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胆管癌的基因组景观揭示了转录后修饰物的破坏

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发表时间:2022-06-02 10:39作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

地理人群和亚型之间的分子变异表明CCA中潜在的基因组异质性和新的基因组特征。在这里,我们分析了来自3个亚洲中心的87例肝门周围胆管癌(pCCA)和261例肝内胆管癌(iCCA)的外显子组测序数据(包括我们中心的43例pCCA和24例iCCA)。iCCA肿瘤显示出比pCCA肿瘤更高的肿瘤突变负荷和拷贝数改变负荷(CNAB ),并且高CNAB表明较差的pCCA预后。我们鉴定了12个显著突变的基因和5个CNA区域,并证明了pCCA肿瘤中转录后修饰相关的潜在驱动基因METTL14和RBM10的常见突变。最后,我们证明了METTL14(一种主要的RNA N6-腺苷甲基转移酶(m6A ))的肿瘤抑制作用,并说明其功能缺失突变R298H可能通过m6A修饰潜在的驱动基因MACF1而起作用。我们的结果可能对更好地理解转录后修饰如何影响CCA发育有价值,并突出了pCCA和iCCA之间的相似性和差异。

介绍

胆管癌(CCA)是一种恶性原发性肝胆疾病,起源于胆管树的每一点,从肝管到主胆管1。近几十年来,CCA的发病率和死亡率在全球范围内都有所增加,尤其是在东亚2,3。在中国,CCA的发病率达到每100,000人中6–7.55人4,5。由于对常规治疗的耐药性和预后不良,CCA的死亡率几乎等于其发病率6。总的5年存活率只有10%7。即使对于接受手术切除的CCA患者,相应的5年生存率也只有25-35%8并且在诊断后仍有50-60%的高复发率,没有有效的治疗方法。

CCA被认为是一组不同的疾病,根据解剖位置进一步分为肝内CCA (iCCA)、肝门部CCA (pCCA)和远端CCA (dCCA)9。pCCA是最常见的亚型,占所有CCA肿瘤的50-60%9。总的来说,据报道,在过去十年中,全世界iCCA的发病率和死亡率都在上升,而pCCA的发病率似乎稳定或下降10。除了丙型肝炎病毒感染的负担与iCCA的发生率相关外,在东亚,肝吸虫感染和HBV相关的肝脏疾病与iCCA的发生率有更强的相关性10,11。原发性硬化性胆管炎(PSC)被认为是CCA,尤其是pCCA的主要危险因素10,12。iCCA和pCCA明显的地理和病因学异质性表明这两种CCA亚型中潜在的不同的癌症起始细胞13。详细地说,由于显著的肿瘤间异质性,认为iCCA起源于两种不同的起源细胞(分泌粘蛋白的胆管细胞或肝祖细胞)14。与iCCA不同,pCCA仅起源于分泌粘蛋白的胆管细胞13,15.

迄今为止,以前对各种胆管癌,特别是iCCA的基因组改变的研究,已经证明了CCA突变的一些已知共性。这些研究确定了许多驱动基因,但大多数代表iCCA的基因组特征,如TP53、KRAS、SMAD4和ARID1A16,17,18,19,20。值得注意的是,高加索肝外CCA (eCCA)(包括pCCA和dCCA)的最新综合基因组分析揭示了西方eCCA的独特分子特征21。然而,CCA及其亚型的流行病学特征显示了巨大的地理差异,表明不同地区潜在的基因组异质性5。东亚CCA患病率最高,亚型分布相似。因此,对亚洲国家测序数据的整合分析可能会发现以前的研究忽略的重要基因组特征。

在这里,我们对43个pCCA和24个iCCA进行了全外显子组测序,并分析了另外44个pCCA和237个iCCA,以分别研究pCCA和iCCA的基因组景观。我们的研究确定了显著突变的CCA驱动基因,并强调了pCCA和iCCA之间相似和不同的基因组特征。值得注意的是,我们强调了潜在的转录后修饰在CCA发生和发展中的作用,并证明METTL14及其功能缺失突变R298H通过潜在驱动基因MACF1上的N6-甲基腺苷(m6A) mRNA甲基化在CCA过程中发挥重要作用。我们的结果对于更好地理解转录后修饰对CCA发育的影响,以及pCCA和iCCA之间的异同可能是有价值的。

