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Hippo肿瘤抑制通路的失活促进黑色素瘤

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发表时间:2022-07-01 10:14作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

黑色素瘤通常由活化MAP激酶BRAF的突变驱动;然而,单独的致癌BRAF不足以促进黑色素形成。相反,它的表达诱导短暂的增生爆发,最终随着由生长停滞的黑素细胞组成的良性痣的发展而停止。抑制痣黑素细胞增殖的肿瘤抑制机制仍然知之甚少。在这里,我们利用细胞和鼠模型来证明致癌的BRAF在体外黑素细胞和体内痣黑素细胞中导致Hippo肿瘤抑制通路的激活。从机制上讲,我们发现致癌的BRAF促进肌动蛋白细胞骨架中ERK依赖的改变和全基因组加倍事件,这两种事件独立地降低RhoA活性以促进Hippo激活。我们还证明了Hippo通路的功能性损伤会导致致癌黑色素瘤-表达黑素细胞以绕过痣的形成并快速形成黑素瘤。我们的数据显示,Hippo途径加强了痣黑素细胞的稳定抑制,是黑色素瘤发展的关键障碍。

介绍

皮肤黑色素瘤源于黑色素细胞的恶性转化,黑色素细胞是主要位于表皮基底层的神经嵴衍生细胞。当局部切除时,黑色素瘤是高度可治愈的;然而,黑素瘤是所有皮肤癌中最具侵袭性的,并且晚期疾病与显著的死亡率相关1。阐明皮肤黑色素瘤发病机理的分子特征对于发展预防性和治疗性治疗策略是至关重要的。

绝大多数黑素细胞肿瘤是由丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中的致癌突变引发的,其中活化突变发生在黑色素瘤投资物业分别约占皮肤黑色素瘤的50%和20%2。在…之内黑色素瘤突变型黑色素瘤是最常见的激活突变,由缬氨酸到谷氨酸的单个氨基酸取代产生组成型活性突变体黑色素瘤V600E3,4。尽管强烈诱导增殖信号,黑素细胞特异性表达黑色素瘤V600E不足以在多种动物模型中诱导黑色素瘤;相反,黑色素瘤V600E表达导致由生长停滞的黑素细胞组成的良性痣(痣)的发展5,6,7,8,9,10。临床证据证实了这一点,因为良性人类痣中的黑素细胞也经常含有黑色素瘤V600E突变11,12并且这些黑素细胞痣很少转变成黑素瘤(年比率< 0.0005%)13。类似地,内部的突变投资物业通常在先天性痣和致癌性痣中检测到投资物业在体内黑素细胞中的表达不会迅速产生黑色素瘤14,15,16。尽管任何单一黑色素细胞痣转变为黑色素瘤的风险极小,但了解这种转变是如何发生的是至关重要的,因为大约三分之一的黑色素瘤与痣共存或起源于痣17.

这些观察表明,在黑素细胞中获得活化MAPK途径突变后,肿瘤抑制机制抑制黑色素瘤的发展。一个长期的观点是,由MAPK途径成分突变驱动的强致癌信号导致癌基因诱导的细胞衰老(OIS ),这防止了肿瘤发生18,19,20。支持这一观点的是,已经证明黑色素瘤V600E在原代黑素细胞中,体外诱导立即的细胞周期停滞,并且这些停滞的黑素细胞表现出癌基因诱导的衰老的所有特征:它们变大、扁平、空泡状,表达p16INK4A,表现出衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性,并具有增加的异色焦点和DNA损伤18,21.

然而,尽管很清楚致癌基因诱导的衰老发生在体外,但这种机制在体内阻止肿瘤发生的程度仍不清楚22,23,24。几个证据反对OIS作为抑制体内含有致癌突变的黑素细胞增殖的主要机制。16).最值得注意的是,癌基因表达(例如,黑色素瘤V600E)不会在体内诱导立即的增殖阻断。相反,这些癌基因最初诱导增殖,正如最终形成痣的黑素细胞的克隆生长所证明的,这需要多轮细胞分裂。此外,缺乏蛋白质(如p16和p53)的黑素细胞保持进入生长停滞状态的能力。黑色素瘤V600E/Cdkn2a−/−黑色素瘤V600E/Trp53−/−小鼠模型仍然主要形成痣,只有少数黑素细胞随机转化为黑色素瘤7.

总的来说,这些数据表明额外的肿瘤抑制机制具有抑制肿瘤细胞增殖的能力黑色素瘤V600E-阳性小鼠黑素细胞,独立于诱导衰老。最近的模型研究导致了这样的假设,即痣黑素细胞的生长停滞不仅仅是由于单个细胞中的癌基因激活和OIS,而是由于细胞感知并响应它们的集体过度生长,类似于正常组织中发生的情况25。这种细胞生长停滞使人想起由Hippo肿瘤抑制通路激活诱导的停滞,Hippo肿瘤抑制通路是一种已知调节器官大小的进化保守通路。当Hippo途径被激活时,Hippo激酶LATS1/2磷酸化转录辅激活因子YAP(YAP1)和塔兹(WWTR1),导致它们因核排斥和随后的降解而失活26,27。相反,当Hippo途径失活时,YAP和TAZ是活性的,并与TEAD转录因子家族形成DNA结合复合物,其与AP-1复合物协同作用,刺激介导进入S期和细胞增殖的基因的表达28,29.

