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黑色素瘤的持续状态导向转变和脆弱性

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发表时间:2022-06-02 09:58作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

黑色素瘤是一种高度可塑性肿瘤,其特征在于不同细胞身份的动态相互转化,这取决于生物学背景。H3K4去甲基化酶KDM5B (JARID1B)高表达的黑色素瘤细胞处于缓慢循环但可逆的持续状态。久而久之,KDM5B高的细胞可以促进具有平衡的KDM5B表达异质性的快速肿瘤再生。KDM5B的细胞特性高的到目前为止,还没有对持久细胞进行研究,错过了黑色素瘤中一个重要的细胞状态导向治疗机会。在这里,我们建立了一个多西环素可滴定系统,用于遗传诱导KDM5B在肿瘤内的永久表达,并筛选出具有这种效应的化学药物。转录谱和细胞功能分析证实,二氢吡啶2-苯氧基乙基4-(2-氟苯基)-2,7,7-三甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氢-喹啉-3-羧酸酯(称为Cpd1)支持高KDM5B表达,并指导黑色素瘤细胞沿着黑素细胞谱系分化和细胞周期停滞。高KDM5B状态还通过细胞动力脱落的负调节防止细胞增殖。此外,用Cpd1治疗促进了黑色素细胞特异性酪氨酸酶基因的表达,该基因特异性地使黑色素瘤细胞对酪氨酸酶加工的抗叶酸前药3-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-(–)-表儿茶素(TMECG)敏感。总之,我们的研究为黑色素瘤的双重打击策略提供了概念证明,其中持续的状态导向转变限制了肿瘤的可塑性,并使黑色素瘤细胞朝着谱系特异性消除的方向发展。

介绍

细胞可塑性描述了细胞从一种表型转换到另一种表型的能力,并被认为是非遗传肿瘤进化的主要驱动力。最近的时间分辨转录组分析指出了对黑色素瘤作为一种异质生态系统的理解,该生态系统通过可变分化的持续状态动态转变,以逃避外源性压力,如减瘤治疗1,2,3.

跨越不同癌症的持续细胞的一个标志是它们暂时停留在染色质介导的慢循环状态,其特征是组蛋白H3赖氨酸去甲基化酶(KDMs)的高但可逆的核表达4,5,6。持续细胞的其他特征是维持胚胎存活或代谢程序,平衡它们对氧化线粒体呼吸的依赖以及氧和脂质自由基的解毒5,7,8。迄今为止,大多数研究都集中在通过利用单个弱点,如脂肪酸氧化、自噬或铁下垂,选择性消除作为总肿瘤群体中的小亚群的持续细胞9,10,11。先前选择性消除表达H3K4去甲基化酶的黑色素瘤细胞(KDM5B高的),例如,基于它们对氧化ATP产生的生物依赖性,显示出一些效果,但是受到这种肿瘤实体的高代谢灵活性的影响12,13。令人惊讶的是,KDM5B的细胞特性高的黑色素瘤持续存在至今未被解开,错过了一个重要的治疗机会。此外,在该领域中缺乏操纵持续细胞表型转换的动力学以及将这些与细胞身份特异性消除相结合的策略。

黑色素瘤通常以KDM5B的连续表达谱为特征高的,KDM5B中间的和KDM5B低的细胞。相比之下,良性黑素细胞痣在大多数细胞中高水平表达KDM5B14。单一分选的黑色素瘤细胞可以快速重建KDM5B异质性,而与它们最初的KDM5B表达水平无关15。即使是KDM5B的显著浓缩高的这在体外和体内的细胞毒性应激下是常见的5,16,17,在存活的黑色素瘤细胞中迅速恢复正常分布。这表明慢循环KDM5B高的持续细胞是肿瘤再生的短暂来源,但黑色素瘤的长寿需要动态的KDM5B肿瘤组成。

总之,这表明慢循环KDM5B高的根据生物学背景,持续状态可能对肿瘤命运具有不同的、甚至相反的影响,并且可能被用作黑色素瘤中肿瘤消除策略的治疗靶点。在本研究中,我们系统地研究了(KDM5B的实际分化表型高的黑色素瘤持续状态,(ii)迫使黑色素瘤细胞异位高水平表达KDM5B而没有机会自发恢复正常表达异质性的后果,以及(iii)KDM5B指导的细胞状态转变是否可用作治疗弱点。