结果

pCCA和iCCA突变谱

我们对87例pCCA(包括医科大学43例和国际癌症基因组联盟44例)和261例iCCA(包括24例、135例和邹等研究的102例)的外显子组测序数据进行了整合分析17).补充表中列出了NMU研究中患者的一般信息和临床特征1。NMU研究的平均测序深度在肿瘤组织中为94.4倍,在肿瘤附近解剖的正常组织中为91.8倍。详细的测序范围和深度信息在补充表中列出2。我们总共检测到91,995个体细胞突变(补充表2)在所有病例中,每例的中位数为120.5。中位肿瘤突变负荷(TMB)为每例2.0兆碱基(/Mb),pCCA (2.0/Mb)和iCCA (2.0/Mb)的负荷相当(Wilcoxon秩和检验P= 0.48,补充图。1A).在这些突变中,我们定义了28,254个非同义突变,每个患者的中位数是33个单核苷酸变异(SNVs)和3个小插入和缺失(INDELs)。有趣的是,iCCA的非同义突变负荷(中位数0.61/Mb)显著高于pCCA(中位数0.47/Mb)(Wilcoxon秩和检验P= 9.6 × 104,图。1A).类似于非同义突变模式,iCCA比pCCA具有更高的拷贝数改变负担(CNAB )( iCCA中位数= 25.0%,pCCA中位数= 8.4%,Wilcoxon秩和检验P= 2.4 × 10−4),无论扩增还是缺失(图。1C).iCCA中基于纯度调整的拷贝数的CNAB也显著高于pCCA (All burden: Wilcoxon秩和检验P= 8.0 × 104;扩增负担:Wilcoxon秩和检验P= 1.9 × 106;删除负担:Wilcoxon秩和检验P= 4.3 × 102;补充表格3).

图CCA患者的突变谱。
figure 1

ApCCAs(以红色表示)和iCCAs(以蓝色表示)之间非同义突变(替代和突变)的肿瘤突变负荷(TMB)。P数值通过Wilcoxon秩和检验获得。BpCCAs(红色)和iCCAs(蓝色)中的COSMIC 30突变特征的组成概要。宇宙特征MMR包括特征6、15和26;签名肝包括签名12、16和24;签名APOBEC包括签名2和13。CpCCAs(红色)和iCCAs(蓝色)之间无论扩增或缺失的拷贝数改变负荷(CNAB)的差异。进行Wilcoxon秩和检验以确定P价值。箱线图描绘了中位数、四分位数和范围。盒状图中的须状物延伸到最极端的数据点,其不超过1.5倍IQR。使用1.5倍IQR的上/下四分位数识别异常值。D对年龄、性别和分期进行校正的Cox比例风险模型用于获得HR和P价值(n= 348).E, F所有样本中CNAB的预后效应。ECNAB在43个pCCAs。FCNAB在126 iCCAs。*P < 0.05; **P < 0.01, ***P < 0.001; TMB Tumor mutation burden, CNV Copy number variation, Amp Amplification, Del Deletion.

接下来,我们研究了基因组突变特征,这为CCA的致癌作用提供了线索。首先,我们将所有的突变分为六个典型的亚型。与之前的研究一致17,18,C > T/G > A替代是所有患者SNVs的主要类型(补充图。1B).pCCA和iCCA之间突变亚型的比例相似(Wilcoxon秩和检验P= 0.46,0.09,0.67,0.62,0.51,0.29分别为C > A,C > G,C > T,T > A,T > C,T > G,补充图1B)。我们进一步使用R package SignatureEstimation分析了突变信号,它基于30个宇宙信号的预定义突变谱精确地重建了所有pCCA和iCCA患者的突变谱22。宇宙信号1(年龄,44.71%)、与错配修复缺陷相关的信号(MMR,信号6、15和26,31.99%)、与活化APOBECs相关的信号(信号2和13,6.48%)和信号8 (6.41%)在pCCA患者中占主导地位(比例> 5%)(图。1B).对于iCCA患者,COSMIC signature 1 (27.19%)和signature MMR (26.74%)也被确定为占优势,但比例略低于pCCA患者。此外,与吸烟行为相关的信号4(10.13%)、与马兜铃酸相关的信号22 (9.96%)和肝癌特异性信号(肝,信号12、16和24,8.7%)在iCCA中占优势。有趣是,标志性肝脏在HBV相关的iCCA中更常见(HBV: 26.0%,非HBV: 3.8%,补充表4).邹等人的研究主要在iCCA患者中发现马兜铃酸相关突变,但在pCCA患者中也观察到这种特征(补充表5).此外,与同源重组缺陷(4.26%)相关的信号3和与改变的极点活性(2.44%)相关的信号10仅在iCCA中鉴定(图。1B),提示在CCA的癌变过程中发生了多种类型的DNA损伤。