尚不清楚Hippo通路激活是否有助于痣黑素细胞的生长停滞。此外,尽管Hippo途径失活被认为促进了皮肤黑色素瘤的生长和侵袭30,31,32Hippo失活是否足以诱导皮肤黑色素瘤的发生和/或发展仍是未知的。在这里,我们使用体外和体内模型系统的组合来检查Hippo肿瘤抑制通路在抑制黑色素瘤发展中的作用。

结果

黑色素瘤 V600E体外表达激活Hippo肿瘤抑制通路

我们试图检验黑色素瘤V600E足以在培养的黑素细胞中诱导Hippo肿瘤抑制通路的激活。先前使用原代黑素细胞的研究表明,致癌基因的外源性表达黑色素瘤V600E导致p53依赖性生长停滞9,33。因此,我们开发了一个系统黑色素瘤V600E可以在没有立即细胞周期停滞的情况下诱导表达,以尝试探索在多个细胞周期中Hippo途径的激活。为了做到这一点,我们建立了一个多西环素诱导系统黑色素瘤V600E在非转化猿猴病毒40 (SV-40)永生化黑素细胞(Mel-ST细胞)中的表达34。编码小T病毒抗原和大T病毒抗原的SV-40早期区域的表达通过包括p53/Rb通路损伤在内的多种机制赋予原代黑素细胞永生34。的归纳黑色素瘤V600EMel-ST细胞中的表达增加了下游激酶ERK和RSK的磷酸化水平,表明细胞模型在添加多西环素(dox)后成功地过度激活了MAPK信号(图。1a)。

图1:黑色素瘤V600E激活海马体肿瘤抑制通路。
figure 1

adox诱导的代表性免疫印迹(IB)黑色素瘤V600EMel-ST细胞培养24小时。bIB的两种不同的dox诱导型黑色素瘤V600EMel-ST克隆培养for 24小时(n≥ 4个独立实验,图表显示平均相对强度SEM,双尾不成对t测试)。c左,两个阿霉素诱导的IB黑色素瘤V600EMel-ST克隆培养for 24小时;右,来自phos-tag凝胶的YAP磷酸化的强度定量(n= 4个独立实验,图表显示平均相对强度SEM,双尾不成对t测试)。d左图显示了YAP/TAZ单独(绿色)或与DNA (DAPI,蓝色)和肌动蛋白(鬼笔环肽,品红色)融合的代表性免疫荧光染色黑色素瘤V600EMel-ST克隆;右,平均YAP/TAZ荧光的核质比的定量(n来自三个独立实验的> 300个细胞,图表显示平均值SEM,比例尺= 20 m,双尾Mann–Whitney检验)。eRT-PCR指示基因的相对表达黑色素瘤V600EMel-ST克隆培养for 24小时(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。f左图,IB为用表达对照载体(H2B-GFP)或BRAF的慢病毒感染的原代人黑素细胞V600E;右,YAP phos-tag的强度量化(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。源数据作为源数据文件提供。

来确定是否黑色素瘤V600E在体外激活了海马肿瘤抑制通路,我们诱导黑色素瘤V600E表达并检测疏水基序(T1079)处活性磷酸化LATS1/2的相对水平27。我们发现在癌基因表达后,LATS磷酸化显著增加。黑色素瘤V600E(图。1b)。然后我们通过phos-tag凝胶电泳评估总YAP磷酸化(p-YAP)。我们观察到黑色素瘤V600E诱导促进了YAP在多个位点的磷酸化(图。1c)。因此,表达黑色素瘤V600E导致YAP的核排斥和YAP靶基因表达的相应减少CYR61AMOTL2(图。1d,e和补充图。S1A).观察到的对LATS和YAP活性的影响是由于黑色素瘤V600E作为野生型的过度表达黑色素瘤对LATS或YAP磷酸化没有影响(补充图。S1B–E).我们在多种细胞系中进一步证实了这些结果,包括具有完整p53途径的非永生化原代成人黑素细胞(图。1f和补充图。S1F).重要的是,观察到的Hippo通路激活的影响并不局限于表达。黑色素瘤V600E单独,因为我们也发现了致癌的诱导表达投资物业Q61R类似地激活海马通路(补充图。S1G).总来说,这些数据证明了通过癌基因的表达对MAPK信号通路的过度刺激黑色素瘤V600E或者投资物业Q61R导致体外激活Hippo肿瘤抑制通路。

良性痣中生长停滞的黑素细胞显示出海马通路激活的证据

众所周知,黑素细胞特异性表达黑色素瘤V600E在动物模型中产生良性痣,其中含有非增殖性黑素细胞5,25。我们假设这些黑色素瘤V600E与我们的体外结果相似,阳性黑素细胞也可能证明Hippo通路激活的证据。为了测试这种可能性,我们分析了在出生后30天(P30)和50天(P50)从野生型对照小鼠和涂有他莫昔芬的小鼠收集的全皮肤提取物的单细胞RNA测序数据集提尔:克里尔T2/Braf加利福尼亚表达活性的小鼠黑色素瘤V600E25。我们研究了这个数据集,以检测在表达致癌基因的黑素细胞中YAP/TAZ依赖性基因转录是否被抑制黑色素瘤V600E。在维数减少和初始聚类之后,我们根据黑素细胞谱系标记的表达确定了代表黑素细胞的聚类离散余弦变换如前所述(图二)。2a)25。正如预期的那样,发现该簇具有其他黑素细胞谱系标记的高表达,特别是黑色素A小眼畸形相关转录因子(补充图S2A).然后,我们采用方差调整的Mahalanobis (VAM)方法,一种scRNA-seq优化的方法来获得准确的信号通路评分,以检测YAP/TAZ介导的基因表达是否降低黑色素瘤V600E-利用以前发表的YAP/TAZ基因表达谱表达相对于野生型黑素细胞的小鼠黑素细胞35,36,37。最基本的分析,所有的单个细胞按基因型分类,证明YAP/TAZ基因表达目标在2005年显著降低。黑色素瘤V600E-与野生型相比呈阳性的黑素细胞(图。2b)。

