MYCN重新编程铌代谢和促进甘油脂类积累
MYCN促进各种代谢适应，以支持肿瘤生长21,22,23,24,25,26,43,44。然而，这些适应是否与NB患者直接相关或者是否可以作为治疗干预的目标仍然不完全清楚。为了填补这一知识空白，我们进行了非靶向代谢组学(Metabolon Inc .，Discovery HD4™platform)在两种NB细胞系中，这两种细胞系具有受干扰的MYCN表达(LAN5 shMYCN和MYCN3 Tet-On)和NB原发性肿瘤(MYCN放大的n= 18;非MYCN放大的[非多边核方案]n= 18，补充数据1).在shMYCN模型中，在MNA LAN5细胞中，使用小发夹RNA (shRNA)介导的基因沉默(1 g/mL多西环素[DOX]0–96h)条件性敲除MYCN(KD)。在MYCN3 Tet-On模型(MYCN-ON)中，在非MNA SHEP亚克隆细胞中，MYCN被有条件地打开(1 g/mL DOX，0-72h )(图。1a、顶部和补充图。1a，左)。总共，在细胞和原发性肿瘤中分别分析了580和789种代谢物(补充数据2).不同模型中MYCN诱导的代谢变化呈现在路径分类网络中(图。1b).蓝色和红色圆圈表示明显下调和上调的代谢物(p≤ 0.05)。圆圈大小代表绝对对数2折叠变化(FC)。值得注意的是，MYCN不同程度地改变了脂质、氨基酸、碳水化合物和核苷酸超级途径中的代谢物水平(p≤ 0.05)，脂质代谢是最具代表性的类别(> 35%的差异代谢物，中值对数2FC > 0.56，补充图1a右侧和底部)。这些发现表明，MYCN在全球范围内重新编程NB代谢，特别是脂质代谢。
图1: MYCN重组了NB的代谢。a使用UHPLC-MS/MS和GC-MS的非靶向代谢组学分析工作流程(Discovery HD4™platform，Metabolon Inc .)，在LAN5细胞(MYCN KD，0、72和96小时，n=各4个)、MYCN3细胞(MYCN开启0、48和72小时，n=各4个)，以及原发性肿瘤(MNA，n= 18;非多边核方案，n= 18).b代谢物分类网络。每个圆圈代表一种代谢物。圆圈大小表示绝对对数2比较MYCN KD 72小时与对照组、MYCN KD 72小时与MYCN KD 72小时与对照组、MNA与非MNA的代谢物水平的FC。红色=上调的代谢物；蓝色=下调代谢物(p≤ 0.05).单向方差分析或韦尔奇双样本t-测试用于比较各组之间的代谢物水平。c子通道内的代谢变化。比较组与(b).从包含至少三种测量的代谢物的子路径计算差异丰度分数。100或100 =子通道中的所有代谢物都上调或下调(p≤ 0.05).圆圈大小=差异改变的代谢物的数量(p≤ 0.05).*表示FDR < 0.25，超几何测试p-通过Benjamini-hoch Berg程序调整的值。d基于GSEA算法的途径富集分析。选择FDR < 0.25的子通道，并按对数排序10(罗斯福)。红色=上调的子通道；蓝色=下调子通道。eLAN5 shMYCN(对照组和MYCN KD持续72小时)、mycn 3[MYCN3关闭(-DOX)和MYCN-打开(+DOX)持续72小时]和SK-N-AS MYCN-ER的脂质组学分析™[MYCN-关闭(4-OHT)和MYCN-打开(+4-OHT)48小时]电池(n=每个4)。双边不成对t-测试；p-通过Benjamini-hoch Berg程序调整的值，以获得FDR。选择显著改变的脂质(FDR < 0.25)用于热图(颜色按比例表示Z-分数:红色=上调；蓝色=下调)。上调和下调脂质类别的百分比显示在堆积条形图中。DG二酰甘油、TG三酰甘油、PC磷脂酰胆碱、PE磷脂酰乙醇胺、PG磷脂酰甘油、PI磷脂酰肌醇、PS磷脂酰丝氨酸、CE胆固醇酯、plasmenyl。血浆基磷脂酰乙醇胺。KD击倒，MNAMYCN-放大的，非多边核方案非MYCN-放大了。源数据在源数据文件中提供。