结果

KDM5B在肿瘤内强制和持续表达的模型高的

KDM5B在黑色素瘤中的表达通常是不均匀分布的,而良性黑色素细胞痣在大多数细胞中高水平表达KDM5B(图。1a15).黑色素瘤中KDM5B的高表达与患者存活率低显著相关(图。1b),而其他KDM5家族成员缺乏这种关联(补充图。1a).在其他癌症实体中,KDM5B与生存率不一致(补充图。1b).为了建立一个允许外源诱导KDM5B蛋白表达的实验模型,我们克隆了一个Tet-On 3G-系统,其中KDM5B的表达由一个强力霉素诱导的P。TRE3G启动子和已建立的稳定黑素瘤细胞克隆(WM3734Tet3G-KDM5B和WM3734Tet3G-EGFP控制,补充图。2a–c).克隆扩增和多西环素诱导后,我们观察到KDM5B mRNA和蛋白水平的剂量依赖性上调(图。1c和补充图。2c),伴随着H3K4me3蛋白水平的反向降低,证实了功能性KDM5B的表达(补充图。2d).在持续多西环素治疗至少3周后,KDM5B蛋白水平稳定上调(补充图。2d).KDM5B免疫染色显示在WM3734的大部分中信号增加Tet3G-KDM5B细胞(图1d).从这里开始,我们将这种情况称为强制KDM5B高的细胞状态。

图1:组蛋白H3K4去甲基化酶KDM5B/JARID1B的表达调节。
figure 1

a黑色素瘤患者样品(左)与良性人类痣(右)的抗KDM5B免疫染色。高阳性细胞核为暗红色,中阳性细胞核为浅红色,低表达细胞核为蓝色。Isotype质控品显示在右上角。描绘了不同黑素瘤或痣样品的代表性图像(n=每个5)。b皮肤黑色素瘤患者的Kaplan-Meier生存曲线是根据TCGA数据集计算的,该数据集基于KDM5B表达的切点优化(高表达,红色,对低表达,绿色,TCGA浏览器工具UCSC谢轩和GraphPad Prism)。样本量显示在风险患者表中(风险数)。通过Long-rank(Mantel-Cox)检验来检验显著性。cqPCR评估强力霉素(Dox)治疗24小时后KDM5B mRNA诱导的定量。示出了一个代表性例子(平均,n= 2).dWM3734的抗KDM5B核免疫染色Tet3G-KDM5B在指定浓度下Dox滴定24小时后的细胞(左,代表性图像;右,定量显示为核染色强度的归一化频率分布)。显示的是三个克隆中的一个代表。e用Cpd1处理72小时后,用流式细胞仪检测内源性KDM5B蛋白水平n= 4);两方面的t-测试。f在10 M Cpd1处理72小时后,三种不同黑素瘤细胞系(WM3734、WM88、MelJuso)的抗KDM5B核免疫染色(左,代表性图片;右,定量显示为核染色强度的归一化频率分布)。g用Cpd1 (10 M)加环己酰亚胺(CHX,50 g/ml,n= 2).hCpd1处理72小时后,泛素蛋白缀合物在WM3734细胞中免疫沉淀。泛素化细胞蛋白的总含量通过泛泛素-HRP抗体检测(上排)。通过KDM5B特异性抗体检测泛素化KDM5B蛋白的部分(中间一行)。Neg4用作结构同系物对照(n= 2).为了改善由免疫沉淀产生的KDM5B条带的可视性,两种处理的对比度被同等地增强。源数据作为源数据文件提供。