上述结果揭示了CCA患者基因组不稳定性的本质。我们进一步调查了TMB/CNAB和患者总生存率之间的关系。我们发现,在对年龄、性别和诊断阶段进行调整后,携带较高突变负荷的患者表现出较差的预后(风险比(HR) = 1.71,P= 3.9 × 104,图。1D).这种相关性在pCCA和iCCA患者中是一致的(补充图。1C).当检查CNAB时,我们注意到具有较高CNAB的pCCA患者的存活率明显差于具有较低CNAB的患者(HR = 2.70,P= 3.6 × 102,图。1E);然而,在具有不同CNAB的iCCA患者之间没有显著差异(HR = 0.91,P= 6.7 × 101,图。1F).基于纯度调整的CNAB (pCCA: HR = 2.89,P= 3.6 × 102;iCCA: HR = 0.84,P= 4.5× 101;补充表格6).

CCA中关键的潜在驱动基因

我们鉴定了36个显著突变的基因(SMGs,Fig。2),也被MutSig2CV和IntOGen描述为mut-drivers,包括24个报告的SMG和12个以前的CCA出版物中未强调的SMG(补充表7).在这些SMG中,MACF1 (5.17%,18/348)和AXIN1 (0.86%,3/348,三名患者均患有iCCA),通常被认为是肝细胞癌(HCC)的潜在驱动因素之一,是β-连环蛋白/Wnt信号通路的两个相互作用的成分(图。2).虽然AXIN1的突变率很低,但我们注意到在两名iCCA患者中存在多个非同义突变(图。2).PI3K通路的组成部分PIK3R1的突变在2.59% (9/348)的患者中显示。转录后修饰基因RBM10 (3.16%,11/348)和METTL14 (0.86%,3/348)作为众所周知的选择性剪接调节子和m6一个作家。重要的是,我们确定了METTL14中的复发性突变,并且该基因中的所有突变影响相同的氨基酸(补充图。2B),一些生物信息学致病性预测工具也将其预测为潜在的有害变异体(补充表7).我们观察到染色质修饰剂SMARCA4和WHSC1的突变率相同(1.44%,5/348)。有趣的是,这些基因的突变倾向于在同一患者中同时发生(Fisher精确检验OR = 660,P= 2.29 × 106,图。2).此外,在其他癌症中鉴定的经典癌症驱动基因在本研究中也被鉴定为SMG,包括ATM (3.45%,12/348),BRCA2 (2.01%,7/348),和MLT 4(2.01%,7/348)。尽管BRCA2、EPHA2和ATM在先前发表的工作中因其相同位置的复发性失活突变而被提及,但我们对更多样本量的综合分析将它们鉴定为SMGs。

图CCA中筛选的显著突变基因(SMG)和复发性突变基因的突变情况。
figure 2

每列代表一名CCA患者,每行代表一个基因。红色的基因符号是我们新发现的CCA相关基因,黑色的基因在CCA中已有报道。左图中的柱状图表明了所有CCA中筛选基因的总体突变率。右图分别是pCCAs和iCCAs的突变谱和突变率。基因符号后的星号表示相关基因中存在重复突变。

我们进一步定义了在pCCA和iCCA之间具有明显突变率的基因。TP53、ARID1A、PBRM1、MACF1、EPHA2、ARID2、IDH1、PTEN、RB1、BRAF、NRAS、SLC8A1、AXIN和MLLT4是富含iCCA的基因,而RBM10、TGFBR2、PIK3R1、ELF3、NACC1和METTL14是富含pCCA的基因。TP53和IDH1的突变率在iCCA中显著较高(Fisher精确检验或TP53= 1.3,PTP53= 8.8 × 103;运筹学IDH1= + ∞ ,PIDH1= 4.4 × 102,图。2).重要的是,IDH1只在iCCA中突变,而在pCCA中没有。然而,RBM10在pCCA中携带的突变明显多于在iCCA中携带的突变(Fisher精确检验或RBM10= 3.8,PRBM10= 3.2 × 102).

