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用于体内肿瘤成像具有扭转诱导解聚的生物正交可活化菁染料

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发表时间:2022-06-28 15:12作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

生物正交化学在分子光学成像中的进展在于扩大了荧光团的库,该荧光团在生物正交连接时可以经历荧光信号变化。然而,大多数可用的生物正交可激活荧光团仅通过分子内电荷转移机制发射浅的组织穿透可见光。在此,我们报道了一个在近红外(NIR)四嗪(Tz)菁探针设计中偶然发现的“扭转诱导解聚(TIDA)”现象。花青的TIDA在Tz-反环辛烯连接时被触发,将其七甲川链从反式顺向构象构象。因此,在生物正交反应后,所得花青聚集的趋势降低,导致TIDA诱导的荧光增强响应。这种Tz-花青探针在静脉注射后5分钟就能灵敏地描绘出活鼠体内的肿瘤。因此,这项工作发现了构建生物正交可激活的NIR荧光团的设计机制,并开辟了在体内成像中进一步利用生物正交化学的机会。

介绍

近红外(NIR)荧光成像在癌症诊断、图像引导手术和通过实时可视化的治疗评估中对改善治疗结果做出了显著贡献1,2,3,4,5,6,7,8。NIR荧光探针提供了更深的光穿透和更少的组织自发荧光,为体内成像提供了更高的信号-背景比9,10,11,12,13,14。传统的NIR成像探针通过选择性结合在疾病中过度表达的生物分子来靶向感兴趣的位点10。然而,由于在正常组织中的被动积累,非特异性背景信号是不可避免的。相比之下,智能近红外光学探针的信号只有在与化学或酶触发反应时才会打开,从而能够以更高的特异性和灵敏度进行疾病检测和生物标志物水平监测15,16,17,18,19,20,21。由于高选择性、快速反应速率和良好的生物相容性,生物正交化学已经成为设计用于灵敏体内成像的智能近红外光学探针的有前途的工具22,23,24,25。近年来,生物正交化学在光学成像中有着广泛的应用,例如可视化内源性分子(即酶、脂质、RNA等)的动态过程。)23,26,27,28,29疾病生物标志物的预靶向成像30,31,32,33原位代谢标记和成像,并能够在体内组装用于治疗诊断学的分子成像剂34,35,36,37,38,39.

生物正交化学在分子光学成像中的进一步发展在于扩大了底物/荧光团的库,所述底物/荧光团在生物正交连接时可以经历荧光信号变化。迄今为止,在生物正交化学工具箱中,能做到这一点的分子支架还很少。一个罕见的例子是四嗪(Tz)和亲双烯体之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IEDDA)反应,该反应以快速动力学发生,以确保在复杂的生物系统中即使在低浓度下也能有效连接40,41,42,43,44,45。因为Tz与电子结构直接共轭的荧光团通常具有通过键的能量转移(TBET)、fr ster共振能量转移(FRET)或光诱导电子转移(PET),所以Tz共轭的荧光团具有内在猝灭的荧光46,47,48,49,50,51。通过IEDDA反应进行生物正交连接后,荧光团结构的变化消除了淬灭效应,导致荧光增强响应52,53。然而,这些荧光团中的大多数,如香豆素、硼-二吡咯亚甲基染料、呫吨、硅罗丹明和吩恶嗪,仅发射浅的组织穿透可见光(图。1)47,48,54,55,56,57,58。使用分子内电荷转移(ICT)仅开发了少数基于Tz的NIR荧光探针59,由此在Tz-亲双烯体连接时形成新的共轭供体–π–受体电子系统,导致荧光增强。然而,当前基于NIR Tz的荧光探针的潜在问题包括复杂的合成和体内自发荧光。因此,开发生物正交可激活的NIR荧光探针仍然是一个处于起步阶段的领域。

图1:基于Tz的生物正交可激活探针的策略。
figure 1

tz-猝灭机理(a)和我们工作中可活化的近红外花青的扭转诱导解聚(TIDA)b).