为了获得调节KDM5B表达的第二种独立方法,该方法还允许简单地应用于几种黑色素瘤细胞系或体内,我们开发了一种基于细胞的化合物筛选试验,应用了我们以前发表的KDM5B启动子-EGFP-在WM3734黑色素瘤细胞(WM3734kdm5b rom-EGFP细胞15,补充图。3a).这种基于荧光的模型有助于监测KDM5B转录状态的动态性质。在筛选了7500个化合物的文库后,在一个CMV-启动子-EGFP-在剂量-反应曲线和独立检测中进一步验证了报告基因检测和确认的命中(补充图。3b–d).选择hit化合物的主要标准是在治疗的72小时内没有直接的整体细胞毒性和调节KDM5B启动子驱动的EGFP表达(缩写为K/EGFP,更多细节见“方法”)。没有考虑直接增加K/EGFP信号的化合物,因为KDM5B的被动富集可能产生掩蔽效应高的如先前在各种细胞毒性药物中所见的细胞5。相反,K/EGFP信号的减少是特别令人感兴趣的,因为它可以间接表明作为化学化合物处理的结果,内源性KDM5B蛋白水平的持续增加(例如,通过高KDM5B蛋白水平对mRNA转录的负反馈)。

如流式细胞仪分析和免疫细胞学所证实的,无论所测试的黑素瘤细胞系的基因型如何,最高的化合物2-苯氧基乙基-4-(2-氟苯基)-2,7,7-三甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氢喹啉-3-羧酸酯(PubChem名称BAS00915510,此处缩写为Cpd1)可再现地增加KDM5B蛋白水平(图。1e,f和补充表格1).选择不能改变K/EGFP转录和内源性KDM5B蛋白水平的结构同源化合物作为随后实验的阴性对照(缩写为Neg4,补充表1和补充图。3c,d).KDMs是组蛋白去甲基化酶和转录调节因子,因此主要在细胞核中起作用18,19,20,21,22。因此,对KDM5B在细胞核与细胞质区室中表达定位的定量分析证实了细胞核KDM5B的Cpd1时间依赖性增加(补充图。3e)现象复制Tet-对3G诱导的KDM5B表达的影响。同样,这与测试的黑色素瘤细胞类型无关(补充图。3f).

这是由于在Cpd1处理的大多数黑素瘤细胞中观察到KDM5B的显著核富集(图。1f),我们假设Cpd1可能作为一种潜在的作用方式影响KDM5B蛋白的天然稳态。用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺对黑色素瘤细胞进行纵向处理,发现KDM5B蛋白稳定减少,24小时和72小时后分别减少79%和98%。与Cpd1共同治疗导致KDM5B水平升高(24和72小时分别为382%和147%),表明Cpd1可能减弱KDM5B蛋白降解,并由此维持其核表达水平(图。第一代).为了研究KDM5B的细胞降解途径,我们建立了蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)模型23,24(补充图4a).该模型基于SLF′-沙利度胺与FKBP12标记的KDM5B的结合。SLF’是FKBP12的合成结合配体,而沙利度胺招募E3泛素连接酶cereblon进行泛素化和随后靶向KDM5B的蛋白体降解。将SLF′-沙利度胺应用于WM3734黑色素瘤细胞中FKBP2标记的KDM5B,我们可以证明KDM5B蛋白以E3泛素连接酶依赖的方式快速蛋白体降解(补充图。4b).因为蛋白酶体降解是钙依赖的过程25,26Cpd1的二氢吡啶结构表明其作为钙通道阻断剂的功能,我们测试了Cpd1是否影响黑色素瘤细胞中细胞内钙含量和泛素化蛋白的降解水平。事实上,急性和长期Cpd1治疗均导致商店经营钙进入显著减少(补充图。4c)伴随着泛素化KDM5B的积累(图。1h).

KDM5B的强制表达将黑色素瘤细胞导向缓慢生长的持续状态

标准增殖(MTT)和凋亡(胱天蛋白酶3加膜联蛋白V测量或7AAD流式细胞术)分析表明,在短期Cpd1处理的黑色素瘤细胞系或WM3734中,细胞生长抑制作用强于细胞凋亡或毒性作用Tet3G-KDM5B细胞(图2a,左图和补充图。5a、b).对于Cpd1,根据MTT分析中的跨细胞系比较,假定最大可行剂量为10 M(补充图。5c)并用于所有随后的实验。与KDM5B相关治疗持久性的报告一致5,16,17,我们观察到KDM5B上调后对MAPK信号通路抑制剂(MAPKi)治疗的药物敏感性降低,而与测试的黑色素瘤细胞系无关(图。2a右侧面板)。

