核Vav3是B细胞淋巴母细胞白血病发生中多梳阻遏复合物-1活性所必需的

急性B细胞淋巴母细胞性白血病(B-ALL)是B细胞祖细胞寡克隆进化的结果，B细胞祖细胞具有引发和传播白血病的特性。Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子(Rac GEF) Vav3和Rac GEF酶的激活是致癌融合蛋白BCR-ABL介导的白血病发生所必需的。在表达BCR-ABL信号时，Vav3的表达主要在细胞核中。在细胞核中，Vav3与BCR-ABL、Rac和多梳阻抑复合物(PRC)蛋白Bmi1、Ring1b和Ezh2相互作用。Vav3的GEF活性对于白血病B细胞祖细胞的增殖、Bmi1依赖性B细胞祖细胞自我更新、核Rac激活、与Bmi1的蛋白质相互作用、H2A(K119) (H2AK119Ub)的单泛素化和PRC-1 (PRC1)下游靶位点的阻遏是必需的。Vav3缺陷导致细胞增殖负调控因子的去阻遏和致癌转录因子的阻遏。从机理上讲，我们发现Vav3阻止了Bmi1在调节残基S314上的Phlpp2敏感性和Akt (S473)依赖性磷酸化，进而促进了白血病B细胞祖细胞的转录因子重编程。这些结果强调了非典型核Rho GTP酶信号在白血病发生中的重要性。

费城积极(Ph⁺)t(9；22)(q34；q11.2)产生组成型活性BCR-ABL癌蛋白的易位经常在老年人(60%)和儿童/青少年-年轻成人(AYA) (25%) B-ALL病例中发现^1,2。p190融合蛋白，在60–80%的儿科/AYA Ph中发现的主要形式⁺B-ALL，一种由B细胞祖细胞转化而来的白血病³。Ph样B-ALL具有其他驱动突变，诱导与Ph相同的转录信号⁺B-ALL²。公共卫生⁺和Ph样B-与其他细胞遗传学或分子学异常相比，预后差得多^4,5,6,7。遗传异常，包括Bmi1上调^8,9,10，纯合缺失INK4A/ARF¹¹以及表达淋巴系转录因子基因座的突变PAX5，IKZF1，以及EBF1^12,13,14与BCR-ABL合作，向积极的B-ALL迈进。然而，这些突变并不存在于所有儿童BCR-ABL病例中⁺B-ALL^13,15并且，当存在时，它们通常是单等位基因，这表明杂合性缺失驱动B-ALL转化。在所有B-ALL亚型中都发现了作为异常DNA甲基化靶基因的复发性表观遗传改变，这表明白血病转化需要表观遗传修饰，而不仅仅是遗传修饰¹⁶。我们的研究小组已经证明，参与B细胞祖细胞增殖和分化的癌基因依赖的表观遗传抑制在B细胞祖细胞白血病发生中起着关键作用¹⁷.

BMI1是多梳抑制复合物(PRC)1.4型的主要成分，在BCR-ABL诱导的慢性粒细胞白血病(CML)晚期患者中上调⁸并通过其镇压活动Cdkn2a所在地¹⁸和其它不太明确的活性导致白血病转化¹⁹。通过抑制B细胞转录程序和诱导自我更新基因，BMI1的过表达将淋巴样白血病祖细胞重编程为自我更新和可移植的干细胞样表型^10,20,21.

rho GTP酶在BCR-ABL驱动的白血病的转化、启动和进展中起重要作用。Rac蛋白缺乏损害p210-BCR-ABL表达诱导的髓系白血病发生^22,23。Vav蛋白(Vav1、Vav2和Vav3)是Rac GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)^{24,25,26,27,28,29}。我们之前已经表明，Vav3基因缺失，而不是Vav1和Vav2基因缺失，可延缓BCR-ABL诱导的淋巴细胞白血病，并增加TKI治疗期间的治疗脆弱性³⁰。人和鼠BCR-ABL⁺b细胞祖细胞显示Vav3的表达和活化增加³⁰我们已经证明，在体外和体内，第一类Vav3抑制剂显著损害人和鼠B细胞祖细胞淋巴母细胞白血病发生³¹。Vav3缺陷损害BCR ABL的Rac GTP酶激活、存活和增殖⁺b细胞祖细胞³⁰。Vav3缺陷B细胞祖细胞的存活与促凋亡蛋白的表达水平负相关³⁰。然而，Vav3调节淋巴样白血病B细胞祖细胞增殖的潜在分子机制仍不清楚。在本研究中，我们证明了Vav3控制白血病细胞增殖的机制是通过与PRC复合物成分成核和控制PRC1.4活性相关的非典型核功能。

核VAV3主要以依赖于GEF的方式控制B细胞祖细胞的增殖

先前的结果表明，VAV3活性在许多癌症模型中起着重要的致瘤功能^32,33,34,35。我们以前的工作还表明，Vav3在急性淋巴细胞白血病中起作用，这种功能与B细胞祖细胞的存活调节有关³⁰。然而，这项工作不能确定这一过程中涉及的信号机制³⁰。据推断，这种白血病发生过程与Vav3在质膜上的典型GEF活性的参与有关。为了解决这个问题，我们首先检测了这种GEF在鼠和人BCR-ABL中的表达和细胞分布⁺所有细胞的祖细胞。与我们之前的研究一致³⁰，我们发现p190-BCR-ABL诱导Vav3表达，主要核定位在小鼠B细胞祖细胞中(图。1A湾).使用不同亚细胞提取物的蛋白质印迹分析显示，在这些条件下，Vav3优先位于细胞核中(图。1C).通过检测GEF (Y174)激活步骤中涉及的关键残基的磷酸化水平推断，核Vav3可能处于活性状态(图。1C).类似地，来自Ph的人类B细胞祖细胞⁺或Ph样B-ALL患者，含有继发性致病突变(包括CDKN2A/B缺失、突变型PAX5和IKZF1缺失；看见补充方法)，显示VAV3表达增加，主要分布在细胞核中(图。1D).