我们通过CCAs中的焦点拷贝数改变(CNAs)进一步确定了22个区域(图。3A,补充表8),包括与先前报道的峰重叠的16个区域,和先前未报道的6个显著改变的区域(在7q31.2、22q11.21的扩增,和在1p36.13、2p24.1、7q35和12q24.33的缺失,图。3A).位于这些峰的癌症相关基因被认为是CNA驱动基因。7q31.2处0.8-Mb区域的增加发生在45个样本(26.6%)中,其包含RTK/RAS途径中的经典MET癌基因。然而,7q31.2的扩增以前在高加索人群中很少见。1p36.13的缺失涉及肿瘤抑制基因SHDB,影响76份样本(45.0%)。12q24.33处的DNA聚合酶ε(POLE)在40名患者(23.7%)中丢失一个拷贝,该位点也被认为在HCC丢失。此外,重要的DNA甲基化因子DNMT3A (2p24.1)和染色质甲基化因子EZH2 (7q35)也分别在20例(11.8%)和19例(11.24%)患者(包括iCCA和pCCA)中显示缺失。而基于先前的单核苷酸多态性阵列分析,这两个区域也被认为在iCCA中缺失。我们仅在CCA患者中观察到异质性丢失(图。3A).在所有区域中,iCCA中8q24.21 (MYC)、1q21.3 (S100A7)、5p15.33 (SDHHA)和7q31.2 (MET)的扩增/增益频率显著较高(补充表8).尽管扩增/增益的频率在各亚型间具有可比性,但在pCCA中高水平扩增的频率显著高于iCCA(图。3A).此外,我们发现经典肿瘤抑制基因(TP53、CDKN2A、SMAD4、PTEN和ATM)的拷贝数丢失和非同义突变倾向于在同一患者中同时发生(Fisher精确检验OR = 8.4,P= 8.2 × 106,图。3B).

图3:频繁改变的焦点CNA区域以及突变驱动基因和CNA驱动基因的特征。
figure 3

A显示了涉及癌症相关区域的22个精选的频繁改变的局灶性CNA区域。每列代表一名CCA患者,每行代表一个病灶区。左边的柱状图显示了所有共同国家评估中的总体CNA比率。右图分别是pCCAs和iCCAs的CNA频谱和速率。上图代表扩增,下图代表缺失区域。红色和蓝色的区域名称表示新的改变,基因符号后的加号表示pCCAs和iCCAs之间的显著改变率差异。星号表示病灶区的基因也在SMGs中被鉴定。B相关肿瘤抑制基因拷贝数丢失和突变的共现。CTCGA胰腺癌十种途径中突变驱动基因和CNA驱动基因的途径富集结果,P超几何检验的值。*P < 0.05; **P < 0.01, ***P < 0.001.

接下来,我们对这项研究中鉴定的所有潜在驱动基因进行了途径富集分析,包括SMGs (mut-drivers)和上述频繁改变的局灶性CNA区(CNA-drivers)中的癌症基因,发现CCA的潜在驱动基因在RTK-RAS、Wnt、PI3K、细胞周期、TP53、TGF-β和HIPPO途径中显著富集(图。3C).包括已鉴定的MET扩增,34.3%的CCA患者在来自RTK-RAS途径的癌基因中含有突变和CNAs,这些改变以相互排斥的方式发生,正如在其他癌症中报道的(补充图。2A).

METTL14中的功能性复发性突变

在上面提到的潜在驱动基因中,我们鉴定了一个潜在的驱动基因METTL14,它是参与各种癌症的异常m6A修饰的主要因子,具有复发性和有害的突变23,24(补充图2B,补充表9).所有三种突变影响相同的298个氨基酸残基(METTL14 p.R298H和p.R298C),并且其中两种位于相同的基因组位置(分别来自NMU和ICGC的两名患者)(补充图。2B).我们在一个独立的pCCA队列中进一步进行了sanger测序,另外40名受试者来自NMU队列,我们还发现了一个额外的p.R298H携带者(补充图。2C,D).在宇宙数据库中,我们还发现同样的p.R298H也出现在三个胰腺导管癌中(补充图。2B)而且三个病人都是东亚人。