图KDM5B表达增强的体外和体内效应。
figure 2

a在第7天开始使用Cpd1进行MTT分析,然后加入MAPKi 72小时。在72小时的MAPKi (5 M PLX4720 + 0.5 M GDC-0973)和总共10天的Cpd1后读取数据。不含MAPKi的DMSO或Cpd1处理10天后(左图)和MAPKi处理72小时后的细胞数,与“无MAPKi对照”相比(右图)。平均标准偏差(n= 3),双面t-测试(* * * * *p≤ 0.0001).bKDM5B诱导后的克隆原性生长(9、16和20天)。均值SD,双侧t-测试。显示的是六个克隆体中的一个。cKDM5B诱导52天后软琼脂集落形成。所示的是一个代表性实验(n= 3).平均标准差;两方面的t-测试。d异种移植WM3734的生长Tet3G-KDM5B细胞。强力霉素治疗从第34天开始。平均SEM与n=对照组中的6只小鼠,以及n=治疗组10只小鼠,线性混合效应样条模型。e用10m CP D1或Neg4连续处理7和9天以上的WM983B和WM1366细胞的克隆形成生长测定(n= 3).f用10m CP D1处理9、16和20天的451Lu和抗性451Lu BR细胞相对于DMSO或Neg4对照的克隆形成生长测定(n= 2).g用10 M Cpd1连续处理19天后的二维集落形成。意思是,n= 3.h在指定剂量下持续Cpd1处理超过30天的软琼脂菌落形成(一个代表性实验n= 2)和i与播种前短期处理72小时而不继续处理相比(平均,n= 2).j在第10天,在10 M的Neg4或Cpd1下,WM3734球体的胶原侵入。所示的是一个代表性实验(n= 3).平均标准差;两方面的t-测试。k胶原包埋后第10天的WM3734黑色素瘤球体。l, m异种移植的WM3734细胞的生长(左,n=每组9只小鼠)和同系CM细胞(右,n=每个控件3个,并且n=每个治疗组5只小鼠)。当肿瘤可触及时,开始Cpd1治疗。均值SEM,线性混合效应样条模型。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们测试了当KDM5B表达谱不断指向更高水平而没有机会动态回复到正常异质性时,黑色素瘤细胞群如何表现。在WM3734中强制表达KDM5BTet3G-KDM5B在长期二维(2D)生长试验中,模型减少了细胞数量,并以剂量依赖的方式减少了贴壁非依赖性三维集落形成(图。2b,c和补充图。5d).幼稚的WM3734和WM3734的成长Tet3G-EGFP对照细胞不受多西环素的影响(补充图。5e).然后在体内研究KDM5B介导的对肿瘤增殖的作用。我们允许异种移植WM3734Tet3G-KDM5B建立约150 mm肿瘤的细胞3在饮用水中添加强力霉素之前。这导致了近2周的显著肿瘤生长延迟(图。2d; p < 0.05, linear mixed-effect model).

Cpd1的长期治疗显著降低了不同黑色素瘤细胞系的生长,与其基因型无关(图。2e,补充图。6a–c显示长达16天的治疗实例)。此外,先前对MAPK抑制产生抗性的黑色素瘤细胞对KDM5B表型的化学强化有反应,这支持了在初始KDM5B富集后长期耐药黑色素瘤细胞群重建正常KDM5B异质性的观察结果(图。2f和补充图。6d–g).7AAD染色表明,这种作用更多地是上调的KDM5B的抗增殖作用的结果,而不是化合物毒性的结果(补充图。6小时).

此外,有限稀释试验和3D集落形成表明,在持续暴露于Cpd1下,黑色素瘤细胞的肿瘤再增殖特性丧失(图。2g,h).相反,在接种到软琼脂上之前仅用Cpd1预处理黑色素瘤细胞3天不足以减少形成的集落数量,这再次表明KDM5B表型在正常条件下的自发可逆性(图。2i和补充图。6i).在3D胶原蛋白球体模型中,Cpd1的持续治疗也降低了黑色素瘤细胞的侵袭能力(图。2j).有趣的是,Cpd1严重削弱了黑色素瘤细胞形成适当球体的能力;尤其是在胶原包埋前开始治疗时(图。2k).