图2:黑色素瘤V600E-表达痣黑素细胞显示YAP/TAZ信号减弱。
figure 2

a相对的UMAP离散余弦变换来自含痣鼠皮肤的所有单细胞的表达,鉴定了代表来自GSE154679的黑素细胞的细胞群。b来自指定基因型的黑素细胞的YAP/TAZ VAM评分(n= 46 for黑色素瘤+/+, n= 543美元黑色素瘤V600E/+,双尾曼恩–惠特尼检验)。c上图,亚群着色的黑素细胞的UMAP;下图,按基因型和动物年龄着色的黑素细胞UMAP(n= 589).d黑素细胞亚群绘制的YAP/TAZ VAM评分。eYAP/TAZ VAM评分比较痣(聚类0,1)和其他黑素细胞(聚类2,3,4)(痣n= 408,其他n= 181,双尾曼恩–惠特尼检验)。f黑素细胞的UMAP通过梯度显示YAP/TAZ VAM评分。g使用两组不同的抗体对两个良性痣病例中的指示蛋白进行代表性免疫荧光染色,(r) =兔,(m) =小鼠,DAPI(蓝色),YAP(绿色),SOX10(品红色),比例尺= 50 m。源数据作为源数据文件提供。

然后我们进行了无监督聚类,产生了五个黑素细胞亚类,以阐明哪些独特的致癌细胞群黑色素瘤V600E-表达黑素细胞表现出最低的YAP/TAZ活性(图。2c).我们从理论上推断,含有痣黑素细胞的细胞群将完全由分离自黑色素瘤V600E小鼠,并且是从50日龄小鼠中分离的主要黑素细胞亚型。基于这些标准,我们将群集0和1标识为黑色素瘤V600E-表达分离自痣的黑素细胞(图。2c和补充图。S2B, S2C).为了支持这一预测,表达了Cdkn2a,其在痣黑素细胞中上调,被发现在聚类0和1中最高,尽管Cdkn2a所有集群的读取深度有限(补充图。S2D).与所有其他黑素细胞相比,痣黑素细胞(聚类0和1)表现出任何聚类中最低的YAP/TAZ活性分数,表明YAP/TAZ介导的基因表达在致癌后减少黑色素瘤在小鼠痣黑素细胞中的表达(图。2d–f).重要的是,无论基因型或聚类如何,Hippo途径成分的表达保持不变,表明YAP/TAZ信号传导的降低是由于Hippo途径激活,而不是YAP/TAZ调节因子表达的改变(补充图。S2E,F).

并非所有的黑色素细胞都是从黑色素瘤V600E小鼠表现出低YAP/TAZ活性分数。集群2和4,其包含来自两者的黑素细胞的可观部分黑色素瘤+/+黑色素瘤V600E小鼠表现出比痣黑素细胞高得多的YAP/TAZ活性(补充图。S2G).然而,在这些集群中,YAP/TAZ活性仍然下降黑色素瘤V600E黑素细胞与野生型细胞相比。这表明细胞的内在机制如下黑色素瘤V600E表达仅部分导致YAP/TAZ活性降低,其他机制,可能是细胞外源性线索,可能在体内发挥额外作用。我们怀疑簇3,唯一没有表现出这种趋势的簇,可能由增殖的滤泡黑素细胞组成,因为该簇主要包含在P30分离的黑素细胞,此时大多数鼠毛囊处于生长期25。综合来看,这些数据揭示了黑色素瘤V600E-表达小鼠黑素细胞大量表现出YAP/TAZ活性降低,在痣黑素细胞中发现最显著的降低,强烈暗示海马通路在响应黑色素瘤V600E表达和体内痣的形成。为了支持这些结论,对三例人类良性痣的免疫荧光染色显示,YAP主要位于细胞质中,因此推测其在人类痣黑素细胞中失活,这与之前使用有效YAP抗体的研究一致(图。2g)38.

黑色素瘤 V600E-诱导的海马激活抑制致癌黑素细胞增殖

我们接下来研究了海马体肿瘤抑制物的激活是否伴随着黑色素瘤V600E表达导致体外黑素细胞增殖减少。群体倍增试验证明了黑色素瘤V600E在4天的时间里,Mel-ST细胞数量相对于未诱导的对照组减少了30-40 %,尽管这些黑素细胞是SV-40永生化的(图。3a)。活细胞成像和增殖分析显示,这主要是由于增殖停滞,而不是细胞死亡增加(补充图。S3A,B和4A)。为了检验观察到的海马通路激活是否由黑色素瘤V600E表达是这种增殖缺陷的原因,我们使用RNAi来敲除LATS1/2激酶。黑色素瘤V600E表情。我们发现LATS1/2的缺失阻止了YAP的磷酸化。黑色素瘤V600E以及完全挽救的细胞生长和生存力(图。3b,c)。我们进一步发现,用有效的小分子抑制剂抑制LATS1/2也挽救了细胞生长(图。三维(three dimension的缩写))39。然后我们用软琼脂生长试验验证了这些发现。而亲代Mel-ST细胞和表达Mel-ST细胞黑色素瘤V600E未能在非贴壁条件下有效生长,Mel-ST细胞表达黑色素瘤V600E与组成型活性YAP突变体(YAP-5SA)一起显示出显著的菌落形成(图。3e和数据未示出)。这些数据表明,通过LATS1/2缺失/抑制或组成型YAP激活,Hippo途径的功能失活足以使增殖恢复到黑色素瘤V600E体外表达永生化黑素细胞。

