。这些发现在第二个患者群组(群组2:GSE85047, n= 283，补充图。3e–g)，暗示着SLC27A2是NB存活的关键转运蛋白。探索瞄准目标的可能性SLC27A2，我们比较了SLC27A2三个NB队列中的mRNA表达(Lastowska，GSE13136, n= 30;你好，山，GSE16237, n= 51;韦尔斯泰格，GSE16476, n= 88)与正常组织群组(肾上腺，SN_ADGL, n= 13;神经嵴，GSE14340, n= 5;正常各种，GSE7307, n= 504包括108种正常组织；从同一个u133p2平台生成并由MAS5.0标准化的数据集)。中位数SLC27A2MNA患者的表达高于正常组织(补充图。3h)，暗示着SLC27A2可以作为NB的治疗靶点。

遗传和药理学抑制SLC27A2损害NB生存

确定…的影响SLC27A2关于细胞存活的表达，我们分析了789细胞系的存活结果SLC27A2使用CRISPR (Avana)公共20Q4V2数据集(美国布罗德研究所)进行敲除49。结果根据主要疾病进行分组，并使用依赖性评分进行排序。NB在30种原发疾病中排名第十(依赖性得分= 0.23)，表明NB细胞依赖于SLC27A2为了生存(补充图。4a).

确认是否SLC27A2是NB生存所必需的，我们基因枯竭了SLC27A2MNA LAN5细胞中通过shRNA介导的基因沉默(两个序列)(图。4a)，这表示基础率高SLC27A2水平(补充图。4b). SLC27A2LAN5细胞中的KD有效地减少FA摄取(p < 0.01, Fig. 4b)和受损的细胞生长(p < 0.0001, Fig. 4c)和菌落形成能力(p < 0.05, Fig. 4d)，暗示着SLC27A2是细胞生长所必需的。这种表型结果在第二个MNA细胞系(IMR32)中得到证实(补充图。4c)并对MNA细胞具有选择性SLC27A2非MNA细胞(SK-N-AS)中的损耗不影响FA摄取或细胞生长(补充图。4c).为了进一步研究SLC27A2是体内肿瘤生长所必需的，我们原位植入MNA LAN5 shCTRL和shSLC27A2细胞移植入NCr裸鼠。噪声抑制SLC27A2显著降低肿瘤生长(通过MRI成像评估，p= 0.048)和肿瘤重量(p= 0.01，图。4e–f).这些效果与肿瘤内中性脂质的显著减少有关(油红O染色，p= 0.003，图。第四代移动通信技术).此外，消耗SLC27A2肿瘤增殖减少(Ki67染色，p= 0.004，补充图4d)和增加的肿瘤凋亡(裂解的胱天蛋白酶-3染色，p < 0.0001, Supplementary Fig. 4e)而不改变MYCN的表情(p= 0.4，补充图。4f).shCTRL的脂质组学分析(n= 8)和shSLC27A2 (n= 8)肿瘤显示大多数DGs和TGs下调SLC27A2KD (FDR < 0.25，绝对FC > 2，图。4h和补充数据3)，证实了抑制作用SLC27A2的有效逆转MYCN诱导的甘油脂类积累。总的来说，这些数据表明SLC27A2是NB细胞存活和肿瘤生长所必需的。

药理学靶向FATP2(由编码SLC27A2)，我们使用了小分子FATP2抑制剂CB546，其引发针对NB细胞的选择性细胞毒性，但不伤害正常细胞(图。2b).我们首先通过稳定同位素示踪验证了CB5阻断NB细胞FA摄取的能力(补充图。2d)并用荧光标记的FA类似物BODIPY染色™C12 C1 500/510号。CB5优先阻断MNA LAN5细胞中的FA摄取(p < 0.05) compared with non-MNA SHEP cells (Fig. 4i).因为FATP2抑制剂CB16.2也抑制FATP1活性41，我们验证了CB5对FATP2的特异性。FATP1和FATP2的异位过表达增加了MNA细胞对FA的摄取。然而，CB5仅减少FATP2过度表达细胞的FA摄取(补充图。第四代移动通信技术)，提示CB5特异性针对NB中的FATP2。CB5在MNA细胞中比在非MNA细胞中更有效地抑制细胞活力并诱导凋亡(由胱天蛋白酶3/7活性确定),而不影响正常细胞(图。2b和4j)，表明靶向FATP2选择性损害MNA细胞存活。与非MNA SHEP细胞相比，在MNA LAN5和IMR32细胞中优先诱导切割的PARP和切割的Caspase-3表达(凋亡的标志)进一步支持了CB5的选择性(p < 0.05, Fig. 4k和补充图。5a).CB5也抑制MYCN，但不抑制c-MYC蛋白表达，支持MNA细胞的选择性靶向。p53及其下游靶标p21(Waf1/Cip1)在细胞周期、增殖和凋亡中发挥关键作用。MYCN放大。尽管MYCN可以直接上调p53作为MYCN诱导的细胞凋亡的机制50我们发现CB5增加了MNA细胞中p53和p21(Waf1/Cip1)蛋白的表达(p < 0.05, Fig. 4k和补充图。5a).因此，CB5抑制MYCN并激活p53信号，从而抑制细胞生长并促进细胞凋亡。