为了确定每个子通道的代谢变化，我们使用了差异丰度分析45进行三次比较(MYCN KD对CTRL，MYCN ON对MYCN OFF，多国行动对非多国行动)。丰度分数为100表明100%的子通路代谢物显著上调(p≤ 0.05)，而100分表示100%的子通路代谢物显著下调(p≤ 0.05).显著丰富的子通道(FDR < 0.25，Benjamini–hoch Berg调整p-值)用星号“*”标记。具有相同数量的“*”标记的子通道通过平均绝对差异丰度分数进行排序。值得注意的是，DG组是差异最丰富的途径，在所有三个系统中均由MYCN持续上调(差异丰度得分:MYCN KD = 25；MYCN ON = 70；MNA = 56图。1c).其他MYCN改变的子途径包括:磷脂(PL)，谷氨酸，内源性大麻素，蛋氨酸，半胱氨酸，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和牛磺酸代谢，以及磷脂酰胆碱(PC) (FDR < 0.25，图。1c和补充图。1b).为了进一步支持我们的发现，我们进行了基因富集分析(GSEA；图。1d和补充数据2).与非MNA患者相比，在MNA患者中DG是最丰富的子途径，并且在两个体外系统中均由MYCN诱导(FDR < 0.25，图。1d).多胺代谢在MNA患者中也上调，这与先前的研究显示MYCN激活多胺代谢一致26。脂肪酰基肉碱组在MYCN激活时高度富集，表明FA氧化的上调，但在其他系统中没有观察到富集。总的来说，这些结果表明MYCN改变了脂质代谢并促进了NB肿瘤中DGs的积聚。
为了具体评估MYCN诱导的脂质代谢变化，我们在LAN5 shMYCN、MYCN3 Tet-On细胞和SK-N-AS MYCN-ER中进行了靶向脂质组学研究™细胞，其中MYCN介导的转录被4-羟基他莫昔芬(4-OHT)条件性激活23。热图中显示了显著改变的脂质(FDR < 0.25，图。1e和补充数据3).所有的TGs(DGs的下游)在MYCN基因缺失时都显著下调(FDR < 0.25，图。1e左)，而大多数DGs和TGs在MYCN诱导后上调(FDR < 0.25，图。1e中右)。因为脂肪酸是甘油脂类合成所必需的，我们分析了三个系统中MYCN上调的甘油脂类的脂肪酸链组成。FA链14:0、16:0、16:1和18:1是最常见的(> 30%，补充图。1c)，表明这些FAs有助于甘油酯的合成。为了检测MYCN是如何改变脂肪酸组成的，我们应用质谱分析了MYCN3四核苷酸序列细胞和TH-MYCN中的脂肪酸组成+/+转基因小鼠，其中神经嵴特异性MYCN表达驱动重演人类疾病的自发性NB形成3。表达高MYCN水平的NB细胞和肿瘤也含有14:0、16:1或18:1的高水平(FDR < 0.25，补充图。1d–e)，表明MYCN上调这些脂肪酸合成甘油脂类。此外，MYCN将比率从14:1提高到14:0，从16:1提高到16:0(补充图一)。1d–e)，因此MYCN也促进FA去饱和。总之，这些结果表明MYCN改变了甘油脂类积累所需的FAs的丰度。
MNA细胞的存活高度依赖于FA的摄取
FAs可以在细胞中合成，也可以从微环境中输入。为了动态检测MYCN是如何调节脂肪酸合成的，我们加入了氘水(D2o)和[U-13C]16:0到SK-N-AS MYCN-ER™细胞培养基分别追踪从头FA合成和去饱和。MYCN激活(4-OHT作用24小时)通过增加氘标记的16:0促进FA从头合成，并通过增加[13C16]16:1对[13C16]16:0和[13C16]18:1对[13C16]18:0 (p < 0.05, Fig. 2a).为了确定MYCN对FA摄取的影响，我们追踪了补充有[13C16]16:0，哺乳动物细胞中最丰富的FA，作为摄取的指标。MYCN激活显著增强FA摄取(p < 0.05, Fig. 2a)，表明MYCN通过增强FA合成和摄取来促进脂质积累。这些发现在第二个MYCN系统(MYCN3 Tet-On细胞，p < 0.05, Supplementary Fig. 2a)，表明MYCN增强了细胞内FA对脂质合成的利用。
图2: MNA细胞的存活依赖于FA的摄取。aSK-N-AS MYCN-ER中FA合成和吸收的稳定同位素示踪™含或不含4-OHT (500 nM)的细胞24、48和72小时。平均值±SD(n= 3);双边不成对t-每个时间点的测试。b用FA合成抑制剂(A939572，奥利司他)和FA摄取抑制剂(CB16.2和CB5)处理72小时后NB和正常细胞的存活力。集成电路50在GraphPad Prism (7.01)中计算。平均标准偏差(n= 3).c顶部，在完全培养基、去脂培养基和补充有0.025% FAs的去脂培养基中的细胞生存力。MNA:LAN 5(0-6天)、IMR 32(0-4天)和SK-N-BE(2c)(0-6天)；非多边核方案:SHEP(0-6天)和SK-N-AS(0-6天)。平均标准偏差(n= 3);采用Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。下图，完全培养基、去脂培养基和补充有0.025% FAs的去脂培养基中4天的胱天蛋白酶3/7活性。平均标准偏差(n= 3);采用Dunnett多重比较检验的单向ANOVA。FC折换，CM全媒体，DLM去脂化媒体。源数据在源数据文件中提供。