A, B共聚焦免疫荧光显微图像(A)和平均荧光强度的量化(B)显示了在p190-BCR-ABL中Vav3的上调和核分布⁺鼠B细胞祖细胞(n=每组13)。Cp190-BCR-ABL的细胞质和细胞核部分中Vav3、pVav3-Y174、Gapdh和Parp的代表性免疫印迹⁺b细胞祖细胞。Vav3主要分布在细胞核部分。D健康供体和B-ALL患者来源的B细胞祖细胞(CD34)中VAV3表达的代表性共聚焦免疫荧光图像⁺/CD19⁺).突变景观从上到下依次是:第一排，正常核型；第二排，BCR-ABL聚变；BCR/EXOSC2融合，CDKN2A缺失；CDKN2B内含子1截短；第三排，BCR-ABL(T315I)；CD36剪接位点609+1G > A；SETD2 E282fs * 19SF3B1 T663I，subTL L2 g 891 fs * 3；TP53 R248Q第四排，BCR-ABL(F359V；T315I)；CDKN2A/B损失；IKZF1损失；ml L2 s 2173 *；PAX5 Y129fs * 64第五排，JAK1 L653(亚克隆)和R724H(亚克隆)；JAK2 R867Q；IGH/crlf 2；CDN2A缺失外显子1；CDKN2B缺失外显子2；foxp 1 R544 *；ZRSR2 R448_R449insSRSR。E来自原始正常和人B-ALL B细胞祖细胞的VAV3的核/胞质平均荧光强度(MFI)比率在中描述D (n=每组16–20人)。Fc-Abl和Vav3或p-Vav3-Y174之间的PLA的代表性共焦图像证明了BCR-ABL和Vav3或p-Vav3之间的物理接近性。GPh中c-ABL和VAV3之间PLA的代表性共焦图像⁺和Ph值⁺(T315I)患者B细胞祖细胞。HVav3的缺乏减弱了白血病B细胞祖细胞的增殖，如通过体内BrdU摄取试验所定量的(n=每组3个)。I, J流式细胞仪点图(I)和量化(J)在Vav3缺陷型B细胞祖细胞中的增殖(BrdU摄取)异位表达结构功能Vav3突变体(FL-全长，CA组成型活性，Vav3 (N369A)(n=每组3个)。KNSG小鼠人B-ALL模型示意图。L标准化转导的人嵌合体(EGFP⁺)显示VAV3 shRNA转导的Ph的嵌合体水平降低⁺(BCR-ABL聚变；BCR/EXOSC2融合，CDKN2A缺失；CDKN2B内含子1截短)和Ph⁺(BCR-ABL(F359V；T315I)；CDKN2A/B损失；IKZF1损失；ml L2 s 2173 *；PAX5 Y129fs*64)骨髓移植组(n=每组4个)。在所有小鼠中，人白血病(转导的和未转导的)的植入率高于90%(见补充图。1F).比例尺，10 μm。蛋白质印迹和显微图像代表至少两个独立实验。数据以最少两次独立实验的平均值±SD绘制。当比较两个以上的组时，使用不成对的Student-t或Anova检验来确定统计显著性。*p <  0.05; **p <  0.01; ***p <  0.001.

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预期的³⁶，BCR-ABL的显著部分位于鼠和人B-ALL B细胞祖细胞的细胞核中(补充图。1A).为了确定ABL和VAV3是否相互作用，我们进行了一项近感连接试验(PLA ),该试验允许用亚细胞定位分辨率原位检测蛋白质-蛋白质相互作用³⁷。使用该方法，我们发现在鼠和人B-ALL细胞祖细胞中，VAV3的核部分确实位于BCR-ABL附近(图。1F，G).相比之下，在来自非白血病小鼠的B细胞祖细胞中没有观察到相互作用(补充图。1B).这些数据表明，在转化的B细胞祖细胞中，BCR-ABL和VAV3在物理上非常接近。

白血病VAV3的核分布促使我们研究它在调节参与白血病B淋巴祖细胞增殖的基因中的作用Vav3^−/−细胞模型(补充图。1C).我们发现Vav3缺陷显著减弱了p190-BCR-ABL的增殖⁺b细胞祖细胞(图。1H).全长(FL) Vav3或组成型活性(CA) Vav3的再表达拯救了Vav3^−/−白血病祖细胞(图。1I，J和补充图。1D).无催化活性的Vav3 (N369A，称为Vav3 NA)的表达不显示这种拯救活性(图。1I，J和补充图。1D)，表明这种生物活性依赖于GEF和GTP酶。同样，我们发现shRNA介导的外源基因敲除VAV3³⁰来自Ph的白血病祖细胞⁺b-所有患者(CD34⁺/CD19⁺；图。1K)将人类白血病祖细胞嵌合体(hCD45)的水平降低约60–75%⁺hCD34⁺hCD19⁺增强绿色荧光蛋白⁺)存在于移植免疫缺陷受体的骨髓中(图。1L和补充图。1F).综上所述，这些数据表明VAV3在Ph的增殖中具有关键作用⁺所有祖细胞。