最后,我们在异种移植物和免疫活性同系小鼠黑色素瘤模型中测试了Cpd15,27。与WM3734细胞相同,Cpd1处理的表型效应预先在小鼠CM细胞的正交体外试验中得到证实(补充图。6j,k,图。1e,f和补充图。三维(three dimension的缩写), 5c, 6b,c,分别为)。在两种小鼠模型中,与载体对照相比,Cpd1治疗导致显著的抗肿瘤生长效果(图。2l,m).离体免疫染色证实了Cpd1诱导的向高KDM5B表达状态的转移(补充图。6l).

总之,我们的结果表明,KDM5B的表达动态可以受到外源性遗传或化学调节的限制,这提供了操纵KDM5B依赖性肿瘤维持的可能性。

KDM5B介导的细胞周期停滞和细胞动力脱落抑制

尽管持续细胞被反复描述为在各种癌症实体中循环缓慢4,6,9在黑色素瘤中,它们真正的细胞特性和增殖表型仍然难以捉摸。我们首先通过DNA含量细胞周期分析证明,在72小时内,KDM5B的表达增强,剂量依赖性地诱导不同遗传性黑色素瘤细胞系的细胞周期延迟(图。3a和补充图。7a).有趣的是,单个FUCCI-WM164细胞的延时细胞周期成像28揭示了Cpd1处理与DMSO-和Neg4对照相比增加了43.8%的总细胞周期长度,这是由于在G1和S/G2/M期花费了更长的时间(图。3b和补充图。7b,c).在用Cpd1连续处理达7天(作为阴性对照的Neg4)下的纵向DNA含量细胞周期分析证明,Cpd1诱导的G1和G2/M延迟可以以时间上连续的方式发生(补充图。7d).总之,这些实验强调了异质性和时间可塑性对单个黑素瘤细胞效应大小测量的作用,特别是对单个时间点表型细胞周期读数的解释。

图3: KDM5B介导的细胞周期停滞和细胞动力脱落的抑制。
figure 3

aCpd1处理的WM3734(如上)或Dox处理的WM3734的碘化丙锭细胞周期分析Tet3G-KDM5B72小时后的细胞(下图)。显示的是代表性数据(n= 4).b通过用Cpd1 (10 M)与DMSO或Neg4对照(10 M)预处理72 h的FUCCI-WM164细胞的实时细胞周期成像,定量G1(上图)和S/G2/M(下图)细胞周期持续时间。散点图代表平均SD(n= 3);克鲁斯卡尔-沃利斯试验。c在用Cpd1 (10 M)与DMSO或Neg4对照(10 M)处理期间,对WM3734细胞数量进行长达72小时的延时成像分析(15个不同区域,n= 2).d分析时间推移显微电影中完成胞质分裂的时间(15个不同的细胞,n= 2).eCpd1处理(72小时)的WM164细胞(左)和Dox处理的WM3734细胞中中间体的定量和代表性免疫荧光染色Tet3G-KDM5B细胞(右)与各自的对照。描绘的是单个荧光通道:蓝色(DAPI,细胞核);黄色(α-微管蛋白,微管);绿色(极光B激酶,中间体);红色(鬼笔环肽,肌动蛋白)。点状图显示了每个视野的中间体/细胞的比率,12-16个视野,n= 3.平均值±SD,左侧,单向ANOVA:右侧,双侧t-测试。fKDM5B-PROTAC模型中中间体减少的定量。SLF′-沙利度胺(SLF′-t)与Cpd1同时应用(“con”)或在Cpd1预处理3天后应用(“pre”)诱导KDM5B的蛋白酶体降解。阴性4用作对照。点图显示了中间体/细胞核的比率作为四分位数范围内的中值(4个盖玻片,n= 2;单向ANOVA)。g通过质谱和RNA测序检测的在Cpd1 (10 M)处理WM3734细胞后显著调节的基因的文氏图和基因本体论分析。h通过质谱和RNAseq(左,n= 1)或qPCR(右,表示SD,n= 2)在Cpd1处理的WM3734和Dox处理的WM3734中Tet3G-KDM5B细胞。源数据作为源数据文件提供。