在这项工作中,我们报告了一个偶然发现的“扭转诱导解聚(TIDA)”现象,在我们的生物正交激活近红外花青探针的设计。与以前利用Tz作为猝灭剂的工作不同60Tz部分被引入七甲川链的中间位置(图。1).在与反环辛烯(TCO)进行生物正交连接时,大体积部分的引入导致荧光团平面性的扰动。扭转角的增加减少了共轭体系内的π-电子离域和π-π堆积,导致荧光团的解聚。因此,这种TIDA现象在生物正交反应后引起荧光增强响应。氮取代基通过氨基-Tz结合到荧光团中,以扩大斯托克斯位移,最小化体内自发荧光。这种方法在有机合成中表现出较少的复杂性,并且可以同时实现体外和体内的高灵敏度成像。此外,PEG修饰被结合到花青探针的设计中,以增强血液循环时间,促进肿瘤组织中的吸收,同时保持良好的清除性能。当应用于4T1荷瘤小鼠模型进行体内成像时,探针的成功生物正交激活在肿瘤检测中提供了良好的灵敏度和特异性。更重要的是,这项工作开辟了使用TIDA作为设计生物正交激活的近红外探针的策略的前景。

结果

设计和光化学特性

迄今为止报道的适用于体内成像的大多数NIR探针是花青衍生物。然而,由于聚集引起的淬灭,它们的荧光有一个固有的缺点。已知市售的NIR花青染料,如吲哚菁绿(ICG)和IR780,在浓度大于1微米时表现出浓度依赖性猝灭(补充图。1).在ICG的情况下,在4 μM处荧光损失可达80%。对于环己胺取代的花青,CyP7-CH,在4微米处观察到55%的荧光损失(补充图。2).虽然荧光在具有大的共轭和刚性平面系统的有机荧光团中是有利的,但是由于π-π堆积,这种结构也易于聚集。因此,我们假设在花青类荧光团中引入空间位阻会破坏π-π堆积,从而为各种生物成像应用提供了一种简单有效的获得良好荧光性质的方法。在此,我们报告了一种生物正交可激活的基于近红外花青的探针,用于通过TIDA进行体内肿瘤成像。

为了赋予探针在血液循环中的长半衰期,短的亲水性聚乙二醇(PEG)链被引入到NIR-苯并吲哚七甲川菁的杂环中,产生CyP7(图。2a).接下来,Tz部分通过用氨基-Tz亲核取代氯原子而结合到CyP7上,产生Tz-花青,CyP7T(图。2b),以及CyP7N(图。2c).随后,在Tz-花青苷(CyP7T或CyP7N)上进行Tz-TCO连接以分别产生CyP7TT和CyP7NT。成功的Tz-TCO连接被HRMS证实,1核磁共振氢谱和13所得缀合物CyP7TT和CyP7NT的C NMR分析(补充图。326).Tz-TCO连接的二级速率常数被确定为5.5±0.9m−1 s−1对于CyP7T与TCO之间的反应(补充图。27).在七甲川链的中间位置引入氮原子后,N-花青苷(CyP7-CH、CyP7T、CyP7TT、CyP7N和CyP7NT)表现出94-112nm的大斯托克斯位移,而CyP7的位移为29 nm(图。2d和补充表格1).令人满意的是,在CyP7T的Tz-TCO连接后,结合物CyP7TT显示出2.5倍高的荧光和高达8微米的浓度依赖性荧光增强(图。2e).值得注意的是,CyP7TT显示几乎没有荧光损失,甚至在4微米(图。2f).相反,在4微米时观察到CyP7 (71%)和CyP7T (38%)的强烈荧光猝灭(图。2g–h).我们推断,通过Tz-TCO连接引入TCO部分可能破坏了荧光团之间的π-π堆积,导致CyP7TT甚至在高浓度下解聚,这不同于Tz猝灭机制61。为了进一步证实这一假设,阴性对照探针CyP7N(图。2c),在Tz部分和七甲川链之间具有更长的PEG接头,被设计用来减轻由在荧光团上引入TCO部分引起的空间位阻。正如预期的那样,我们观察到CyP7N和CyP7NT之间的荧光猝灭几乎没有差异(图。2i).这证实了我们的假设,即较弱的空间位阻导致最小的π-π堆积破坏,因此与CyP7TT相比,CyP7NT的解聚较少(图。2c).为了阐明这一现象背后的机制,接下来进行了理论计算、核磁共振研究和建模模拟。

图2:花青的分子设计和光谱性质。
figure 2

的化学结构aCyP7,b生物正交激活的花青,和c控制蓝蛋白。生物正交部分Tz(红色基团)与底物结构的距离为甲基(较短)(CyP7T)或PEG3(较长)(CyP7N)。CyP7T/CyP7N和TCO通过IEDDA反应激活CyP7TT/CyP7NT。d染料的标准化吸收(黑色)/发射(红色)光谱。e不同浓度的花青在最大发射光谱处的荧光强度。fh荧光随浓度的损失。虚线代表荧光强度和浓度之间的理想线性关系,表明在蓝色范围内没有淬灭。i对照组的ACQ效应(由CyP7N和TCO形成的CyP7NT)。