核Vav3与Bmi1相互作用并调节PRC1活性

为了阐明涉及Vav3介导的p190-BCR-ABL调节的机制⁺白血病发生，我们首先在Vav3缺陷和对照转化的B细胞祖细胞中进行了全基因组表达分析(图。2A).我们鉴定了1110个基因的差异表达(450个上调，660个下调)。Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(< 0.5至> 1.5倍，p <  0.05; Supplementary Data 1).基因本体论(GO)分析揭示了核分裂、细胞周期调控、G₁/S相变、染色体组织和共价组蛋白修饰(图。2B和补充数据2).我们还发现这种转录组与先前在具有细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂功能获得的细胞中发现的转录组相似Cdkn2a和Cdkn2b(GSE125841)³⁸和B细胞分化主调节因子Pax5(GSE126375)³⁹。所有这些基因在B-ALL中都经常改变^40,41。与此一致，我们发现Vav3的缺乏导致所有这些转录物的上调(图。2C和补充图。2A)以及p16Ink4a和p15Ink4b的表达增加(图。2D).然而，表达的Ebf1和Ikzf1另外两个关键的B细胞分化因子，在缺乏Vav3时保持不变(补充图。2A).

A描述图2中进行的分析的示意图。B野生型和野生型差异表达基因的比较转录组和基因本体[分子和生物学功能]Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞，表现出参与核分裂、细胞周期调节、G1/S相转变和组蛋白共价修饰的基因的差异调节。C定量实时PCR (Q-RT-PCR)分析Cdkn2a和Cdkn2b在Vav3p190-BCR-ABL缺陷⁺b细胞祖细胞与其WT对应物相比(n=每组4–12人)。DWT和的全细胞裂解物中p16/Ink4A、p15/Ink4b和肌动蛋白的代表性免疫印迹Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。EWT和的核部分中H2AK119Ub、H3K27me3和Parp的代表性免疫印迹Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。F用空载体转导的WT白血病B细胞祖细胞的核部分中H2AK119Ub和Parp的代表性免疫印迹Vav3^−/−用空载体或Vav3 FL或Vav3N369A GEF突变载体转导的白血病B细胞祖细胞。GQ-RT-PCR分析Cdkn2a和Cdkn2b在空载体转导的WT和空或Vav3或Vav3N369A载体转导的Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(n=每组6–8个)。数据以2或3个独立实验的平均值±标准差表示。使用未配对的学生来确定统计显著性t或者当比较两个以上的组时进行Anova测试。*p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001.

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人类BCR-ABL的转录谱⁺淋巴样和髓样母细胞危象祖细胞分别富含PRC1-和缺乏pr C2-相关基因⁴²。我们的转录数据也表明Vav3在调节组蛋白共价修饰中的作用，如PRC复合物产生的修饰(图。2B和补充数据2).这让我们分析了中国在2005年的活动状况Vav3^−/−白血病祖细胞。我们发现Vav3的损失减少了(60±1%，p < 0.05) the global level of H2A(K119) mono-ubiquitination (H2AK119Ub), a hallmark of PRC1 activity (Fig. 2E).然而，通过分析H3K27三甲基化(H3K27me3)的总体水平评估，Vav3缺陷不影响PRC2活性水平(图。2E).全长Vav3的再表达恢复了整体H2AK119Ub水平和转录抑制。Cdkn2a/2b(图。2F).进一步强调这一过程的全环基金依赖性，当使用无催化活性的Vav3时，我们没有观察到任何拯救活动(图。2F).

之前已经报道了酶ezh 2(pr C2复合物的已知成员)和Vav家族蛋白之间的相互作用⁴³。也描述了PRC2和PRC1之间的动态相互作用⁴⁴。基于我们的数据，我们假设VAV3和BMI1，PRC1复合蛋白中负责H2AK119单泛素化的关键成分⁴⁵，可能会参与这个过程。为了验证这一想法，我们使用Ba/F3细胞的细胞质和细胞核提取物进行了Bmi1和Vav3共免疫沉淀(图。3A).与原始鼠B细胞祖细胞相似，我们观察到p190-BCR-ABL促进了这些细胞中Vav3的表达和核定位(图。3B和补充图。2B角).正如所料，PRC蛋白Bmi1和Ring1B存在于细胞核部分(图。3B).我们发现Vav3与Bmi1、Ring1B和PRC2蛋白Ezh2免疫沉淀(图。3C).相反，我们发现在这些细胞中，Vav3也与Bmi1免疫共沉淀(图。三维（three dimension的缩写）).尽管主要在细胞质中，我们也发现Rac1和Rac2 GTP酶在表达p190-BCR-ABL的Ba/F3细胞中与核Vav3免疫共沉淀(图。3B角).

A描述图3中进行的分析的示意图。B–D输入的蛋白质印迹分析(B)，Vav3抗体免疫沉淀(C)，以及免疫沉淀的Bmi1抗体(D)空载体和p190-BCR-ABL转导的Ba/F3细胞的细胞质和细胞核部分。E空载体或p190-BCR-ABL转导的Ba/F3细胞中Vav3和Bmi1之间PLA的共聚焦显微图像。F中描述的PLA信号平均荧光强度的量化D (n=每组16–43人)。G空载体或p190-BCR-ABL转导的鼠B细胞祖细胞中Vav3和Bmi1之间PLA的共聚焦显微图像。H中描述的PLA信号平均荧光强度的量化G (n=每组12个)。细胞核Vav3和Bmi1非常接近，p190-BCR-ABL表达增强PLA信号。I, JVav3和Bmi1之间的PLA的共焦显微图像(I)和量化(J)在空载体转导的WT白血病鼠B细胞祖细胞和空载体/Vav3 FL/Vav3 GEF失活突变慢病毒载体转导的Vav3^−/−白血病鼠B细胞祖细胞(n=每组11–17人)。K, LVav3和Bmi1之间的PLA的共焦显微图像(K)和量化(L)以WT和Rac2^−/−白血病鼠B细胞祖细胞(n=每组12–15人)。比例尺，10 μm。数据表示为2或3个独立实验的平均值±SD。使用未配对的学生来确定统计显著性t或者当比较两个以上的组时进行Anova检验。使用对数秩检验存活率的差异P测试。*p <  0.05; **p <  0.01; ***p <  0.001.