为了进一步阐明KDM5B抗增殖作用的分子机制,我们对Cpd1处理的WM3734细胞与Neg4处理的对照细胞进行了单细胞延时显微镜检查(补充电影13).72小时后细胞数量的定量证实了细胞增殖的减少(图。3c).有趣的是,我们观察到一些经历细胞分裂的细胞表现出延长的时间来完成细胞脱落(图。三维(three dimension的缩写)).我们假设这种现象可能是由KDM5B在胞质分裂(分裂细胞物理分离的最终过程)中迄今未知的调节作用引起的。我们的目的是通过细胞间中间体的免疫染色对此进行定量,细胞间中间体即代表富含微管的膜桥的结构,其在膜完全分离前不久连接两个子细胞29。事实上,我们发现在一部分Cpd1处理的WM164细胞中,中间体的数量显著增加(p≤ 0.0001)以及经强力霉素处理的WM3734Tet3G-KDM5B单元格(p= 0.0033)(图。3e).重要的是,Cpd1介导的中间体增加被SLF′-沙利度胺诱导的WM3734中KDM5B的降解所挽救Tet3G-KDM5B-FKBP12细胞(图3f).在10 M Cpd1作用72小时后,通过RNAseq和无标记定量质谱法对KDM5B增强的WM3734细胞进行转录和蛋白质组分析,发现11个基因/蛋白质有少量重叠,其中7个在胞质分裂期间具有已知功能(图。3g和补充数据1以粗体突出显示)。举个例子,极光激酶, MKI67, KIF4A, UBE2C, RRM2, KIF1C1,以及苯铵素归因于GO细胞骨架依赖性胞质分裂。对于基因子集的表达(极光激酶, KIF4A, SHCBP1,以及UBE2C),我们发现Cpd1处理的WM3734和多西环素处理的WM3734都下调Tet3G-KDM5B细胞(图3h). 极光激酶, KIF4A,以及UBE2C已知调节纺锤体装配和协调脱落30,31. SHCBP1参与中间体组织和胞质分裂的完成32。因此,不考虑所用的模型,上述基因可能在功能上参与观察到的中间体的增加和细胞加倍的延迟。

我们的实验表明,到目前为止,KDM5B的外源性表达可以在大多数肿瘤细胞中将黑色素瘤导向慢循环肿瘤表型,其中不同的分子机制可能协同阻止细胞增殖。考虑到潜在的临床意义,降低持续状态的可塑性可以通过延缓肿瘤的发展而及时获得治疗效果。然而,如果通过利用状态特异性药物敏感性额外根除缓慢循环和潜在的肿瘤再增殖持续状态,这种方法可能更有效。

强制KDM5B表达导致谱系重编程

为了揭示KDM5B强制表达后细胞特性和潜在转录程序的潜在变化,我们对我们的遗传和化学KDM5B诱导模型(Tet-On 3G和Cpd1)进行了RNA测序。WM3734Tet3G-KDM5B用多西环素处理细胞24、48和72小时,然后收获用于分析。平行地,用Cpd1处理幼稚的WM3734和患者来源的短期培养的CSM152细胞,并在72小时后进行分析(补充数据2).我们首先检查Cpd1是否也在转录水平上复制Tet-对3G介导的KDM5B诱导的作用。事实上,我们发现我们的两个模型都可以在相似的程度上调节以前发表的KDM5B靶基因基序(SCIBETTA _ KDM5B _ TARGETS _ DN(DN = " down ")基序,79个基因)21(补充图8a).随后的基因集合富集分析(GSEA)以及随后的细胞图像可视化揭示了与其他预期的KDM5B相关途径(如染色体重塑或ATP酶代谢)相匹配的转录景观。此外,参与细胞周期/有丝分裂、DNA损伤反应、RNA加工和免疫反应的基因被发现受KDM5B调节(补充图。8b).控制细胞周期和有丝分裂的转录物揭示了从KDM5B诱导的24小时到48小时和72小时的稳定增加和统计上显著的调节,这表明对细胞增殖机制的基本和暂时的动态影响(补充图。8c).