图3:致癌的BRAF诱导的Hippo途径激活抑制黑素细胞生长。
figure 3

a两种阿霉素诱导的细胞群体倍增试验黑色素瘤V600EMel-ST克隆dox(n= 3个独立实验,线代表二阶多项式非线性拟合,线颜色代表95%置信区间(点显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。b左,用对照siRNA (siC)或LATS1和LATS2 siRNAs (siLATS) dox处理24小时的两个dox诱导型Mel-ST克隆的代表IB;右,YAP phos-tag的强度量化(n= 4个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。c用指定的siRNA或药物处理4天的Mel-ST细胞系的相对存活力(n= 3个独立实验,技术上一式五份,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。d用DMSO或LATS1/2抑制剂(LATSi)、dox(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。edox诱导的代表性结晶紫染色黑色素瘤V600E表达指示基因的Mel-ST细胞系生长在含dox的软琼脂中,定量如下(n=技术上一式三份的2个独立实验,图表显示平均值)。f对数图2来自TCGA-SKCM或来自MSKCC-SKCM数据库的GISTIC 2.0调用的基因拷贝数值LATS1LATS2;左下角的百分比是LATS1/2共杂合缺失。g三个人黑色素瘤病例中指示蛋白的代表性免疫荧光染色,比例尺= 25 m)。源数据作为源数据文件提供。

我们试图确定人类黑色素瘤细胞在多大程度上抑制了Hippo通路。我们首先询问了癌症基因组图谱(TCGA ),在那里我们发现LATS1/2在约15%的人类黑色素瘤中观察到(图。3f和补充图。S3C,D).然后,我们利用SOX10作为黑色素瘤细胞的标记,对一组人类黑色素瘤样本进行YAP定位染色,并与先前的研究一致,发现多个黑色素瘤肿瘤表现出强有力的细胞核YAP定位,表明Hippo途径失活(图。3g和补充图。S3E)31,38。总的来说,这些数据表明,在黑色素形成过程中,致癌黑色素细胞的亚群将克服或绕过Hippo途径激活,以重新获得增殖能力。

黑色素瘤 V600E诱导的Hippo激活是ERK依赖性的,部分由肌动蛋白细胞骨架的变化介导。

我们试图理解这种机制黑色素瘤V600E直接或间接激活Hippo肿瘤抑制通路。致癌的MAPK信号先前已被证明损害有丝分裂,并且完全的有丝分裂失败可导致激活Hippo途径的四倍体细胞的产生40,41,42,43。我们推测这种表达黑色素瘤V600E可能通过破坏有丝分裂的正常完成而导致Hippo通路激活。为了测试这种可能性,我们进行了强力霉素诱导的活细胞成像黑色素瘤V600E稳定表达染色体标记组蛋白2B-绿色荧光蛋白(H2B-绿色荧光蛋白)的Mel-ST细胞。我们观察到在进入有丝分裂时,细胞表达黑色素瘤V600E相对于未诱导的对照组,经常表现出大范围的染色体振荡,并且不能保持紧密排列的中期平板(图。4a).这些染色体排列缺陷损害了许多细胞满足纺锤体装配检查点的能力,并因此损害了一部分染色体的排列。黑色素瘤V600E-表达细胞经受了显著延长的有丝分裂(图。4a、b和补充图。S4A,B).不能满足纺锤体装配检查点的细胞或者经历有丝分裂细胞死亡,或者在没有经历细胞分裂的情况下退出有丝分裂,这种现象称为有丝分裂滑脱44。经历有丝分裂滑移的细胞通常产生多核四倍体细胞,在人类痣中已经观察到多核黑素细胞42,44,45。我们观察到,在诱导黑色素瘤V600E产生四倍体细胞的有丝分裂数量显著增加(对照组:2.47%,诱导组:24.75%),主要是由有丝分裂滑移的增加驱动的(对照组:~1%,诱导组:~20%)(图。4b和补充图。S4B).这些数据表明黑色素瘤V600E会损害有丝分裂,导致有丝分裂滑移和体外多核四倍体黑素细胞的形成。然而,两行证据表明导致四倍体化的有丝分裂错误不是海马通路激活的主要潜在驱动因素。黑色素瘤V600E-表达黑色素细胞。首先,黑色素瘤V600E-表达Mel-ST细胞阻滞在G1(通过胸苷)或G2(通过RO-3306介导的CDK1抑制)仍然经历了Hippo激活,尽管它们不能变成四倍体(补充图。S4C).其次,免疫荧光实验显示单核二倍体细胞也表现出核YAP/TAZ减少,表明四倍化对于观察Hippo途径激活不是必需的(图。1d).

图4:延长的MAPK激活导致细胞骨架缺陷和海马激活。
figure 4

a来自阿霉素诱导的活细胞视频的代表性荧光和相差图像黑色素瘤V600E表达染色体标记H2B-GFP(绿色)的Mel-ST细胞培养的dox(比例尺= 25 m,hh:mm)。b来自(a) (n来自两个独立实验的每个条件> 80个有丝分裂,图表显示平均值SEM,点代表单独追踪的有丝分裂,黑色P值代表有丝分裂持续时间显著性,双尾不成对t测试,蓝色P数值代表全基因组加倍事件频率差异显著性,双侧Fisher精确检验)。c左,IB所示的dox诱导型黑色素瘤V600EMel-ST细胞系将dox与指定的药物一起培养24小时,剂量如下:ERKi (20 nM),MEKi-1 (10 M),MEKi-2(20nm);右,YAP phos-tag的强度量化(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,具有多重比较的单向ANOVA)。d左,1磅阿霉素诱导型黑色素瘤V600EMel-ST细胞系培养dox指定时间;右,YAP phos-tag的强度量化(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。e左,代表阿霉素诱导的IB黑色素瘤V600EMel-ST细胞系用dox处理24小时或用1 mM羟基脲处理6小时;右,YAP phos-tag的强度量化(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。fRhoA-GTP下拉的代表IB在指定的DOX-可诱导的黑色素瘤V600EMel-ST细胞系dox右,ρa-GTP对总ρa的强度量化(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。源数据作为源数据文件提供。