理论计算

为了研究Tz-TCO连接后在CyP7TT中观察到的上述去猝灭现象,进行了密度泛函理论计算以确定CyP7、CyP7-CH、CyP7T和CyP7TT的最低能量构象、前线分子轨道以及电子跃迁能量。如图所示。3a和补充图。28,CyP7具有高度刚性的平面π共轭体系,扭转角为0.009。然而,氮取代的花青素,CyP7-CH和CyP7T,是面外的,扭转角分别为28.602°和33.149°。Tz-TCO结扎后,CyP7TT显示最大扭转角为44.354°。对于阴性对照组CyP7N/CyP7NT,如预期的那样,在生物正交反应后,几乎没有观察到它们的扭转角(34.967和34.664)的差异(补充图。28).受显示分子的非平面性和荧光发射之间的关系的上述结果的鼓舞,还测定了花青染料的激发态性质。数字3b和补充表格2显示S0构成名词复数1具有最大振子强度的激发来自ICT,通过CyP7的HOMO/LUMO。CyP7-CH、CyP7T和CyP7TT分别通过HOMO/LUMO和HOMO-1/LUMO产生扭曲的分子内电荷转移(TICT)。菁染料的HOMO和LUMO能级随着扭转角的增加而增加。同时,HOMO-LUMO能隙按CyP7TT > CyP7T > CyP7-CH > CyP7的顺序增加,表明扭转角的增加有助于扩大HOMO-LUMO能隙,导致共轭体系内π电子离域减少。这破坏了荧光团之间的π-π堆积,从而导致了被称为TIDA的现象。

图3:理论计算下TIDA效应的机理。
figure 3

a在B3LYP/6-31G*水平优化的CyP7、CyP7-CH、CyP7T和CyP7TT花青苷的代表性分子结构和构象(为了清晰起见,忽略了氢原子、苯并吲哚环上的N-取代基和内消旋氨基取代基)。bCyP7、CyP7-CH、CyP7T和CyP7TT(忽略氢原子)的HOMO/HOMO-1/LUMO轨道和具有最大振子强度的能量。

接下来,进行1D和2D核磁共振分析来研究CyP7、CyP7T/CyP7TT和CyP7N/CyP7NT的结构和构象。如图所示。4a,即H2/H3和H1/H4CyP7的乙烯基质子分别位于8.372 ppm和6.473 ppm。至于CyP7T/CyP7TT和CyP7N/CyP7NT,乙烯基质子都位于更远的场(H2/H3= 7.665-7.750;H1/H4= 5.896-5.983),证实了先前在DFT计算中显示的平面性和共振结构的损失(图。34b–e).在图。4d–eTz-TCO结合物CyP7NT的乙烯基质子峰保持相对不变(H2/H3= 7.764 ppmH1/H4= 7.742 ppm),对应于DFT计算和荧光猝灭测量表明的其构象的最小扰动。然而,对于Tz-TCO缀合物CyP7TT,乙烯基质子上移(H2/H3= 7.665;H1/H4= 5.896 ppm)与CyP7T (H2/H3= 7.750 ppmH1/H4= 5.983 ppm)(图。4b,c).为了进一步阐明CyP7T和CyP7TT的2D构象,还进行了旋转框架overhause效应光谱(ROESY) NMR分析。如图所示。4f补充图。2930,即–CH3CyP7T的质子(Ha)显示出与乙烯基质子H的强核overhauser效应2/H3,暗示一个反式构象。此外,对于–CH,仅发现单峰3质子(Ha)属于CyP7T(以及CyP7N和CyP7NT),明确表示对称反式构象。然而,在CyP7TT中,Ha荣誉勋位爵士3质子与氢原子有很强的相关性5Tz部分上的芳族质子,由不对称的顺向构象康福尔。1核磁共振分析也揭示了–CH3质子(Ha)表现为三个独立的峰(图。第四代移动通信技术).总的来说,从这些数据中,我们可以得出结论,CyP7TT确实采用了不常见的顺向构象康福尔。有趣的是,DFT计算同样显示了七甲川链从反式顺向构象发生在Tz-TCO结扎后的CyP7TT中(图。3一个和4f–g).因此,我们得出结论S-反式-STz-TCO连接后,随着扭转角增加的-顺式转化减少了共轭系统内的π-π堆积,然后导致TIDA。

图4:1氢和二维核磁共振分析。
figure 4

1乙烯基氢的核磁共振位移变化1,H2,H3,H4)对于aCyP7,bCyP7T,cCyP7TT,dCyP7N,以及eCyP7NT。橙色区域是指H1/H4蓝色区域指的是H2/H3。2D·罗西核磁共振fCyP7T和gDMSO中的cyp 7 TT-d6.