因为据报道KDM5B以高度保守的方式指导发育过程33,34,35,我们询问KDM5B的表达是否会影响黑色素瘤细胞的分化状态。事实上,我们观察到遗传的以及化学的KDM5B的实施显著下调间充质细胞(SARRIO _ EPITHELIAL _ MESENCHYMAL _ TRANSITION _ DN,145个基因)36和增殖(GERBER_PROLIFERATION_SPOT A,405个基因)37基因基序(图。4a,转发p < 0.05 was considered as statistically significant). Additionally, melanocytic differentiation genes were specifically regulated in both models (GO_PIGMENTATION38,39,86个基因,图。4b).最引人注目的是,KDM5B表达增强后伴随着时间依赖性转录转变,其中细胞随着时间的推移逐渐从未分化和神经嵴样转变为过渡黑素细胞和黑素细胞基因基序(图。4c和补充表格2).因此,KDM5B敲除显示了朝向未分化状态的反向基因表达(图。4c控制补充图中的WB。8d).在一项独立的对照实验中,Cpd1的分化重编程被复制,并以时间依赖的方式发生(补充图。8e,补充表2和补充数据3).重要的是,在患者来源的CSM152黑色素瘤细胞中,与KDM5B相关的分化重编程同样被Cpd1诱导(图。4a、b和补充图。8a、e)并且还在计算机中证实了从人肿瘤组织分离的单个黑素瘤细胞中的内源基因表达(n=来自19个肿瘤的1253个黑色素瘤细胞40).这里,与具有未分化标记的细胞相比,具有黑素细胞基因标记的细胞中KDM5B表达显著更高(图。4d).

图4: KDM5B导致分化导向的表型转变。
figure 4

a, bSARRIO _ EPITHELIAL _ MESENCHYMAL _ TRANSITION _ DN热图36,GERBER_PROLIFERATION_SPOT A签名37 (a)和GO _色素沉着签名38,39 (b)来自WM3734Tet3G-KDM5BDox处理72小时后的细胞和Cpd1处理72小时后的WM3734和CSM152细胞;红色,上调;绿色下调基因。重要性用FWER表示p < 0.05. cTsoi分化轨迹的热图66对于WM3734Tet3G-KDM5BDox处理24、48和72小时后的细胞(左),WM3734 KDM5B敲除(sh)对对照(scr)细胞(右);红色基因上调,绿色基因下调。dViolin图显示了根据单细胞RNA测序人类黑色素瘤中转录分化水平的内源性KDM5B表达水平。星号代表p采用Dunnett多重比较检验的单向ANOVA得出的值< 0.0001。这里对未分化组进行了比较。

KDM5B是胞质分裂和分化基因转录的表观遗传决定因子

考虑到KDM5B作为组蛋白去甲基化酶直接参与转录调节的已知作用,我们使用ChIP-Atlas对KDM5B和H3K4me3 ChIP-Seq数据进行了计算机分析41设置为“所有细胞类型类别”以及来自乳腺癌的H3K4me3芯片序列数据42和黑色素瘤细胞43,44。这表明了KDM5B DNA结合基序和H3K4me3染色质标记在许多胞质分裂基因(乳腺癌和黑素瘤细胞系)和黑素细胞分化基因(黑素瘤细胞系)之间的相关性(图。5a、b).具体来说,这包括胞质分裂基因AURKB、KIF4A、SHCBP1,以及UBE2C以及分化基因MITF,姆拉纳,NGFR,AXL,提尔,TJP1,CDH2,ZEB1SMAD1,我们发现其受Cpd1依赖的方式调节(图。3g,h4a–d).