我们接下来调查了黑色素瘤V600E具体地说,或者更确切地说,MAPK通路的过度激活通常是Hippo通路激活的原因。我们发现,通过抑制下游激酶MEK1/2或ERK1/2来抑制MAPK信号传导,完全阻止了Hippo通路的激活,这可以通过YAP/TAZ磷酸化状态来测量。黑色素瘤V600E可诱导的细胞系(图。4c和补充图。S5A).这些数据表明,Hippo通路的激活完全是由MAPK信号的普遍过度激活介导的,并且需要ERK下游的因子。这些数据也排除了致癌的可能性黑色素瘤V600E通过直接磷酸化关键的Hippo途径成分激活Hippo信号。

我们注意到YAP的磷酸化作用如下黑色素瘤V600E表达需要至少12-16小时的持续MAPK刺激,因为瞬时MAPK激活对YAP磷酸化的影响很小(图。4d和补充图。S5B).我们推测,癌基因诱导的复制应激可能促进了海马通路的激活;然而,仅通过羟基脲处理诱导复制应激不足以激活Hippo途径(图。4e)。或者,已经证明MAPK通路的致癌激活以ERK1/2依赖的方式显著改变肌动球蛋白细胞骨架收缩性并降低RhoA活性46,47,48。众所周知,活性RhoA的减少促进了Hippo途径的激活,此外,ERK1/2依赖性细胞骨架的变化先前已被证明可调节黑色素瘤细胞系中YAP/TAZ的活性40,49,50。因此,我们假设RhoA活性的降低可能代表一种机制黑色素瘤V600E-表达细胞在体外激活Hippo通路。事实上,我们观察到细胞中肌动蛋白应力纤维的数量在激活。黑色素瘤V600E,表明RhoA活性降低(补充图。S5C,D).然后,我们通过下拉试验直接测量RhoA活性,结果显示Mel-ST细胞表达的活性RhoA水平显著降低黑色素瘤V600E相对于对照组(图。4f)。这些数据表明黑色素瘤V600E-诱导的海马通路激活至少部分是由延长的MAPK过度刺激介导的,导致ERK1/2依赖性细胞骨架失调。支持这一观点的,内生的黑色素瘤V600E在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达已经被证明可以显著减少肌动蛋白应力纤维,最近的一项研究也证明了肌动蛋白应力纤维的表达。黑色素瘤V600E在RPE-1细胞中,导致体外RhoA活性降低和斑马鱼胞质分裂失败(Darp等人,未发表)51.

Lats1/2 −/−缺失会促进黑色素生成

我们的数据表明,Hippo肿瘤抑制通路的功能性失活可能使黑色素瘤V600E-表达黑素细胞以逃避生长停滞并促进黑素瘤发展。为了验证这一点,我们培育了携带两者固定等位基因的小鼠Lats1Lats252随着提尔:克里尔T2以允许Hippo途径的可诱导的、黑素细胞特异性失活(提尔:克里尔T2/Lats1f/f/Lats2f/f).删除LATS1/2完全废除了Hippo途径,并且共杂合性缺失LATS1/2在大约15%的人类黑色素瘤中观察到Lats1/2临床相关(图3f和补充图。S3C,D)2,53。我们也穿越了提尔:克里尔T2/Lats1f/f/Lats2f/f (Lats1/2−/−2)具有表达Cre可激活致癌基因的小鼠的小鼠黑色素瘤等位基因(黑色素瘤CA/+),生成提尔:克里尔T2/Braf加利福尼亚/Lats1f/f/Lats2f/f (黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−)小鼠(图。5a和补充图。S6A).我们证实了我们的黑色素细胞特异性提尔:克里尔T2通过掺入荧光谱系痕迹来表达小鼠(黄色荧光蛋白链路支持层),其表达仅在黑素细胞标记物共染色的细胞中观察到(补充图。S6B).

图5:Lats1/2缺失会促进黑色素瘤的形成。
figure 5

a卡通描绘4-HT绘画实验。b诱导的代表形象黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−小鼠肿瘤,比例尺= 0.5厘米。c自发性或诱发性肿瘤的代表性苏木精和伊红染色黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−鼠标,比例尺= 50米(n> 3个自发性肿瘤,n= 2个诱导肿瘤来自黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−老鼠)。d所示蛋白质的代表性IHC,比例尺= 40米(n> 3个自发性肿瘤,n= 2个诱导肿瘤来自黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−老鼠)。e诱导的代表形象Lats1/2−/−小鼠肿瘤,比例尺= 0.5厘米。f诱导的侧腹肿瘤的代表性苏木精和伊红染色Lats1/2−/−鼠标,比例尺= 50米(n> 6只结果相似的独立小鼠)。g从绘画到研究终点的生存情节Lats1/2−/−侧腹涂有4-HT的小鼠(Cre阴性n= 4,Lats1/2−/− n= 7,对数秩检验)。h所示蛋白质的代表性IHC,比例尺= 40米(n≥ 3Lats1/2−/−老鼠)。i漫画描绘脱毛实验在Lats1/2−/−老鼠。j可触及的肿瘤发生百分比Lats1/2−/−指示时间点的小鼠(n= 10只小鼠,双尾不成对t测试)。k在指定时间点测量的每只动物的最大肿瘤直径(n在每个时间点测量≥ 3个肿瘤,误差线SEM,总共10只小鼠,双尾不成对t检验)。源数据作为源数据文件提供。