metl 3-metl 14复合物的晶体结构揭示了p.R298位于该复合物的推定RNA结合沟附近,其可能具有影响甲基化活性的复杂作用25。复发和缺失突变型p.R298H提示我们它可能是正选择,以及METTL14在抗肿瘤过程中发挥正常作用的需要。然而,这种热点突变和m6CCA的mRNA甲基化尚未确定。形成核心m的关键催化蛋白METTL14的功能障碍6一种甲基转移酶复合物,在癌症的发生和发展中显示出基本的生物学效应24,26。因此,我们假设CCA可能与调节m的METTL14有关6mRNA甲基化。因此,我们首先检测了69对CCA和匹配的邻近正常组织中METTL14的表达。qRT-PCR和western blot结果显示METTL14的表达在肿瘤中显著下调(P < 0.01; Fig. 4A湾和补充图。7A).组织微阵列上的免疫组织化学(IHC)染色也证实了METTL14染色在蛋白质水平上在CCA中减少(补充图。3A)且其下调显示出与CCA中不良癌症特异性存活率显著相关(对数秩P= 0.045;补充图3B).我们一致发现m6总RNA水平在CCA组织中显著降低(图。4C).有趣的是,我们也观察到了m6与metl 14高表达CCA组相比,metl 14低表达CCA组中的修饰水平显著降低(补充图。3C).这些结果表明METTL14及其介导的m6在CCA中,a修饰经常被下调或干扰。

图4:金属14R298H突变降低了勇气14重量CCA的抑瘤作用。
figure 4

AMETTL14蛋白水平在CCA组织中得到验证。B通过qRT-PCR检测69对iCCA和pCCA肿瘤组织以及癌旁正常组织中METTL14 mRNA表达下调(p= 0.0064).Cm的水平6肿瘤和邻近正常组织的改变(n= 8).D表达METTL14的慢病毒构建体的转染效率重量和勇气R298H在RBE细胞系(n= 3).E金属14R298H缩减金属14重量介导的m6由m检测到的修改6RBE细胞系中比色定量(n= 3).FMETTL14检测RBE细胞增殖曲线R298H,金属14重量或阴性对照(名词= 3).GMETTL14检测RBE细胞凋亡R298H,金属14重量、或阴性对照通过PI和膜联蛋白V双重染色测定和流式细胞仪分析(n= 3);p(NC对WT) < 0.001,p(WT对R298H) < 0.001)。HMETTL14检测RBE细胞的集落形成R298H,金属14重量,或阴性对照。计数菌落数并显示在直方图中(n= 3).I跨井迁移的代表性图像(左)和量化(右)(p(NC对WT)= 0.0024;p(WT对R298H) = 0.0194)和侵袭(p(NC对WT) < 0.001,p(WT对R298H) < 0.001)的测定重量,金属14R298H或阴性对照(n= 3).J上图是来自小鼠的切除肿瘤组织的照片。底部面板是平均重量(p(NC对WT)= 0.0011;p(WT对R298H) = 0.0066)和体积(p(NC对WT)< 0.001;p(WT对R298H) = 0.0005)的结果重量和勇气R298H组(n= 5).数据表示为平均标准偏差。K金属14R298H逆转METTL14的肿瘤抑制作用重量在体内肺转移实验中。左图是在北卡罗来纳州第六周拍摄的代表性图像14重量和勇气R298H组(n = 3)。数据显示为平均值SEM。这P使用不成对的双边学生的计算值t多重比较无校正测试。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; T, Tumor tissue, N, normal tissue, R298H, METTL14R298H;重量,金属14重量;NC,阴性对照。

为了确定metl 14和R298H突变在CCA发展过程中的“驱动”作用,我们首先使用sanger测序法证实CCA细胞系(RBE和HCCC9810)中没有metl 14的R298H突变(补充图。第三代),然后证实了表达METTL14的慢病毒构建体的转染效率重量和勇气R298H在RBE和HCCC9810细胞系中(图。4D补充图。3D,E,以及7C).与稳定过表达METTL14的细胞相反重量,过度表达METTL14的细胞R298H显示整体m显著降低6修改能力(图4E和补充图。3F).随后,虽然野生型METTL14的过表达影响细胞增殖和凋亡,但该突变的过表达对增殖和凋亡没有显著影响(图。4F–H补充图。3H,I,L,以及4A).此外,METTL14的过表达重量导致细胞迁移和侵袭的减少,METTL14R298H显著逆转了基因抑制CCA细胞迁移和侵袭的能力(图。4I和补充图。3J,K).总之,这些结果为我们提供了METTL14引起功能丧失的证据R298H突变,表明METTL14R298H突变会降低METTL14的抑瘤作用重量在CCA。