为了评估FA合成和摄取对细胞存活的影响，我们评估了NB细胞生存力[MNA: LAN5，IMR32，SK-N-BE(2c)；非MNA: SH-SY5Y，SHEP，SK-N-AS]和正常细胞(ARPE-19，C2C12和HS-5)经两种FA合成抑制剂(A939572，一种SCD1抑制剂和奥利司他，一种FASN抑制剂)处理后22,34或者两种FA摄取抑制剂(针对FATP2的CB16.2和CB5)46(图。2b).NB细胞对FA摄取抑制更敏感50:0.5–7.9米；非多国核集成电路50:1.4–10.4M)比FA合成抑制(MNA IC50:7.6–60.7米；非多国核集成电路50:9.2–77.5M)，提示NB细胞积极利用外源性FA存活。CB16.2对所有测试的正常细胞都是有毒的，尽管在NB细胞中具有最高的功效。相反，CB5在NB细胞中高度有效，并且不引发针对正常细胞的细胞毒性。MYCN增强SCD1活性(补充图。1d–e和2a)，而A939572抑制SCD1活性(p < 0.0001) and de novo FA synthesis (p < 0.05) in MNA cells (Supplementary Fig. 2b，左)。然而，SCD1抑制并不能有效地抑制细胞生长，并刺激来自培养基的补偿性剂量依赖性FA输入(p < 0.05; Supplementary Fig. 2b右)，表明外源FA摄取可能降低细胞对FA合成抑制的敏感性。为了验证这一假设，我们评估了MNA细胞在含和不含A939572的完全和去脂培养基中的存活力。去除外源性脂质显著增强了A939572的细胞毒性(IC50从41.0米到2.2米)，通过补充FAs得到部分挽救(补充图。2c).通过CB5对FA摄取的药理学抑制也增强了A939572 (IC50从39.3 M到0.4 M)和增加的细胞凋亡(p < 0.05, Supplementary Fig. 2d).这些结果表明，NB细胞输入外源性FAs作为逃避FA合成抑制的补偿机制。
为了确定MYCN驱动的FA摄取是否支持细胞存活，我们检测了三种MNA (LAN5，IMR32和SK-N-BE(2c))和两种非MNA (SHEP和SK-N-AS)细胞系和SK-N-AS MYCN-ER的生存能力™在完全和去脂培养基条件下有和没有MYCN活化的细胞。与非MNA和MYCN-ER对照细胞(4-OHT)相比，外源性脂质的剥夺更大程度地降低了MNA和MYCN-ER激活细胞(+4-OHT)的存活力(图。2c和补充图。2e).此外，补充FA部分恢复了MNA和MYCN ER激活细胞的活力(p < 0.05; Fig. 2c和补充图。2e)，表明外源性FAs支持MYCN驱动的细胞存活。类似地，脂质剥夺诱导MNA和MYCN ER激活细胞的细胞凋亡(图。2c和补充图。2e)，通过补充FA显著缓解(p < 0.05), suggesting that exogenous FAs selectively promote cell survival in MYCN-driven cells. Collectively, our data indicate that MYCN-driven cell growth depends on exogenous FAs.
FA传送器SLC27A2是MYCN的直接目标
为了进一步阐明MYCN是如何调节FA输入的，我们评估了细胞膜FA转运蛋白基因的表达(SLC27A1–6和CD36)在多个MYCN模型中。SLC27A2在SK-N-AS MYCN-ER中显著上调™MYCN激活后的细胞(48小时10倍，p= 0.0001，图。3a)和在MYCN诱导的MYCN3细胞中(p= 0.006，补充图3a).此外，SLC27A2是Tet-21/N细胞中MYCN关闭时唯一显著下调的转运蛋白(p= 0.01，图。3b)，暗示着SLC27A2是由MYCN有选择地管理的。
图3: MYCN直接上调FA转运蛋白SLC27A2.