我们观察到黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−小鼠在出生后几周内非常容易发生自发性皮肤肿瘤,即使没有局部施用4-羟基他莫昔芬(4-HT)。一个类似的黑色素瘤小鼠模型,提尔:克里尔T2/Braf加利福尼亚/Ptenf/f (黑色素瘤V600E/Pten−/−),由于可诱导的Cre重组酶的泄漏,在缺乏局部4-HT的情况下,也显示出易于自发黑色素瘤形成54,55。这表明删除Lats1/2在促进黑色素瘤发展中起着重要作用黑色素瘤V600E在鼠黑素细胞中单独表达不会产生肿瘤5,25(补充图S6A).在少数没有或延迟自发肿瘤发生的小鼠中,给予4-HT黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−侧翼导致肿瘤的有效形式,其在组织学上看起来类似于自发产生的肿瘤(图。5b、c和补充图。S6C).这些肿瘤显示出强的细胞核YAP/TAZ染色,表明Hippo失活,并且黑色素细胞标记SOX10和S100染色阳性(图。5d)。SOX10染色为核同质染色,而S100染色为弱异质染色。皮肤病理学专家随后进行的组织病理学分析证实这些浸润性梭形细胞肿瘤为小鼠黑色素瘤。不像其他人黑色素瘤V600E驱动的小鼠黑色素瘤模型(例如,黑色素瘤V600E/Cdkn2a−/−, 黑色素瘤V600E/Trp53−/−),其仍然主要诱导痣的形成,我们不能评价任何明显的痣形成黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−老鼠。这些数据表明致癌黑色素瘤V600E如果没有功能性的Hippo肿瘤抑制通路,阳性黑素细胞可能无法进入持久的生长停滞期。

我们还调查了Lats1/2缺乏致癌因素时黑素细胞的损失黑色素瘤。我们发现黑色素细胞特异性缺失Lats1/2,小鼠没有表现出明显的色素沉着过度,但仍然在4-5周后快速发展为100%外显率的皮肤肿瘤(图。5e–g和补充图。S6C–E).共杂合缺失Lats1/2也促进了皮肤肿瘤的发生,尽管时间延长(补充图。S6F).对...的分析Lats1/2−/−肿瘤切片显示出与侵袭性肿瘤非常相似的非色素性肿瘤黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−小鼠肿瘤,表现出类似的染色特征,随后被诊断为小鼠黑色素瘤(图。5h)。先前的研究已经确定TEAD和AP-1转录因子是黑色素瘤侵袭状态的主要调节因子,黑色素瘤侵袭状态的标志是去分化和色素沉着标记的丧失56,57。我们假设YAP/TAZ-TEAD激活,由Lats1/2缺失,可能使黑素细胞直接进入这种侵入性基因程序,解释我们观察到的色素沉着的缺乏。为了支持这一假设,两者都黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−Lats1/2−/−小鼠黑色素瘤对成熟、分化的黑素细胞标记物的染色明显较低(补充图。S6G).

考虑到Lats1/2−/−肿瘤没有表现出明显的色素沉着迹象,我们试图产生额外的数据来证实这些肿瘤起源于黑素细胞。最近的研究表明,毛囊周期的开始,通过脱毛,强烈促进黑色素细胞的转化黑色素瘤V600E/Pten−/−老鼠58,59。我们利用小鼠黑色素形成的这一独特特征来测试Lats1/2−/−脱毛也促进了肿瘤的形成,表明肿瘤起源于黑色素细胞。我们导致了Lats1/2然后仅脱毛一个侧腹,以便比较脱毛和未脱毛区域的致瘤率(图。5我)。我们观察到,在4-HT治疗后脱毛的皮肤区域表现出明显更快的肿瘤发生,在治疗后约一个月,在70%的脱毛区域观察到可触及的肿瘤,相比之下,在20%的非脱毛区域观察到可触及的肿瘤(图。5j)。不仅肿瘤在脱毛区域出现得更快,而且这些肿瘤也生长得更大。5k).总的来说,我们的数据证明了黑素细胞特异性缺失Lats1/2单独使用,或与致癌物联合使用黑色素瘤表达,促进小鼠黑素细胞转化和小鼠黑色素瘤的形成。

然后,我们研究了海马通路失活是否也发生在其他黑色素瘤小鼠模型中。我们使用从良性和转化黑素细胞中收集的基因表达数据进行了基因集合富集分析(GSEA)黑色素瘤V600E/Cdkn2a−/−黑色素瘤V600E/Cdkn2a−/−/Lkb1−/−老鼠7。GSEA揭示,与停滞的痣黑素细胞和增殖的非致瘤性黑素细胞相比,YAP/TAZ基因组在鼠黑素瘤细胞中显著富集(图。6a和补充图。S7A–D).这些数据表明,随着这些鼠黑素细胞转化为黑色素瘤,Hippo肿瘤抑制通路变弱。