为了更深入地了解π-π堆积的TIDA效应,我们还进行了分子动力学模拟。如补充图所示。31,CyP7形成具有强吸引力的面对面二聚体聚集体,如高结合能所示(BE =–10.1558千卡摩尔–1)和最短配位壳层距离(r= 0.496 nm)。然而,CyP7TT中二聚体的相互作用明显受阻(BE =-1.8647千卡摩尔–1, r= 0.518纳米)与CyP7T(BE =–2.0121千卡摩尔–1, r> 1 nm),进一步证实了π-π堆积的破坏。该分子动力学模拟数据也与图1中的吸收/发射分析结果一致。2d,由此观察到吸收中二聚体峰的消失(图。2d).此外,还比较了CyP7、CyP7T和CyP7TT的空间分布函数(SDF ),以分析二聚体的形成(补充图。32).观察到CyP7共轭平面上的三维密度分布(补充图。32a, 14).这表明存在促进二聚体形成的强π-π堆积。虽然CyP7T可以形成聚集体,但在SDF中很少观察到花青主链的π-π堆积(补充图。32b).至于CyP7TT,几乎没有观察到密度分布区域,表明几乎没有观察到聚集或二聚体形成(补充图。32c).总之,理论计算、分子模拟、核磁共振表征和分析提供了对TIDA现象的全面理解和更深入的了解。因此,TIDA策略为设计用于成像应用的生物正交可激活的NIR荧光团提供了范例。

体外成像

作为概念证明,接下来在活细胞中进行生物正交可激活成像。首先,将4T1细胞与CyP7T、两亲性CyP7、亲水性ICG或疏水性IR780一起孵育,以评估探针的膜渗透性。孵育0.5小时后,使用荧光激活细胞分选(FACS)分析来确定不同探针的细胞摄取。对于CyP7和CyP7T,细胞摄取分别为99.98%和100%,表明这两种染料的优异渗透性和快速摄取(补充图。33).CyP7T和CyP7TT也表现出最小的细胞毒性(补充图。34).接下来,使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对用CyP7T处理的4T1细胞以及CyP7或ICG进行活细胞成像。如补充图所示。35孵育0.5小时后,ICG的荧光信号可以忽略不计。观察到CyP7有明显的荧光信号,与FACS分析结果一致(补充图。33).对于CyP7T处理的细胞,与CyP7处理的细胞相比,观察到更强的荧光信号。这可能归因于CyP7T的更大的斯托克斯位移,注意到CyP7T可以容易地实现TIDA,因为高自发荧光可以被完全最小化。对于TCO/CyP7T处理的细胞,CLSM分析表明在CyP7T孵育0.5小时后,胞质溶胶中有强荧光信号。上述结果表明,成功的细胞内Tz-TCO连接和TIDA导致显著的荧光增强。

一旦概念验证成功,接下来通过改变TCO的比率同时保持CyP7T的浓度恒定(5微米)来确定用于后续活细胞实验的Tz-TCO连接的TCO:CyP7T的最佳比率。当TCO:CyP7T的比例为2:1时,CLSM成像和定性分析都证实获得了最大荧光强度(图。5a–b).然后,我们评估了在与CyP7T孵育的活细胞中TCO生物正交激活的效率和效果。首先用10微米TCO处理4T1细胞3小时,然后用5微米CyP7T洗涤和孵育细胞。然后在CyP7T孵育后的不同时间点(5至30分钟)拍摄CLSM图像。值得注意的是,仅在CyPT7孵育后10分钟就已经观察到荧光增强(图。5c).随着更长的孵育时间达到30分钟,CLSM图像显示在用TCO/CyP7T处理的细胞中具有统计学上显著更强的荧光信号(图。5d).至于阴性对照细胞,在生物正交连接时荧光信号没有显示出显著差异(图。5c,d补充图。3637).