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为了验证这些观察结果，我们还发现Vav3和Bmi1在细胞核内非常接近(图。3E，F).Bmi1和Vav3也与初级鼠祖细胞相关，p190-BCR-ABL的异位表达促进了相互作用(图。3G，H).与全长Vav3蛋白相比，催化缺陷型Vav3(N369A)突变蛋白与Bmi1的相互作用降低了约2倍(图。3I，J).在Rac2缺陷的白血病B细胞祖细胞中观察到类似的效果(图。3K湖)，进一步表明发生在细胞核内的va v3-BMI 1相互作用是GEF和GTP酶依赖性的。

Vav3与Bmi1在B细胞白血病发生中的协同作用

为了确定Vav3和Bmi1相互作用是否调节PRC1活性和p190-BCR-ABL诱导的B-ALL进展，我们共转导WT和Vav3^−/−具有p190-BCR-ABL(加上EYFP)和Bmi1(加上EGFP)双顺反子整合载体的低密度骨髓细胞(LDBM)，然后将它们移植到致命辐射的同源雌性小鼠中以监测白血病发生(图。4a).作为对照，我们使用只表达EGFP的载体。我们证实了Bmi1转导的白血病祖细胞中核Bmi1过表达(FSC^你好增强型黄色荧光蛋白⁺增强绿色荧光蛋白⁺B220^瞧CD19⁺免疫球蛋白M^–CD43⁺)(补充图。3和图。4b).与我们之前的报告一致^10,30p190-BCR-ABL-表达野生型或Vav3^−/−白血病LDBM细胞在这两种情况下都导致白血病发生，如通过检测头颈部的淋巴结病、肝脾肿大和骨外肿瘤所证实的(数据未显示)。然而，这一过程在Vav3缺陷型LDBM细胞的小鼠受体中显著延迟(图。4C).WT白血病细胞中Bmi1的过度表达导致更具侵袭性的白血病的发展，导致约40%的移植小鼠比对照组死亡快得多(图。4C).然而，当Bmi在Vav3缺陷细胞中异位表达时，没有观察到体内白血病发生的加速(图。4C).当使用不同细胞剂量的来源于野生型和非野生型的B细胞祖细胞的系列移植时，这种差异行为被进一步放大Vav3^−/−原发白血病小鼠(图。4D).全外显子组测序和拷贝数变异分析表明，在连续繁殖的野生型和野生型小鼠中，含有白血病发生相关基因的区域没有大规模突变或拷贝数变异Vav3^−/−白血病(补充数据3).然而，我们确实在四个分析的继发性WT白血病中的三个中发现了Pax5 (P80R)的杂合点突变，但在这些白血病中没有发现。Vav3^−/−白血病。有趣的是，这种由Vav3缺陷引起的次级受体存活率的差异并没有被Bmi1的过度表达所挽救(图。4D)，强化了Vav3是Bmi1诱导的白血病加速所必需的概念。

A野生型或Vav3^−/−用p190-BCR-ABL逆转录病毒和空的或Bmi1慢病毒共转导的LDBM细胞被移植到致死辐射的C57Bl/10小鼠中，用于发展p190-BCR-ABL诱导的B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。B来源于p190-BCR-ABL逆转录病毒和空的或Bmi1慢病毒共转导和移植的白血病小鼠的B细胞祖细胞的细胞质和细胞核提取物中Bmi1、Parp和Gapdh的代表性免疫印迹(n=每组10只小鼠)。CKaplan-Meier对移植WT或Vav3^−/−LDBM细胞(10⁶细胞/小鼠)与p190-BCR-ABL逆转录病毒和空病毒或Bmi1慢病毒共转导。Vav3缺陷导致嵌合体小鼠死亡的显著延迟。Bmi1在WT中过度表达，而在非WT中过度表达Vav3^−/−白血病细胞导致嵌合体小鼠死亡的潜伏期显著缩短。D移植了10只小鼠的次级受体小鼠的Kaplan-Meier生存分析(90天)⁴(虚线，黑色-WT空；灰色-Vav3^−/−空的；浅蓝色-Vav3^−/−Bmi1)，3 × 10⁴(虚线，黑色-WT空；灰色-Vav3^−/−空的；浅蓝色-Vav3^−/−Bmi1)和10⁵(实线，黑色-WT空；灰色-Vav3^−/−空的；浅蓝色-Vav3^−/−Bmi1)来源于原发性白血病小鼠的白血病B细胞祖细胞。Vav3缺陷显著延长了存活时间。之间的存活率没有显著差异Vav3^−/−+空且Vav3^−/−+ Bmi1在测试的三个细胞剂量的任何一个中被发现(n=每组10只小鼠)。EWT和的BrdU摄取的定量Vav3^−/−共表达p190-BCR-ABL和Bmi1的b细胞祖细胞。Vav3缺陷部分削弱了Bmi1过表达效应(n=每组3个)。FCFU-普罗布的系列平板显示Vav3缺陷的空的或Bmi1转导的p190-BCR-ABL表达B细胞祖细胞的CFU产生能力的消除。GH2AK119Ub和β-肌动蛋白在空的或Bmi1过表达的WT或Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(n=每组3个)。H空的或Bmi1过表达的WT或中的Rac活化分析Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。I空的CFU-普罗伯含量或Bmi1过度表达WT或Rac2^−/−白血病B细胞祖细胞(n=每组6个)。数据以两个或三个独立实验的平均值±标准差表示。当比较超过2组时，使用不成对的Student-t或Anova检验来确定统计显著性。*p < 0.05; **p <  0.01; ***p < 0.001.