aFA转运蛋白(SLC 27 a 1–6, CD36)和ODC1SK-N-AS MYCN ER的mRNA表达™细胞(0、24、48小时的1m 4 OHT)。平均SEM(n= 3);采用Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。bFA转运蛋白(SLC 27 a 1–6, CD36)Tet21/N细胞中的mRNA表达(2 g/mL DOX持续24小时)。平均SEM(n= 3);双边不成对t-测试。MYCN蛋白在Tet21/N细胞中的表达(DOX，MYCN-ON和+DOX，MYCN-OFF)。cTET21/N细胞中的MYCN芯片-qPCR分析(2 g/mL DOX持续48小时)。使用特异性引物通过qPCR分析输入和MYCN芯片样品SLC 27 a 1–6和CD36。平均标准偏差(n= 3);采用Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。d群组1中的基因表达分析(GSE45547).左，转运蛋白基因表达的相关矩阵，MYCN表情/活动，以及c-MYC表情。与...的相关性p-值< 0.05表示在热图中。红色=阳性；蓝色=负相关。中间，SLC27A2MNA中的表达式(n= 93)和非MNA患者(n= 550).双侧不成对韦尔奇氏t-测试。对，SLC27A2在1-4S期患者中的表达(1期:n= 153;第二阶段:n= 113;第三阶段:n= 91;第四阶段:n= 214;第四阶段:n= 78).采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。箱线图表示中间值(中线)、第25和第75个百分点(方框)，以及最小值和最大值(须状)。e, f队列1中的生存分析(GSE45547). e1-4期和3-4期患者的OS和EFS率高(上三分之一)或低(下三分之一)SLC27A2表情。f长链FA转运基因集中基因的OS和EFS预测(GO:0015909)；–日志10(p-值)。Kaplan–Meier法用于绘制生存曲线，对数秩检验用于统计分析。红色=高表达预后不良(p < 0.05); blue = low expression has poor prognosis (p < 0.05); gray = no significance. FC fold change, OS overall survival, EFS event-free survival. Source data are provided in the Source Data file.
为了评估MYCN与膜FA转运蛋白启动子区域的结合(SLC27A1–6和CD36)，我们在MNA细胞和MYCN Tet-Off细胞(Tet-21/N)中进行了MYCN芯片qPCR分析。我们发现结合到启动子区域的MYCN显著富集(> 15倍)SLC27A2(chr15 [hg38]: 50，182，222-50，182，302)，其中包含MNA细胞中的非规范E盒(CAC ctg)(LAN 5和IMR32，补充图。3b–c和补充数据4).此外，关闭MYCN几乎完全废除了MYCN绑定。3c).然后我们问c-MYC是否也能结合到SLC27A2。在具有高c-MYC表达的SH-SY5Y NB细胞中的c-MYC芯片-qPCR分析显示，c-MYC与相同的启动子区域结合，但具有较低的亲和力(4倍富集；补充图3b–c).为了确定MYCN启动子结合是否导致基因转录，我们将一个下游荧光素酶基因融合到SLC27A1野生型和突变型SLC27A2，以及ODC1(一个已知的MYCN目标)47并评估荧光素酶活性。关闭MYCN大大减少了野生型SLC27A2融合荧光素酶活性(p= 0.01，补充图三维（three dimension的缩写）).然而，突变的非规范E盒(CACCTG到GAATTC)SLC27A2启动子消除了这种效应(补充图。三维（three dimension的缩写）)，暗示MYCN激活SLC27A2通过与该区域结合进行转录。虽然MYCN也绑定到SLC27A1启动子(图3c和补充图。3b)，没有变化SLC27A1当MYCN关闭时，检测到转录活性(补充图。三维（three dimension的缩写）).总之，我们的研究发现SLC27A2作为MYCN的直接转录靶标。