图4T1细胞中响应TCO的CyP7T的生物正交成像。
figure 5

a4T1细胞的CLSM成像与不同浓度的TCO (0,5,10,20微米)预孵育3小时,用PBS洗涤,然后与CyP7T (5微米)孵育0.5小时。细胞核用DAPI(蓝色)染色。b图5a中荧光的定性分析。数据以平均值±SD表示。进行双边学生t检验(1:1对0:1,p= 0.0244;2:1对1:1,p= 0.0102;2:1对0:1,p= 0.0015;4:1对2:1,p= 0.2988).c用10微米TCO预孵育3小时,用PBS洗涤,然后用5微米CyP7T或CyP7N孵育5、10、15、30分钟的4T1细胞的共聚焦荧光图像。d图5c中荧光的定性分析。数据以平均值±SD表示。双面学生的t测试已执行(p=从左到右依次为0.2205,0.1959,0.0139,0.5054,0.0025,0.2600,0.0033,0.9434,0.0188,0.8194)。细胞的荧光图像记录在λ不包括= DAPI为405纳米,λ不包括=近红外染料的640纳米。比例尺:30 μm。误差线:三次单独测量的标准偏差。*p < 0.05, **p < 0.01, ns not significant.

为了进一步评估CyP7T的生物正交激活增强特性,对4T1细胞进行了靶向成像(图。6a).已知4T1乳腺癌细胞高表达整合素αvβ3受体。三氨基酸序列,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或“RGD”通常用作整联蛋白的抑制剂αvβ3受体-配体相互作用诱导细胞凋亡。RGD肽与TCO结合,赋予其肿瘤靶向性43。之后,4T1细胞首先与10微米TCO-RGD预孵育3小时,随后洗涤以去除过量的TCO-RGD,随后与5微米CyP7T孵育(图。6b).对于TCO-RGD处理的细胞,仅在CyP7T孵育10分钟后,通过CLSM分析可以观察到强荧光信号,证明生物正交可激活成像导致显著的荧光增强。荧光的定性分析。6a表明CyP7T表现出ca。存在TCO-RGD时,荧光强度增加6倍(图。6c).同时,进行了负极电池实验αvβ3-低表达MCF-7细胞62通过CLSM分析,TCO-RGD处理的细胞与TCO-处理的细胞相比没有显示出显著的荧光差异(图。6d–e).因此,这些结果证实了在活细胞中使用CyP7T的具有增强荧光信号的成功和有效的生物正交激活的NIR成像。

图4T1细胞和MCF-7细胞中的生物正交激活成像。
figure 6

a4T1细胞的CLSM成像(整合素αvβ3高表达)与CyP7T、CyP7T/TCO和CyP7T/TCO-RGD (5微米)孵育0.5小时b添加CyP7T和TCO/TCO-RGD的时间表。细胞用10微米TCO或TCO-RGD预孵育3小时,用PBS洗涤,然后用CyP7T (5微米)孵育10分钟。cNIRF信号的量化a。数据以平均值±SD表示。双面学生的t进行了测试(CyP7T/TCO-RGD与CyP7-CH,p= 0.0003;CyP7T/TCO-RGD vs CyP7Tp= 0.0006;CyP7T/TCO-RGD vs CyP7T/RGD,p= 0.0017).dMCF-7细胞的CLSM成像(整合素αvβ3低表达)与CyP7T、CyP7T/TCO和CyP7T/TCO-RGD (5微米)孵育0.5小时eNIRF信号的量化d。数据以平均值±SD表示。双面学生的t进行了测试(CyP7T/TCO vs CyP7T,p= 0.0187;CyP7T/TCO vs CyP7T/TCO-RGD,p= 0.8359).细胞用核染料DAPI(蓝色)染色。所有图像均在40倍放大倍数下获得。比例尺:30 μm。误差线:三次单独测量的标准偏差。**p < 0.01, ns not significant.

原位和体内成像

随着活细胞实验的成功,CyP7T的应用接下来被应用于体内成像。首先,在4T1荷瘤小鼠中,评价PEG修饰的CyP7与疏水性CyB7和亲水性ICG的生物分布和肿瘤蓄积。如补充附图所示。3839,ICG处理的小鼠组显示出较差的肿瘤蓄积,消除半衰期,t1/2= 1.65分钟。另一方面,PEG修饰的CyP7显示出良好的肿瘤蓄积性和更长的半衰期1/2= 24.9分钟。注射后24小时(HPI),还获得了主要器官的离体荧光图像,以检查探针的生物分布(补充图。40).CyP7的PEG修饰赋予了探针良好的体内特性,这对于减少成像期间的背景信号和消除由于在肝脏中的累积而产生的毒性是必不可少的。