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进一步的分析表明Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞比他们的对照细胞增殖少(图。4E和补充图。4A).Bmi1过度表达导致WT和Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(图。4E和补充图。4A).然而，Bmi1表达的增殖希伯来语的第六个字母3^−/−细胞数量显著低于野生型对照组(减少约20%)(图。4E和补充图。4A).这表明Bmi1的过度表达不能克服Vav3^−/−细胞。我们还发现，Vav3缺陷和Bmi1过度表达分别损害和增加了白血病祖细胞的自我更新能力(图。4F).Bmi1的过表达部分地消除了Vav3缺陷对原发性克隆原性白血病祖细胞频率的影响，但不能消除Vav3缺陷对白血病祖细胞增殖和自我更新的负面影响(图。4F).在生化水平上，Bmi1过表达并不能拯救Vav3缺陷的白血病B细胞祖细胞的受损H2AK119Ub(图。第四代移动通信技术).这些结果表明，Bmi1诱导的自我更新、体内肿瘤启动/传播和PRC1活性的刺激都是Vav3依赖性的。

Bmi1依赖性核Rac激活依赖于Vav3

为了了解在Bmi1过度表达的情况下Vav3在核Rac激活中的作用，我们在p190-BCR-ABL的核部分进行了Rac GTP酶激活试验⁺b细胞祖细胞。Bmi1过度表达增加，而Vav3缺陷消除Rac激活(图。4H).WT白血病B细胞祖细胞中Bmi1诱导的Rac活化与Vav3的增强表达和活化相关(补充图。4B).RAC 2 GTP酶的基因去除现象复制了Vav3缺陷，消除了Bmi1过度表达对p190-BCR-ABL的扩张效应⁺白血病B细胞集落形成(图。4I).为了进一步分析Bmi1在p190-BCR-ABL中的作用⁺b细胞祖细胞在Vav3和Rac2缺乏的情况下，我们通过shRNA介导的敲除来减少Bmi1(补充图。5A).系列克隆原性CFU-普罗布试验表明，p190-BCR-ABL转化的B细胞祖细胞的再植能力完全依赖于内源性Bmi1表达(补充图。5B).这些数据加强了Vav3和Rac2在Bmi1介导的白血病祖细胞转化和自我更新中的作用。

Vav3是维持体内平衡PRC1.4表观遗传程序所必需的

为了在全基因组水平上评估Vav3对PRC1.4活性的影响，我们使用核酸酶进行了靶向切割和释放，随后在WT和Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。该技术切割与蛋白A缀合的微球菌核酸酶相关的DNA序列，从而允许检测整个基因组中DNA调控区的蛋白结合和组蛋白标记富集。为此，我们在WT和中执行了切割和运行序列Vav3^−/−使用特异性抗体的白血病B细胞祖细胞。在Bmi1缺失(CRISPR/Cas9)的前B白血病Ba/F3细胞中评估，证实抗Bmi1抗体对核Bmi1具有特异性(补充图。6A湾)和抗体，之前已验证染色质免疫沉淀，随后是Ring1b和H2AK119Ub抗体的下一代测序⁴⁶被用过。随后，Bmi1、Ring1b和H2AK119Ub在WT和Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞按照方法(补充图。7和8).每个CUT&RUNseq数据集的重复之间的相关性(补充图。7A)证实了抗Bmi1结合的良好相关性(r≥ 0.84)与Ring1b和H2AK119Ub标记的相关性较低。我们发现抗体结合峰的分布没有明显差异(补充图。7B)，尽管我们确实在抗体结合峰产生的平均信号中检测到统计学上显著的定量差异(补充图。7C–E和8A–C)用于Bmi1、Ring1b和H2AK119Ub。具体来说，349个位点明显缺乏Bmi1结合。Vav3^−/−p190-BCR机场⁺b细胞祖细胞(补充图。8A和补充数据4).Ring1b和H2AK119Ub切割和运行数据集的差异结合分析显示，在Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(5607 Ring1b结合和2605 H2AK119Ub结合)(补充图。8B，C和补充数据5和6).为了鉴定PRC1.4特异性靶标，我们对所有三个数据集进行了交叉分析，发现了75个共同基因座(p= 1.77 × 10⁻⁴⁹)包括编码细胞周期调节因子的那些(Cdkn2a，Cdkn2b，Mir503，Cdc7, Cdk8，Nrbp1，Tgfbr3，Phkg1，Nek8，Pan3，Tec，Prkag2，Proca1)与Bmi1、Ring1b和H2AK119Ub的相关性降低有关Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(图。5A–C；补充图9A、B；和补充数据7).这些数据进一步支持了Vav3在PRC1调节中的作用Cdkn2a/2b如上所述的表达和细胞周期进程(图。1h，J和2B–东和补充图。10A).他们还提出，在表观遗传学水平上对前述基因座的调节可以代表一种似乎合理的机制来解释白血病B细胞白血病中杂合性的丧失，该白血病B细胞白血病通常仅包含以下之一的杂合性缺失Cdkn2a/b对立形质^16,47。相反，我们还发现在345个基因座中Bmi1增加(补充图。7C和8A和补充数据4)以及在缺乏Vav3表达的细胞中与增加的Ring1b (535个基因座)和H2AK119Ub结合(3506个基因座)相关的更高数量的基因(补充图。7D，E和8B，C和补充数据5和6).对那些细胞中Bmi1、Ring1b和H2AK119Ub结合增强的基因座的分析确定了50个常见基因座(p= 4.5 × 10⁻⁶⁸)具有直接或RNA pol-II结合依赖性转录调节活性(图。5D–F补充图。9C，D和10B和补充数据8).我们证实了致瘤转录因子的表达减少Isl1⁴⁸，Zfhx3⁴⁹，Meis2⁵⁰和Bhlhe22⁵¹ 在va v3-缺陷细胞(补充图。10C)，表明PRC1.4复合物与这些基因座的结合增加也与这些白血病原基因的抑制有关。Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。