图6: YAP激活促进黑色素形成。
figure 6

aGSEA对GSE61750进行了研究,比较黑色素瘤中YAP/TAZ信号的富集与所示基因型中黑素细胞的停滞(见补充图。S7A, S7D). b左,用对照siRNA (siC)或LATS1和LATS2 siRNAs (siLATS)处理Mel-ST亲代细胞系的代表IB;右,PTEN和p-S6蛋白的定量与加载对照或总蛋白相比(n= 3个独立实验,图表显示平均值SEM,双尾不成对t测试)。c顶部,代表表达所示质粒的Mel-ST亲代细胞系的IB,EV:空载体;下图,与加载控制相比,PTEN的量化(n= 2个独立实验,图表显示平均值)。dIB比较D4M.3 A细胞和Lats1/2−/−肿瘤裂解物,其中数字分别代表重复或不同的肿瘤(n= 3个独立实验或小鼠)。e左侧,具有指定基因型的斑马鱼的存活曲线;右图是标明基因型的斑马鱼的代表性图像(n= 14条独立的EGFP鱼,n= 10条独立YAP-5SA鱼,对数秩检验)。f图表显示了用10 M MGH-CP1处理4天(n= 3个独立实验,技术上一式五份,图表显示平均值SEM,采用Dunnett多重比较检验的单向ANOVA)。g我们提出在获得致癌基因后黑素细胞过度增殖的模式黑色素瘤V600E导致局部黑素细胞密度增加,随后促进河马通路激活,并导致生长停滞和痣形成。Hippo通路的功能损伤导致YAP/TAZ激活,使黑素细胞表达黑色素瘤V600E以避免稳定生长停滞并促进黑色素瘤的发展。源数据作为源数据文件提供。

活跃的YAP驱动黑色素瘤的发展

我们的目的是进一步定义Lats1/2促进体内黑色素瘤的发展。尽管已经很好地描述了Lats1/2缺失在功能上使Hippo通路失活并导致YAP和TAZ的激活,LATS1/2也可以影响促进肿瘤发展的其他信号通路。例如,最近的研究表明,Hippo途径的失活可以通过多种途径促进mTOR信号传导,包括YAP驱动的微小RNA miR-29的表达,其靶向PTEN mRNA进行沉默60,61,62。然而,在Mel-ST细胞中RNAi介导的LATS1/2敲低或组成型活性YAP (YAP-5SA)或TAZ (TAZ-4SA)表达后,我们没有检测到PTEN蛋白水平的显著变化(图。6b,c)。我们也不能理解随后磷酸化S6水平的任何显著变化LATS1/2静音(图6b).此外,检查Lats1/2−/−肿瘤显示PTEN在体内仍然强烈表达(图。6d).这些数据揭示了Lats1/2不是通过miRNA介导的PTEN缺失激活mTOR来驱动黑色素瘤形成。也已经证明活性LATS2可以结合和抑制MDM2,导致p53蛋白水平增加63,提高了删除Lats1/2导致p53减少,这可能有利于黑色素瘤V600E驱动的鼠黑色素瘤形成64。不考虑这一点,我们发现p53仍然在Lats1/2−/−肿瘤(图6d).先前的研究也表明Lats1/2敲除可以诱导MEFs中胞质分裂失败和全基因组加倍(WGD)。由于众所周知WGD促进肿瘤发生,并且人类黑色素瘤的很大一部分是WGD,我们推测Lats1/2丢失可能通过最初的WGD事件驱动体内肿瘤发生。为了测试这种可能性,我们使用超低通全基因组测序(ULP-WGS)进行了拷贝数分析,以检测基因组改变,如WGD事件,是否在人类基因组中富集黑色素瘤V600E/Lats1/2−/−肿瘤相对于黑色素瘤V600E/Pten−/−肿瘤。然而,测序显示这些模型的所有肿瘤都是二倍体,排除了以下可能性Lats1/2缺失主要是通过WGD中间体诱导黑色素瘤(补充图。S8A).

然后我们评估YAP激活是否足以促进黑色素瘤的发展。为此,我们利用miniCoopR系统建立了转基因斑马鱼模型,该模型在斑马鱼黑素细胞中表达组成型活性YAP (YAP-5SA)65。这些Tg(mitfa:YAP-5SA)斑马鱼迅速发展成色素鱼黑色素瘤(图。6e),证明组成型活性YAP足以在斑马鱼模型中诱导黑素瘤发展。

由于观察到YAP/TAZ信号的激活促进黑色素瘤形成,我们研究了YAP/TAZ的缺失是否能抑制黑色素瘤细胞的生长。RNAi介导的YAP/TAZ基因敲除。黑色素瘤V600E/Pten−/−与永生化黑素细胞相比,小鼠黑素瘤细胞系(D4M.3A)导致存活力显著降低(补充图。S7E).我们利用泛TEAD抑制剂MGH-CP1进一步研究了一组人类黑色素瘤细胞系中YAP/TAZ的依赖性,发现许多黑色素瘤细胞系对YAP/TAZ活性的抑制非常敏感(图。6f和补充图。S7F)66。正在…YAP1在人类黑色素瘤中并不常见突变,YAP1已经观察到扩增和突变,并且原发性黑色素瘤中的YAP染色显示与患者存活率降低显著相关31,38,67。总之,这些数据表明YAP是一种皮肤黑色素瘤癌基因,也是人类黑色素瘤治疗中进一步探索的新的治疗靶点。

讨论

辨别控制痣黑素细胞生长停滞的分子途径,以及黑素细胞最终如何克服这些障碍,对于全面理解黑素生成的机制至关重要。大量的工作支持OIS在体外和体内预防黑素细胞的致瘤性生长的作用;然而,越来越多的证据表明痣中的黑素细胞保持增殖能力,与OIS暗示的绝对生长停滞相矛盾16。事实上,预计高达30%的黑色素瘤来自于前驱痣17。这些观察强调了痣是“稳定克隆扩张”的产物,而不是衰老的产物16。已经鉴定了几种能够克服表达致癌性MAPK突变的黑素细胞的稳定生长停滞的遗传改变,包括CDKN2A,以及TP533,5,6,7,64。当删除Cdkn2aTrp53随着黑色素瘤V600E表达诱导鼠黑素生成,绝大多数黑素细胞仍然进入稳定的生长停滞以形成痣7。此外,最近的鼠单细胞测序分析揭示黑色素瘤V600E-阳性痣黑素细胞不显示衰老标记的表达25。总的来说,这些发现表明存在另外的未鉴定的肿瘤抑制机制来加强痣黑素细胞的抑制。