为了进一步验证METTL14的功能作用重量和勇气R298H在体内,我们观察到金属14重量有效地抑制肿瘤生长,如裸鼠和肺转移模型中肿瘤大小和重量的显著减少所反映的,METTL14重量还能显著抑制肺转移。与体外实验的结果一致,METTL14的抑制作用R298H对肿瘤增殖和肺转移的抑制作用在体内明显减弱重量组(图。4J,K).因此,这些数据暗示了METTL14引起的功能丧失R298H突变足以抑制METTL14的肿瘤抑制功能重量在CCA。

潜在驱动基因MACF1作为METTL14的靶标

然后我们在阴性对照中进行RNA-Seq和MeRIP-Seq分析,METTL14重量,和金属14R298H细胞。所有细胞中共有2601个峰,包括1586个基因的经典转录物,被exomePeak2强有力地鉴定。最常见的m6一个主题,GGAC,在m6a确定的峰值(补充图。4B),以及m6a峰特别集中在终止密码子附近。接下来,我们执行差分m6对照和金属之间的a-甲基化分析14重量细胞以及金属之间14重量和勇气R298H细胞。因为梅特14在m6甲基化修饰,我们只包括m6a峰值(712)随着金属丰度的增加而增加14重量与对照细胞相比的细胞,以及金属丰度降低的峰(990)14R298H与金属相比14重量细胞。两种分析共有237个峰,包括上述两种潜在驱动基因的四个峰(MACF1,MET)(图。5A、B,补充图。4C).MACF1也是本研究中鉴定的潜在驱动基因(补充表7).然后我们验证了m6a修饰的MACF1易受衰变的影响。MACF1的寿命明显延长14R298H细胞和缩短的金属14重量放线菌素D处理后的细胞(图。5C和补充图。4D).我们进一步免疫沉淀了m6来自METTL14的RNA重量和勇气R298H细胞,发现金属14R298H显著降低了m修饰的MACF1的量6a与金属相比14重量(图。5D和补充图。4E).根据以前的研究,METTL14的p.R298属于METTL3和METTL14之间的沟,可能负责RNA结合,因此我们推测METTL14R298H可能调节MACF1 mRNA的富集25,27。我们发现mett 14特异性抗体显著富集mett 14中的MACF1 mRNA重量与金属相比R298H使用RNA免疫沉淀分组(图。5E和补充图。4F).然后我们应用免疫荧光分析和蛋白质印迹进一步证实METTL14重量介导的MACF1降解和METTL14R298H显示与METTL14相比MACF1的表达增加重量(图。5F,G补充图。4H,我,以及7B).我们还发现金属14重量细胞减少了MACF1的表达,并且在METTL14中没有观察到对MACF1表达的显著影响R298H使用qRT-PCR的细胞(补充图。4J).