A描述基因交叉的文氏图，其中Bmi1、Ring1b和H2AK119Ub的CUT&RUNseq信号在Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(Diffbind: Log₂折叠变化>1, p <  0.05). BBmi1、Ring1b和H2AK119Ub结合减少的基因的分子和生物学功能的基因本体论分析。与蛋白激酶活性负调节、蛋白磷酸化负调节和细胞周期G1/S转换相关的基因显示PRC1成分结合减少。CBmi1、Ring1b和H2AK119Ub结合减少的75个常见基因的代表性密度图Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。显示的轨迹用于Bmi1结合。在WT和的两个切割和运行重复之间进行Diffbind分析Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞，和一个代表性的例子密度图。D显示Bmi1、Ring1b和H2AK119Ub结合的基因交叉的文氏图Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞增加(Diffbind: Log₂折叠变化>1). EBmi1、Ring1b和H2AK119Ub结合增加的基因的分子和生物学功能的基因本体论分析。与RNA polII转录调节区相关的基因特异性DNA结合，转录因子调节子活性显示增加的PRC1成分结合。FBmi1、Ring1b和H2AK119Ub结合增加的50个常见基因的代表性密度图Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。显示的轨迹用于Bmi1结合。在WT和的两个切割和运行重复之间进行Diffbind分析Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞，和一个代表性的例子密度图。

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Vav3/Phllp2/Akt轴调节核Bmi1磷酸化和PRC1活性

已经表明在S上Bmi1的磷酸化³¹⁴被激活的Akt导致Bmi1从PRC1复合物上解聚，并随后去阻遏。Cdkn2a⁵²。为了理解Vav3缺陷如何削弱Bmi1的致癌作用，去抑制与增殖和分化相关的基因，并导致Bmi1与自我更新相关基因的重新连接，我们接下来决定比较p190-BCR-ABL中Bmi1的表达和磷酸化水平⁺重量和Vav3^−/−b细胞祖细胞。使用这些分析，我们发现Vav3的损失导致59±4.9%(p < 0.01) increase in phospho-S³¹⁴p190-BCR-ABL细胞核部分的Bmi1蛋白水平⁺ Vav3^−/−b细胞祖细胞(图。6A).虽然总Bmi1表达保持不变，但Vav3缺陷与Bmi1从与染色质结合到核基质的穿梭相关(图。6B).这种增加的磷酸化水平与表达增强相关。Cdkn2a，Cdkn2b, 和Pax5成绩单在Rac2^−/−白血病B细胞祖细胞(补充图。11A、B).总之，这些数据表明va v3–Rac2活性是确保Bmi1的核表达和染色质结合所必需的。

A代表性免疫印迹显示Bmi1在细胞核部分的磷酸化增强。Vav3^−/−p190-BCR机场⁺b细胞祖细胞。B代表性免疫印迹显示染色质结合减少，核基质Bmi1增加。Vav3^−/−p190-BCR机场⁺b细胞祖细胞。Cmock、Bmi1和Bmi1 (S314A)转导的WT和Vav3^−/−p190-BCR机场⁺b细胞祖细胞(n=每组6个)。DQ-RT-PCR分析Cdkn2a在空载体/Bmi1/Bmi(S314A)转导的WT和中的表达Vav3^−/−p190-BCR机场⁺b细胞祖细胞(n=每组4个)。EWT和Vav3缺陷型p190-BCR-ABL的细胞质和细胞核部分中p-Akt (S-473)、Akt和Phlpp2的代表性免疫印迹⁺b细胞祖细胞。代表性的膜印迹与图1相同。6a. F在MK2206处理的WT和的核部分中p-Bmi1、pAkt-S473和Parp的代表性免疫印迹Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。G白血病B细胞前体细胞核中Vav3和Phlpp2之间PLA的共聚焦显微图像。H描述WT和共转导的示意图Vav3^−/−林⁻受体⁺Sca1⁺用p190-BCR-ABL逆转录病毒和空的或Phlpp2慢病毒培养的BM细胞，然后移植入C57bl/10小鼠。I移植WT或or的初级受体小鼠的Kaplan-Meier生存分析Vav3^−/−林⁻受体⁺Sca1⁺用p190-BCR-ABL逆转录病毒和空的或Phlpp2慢病毒(n=每组5只小鼠)。Vav3缺陷显著延长了存活时间。Phlpp2过表达于Vav3^−/−祖细胞恢复白血病发生。J空载体或Phlpp2转导的WT的CFU-普罗布含量和Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(n=每组3个)。KWT和中p-Bmi1、Bmi1、H2AK119Ub、Phlpp2和Parp的代表性免疫印迹Vav3^−/−用空病毒或Phlpp2慢病毒转导的白血病B细胞祖细胞。LQ-RT-PCR分析Cdkn2a在空的或Phlpp2转导的野生型和Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(n=每组5个)。M代表控制白血病原性PRC1.4活性的核蛋白复合物的模式。标尺，10 μm。数据表示为两个或三个独立实验的平均值±SD。使用未配对的学生来确定统计显著性t或者当比较两个以上的组时进行Anova测试。使用对数秩P检验检验存活率的差异。*p <  0.05; **p <  0.01; ***p <  0.001.