我们发现这种表达黑色素瘤V600E促进跨多种细胞系的Hippo肿瘤抑制通路的激活黑色素瘤V600E-阳性鼠痣黑素细胞显示体内YAP/TAZ信号传导显著降低。我们的数据表明致癌的黑色素瘤表达通过细胞内在机制在体外诱导Hippo途径激活和细胞周期停滞,其中过度活跃的MAPK信号部分通过降低RhoA信号改变细胞骨架,从而间接导致Hippo途径激活。然而,我们的数据也表明,细胞外的线索,也许继发于痣微环境,也可能影响体内YAP/TAZ信号。我们对小鼠黑素细胞的单细胞测序分析表明黑色素瘤V600E-表达导致大多数黑素细胞中YAP/TAZ信号的普遍抑制,这种效应在痣黑素细胞中最强(图。2d)。最近的一项模型研究提出,痣黑素细胞的生长停滞可能是由于细胞感知并响应其集体过度生长,而不是细胞自主机制25。这种生长停滞模型与介导接触抑制和器官生长的集体细胞过程高度相似,后者由Hippo途径控制。因此,推测癌基因表达诱导的黑素细胞过度生长在多轮分裂中显著增加黑素细胞密度,最终促进海马肿瘤抑制通路的激活,最终生长停滞和痣形成(图。6g).如果是真的,人们将预测河马通路激活将仅在痣超过临界尺寸阈值后进行,并且痣黑素细胞生长应通过降低局部黑素细胞密度来恢复。有趣的是,已经观察到部分切除的痣恢复了增殖能力,并且这些复发痣的大部分没有生长超过最初手术疤痕的界限,这表明这些痣黑素细胞一旦达到类似的大小就会停止生长68,69。虽然由于色素痣的形成,表达癌基因的黑素细胞的生长停滞是明显的,但是也有可能癌基因诱导的来自其他组织的细胞的生长停滞同样由Hippo途径的激活介导。

我们还证明了体内黑素细胞中Hippo途径的功能损伤,或者是通过缺失Lats1/2在小鼠中或组成型活性的表达YAP1在斑马鱼中,促进皮肤黑色素生成。这一发现具有临床相关性,因为共杂合性缺失LATS1/2和扩增YAP1在原发性和转移性人类黑色素瘤中观察到31,32,38。然而,应该注意的是,在人类黑素瘤中没有观察到单独的Hippo途径的功能损伤,因此我们的模型仅部分复制了人类肿瘤的特征。展望未来,确定人类黑色素瘤细胞绕过Hippo途径激活YAP的其他机制将非常重要38,70,71。例如,80%以上的葡萄膜黑色素瘤和大约6%的皮肤黑色素瘤的GNAQ/GNA1蛋白有突变,这种突变刺激RhoA活性并激活YAP/TAZ,而不依赖于GNAQ/GNA 1蛋白的任何改变。LATS1/272,73,74.

我们的活细胞成像也揭示了致癌基因的诱导黑色素瘤促进染色体排列缺陷、延长的有丝分裂和导致全基因组加倍(WGD)的有丝分裂或细胞动力学失败。经历了WGD的细胞(WGD+细胞)是基因不稳定的和致瘤的,并且它们对人类癌症的贡献是显著的75,76,77。致瘤的黑色素瘤因此,可能不仅通过激活MAPK信号,而且通过增加致癌WGD的基线水平来促进肿瘤发生+细胞。然而,尽管约30–40%的人类黑色素瘤和绝大多数人类转移性黑色素瘤显示了WGD的证据78,我们的小鼠黑色素瘤模型未能表现出这一基因组特征(补充图。S8).这可能是因为小鼠模型已经具有很强的致瘤性,而不需要WGD赋予额外的致癌作用;然而,在鼠黑素瘤中缺乏任何可感知的WGD说明这些模型在再现人类疾病方面有局限性45,76,77,78.

据信激活MAPK突变对于人类黑素细胞转化是至关重要的;然而,我们发现鼠黑素细胞缺乏Lats1/2在没有任何其他刺激MAPK途径的基因改变的情况下,迅速发展成黑色素瘤。因此,仍然存在的问题是,单独的Hippo通路失活如何能如此强烈地促进小鼠黑色素瘤的发展。我们观察到黑色素瘤产生于Lats1/2−/−小鼠表现出强烈的p-ERK染色。这表明Lats1/2−/−黑素细胞在转化过程中很可能通过获得额外的遗传改变,或者通过YAP/TAZ依赖的转录组变化刺激或模拟MAPK活性,进化成MAPK通路过度激活73。事实上,已经观察到对BRAF Vemurafenib的一种常见抗性机制V600E-特异性抑制剂,是YAP的扩增和/或激活49,70,79。这表明YAP活性可以补偿黑色素瘤V600E发信号。鉴于MAPK抑制剂耐药仍然是治疗失败的一个重要因素,我们的数据表明联合靶向MAPK和YAP-TEAD信号可以同时预防耐药70和降低黑色素瘤细胞生存力32,80.

总之,我们证明了Hippo肿瘤抑制通路的激活促进了黑色素细胞生长停滞,以响应癌基因的表达黑色素瘤V600E。在多种黑色素瘤形成模型生物中,Hippo途径的功能性损伤有效地诱导了体外黑素细胞的生长和体内肿瘤的发展。总的来说,我们的数据表明Hippo途径是一种重要的黑色素瘤肿瘤抑制因子,并强调YAP/TAZ是研究人类黑色素瘤治疗的有前途的治疗靶点。


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