图5: M6β-连环蛋白核质转运中MACF1的修饰介导表达。
figure 5

A显著不同m的重叠6从金属14中确定的修饰峰R298H与METTL14相比重量,金属14重量与NC和突变驱动基因相比。B不同m的log2标度倍数变化6a WT对NC和R298H对WT的修饰峰。C转染METTL14的RBE细胞中MACF1的RNA寿命R298H,金属14重量、或NC。Dm6在MeRIP中验证了RBE细胞中MACF1的修饰水平(n= 5).E在NC中免疫沉淀金属蛋白14相关RNA重量和勇气R298H在RBE细胞中进行,随后用RT-qPCR检测与METTL14结合的MACF1 mRNA的量(n= 3).FMETTL14中MACF1免疫荧光的代表性图像重量和勇气R298H (n= 3).GMACF1在NC后的表达,METTL14重量和勇气R298H通过蛋白质印迹进行评估。所有数据代表了至少两个具有相似结果的独立实验。H用NC和si-MACF1(n= 3).I用NC和si-MACF1测定RBE细胞的凋亡测定(n= 3;p(NC vs si # 1)= 0.0004;p(NC对si#2) < 0.0001)。J具有MACF1和si-MACF1的RBE细胞的增殖曲线(n= 3;p(NC对si # 1)< 0.0001;p(NC对si#2) = 0.0001)。K用MACF1和si-MACAF1在RBE细胞中进行跨孔迁移和侵袭试验(n= 3;迁移:p(NC vs si # 1)= 0.0076;p(NC vs si # 2)= 0.003;入侵:p(NC vs si # 1)= 0.0417;p(NC对si#2) = 0.0430)。LQRT-PCR结果显示METTL14和MACF1在CCA组织中的表达呈负相关(n= 82).Mβ-连环蛋白免疫荧光图像显示,METTL14的表达有增加核β-连环蛋白的趋势R298H与金属相比14重量在RBE的牢房里。所有数据代表了至少两个具有相似结果的独立实验。NWestern blot分析细胞质、细胞膜和细胞核提取物中的β-连环蛋白,以及总RBE细胞提取物中E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、PCNA和细胞周期蛋白D1的表达。所有数据代表了至少两个具有相似结果的独立实验。这P使用不成对的双边学生的计算值t多重比较无校正测试。数据显示为平均值SEM。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

当我们用靶向MACF1的siRNA库成功转染CCA细胞时(补充图。4K湖,以及7D),我们发现在功能分析中,敲除MACF1显著增加细胞凋亡,减少CCA细胞增殖和转移(图。5H–K和补充图。5A–F).最近的研究表明,MACF1参与肿瘤转移和细胞骨架,并在β-catenin的核转位中发挥重要作用28,29。在我们的发现中,我们首先使用qRT-PCR验证了MACF1在CCA中的上调(补充图。第四代移动通信技术),并注意到较低的METTL14 mRNA水平表现出较强的MACF1表达(图。5L).鉴于MACF1在调节β-catenin核转位中的重要作用,免疫荧光试验和western blotting分析表明,核β-catenin的增加与METTL14的表达相关R298H而不是勇气重量(图。5M,N补充图。5G,H,以及7E).为了确定MACF1在mett 14介导的β-连环蛋白核转位中的作用,我们将MACF1 siRNA转染到mett 14中R298H-过表达细胞,并观察到β-连环蛋白的核转位与仅METTL14相比减少R298H-过表达细胞(补充图。5I).

此外,金属14R298H导致E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、PCNA和细胞周期蛋白D1的表达水平逆转,它们是β-连环蛋白的下游靶点,与METTL14相关重量(图。5N补充图。5G,以及7B,E).这些结果表明METTL14介导的m。6一个修饰抑制了CCA中的MAC f1/β-连环蛋白通路,而METTL14R298H突变破坏了这一机制。

讨论

在这项研究中,我们纳入了348例CCA样本(其中87例来自pCCA,261例来自iCCA)的基因组数据,以研究pCCA和iCCA的基因组景观。我们发现了这两种解剖亚型之间的共同和不同的特征。目前,没有有效的生物标志物可以准确预测CCA患者的预后30,31。我们的研究发现TMB对东亚CCA患者的预后有很好的预测作用。值得注意的是,与CNAB较低的患者相比,CNAB较高的pCCA患者的生存结果较差。这些发现表明,我们可以从更宏观的遗传学角度探索CCA患者的预后标志物。

除了经典途径中的几个重要驱动基因外,我们还鉴定了参与转录后修饰的驱动基因(即METTL14和RBM10),它们在pCCA患者中携带更多突变。通过体外实验,我们证实了METTL14的作用,以及这种突变在CCA发展中的作用。我们进一步确定m6METTL14可调节潜在驱动基因MACF1的修饰水平和表达,从而影响CCA细胞的增殖和转移能力。值得注意的是,尽管我们提供证据证明METTL14介导的m。6一个修饰抑制了CCA中的MAC f1/β-连环蛋白通路,而METTL14R298H突变破坏了这一机制,m6A相关的关键催化蛋白将在WNT途径上变得更加复杂,其潜在机制尚未完全阐明。以前,ALKBH5降低WIF-1的m6A水平并阻碍Wnt信号的激活32。YTHDF结合METTL3介导的m6A APC mRNA并上调Wnt/β-catenin通路33。鉴于Wnt信号在调控肿瘤发生中的重要性,mett 14-MAC f1-WNT将更加复杂,值得进一步研究。