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为了进一步研究VAV3的缺乏是否会导致BM1-1磷酸化的增加和人类B细胞前体白血病的生长停滞，我们沉默了VAV3在四个独立的Ph中⁺人B-前体白血病细胞系(BV-173、NALM-1、汤姆-1和SUP-B15)^53,54,55,56。除了靶向BCR和ABL基因座的突变外，这些细胞系还含有额外的次级突变。与原代细胞相似，我们发现在这些B-ALL细胞系中，VAV3的表达主要在细胞核中(补充图。12A).更重要的是，我们发现在VAV3下调后，VAV3的残留表达与BMI1磷酸化负相关(补充图。12B).VAV3的沉默也导致液体培养中CFU胚形成频率和扩增能力的降低(补充图。12C，D).为了证实Vav3-Rac2轴参与了Bmi1去磷酸化状态的下调，我们转导了WT和Vav3^−/−使用慢病毒递送方法的Bmi1野生型或磷酸化缺陷型(S314A)白血病B细胞祖细胞(补充图。13A).正如预期的那样，Bmi1(S314A)的表达拯救了白血病细胞的生长(图。6C)，H2AK119泛素化(补充图。13A)，以及对Cdkn2a关于Vav3^−/−p190 BCR机场⁺b细胞祖细胞(图。6D).

为了进一步理解这一过程，我们分析了活化的Akt(磷酸-S⁴⁷³)在WT和Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞。我们观察到Akt优先定位于细胞质部分，而与所分析细胞的基因型无关(图。6E).然而，我们发现6.0±1.1高水平的活化Akt存在于细胞核中。Vav3^−/−当与野生型对照相比时，白血病B细胞祖细胞(p <  0.001; Fig. 6E).变构Akt特异性抑制剂MK2206减少了在Vav3缺陷细胞中发现的Bmi1磷酸化(图。6F)，表明在这些细胞中发现的磷酸Bmi1的增强表达依赖于核Akt激活。蛋白磷酸酶2A (Pp2a)和针对磷酸化T细胞的pleckstrin同源结构域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2 (Phlpp2)共同作用下调Akt活化³⁰⁸和S⁴⁷³Akt的残基^57,58。我们观察到降低的水平(40±2%，p <  0.01) of Phlpp2 in the nuclear fraction of Vav3^−/−白血病B细胞祖细胞(图。6E).在转录水平没有观察到这种变化(补充图。13B)，表明该磷酸酶在转录后水平受到调节。在缺乏Vav3时Pp2a的表达也减少(41±15%，p < 0.05, n= 2).然而，在这种情况下，我们不能观察到任何磷酸-Akt(T308)水平的变化。Vav3^−/−白血病祖细胞核部分(补充图。13C).这表明Pp2a不太可能参与这一调节步骤。进一步加强Vav3和Phlpp2之间的信号联系，我们发现这两种蛋白在核内非常接近(图。6G).在Bmi1和Phlpp2之间没有发现这种接近，表明Phlpp2本身不太可能调节Bmi1磷酸化(补充图。13D).这些数据支持Vav3与Phlpp2联合维持B-ALL祖细胞细胞核中低水平Akt和Bmi1磷酸化的概念。

Phlpp2的异位表达恢复Vav3缺陷的白血病B细胞祖细胞的核Bmi1表达和白血病发生

为了了解Phlpp2在Vav3依赖的B细胞白血病发生中的作用，我们分离了谱系⁻/c套件⁺/Sca-1⁺(LSK)野生型或野生型骨髓祖细胞Vav3^−/−在用编码p190-BCR-ABL的逆转录病毒加上对照或表达Phlpp2的慢病毒转导后，将小鼠移植到C57/Bl10同源受体中(图。6小时).移植了BCR-ABL的小鼠⁺用表达Phlpp2的慢病毒颗粒和对照慢病毒颗粒转导的LSK细胞发展为B-ALL，平均存活时间分别为50天和45天(图。6I).正如所料，移植了Vav3^−/−用p190-BCR-ABL和空载体共转导的LSK比以前的存活时间明显更长(平均存活100天)。然而，Phllp2在这些细胞中的异位表达消除了Vav3缺陷的影响，导致中位死亡时间显著缩短至70天(图。6I).Phlpp2的过表达也恢复了Vav3^–/–白血病B细胞祖细胞(图。6J)以及正常水平的Bmi1磷酸化、H2AK119泛素化和Cdkn2a和Pax5表情(图。6K，L和补充图。13E).这些结果表明，细胞核va v3–PHL LP 2–Akt–BMI 1轴在p190-BCR-ABL的进展中起重要作用⁺B-ALL(图。6M).