因为MYCN选择性上调SLC27A2表达，我们接下来问SLC27A2表达与...相关MYCNNB患者的表达、活性或扩增状态。SLC27A2表达与正相关MYCN表达和活性，如157个MYCN靶基因的总表达分数所示48 (p < 0.05, Fig. 三维（three dimension的缩写）)在大型患者群组(群组1:GSE45547, n= 649).相比之下，其他FA转运蛋白的mRNA水平并不相关。MYCN表情或活动，虽然CD36表达与c-呈正相关真菌学表情(p < 0.05, Fig. 三维（three dimension的缩写），左)。高表达SLC27A2也与MYCN放大(p= 8.1e−45)和第4阶段疾病(p < 0.01) (Fig. 三维（three dimension的缩写）)，并强烈预测所有阶段患者的不良总生存率(OS)和无事件生存率(EFS )( OS:p= 1.0e−8；EFS:p= 4.7e−6)和3-4期高危患者(OS:p= 2.7e−4；EFS:p= 4.2e−2，图。3e).与其他长链FA转运相关基因(去吧:0015909, n= 75),SLC27A2在预测不良临床结果方面排名第一(R2，图。3f，红点)。这些发现在第二个患者群组(群组2:GSE85047, n= 283，补充图。3e–g)，暗示着SLC27A2是NB存活的关键转运蛋白。探索瞄准目标的可能性SLC27A2，我们比较了SLC27A2三个NB队列中的mRNA表达(Lastowska，GSE13136, n= 30;你好，山，GSE16237, n= 51;韦尔斯泰格，GSE16476, n= 88)与正常组织群组(肾上腺，SN_ADGL, n= 13;神经嵴，GSE14340, n= 5;正常各种，GSE7307, n= 504包括108种正常组织；从同一个u133p2平台生成并由MAS5.0标准化的数据集)。中位数SLC27A2MNA患者的表达高于正常组织(补充图。3h)，暗示着SLC27A2可以作为NB的治疗靶点。
遗传和药理学抑制SLC27A2损害NB生存
确定…的影响SLC27A2关于细胞存活的表达，我们分析了789细胞系的存活结果SLC27A2使用CRISPR (Avana)公共20Q4V2数据集(美国布罗德研究所)进行敲除49。结果根据主要疾病进行分组，并使用依赖性评分进行排序。NB在30种原发疾病中排名第十(依赖性得分= 0.23)，表明NB细胞依赖于SLC27A2为了生存(补充图。4a).
确认是否SLC27A2是NB生存所必需的，我们基因枯竭了SLC27A2MNA LAN5细胞中通过shRNA介导的基因沉默(两个序列)(图。4a)，这表示基础率高SLC27A2水平(补充图。4b). SLC27A2LAN5细胞中的KD有效地减少FA摄取(p < 0.01, Fig. 4b)和受损的细胞生长(p < 0.0001, Fig. 4c)和菌落形成能力(p < 0.05, Fig. 4d)，暗示着SLC27A2是细胞生长所必需的。这种表型结果在第二个MNA细胞系(IMR32)中得到证实(补充图。4c)并对MNA细胞具有选择性SLC27A2非MNA细胞(SK-N-AS)中的损耗不影响FA摄取或细胞生长(补充图。4c).为了进一步研究SLC27A2是体内肿瘤生长所必需的，我们原位植入MNA LAN5 shCTRL和shSLC27A2细胞移植入NCr裸鼠。噪声抑制SLC27A2显著降低肿瘤生长(通过MRI成像评估，p= 0.048)和肿瘤重量(p= 0.01，图。4e–f).这些效果与肿瘤内中性脂质的显著减少有关(油红O染色，p= 0.003，图。第四代移动通信技术).此外，消耗SLC27A2肿瘤增殖减少(Ki67染色，p= 0.004，补充图4d)和增加的肿瘤凋亡(裂解的胱天蛋白酶-3染色，p < 0.0001, Supplementary Fig. 4e)而不改变MYCN的表情(p= 0.4，补充图。4f).shCTRL的脂质组学分析(n= 8)和shSLC27A2 (n= 8)肿瘤显示大多数DGs和TGs下调SLC27A2KD (FDR < 0.25，绝对FC > 2，图。4h和补充数据3)，证实了抑制作用SLC27A2的有效逆转MYCN诱导的甘油脂类积累。总的来说，这些数据表明SLC27A2是NB细胞存活和肿瘤生长所必需的。