靶向FA转运有效抑制NB肿瘤生长

为了确定FA转运对肿瘤生长的贡献，我们在多个临床前NB模型中评估了CB5的抗肿瘤活性。我们将MNA LAN5荧光素酶表达细胞和非MNA SK-N-AS细胞原位植入NCr裸鼠的肾包膜中(图。5a).在肿瘤移植后，将小鼠随机分配到对照组(载体)或CB5组(25毫克/千克，每天两次)[英国国际发展银行。]、腹腔注射(知识产权。)治疗2周。通过荧光素酶活性测定，CB5显著抑制LAN5异种移植物的生长(p= 0.002)和肿瘤重量(p= 0.03，图。5b和补充图。5b).然而，CB5并没有减少SK-N-AS异种移植物的肿瘤体积和重量(图。5c和补充图。5c)，提示CB5优先抑制MNA肿瘤。值得注意的是，CB5治疗没有引起毒性，通过治疗期间小鼠一般临床状况和体重变化进行评估(补充图。5b–c).

TH-MYCN转基因模型是一种侵略性的MYCN诱导的从头NB模型3。为了评估CB5的抗癌活性，我们通过植入TH-MYCN产生了NB的原位同种异体移植物模型+/+肿瘤转移到NCr裸鼠中(图。5d).肿瘤在2周后发展，此时将小鼠随机分配到CTRL(载体)或CB5 (25 mg/kg，英国国际发展银行。)治疗组。在治疗第1天和第14天进行MRI以监测肿瘤生长。CB5显著减小了肿瘤体积(p= 0.006，图。5e和补充图。5d)和重量(p= 0.01，图。5f)在该模型中，并且在研究期间没有观察到毒性迹象(补充图。5d).此外，对CB5治疗有反应的小鼠显示出比对照组小鼠更低的中性脂质水平(p= 0.004，图。5g)，提示CB5阻断体内脂质堆积。这可能是由于CB5介导的对MYCN和MYCN靶向FA合成和转运蛋白表达的抑制(SCD1，ACC和FATP2补充图5d).两个肿瘤逃过了CB5治疗(图。5f).支持我们的发现，这些肿瘤没有表现出脂质抑制，并显示出MYCN激活和FA合成/转运活性的迹象(SCD1和FATP2，补充图。5d).

使用裸鼠作为临床前模型的一个警告是，它们缺乏免疫微环境。为了评估在完整的免疫微环境中阻断FA转运的有效性，我们制备了TH-MYCN+/+衍生的同系小鼠原位模型(图。5h)通过植入TH-MYCN+/+肿瘤进入野生型免疫活性129×1/svj小鼠的肾囊。2周后，用CTRL(载体)或CB5 (30 mg/kg，联邦调查局。)2周。CB5治疗阻断了肿瘤生长(图。5h, p < 0.0001) without apparent toxicity (Supplementary Fig. 5e)在这种模式下。为了评估在MNA NBs中阻断FA摄取的长期效果，我们使用了患者来源的原位异种移植模型(图。5i).将从原发性MNA期NB肿瘤(P0)制备的细胞植入NOG小鼠(P1)的肾被膜中。然后将肿瘤在NOG小鼠中转移到P4，在NCr裸鼠中转移到P6。在该模型中，肿瘤在植入后大约5周开始，小鼠在植入后8-10周死于疾病负担。我们询问通过长期CB5治疗阻断FA摄取是否可以预防MNA肿瘤发展并延长动物存活。CB5治疗在植入后2周当肿瘤尚未开始时应用。小鼠接受CTRL(赋形剂)或CB5 (25毫克/千克，英国国际发展银行., 知识产权。)6周，并通过MRI监测肿瘤生长。CB5不能阻止肿瘤的发生(图。5i).然而，慢性CB5治疗显著延长了动物存活(p= 0.004，图。5i)无明显毒性(补充图。5f)，表明阻断FA摄取可以抑制原发性MNA肿瘤生长并延长生存期。