在目前的研究中，我们证明了在BCR-ABL表达后，Vav3在人和鼠淋巴母细胞白血病祖细胞的细胞核中意外地被上调和激活。此外，我们已经表明在细胞核中发现的Vav3的交换活性对于p190-BCR-ABL的增殖和进展是重要的⁺白血病利用PRC1-依赖机制，并在较小程度上利用pr C2-依赖机制。缺乏Vav3的白血病B细胞祖细胞的PRC1.4活性受损，与Bmi1的磷酸化增加和失活有关。我们之前已经报道了VAV3的抗凋亡活性³⁰以及其被第一类小分子抑制剂靶向，所述小分子抑制剂在体外和体内显著损害人和鼠B-细胞祖淋巴母细胞白血病发生³¹。总之，这些数据巩固了我们对VAV3驱动的肿瘤发生及其对B-ALL治疗的翻译重要性的理解。

Vav3缺陷型淋巴样白血病B细胞祖细胞的增殖减少与至少Cdkn2a和Cdkn2b，已知受PRC调控的基因。PRC系统(PRC1和PRC2)调节发育基因表达，控制干细胞自我更新和谱系定向，并且在癌症中经常被解除调节⁵⁹。这两种PRC复合物协同调节组蛋白修饰和靶基因的阻遏。基因抑制的经典模式始于PRC2的H3K27三甲基化，接着是PRC1介导的H2AK119单泛素化，导致基因表达的抑制。PRC1复合物由环1A或环1B与六种PCGF蛋白(PCGF1-6)之一结合形成，形成具有不同生物学功能的PRC1至PRC6复合物⁶⁰。BMI1/PCGF4是PRC1.4的关键成分，控制正常和白血病干细胞的增殖能力和自我更新能力^20,21。BMI1抑制活性需要依赖PRC2/EZH2的H3K27me3^44,61以及将RING1蛋白的E3泛素连接酶活性激活为单泛素化H2A (K119)⁴⁵。我们还发现了一组公认的致癌转录因子，它们的表达在Vav3缺陷的白血病B细胞祖细胞中被PRC1.4进一步抑制。总之，这组数据强烈表明，Vav3依赖的转录抑制程序并不普遍，在许多基因座中，Vav3依赖的PRC1.4抑制活性可能被在缺乏Vav3时激活PRC1.4抑制活性的替代系统所取代。

BMI1在BCR-ABL诱导的慢性粒细胞白血病(CML)晚期患者中上调⁸并通过其镇压活动Cdkn2a所在地¹⁸和其他不太明确的特征Cdkn2a独立活动导致白血病转化¹⁹。BMI1和BCR-ABL在人脐血CD34中的共表达⁺细胞诱导白血病，可在偏向淋巴母细胞危象的免疫缺陷小鼠中连续繁殖⁹。我们的小组已经证明，BMI1将CML B淋巴祖细胞转化和重编程为自我更新的白血病起始细胞¹⁰。Bmi1缺失通过上调淋巴特异性基因加速B细胞分化⁶²并且Bmi1的转录抑制活性是正常和白血病干细胞自我更新所必需的^20,21.

Akt对残基S314上的Bmi1磷酸化⁵²导致其失活并从PRC1复合物上解离，导致Cdkn2a所在地⁵²。这种效应是残基特异性的，因为Bmi1在其他Akt依赖位点的磷酸化²⁵¹，S²⁵³、和S²⁵⁵导致Bmi1激活⁶³。我们发现在缺乏Vav3或Rac2表达的S314上Bmi1磷酸化增加，表明Vav3/Rac2阻止Bmi1磷酸化。Bmi1磷酸化增加与细胞核内Akt活化增加和磷酸化Akt(S473)特异性蛋白磷酸酶Phlpp2水平降低相关⁶⁴。发现Phlpp2不直接接近Bmi1，表明Phlpp2不太可能直接作用于Bmi1磷酸化。Phlpp2或突变体Bmi1 (S314A)的过表达，而不是野生型Bmi1的过表达，导致白血病发生和转录抑制的恢复。Vav3控制肿瘤抑制因子Phlpp2的核表达的机制尚不清楚，但通过p27(kip1)稳定Phlpp2，p27是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，在白血病祖细胞中由BCR-ABL上调⁶⁵，已突出显示⁶⁶Vav3可能参与了Phlpp2的稳定。

核Rac在染色质修饰和基因表达中起着关键作用⁶⁷下游肌动蛋白聚合在控制胚胎干细胞分化的异染色质和常染色质之间的基因再定位中起主要作用⁶⁸。Rac及其下游靶波是转录重编程所必需的⁶⁹并且聚合肌动蛋白已被证明控制多梳介导的基因沉默⁷⁰。在白血病祖细胞中，Rac2足以观察到Vav3缺陷的影响，而Rac1对于BCR-ABL诱导的增殖是不必要的^22,23,30。连同我们公布的数据³⁰该报告支持核Vav3和Rac2在调节B细胞白血病发生中的PRC1.4依赖性转录抑制和重编程中的选择性作用，并表明它们控制转录抑制的更高水平的核结构，选择性地作用于特定位点。抗Bmi1结合使我们能够建立足够的信号/噪声比，以区分Vav3缺陷白血病祖细胞中最有差异的结合位点，并确定75个与B细胞祖细胞增殖和分化相关的PRC1.4结合/活性降低的位点，而与自我更新相关的其他50个位点增加了PRC1.4结合/活性。这种差异结合的机制尚不清楚，但它可能依赖于优先结合的高级染色质结构的选择性和替代的非规范PRC1.4复合物的使用(综述见参考文献1)。⁷¹).

总之，本研究的结果表明，Vav3主要存在于白血病B细胞祖细胞的细胞核中，它在Ph中起关键作用⁺白血病发生通过调节PRC1.4活性并依赖于核Phlpp2调节的Akt活性。这种对与致癌性多梳抑制程序相关的细胞核GEF活性的描述，打开了一个研究领域，以更好地理解核Rho GTP酶在白血病发生中的作用。