图4:抑制FA摄取损害NB细胞存活。a噪声抑制SLC27A2在LAN5细胞中。两个shSLC27A2测试GIPZ载体，用空的GIPZ载体作为对照。平均SEM(n= 3).bLAN5 shCTRL和sh对FA的吸收SLC27A2细胞。用FA类似物BODIPY染色的细胞™558/568 C12，并通过ImageJ2量化为CTCF。平均标准偏差(n= 3).cLAN5 shCTRL和sh中的细胞生长SLC27A2细胞。平均标准偏差(n= 3).dLAN5 shCTRL和sh的克隆原性分析SLC27A2细胞。平均标准偏差(n= 3);e–hLAN5 shCTRL和shSLC27A2原位异种移植模型。e植入后3周和4周的肿瘤体积。CTRL = 15嘘SLC27A2= 14;采用Sidak多重比较检验的双向ANOVA。f植入后第5周的肿瘤重量。平均SEM(控制= 13，shSLC27A2= 12);双侧不成对曼恩-惠特尼检验。g瘤内脂质的油红O染色。平均SEM(控制= 6，shSLC27A2= 8);双侧不成对曼恩-惠特尼检验。hshCTRL和sh的脂质组学分析SLC27A2肿瘤(n=每个8)。脂质(FDR < 0.25，绝对FC > 2)显示在热图中(颜色按Z值缩放:红色=上调；蓝色=下调)。MGDG单半乳糖二酰甘油，DGDG双半乳糖二酰甘油，dhCER二氢神经酰胺，CL心磷脂，SM鞘磷脂，PA磷脂酸，lyso。溶血磷脂酰胆碱。溶血磷脂酰乙醇胺。PC血浆磷脂酰胆碱，所有其他缩写与图一致。1e. iLAN5和SHEP细胞在CB5处理后的FA摄取(0-15M，5分钟)。用BODIPY染色的细胞™500/510 C12 C1，由ImageJ2量化为CTCF。平均标准偏差(n= 3).jCB5处理后NB和正常细胞的Caspase 3/7活性(0–10M，24 h)。平均标准偏差(n= 3).k细胞凋亡、p53/p21和MYCN/c-MYC蛋白在LAN5、IMR32和SHEP CB5中的表达(0-20M，16-24h)。VP16 (10米，24小时)=正控制。显示了来自三个独立实验的代表性印迹。FC折叠变化。单位任意单位。a, b, d，以及i，用Dunnett多重比较检验的单因素方差分析；c和j，采用Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。源数据在源数据文件中提供。
药理学靶向FATP2(由编码SLC27A2)，我们使用了小分子FATP2抑制剂CB546，其引发针对NB细胞的选择性细胞毒性，但不伤害正常细胞(图。2b).我们首先通过稳定同位素示踪验证了CB5阻断NB细胞FA摄取的能力(补充图。2d)并用荧光标记的FA类似物BODIPY染色™C12 C1 500/510号。CB5优先阻断MNA LAN5细胞中的FA摄取(p < 0.05) compared with non-MNA SHEP cells (Fig. 4i).因为FATP2抑制剂CB16.2也抑制FATP1活性41，我们验证了CB5对FATP2的特异性。FATP1和FATP2的异位过表达增加了MNA细胞对FA的摄取。然而，CB5仅减少FATP2过度表达细胞的FA摄取(补充图。第四代移动通信技术)，提示CB5特异性针对NB中的FATP2。CB5在MNA细胞中比在非MNA细胞中更有效地抑制细胞活力并诱导凋亡(由胱天蛋白酶3/7活性确定),而不影响正常细胞(图。2b和4j)，表明靶向FATP2选择性损害MNA细胞存活。与非MNA SHEP细胞相比，在MNA LAN5和IMR32细胞中优先诱导切割的PARP和切割的Caspase-3表达(凋亡的标志)进一步支持了CB5的选择性(p < 0.05, Fig. 4k和补充图。5a).CB5也抑制MYCN，但不抑制c-MYC蛋白表达，支持MNA细胞的选择性靶向。p53及其下游靶标p21(Waf1/Cip1)在细胞周期、增殖和凋亡中发挥关键作用。MYCN放大。尽管MYCN可以直接上调p53作为MYCN诱导的细胞凋亡的机制50我们发现CB5增加了MNA细胞中p53和p21(Waf1/Cip1)蛋白的表达(p < 0.05, Fig. 4k和补充图。5a).因此，CB5抑制MYCN并激活p53信号，从而抑制细胞生长并促进细胞凋亡。
靶向FA转运有效抑制NB肿瘤生长
为了确定FA转运对肿瘤生长的贡献，我们在多个临床前NB模型中评估了CB5的抗肿瘤活性。我们将MNA LAN5荧光素酶表达细胞和非MNA SK-N-AS细胞原位植入NCr裸鼠的肾包膜中(图。5a).在肿瘤移植后，将小鼠随机分配到对照组(载体)或CB5组(25毫克/千克，每天两次)[英国国际发展银行。]、腹腔注射(知识产权。)治疗2周。通过荧光素酶活性测定，CB5显著抑制LAN5异种移植物的生长(p= 0.002)和肿瘤重量(p= 0.03，图。5b和补充图。5b).然而，CB5并没有减少SK-N-AS异种移植物的肿瘤体积和重量(图。5c和补充图。5c)，提示CB5优先抑制MNA肿瘤。值得注意的是，CB5治疗没有引起毒性，通过治疗期间小鼠一般临床状况和体重变化进行评估(补充图。5b–c).