先前的研究表明,根据转录组和甲基化数据的整合分析,缺乏解剖位置决定分子亚型的证据34。我们的研究确定了四个与染色质和甲基化修饰相关的潜在驱动基因(即mut-drivers:smarc 4和WHSC1;CNA-驱动基因:DNMT3A和EZH2),进一步支持了驱动基因在转录水平引起破坏的发现。与之前的研究结果一致,我们发现潜在驱动基因的这些改变之间的频率相当。然而,我们的分析确定了两个基因作为驱动因子(METTL14和RBM10),并发现它们与转录后修饰有关。这两种基因的突变在pCCA患者中更常见。这一证据表明,对pCCA和iCCA之间差异的研究应该扩展到转录后领域。METTL14从事m6修改35,36,调节mRNA的选择性剪接、输出、稳定性和翻译37。有趣的是,我们发现两个潜在的驱动基因(MACF1和MET)可以被m6由金属突变引起的变化。值得注意的是,所有这些基因在iCCA中的突变率或拷贝数改变率均高于在pCCA中的突变率或拷贝数改变率。因此,它们在iCCA和pCCA中都是重要的潜在驱动基因。然而,它们可以通过不同的机制被激活。虽然MACF1和MET可以作为pCCA和iCCA的共同治疗靶点,但是我们不应该忽视METTL14可以调节m6除了这两个驱动因子之外的更广泛基因的修饰,可能会导致意想不到的耐药性或副作用,因此,对pCCA患者的进一步研究是有保证的。另一个基因,RMB10,是一个RNA结合蛋白和选择性剪接调节子,在肺腺癌中经常突变38。与肺癌相似,CCA中大多数RBM10突变(63.6%)截断了该蛋白,并可能改变特定基因的下游剪接38,39。因此,CCA的转录后事件可能受到高度干扰,进一步的研究可能有助于确定新的分子亚型和优化临床治疗策略。

我们的研究还发现了一些关键的潜在驱动基因,这些基因在以前的研究中没有报道,涉及多个重要的途径。在我们的研究中,MACF1和AXIN1被鉴定为CCA的SMG。它们参与包含CTNNB1、GSK3B和APC的复合物,并能促进β-连环蛋白/Wnt信号通路的激活28,40。这两个基因的突变一直是相互排斥的。CNA驱动的MET属于经典的RTK-RAS信号通路,其抑制剂已被广泛应用于其他癌症41,42。虽然在CCA中已有MET扩增的报道,但我们的研究强调MET扩增的存在是pCCA的一个基因组特征,并报道在高加索iCCA中有罕见的扩增频率43,44,表明它可能在中国患者中发生得更频繁。根据OncoKB的研究,所有CCA患者中有近106例(30.5%)携带RTK-RAS信号通路的可操作性改变。PIK3R1,磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单位α,是PI3K的主要调节亚型45并且在多种癌症中频繁突变46,47。ATM作为TP53肿瘤抑制蛋白和体细胞ATM突变或缺失的激活剂,通常在淋巴恶性肿瘤、胰腺癌和肺腺癌中发现48。值得注意的是,我们的结果表明ATM可能同时受到截短突变和缺失的影响,导致双等位基因失活。一些已知的肿瘤抑制因子,如TP53、SMAD4、PTEN和CDKN2A,显示了相似的双等位基因缺失模式。据报道,在家族性CCA病例中,编码BRCA相关蛋白的BRCA2发生种系突变49,50。我们的研究还表明,BRCA2可能受到体细胞突变的影响。MLLT4,也称为AF6,通常在急性髓性白血病中与KMT2A融合。它也被认为是乳腺癌中的SMGs51。很少有关于NACC1基因改变的报道,但它在卵巢浆液性癌中被激活,并影响癌细胞的细胞凋亡、衰老和胞质分裂52,53。亚洲CCA的整合全外显子组分析确定了重要的CCA驱动基因,并强调了pCCA和iCCA之间基因组特征的相似性和差异性。重要的是,我们的研究还强调了潜在的转录后修饰在CCA发生和发展中的作用。这些结果提供了对CCA突变景观的更好理解,这可能推动临床实践的改进。


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