靶向FA转运使NB对常规化疗增敏

脂质代谢升高促进对化疗的获得性抵抗。在成人模型中，靶向FA合成(FASN)、氧化(CPT1)或摄取(CD36)使癌细胞对化疗敏感40,51,52。因此，我们询问FATP2抑制是否增强了常规化疗的抗肿瘤活性，如用于诱导或复发治疗的依托泊苷(VP16，一种拓扑异构酶II抑制剂)或替莫唑胺(TMZ，一种DNA烷化剂)。我们首先评估了CB5和VP16或TMZ之间的协同作用，通过评估单一和组合处理条件下的细胞活力，使用Bliss模型指定协同作用分数(> 10表示协同作用)53。CB5与MNA细胞中的VP16和TMZ协同作用(图。6a和补充图。6a–b).此外，在MNA细胞中，与单一药物治疗相比，CB5 + VP16和CB5 + TMZ组合增加了胱天蛋白酶介导的凋亡(p < 0.05, Fig. 6b和补充图。6c)，表明这些联合疗法在以下情况下非常有效MYCN放大。

因为CB5 + VP16组合显示出有希望的体外协同效应，我们评估了该组合在MNA LAN5衍生的原位异种移植物中的抗肿瘤活性(图。6c).联合治疗(CB5: 15毫克/千克，英国国际发展银行., 知识产权。6天/周，VP16: 8毫克/千克，知识产权。3天/周)显著降低最终肿瘤重量(p < 0.0005, Fig. 6c).此外，CB5 + VP16显示出对肿瘤细胞增殖和凋亡的增强作用(p≤ 0.05，补充图。6d–e)与单独的CB5相比，没有进一步降低MYCN的表达(补充图。6f)且没有体重减轻或正常器官毒性的证据(补充图。6g).这些数据表明阻断FA转运有效地增强了肿瘤对VP16的反应。为了确定联合治疗对动物存活的长期影响，我们使用了MNA患者来源的原位异种移植模型(图。6d).对小鼠进行单一或联合治疗(CB5: 15 mg/kg，英国国际发展银行., 知识产权。6天/周，VP16: 6毫克/千克，知识产权。3天/周)持续5周。用CB5 + VP16联合疗法治疗的动物比接受单一药物疗法的动物存活时间明显更长(p < 0.05, Fig. 6d).没有治疗引起显著的体重减轻或毒性的临床症状(补充图。6小时).总之，我们的数据表明阻断MYCN诱导的代谢重编程有效地增强了常规化疗的抗肿瘤效果。

讨论

使用多种生物化学和分析方法，我们全面描述了NB肿瘤的代谢情况，并定义了MYCN扩增是不同代谢适应的主要驱动力。我们对不同模型的人类肿瘤和细胞系的代谢筛选和分析显示，MYCN诱导了甘油脂类的持续积累。甘油脂类作为第二信使激活下游致癌信号，并作为能量储存的FA库，防止支持肿瘤生长的毒性FAs积累29. MYCN诱导或扩增导致明显的甘油脂类信号，其主要特征是DGs的大量增加。FAs可以进入各种代谢途径，合成更复杂的脂质种类，包括DGs(TGs的前体)，有助于细胞脂质的结构多样性。MYCN可以直接调节甘油脂类的合成和降解，例如，通过上调二酰基甘油-酰基转移酶2 (DGAT2)在甘油三酯和LDs中储存过量的FAs(补充图。7).DGAT1和DGAT2催化酰基辅酶a与DGs酯化形成TGs54。尽管它们在肿瘤发生中的作用仍未被充分研究，但靶向DGAT1以阻断FA的储存在胶质母细胞瘤中诱导了严重的氧化应激55。未来的研究仍然需要阐明MYCN如何维持脂质稳态和保护NB细胞免受氧化损伤。在这里，我们表明靶向FA摄取有效抑制MYCN诱导的甘油脂类积累和肿瘤生长，表明FA转运对这些功能至关重要。