图5:抑制FA摄取在多个临床前模型中发挥抗肿瘤作用。a–cNB细胞系来源的原位异种移植模型。a将LAN5或SK-N-AS细胞原位植入NCr裸鼠。两周后用载体或CB5 (25毫克/千克，英国国际发展银行。6天/周)持续2周。b治疗后LAN5肿瘤大小(IVIS)和重量。均值SEM (CTRL = 6，CB5 = 6)；采用Sidak多重比较检验的双向方差分析(左)；双侧不成对曼恩-惠特尼检验(右)。cSK-N-AS治疗后肿瘤体积(MRI)和重量。均值SEM (CTRL = 8，CB5 = 8)；采用Sidak多重比较检验的双向方差分析(左)；双侧不成对曼恩-惠特尼检验(右)。d–g第MYCN+/+同种异体原位移植模型。d来自第一MYCN的细胞+/+将肿瘤原位植入NCr裸鼠。两周后用载体或CB5 (25毫克/千克，英国国际发展银行。6天/周)持续2周。e治疗第1天和第14天的肿瘤体积(MRI)。肿瘤被框定并量化；显示了代表性图像和平均SEM(CTRL = 10，CB5 = 9)。f治疗第14天的肿瘤重量。均值SEM (CTRL = 10，CB5 = 9)；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。g瘤内脂质的油红O染色。平均SEM (CTRL = 6，CB5 = 5个响应肿瘤)；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。h来自第一MYCN的细胞+/+将肿瘤原位植入同系129 × 1/svj野生型小鼠。两周后用载体或CB5 (30毫克/千克，英国国际发展银行。6天/周)持续2周。肿瘤在治疗第14天称重。均值SEM (CTRL = 14，CB5 = 13)；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。i将来自一个MNA患者肿瘤(P6)的细胞原位植入NCr裸鼠中，2周后用载体或CB5 (25 mg/kg，英国国际发展银行。6天/周)持续6周。用Fisher精确检验分析肿瘤发病率(CTRL = 8，CB5 = 9)。用对数秩检验分析Kaplan-Meier存活率。Arb。单位任意单位，Px处理周期。源数据在源数据文件中提供。
TH-MYCN转基因模型是一种侵略性的MYCN诱导的从头NB模型3。为了评估CB5的抗癌活性，我们通过植入TH-MYCN产生了NB的原位同种异体移植物模型+/+肿瘤转移到NCr裸鼠中(图。5d).肿瘤在2周后发展，此时将小鼠随机分配到CTRL(载体)或CB5 (25 mg/kg，英国国际发展银行。)治疗组。在治疗第1天和第14天进行MRI以监测肿瘤生长。CB5显著减小了肿瘤体积(p= 0.006，图。5e和补充图。5d)和重量(p= 0.01，图。5f)在该模型中，并且在研究期间没有观察到毒性迹象(补充图。5d).此外，对CB5治疗有反应的小鼠显示出比对照组小鼠更低的中性脂质水平(p= 0.004，图。5g)，提示CB5阻断体内脂质堆积。这可能是由于CB5介导的对MYCN和MYCN靶向FA合成和转运蛋白表达的抑制(SCD1，ACC和FATP2补充图5d).两个肿瘤逃过了CB5治疗(图。5f).支持我们的发现，这些肿瘤没有表现出脂质抑制，并显示出MYCN激活和FA合成/转运活性的迹象(SCD1和FATP2，补充图。5d).