接下来在4T1荷瘤小鼠模型中验证了使用CyP7T的生物正交可激活成像。首先,为了在体内验证荧光增强,选择肿瘤内给药以消除由循环系统产生的代谢或清除导致的探针性质的差异。将TCO-RGD和CyP7T或CyP7N探针同时施用到4T1荷瘤小鼠的肿瘤内。感兴趣区域(ROI)用于定量肿瘤中的荧光信号。肿瘤内注射15分钟后,CyP7T/TCO-RGD组的肿瘤中的荧光信号显示出比仅CyP7T组高两倍的荧光增强,直到24 HPI(补充图。41).至于阴性对照CyP7N和CyP7N/TCO-RGD组,没有观察到荧光信号的统计学显著差异。接下来,进行TCO-RGD和花青探针的静脉内(i.v .)给药。静脉注射TCO-RGD 12小时后,随后给予CyP7T,同时进行体内成像(图。7a).如补充图所示。42,早在5分钟就可以在肿瘤部位清楚地观察到荧光信号。然而,仅注射CyP7T的对照组小鼠仅在8 HPI后在肿瘤部位达到相同的荧光强度(图。7b,c).ROI分析显示,TCO-RGD处理的小鼠和对照组的肿瘤中的荧光信号逐渐增加,在24 HPI后达到最大值。TCO-RGD预处理小鼠的肿瘤区域中的ROI信号比对照组小鼠高2.6倍(图。7c).在存在TCO-RGD的情况下,在24 HPI和48 HPI后,荧光信号的肿瘤-背景比(TBR)分别为约6和4(图。7d).相反,对照组小鼠的TBR在24 HPI时约为3,在48 HPI时降至2。在24 HPI后收获切除的器官用于离体荧光成像和生物分布研究(补充图。43).半定量分析表明,肿瘤显示最高的荧光信号,其次是两组的肝脏(图。7e).值得注意的是,与对照组小鼠(1.2倍)相比,TCO-RGD治疗组显示出更高的肿瘤与肝脏荧光信号比率(4.6倍)。接下来,通过组织学评估探针的生物相容性和生物安全性。主要器官切片的苏木精-伊红染色(H&E)图像显示心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺和胃没有明显的病理变化或结构异常(补充图。44).总之,这些结果证实了可生物正交活化的花青探针CyP7T可以安全且成功地用于增强活细胞以及体内的NIR成像的灵敏度和特异性。

图4T1荷瘤小鼠的体内生物正交NIR成像。
figure 7

aRGD-TCO、CyP7T注射液和近红外成像时间表。小鼠预先注射TCO-RGD (10 nmol)或生理盐水,12小时后注射CyP7T (5 nmol)。b在注射CyP7T后的不同时间点(0、0.5、1、2、4、8、12、24、48小时)进行NIR成像。c肿瘤组织中的荧光信号强度d肿瘤与背景的比率(TBR ),n= 3.TBR由(肿瘤ROI-背景ROI)/背景ROI确定。eCyP7T注射后24小时从小鼠收获的切除器官的荧光强度分析。数据以平均值±标准差表示。(n=每组3只生物学上独立的小鼠)。

讨论

总之,我们开发了一种生物正交可激活的近红外花青探针(CyP7T ),使用TIDA进行体内肿瘤成像。DFT计算、分子模拟和NMR分析证实,在Tz-TCO连接后,荧光团七甲川链上的构象从反式顺向构象产生TIDA,导致显著的荧光增强。我们证明了灵敏的NIR荧光成像可以在活细胞中进行,可视化最快可在5分钟内完成。类似地,在体内,CyP7T的荧光可以在5分钟内通过与肿瘤部位的TCO-RGD的生物正交反应而被成功且有效地激活。肿瘤检测的灵敏度和特异性高度依赖于肿瘤与背景的比率。有充分证据表明,肿瘤与背景比值的最佳阈值≥3.06。对于700-900纳米的近红外光谱范围,通过使用有机荧光团,TBR比率通常为~ 2463,64。在我们的工作中,在4T1荷瘤小鼠模型上,使用CyP7T和TCO-RGD的生物正交成像提供了6的高肿瘤-背景比,用于灵敏和特异的体内肿瘤成像。据我们所知,TIDA策略不同于其他已知的基于Tz-淬灭机制的设计,例如FRET、TBET、PET和ICT。因此,这项研究提出了一个设计生物正交激活的近红外荧光探针的范例。我们预计,这种策略将为生物正交化学的其他荧光可激活支架的开发铺平道路,并有助于推进生物正交化学在体内成像和诊断。


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