癌症组织显示出异常的从头脂肪生成的激活，并且FA生物合成途径中的酶的抑制可以阻断肿瘤生长30。FA生物合成除了调节对细胞存活至关重要的膜运输和信号通路(如磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和鞘脂)之外，还通过在营养耗尽期间提供生物膜和ATP合成的构件而促进癌症56,57。MYC(N)动态改变新的脂肪生成、脂质储存和β-氧化产生ATP。MYC(N)的抑制诱导LDs的形成，这是FA氧化受损的结果58。我们和其他人还发现MYC(N)促进FA生物合成和SREBP1的异常激活18在癌症中，包括NB22,23，对FA生物合成的遗传和药理学干扰阻断了MYC驱动的肿瘤生长18。此外，ACC或FASN抑制作用部分阻断了皮下NB模型中的癌症生长22。然而，这种方法的长期疗效和正常组织毒性仍不清楚。我们发现，通过SCD1抑制剂A939572抑制FA生物合成触发了FA的补偿性摄取，这表明当前体受限或FA合成受损时，NB细胞可以利用外源性脂质。我们证明了通过外源性脂质剥夺或药理学FATP2抑制来阻断FA摄取显著降低了MYCN诱导细胞的生存力，促进了细胞凋亡，并增强了对FA生物合成抑制的敏感性。这些影响可以通过补充FA而部分恢复，表明MYCN驱动的细胞依赖于FA的摄取而存活。对外源性FAs的依赖正在其他癌症中出现。在前列腺癌和黑色素瘤中，膜转运蛋白CD36和FATP1分别促进脂质积累和肿瘤进展38,41。此外，黑色素瘤细胞使用FATP2从老化的成纤维细胞获取脂质，从而对靶向治疗产生抗性42。在NB中，我们发现致癌的MYCN驱动FA摄取以维持肿瘤生长。通过筛选mRNA表达和MYCN与膜FA转运蛋白的结合，我们鉴定了FA转运蛋白基因SLC27A2(编码FATP2)作为NB存活所需的直接MYCN靶。SLC27A2NB患者中的表达与下列因素独特相关MYCN表情和活动。而且，高SLC27A2与其他FA转运蛋白相比，其表达强烈预示着较差的临床结果。总的来说，这些数据表明MNA NB依赖于SLC27A2-介导的FA摄取，制造SLC27A2高危疾病的有吸引力的治疗目标。

SLC27A2是NB存活所必需的，因为通过小分子抑制剂CB5的遗传干扰和药理学抑制都削弱了MYCN诱导的肿瘤生长。支持选择目标SLC27A2在NB中，正常细胞不受CB5治疗的影响，这表明了新的治疗机会的可能性。我们在多种MYCN诱导的临床前NB模型中证明了CB5的抗肿瘤活性，包括细胞系来源的原位模型、同种异体移植和同系移植模型以及患者来源的模型，表明FA的摄取通过SLC27A2代表了MYCN驱动的肿瘤的内在脆弱性，可以作为治疗的目标。SLC27A2也在免疫细胞中表达，如致癌的多形核白细胞髓源性抑制细胞，以及SLC27A2抑制阻断了这些细胞的免疫抑制活性，延缓了肿瘤的发展59。未来的研究仍然需要确定是否SLC27A2抑制也干扰免疫细胞功能及其代谢依赖性，从而抑制肿瘤生长。

MYCN诱导的耐药性限制了常规化疗的抗肿瘤效果，因此仍然是一个主要的临床障碍60。此外，代谢重编程和脂质代谢的改变也促进了获得性耐药27。增加的姊靛湥, CPT1B，以及CD36在癌症患者中表达与不良药物反应相关40,51,52。我们发现，针对一个关键的MYCN依赖的代谢脆弱性，FA摄取途径，强烈增强了抑制DNA合成的细胞毒性药物的临床活性，如VP16和TMZ。因为FA衍生的乙酰辅酶a可以为TCA循环提供燃料，生成核苷酸合成前体天冬氨酸61，我们推测抑制FA摄取可能会限制DNA合成的核苷酸储备。未来的研究需要测试FA摄取是否有助于FA氧化和核苷酸合成，并调查CB5和常规化疗之间观察到的协同作用的分子机制。