使用裸鼠作为临床前模型的一个警告是，它们缺乏免疫微环境。为了评估在完整的免疫微环境中阻断FA转运的有效性，我们制备了TH-MYCN+/+衍生的同系小鼠原位模型(图。5h)通过植入TH-MYCN+/+肿瘤进入野生型免疫活性129×1/svj小鼠的肾囊。2周后，用CTRL(载体)或CB5 (30 mg/kg，联邦调查局。)2周。CB5治疗阻断了肿瘤生长(图。5h, p < 0.0001) without apparent toxicity (Supplementary Fig. 5e)在这种模式下。为了评估在MNA NBs中阻断FA摄取的长期效果，我们使用了患者来源的原位异种移植模型(图。5i).将从原发性MNA期NB肿瘤(P0)制备的细胞植入NOG小鼠(P1)的肾被膜中。然后将肿瘤在NOG小鼠中转移到P4，在NCr裸鼠中转移到P6。在该模型中，肿瘤在植入后大约5周开始，小鼠在植入后8-10周死于疾病负担。我们询问通过长期CB5治疗阻断FA摄取是否可以预防MNA肿瘤发展并延长动物存活。CB5治疗在植入后2周当肿瘤尚未开始时应用。小鼠接受CTRL(赋形剂)或CB5 (25毫克/千克，英国国际发展银行., 知识产权。)6周，并通过MRI监测肿瘤生长。CB5不能阻止肿瘤的发生(图。5i).然而，慢性CB5治疗显著延长了动物存活(p= 0.004，图。5i)无明显毒性(补充图。5f)，表明阻断FA摄取可以抑制原发性MNA肿瘤生长并延长生存期。
靶向FA转运使NB对常规化疗增敏
脂质代谢升高促进对化疗的获得性抵抗。在成人模型中，靶向FA合成(FASN)、氧化(CPT1)或摄取(CD36)使癌细胞对化疗敏感40,51,52。因此，我们询问FATP2抑制是否增强了常规化疗的抗肿瘤活性，如用于诱导或复发治疗的依托泊苷(VP16，一种拓扑异构酶II抑制剂)或替莫唑胺(TMZ，一种DNA烷化剂)。我们首先评估了CB5和VP16或TMZ之间的协同作用，通过评估单一和组合处理条件下的细胞活力，使用Bliss模型指定协同作用分数(> 10表示协同作用)53。CB5与MNA细胞中的VP16和TMZ协同作用(图。6a和补充图。6a–b).此外，在MNA细胞中，与单一药物治疗相比，CB5 + VP16和CB5 + TMZ组合增加了胱天蛋白酶介导的凋亡(p < 0.05, Fig. 6b和补充图。6c)，表明这些联合疗法在以下情况下非常有效MYCN放大。
图6:抑制FA摄取促进常规化疗的功效。a在用CB5(0.4-2.5米)、VP16(5-50纳米)及其组合处理72小时的MNA (LAN5和IMR32)和非MNA (SHEP)细胞中的协同作用分析。热图代表三个独立实验的平均幸福评分。幸福得分> 10表示协同作用。b单一和组合处理后的细胞生存力和胱天蛋白酶3/7活性。用CTRL、CB5 (3 M)、VP16 (80 nM)或它们的组合处理细胞72小时n= 3);采用Tukey多重比较检验的单向ANOVA。cCB5 + VP16联合治疗在LAN5来源的原位异种移植物中的抗肿瘤活性。将LAN5细胞植入NCr裸鼠的肾被膜中。植入后两周，用CTRL(载体)、CB5 (15 mg/kg，英国国际发展银行。6天/周)、VP16(每天8毫克/千克，每周3天)或其组合，持续2周。显示了治疗2周后的肿瘤重量。均值SEM (CTRL = 11，CB5 = 11，VP16 = 10，CB5+VP16 = 12)；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。d患者原位异种移植物的存活率分析。将从一个MNA患者肿瘤(P8)制备的细胞植入NCr裸鼠的肾被膜中。植入后五周半，用CTRL(载体)、CB5 (15毫克/千克，英国国际发展银行。6天/周)、VP16(每天6毫克/千克，每周3天)或它们的组合，持续5周。生存率绘制为卡普兰-迈耶曲线，并通过对数秩检验进行分析(CTRL = 12，CB5 = 10，VP16 = 10，CB5 + VP16 = 11)。Px处理期；FC折叠更改。源数据在源数据文件中提供。
因为CB5 + VP16组合显示出有希望的体外协同效应，我们评估了该组合在MNA LAN5衍生的原位异种移植物中的抗肿瘤活性(图。6c).联合治疗(CB5: 15毫克/千克，英国国际发展银行., 知识产权。6天/周，VP16: 8毫克/千克，知识产权。3天/周)显著降低最终肿瘤重量(p < 0.0005, Fig. 6c).此外，CB5 + VP16显示出对肿瘤细胞增殖和凋亡的增强作用(p≤ 0.05，补充图。6d–e)与单独的CB5相比，没有进一步降低MYCN的表达(补充图。6f)且没有体重减轻或正常器官毒性的证据(补充图。6g).这些数据表明阻断FA转运有效地增强了肿瘤对VP16的反应。为了确定联合治疗对动物存活的长期影响，我们使用了MNA患者来源的原位异种移植模型(图。6d).对小鼠进行单一或联合治疗(CB5: 15 mg/kg，英国国际发展银行., 知识产权。6天/周，VP16: 6毫克/千克，知识产权。3天/周)持续5周。用CB5 + VP16联合疗法治疗的动物比接受单一药物疗法的动物存活时间明显更长(p < 0.05, Fig. 6d).没有治疗引起显著的体重减轻或毒性的临床症状(补充图。6小时).总之，我们的数据表明阻断MYCN诱导的代谢重编程有效地增强了常规化疗的抗肿瘤效果。