图5: KDM5B依赖性胞质分裂和分化基因转录。
figure 5

胞质分裂和有丝分裂纺锤体装配基因的计算机分析(a)或分化基因(b)的KDM5B-和H3K4me3-ChIPseq数据,来自乳腺癌细胞系SUM185、SUM159、MCF7、HCC2157、T47D和MDA231 (GSE4607342)和黑素瘤细胞系MM27、MM13、MM16 (GSE7185444)和A375 (GSE9983543))和芯片-图册41. csiRNA转染后4天,通过免疫印迹证实MaMel63a细胞中KDM5B敲低。dKDM5B敲除4天后和Neg4或Cpd1处理3天后(10 M),通过qPCR分析细胞质分裂相关基因(AURKB,KIF4A)和分化相关基因(DCT,MelanA)的KDM5B靶基因表达。示出了一个代表性例子(平均值SD,n= 2).源数据作为源数据文件提供。

为了从功能上支持所观察到的Cpd1对基因表达的影响确实是KDM5B依赖性的,我们进行了KDM5B的siRNA敲除,并随后测量了在同时进行Cpd1处理时所选择的胞质分裂和分化基因的转录表达(图。5c,d).正如所料,我们发现在遗传性(和Cpd1介导的)KDM5B上调后,细胞质基因表达下调。3h,在siRNA敲除KDM5B后,在mRNA水平上调。5dNeg4处理)。因此,我们发现在KDM5B诱导下分化基因上调(图。6a),在KDM5B敲除后下调。当我们用Cpd1处理混乱的对照细胞时,我们再次看到了KDM5B诱导的预期下游效应,即胞质分裂的mRNA下调和分化基因的上调(灰色条)。当我们将Cpd1加入siRNA KDM5B敲除的细胞中时,Cpd1不能维持KDM5B蛋白水平(图。5c没有产生可以防止蛋白酶体降解的KDM5B蛋白),因此不能逆转KDM5B下游基因的siRNA依赖性调节(白条)。

图6:增强的KDM5B表达促进了TMECG对黑素细胞谱系的定向清除。
figure 6

aqPCR评估Cpd1处理MaMel63a细胞24小时、48小时、72小时和7天后mRNA的定量。平均标准差。所示的是一个代表性的例子。b在WM3734细胞中KDM5B shRNA敲除后,通过cDNA微阵列分析检测分化、胞质分裂和有丝分裂纺锤体装配基因的调节(n= 1).c, dWM3734中KDM5B诱导24小时后黑素细胞谱系和(去)分化标记的免疫印迹Tet3G-KDM5B单元格(c)和在MaMel63a细胞中Cpd1处理72小时后(d).所示的是代表性数据(n= 2).e来自Cpd1处理的与对照小鼠的CM黑素瘤肿瘤移植物的抗MITF免疫染色(上图)和Fontana-Masson染色(下图)。fWM3734细胞的MTT细胞活性测定。代表性例子显示在左边(平均值SD,n= 2)和相应的IC50右边的值。TMECG或者与Cpd1一起同时给药(“con”),或者在Cpd1预处理后3天添加(“pre”)。在TMECG处理72小时后进行读出。g体内持续状态导向治疗模型。左:免疫缺陷NMRI-(nu/nu)-裸鼠中治疗剂量和时间的示意图。右图:WM3734异种移植物的肿瘤体积(终点在第30天)。TMECG或者与Cpd1一起同时给药(“con”),或者在Cpd1预处理后一周添加(“pre”)。平均SEM(tme CG和Cpd1对照组中的6只小鼠,“con”组中的5只小鼠和“pre”组中的7只小鼠)。显著性由双侧Mann-Whitney检验确定。源数据作为源数据文件提供。

强制KDM5B表达式导致世系导向的漏洞

观察到的KDM5B依赖性细胞状态重编程不仅证实了对黑素细胞分化的承诺,还可以使黑素瘤细胞对次级表型特异性药物敏感。我们试图利用3-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-(-)-表儿茶素(TMECG),一种酪氨酸酶(TYR)加工的抗代谢剂,先前被描述为以谱系特异性方式消除黑色素瘤细胞45。因此,我们首先评估Cpd1治疗是否真正激活黑色素瘤细胞中的黑色素细胞分化/色素沉着机制。事实上,我们发现黑色素细胞主调节因子的显著时间依赖性Cpd1诱导转录小眼畸形相关转录因子和其他下游分化基因泰勒DCT,以及玛特-1/姆拉纳在有色素沉着能力的黑色素瘤细胞中(图。6a).相反,KDM5B敲低与分化基因表达降低相关(图。6b).WM3734的免疫印迹Tet3G-KDM5B细胞证实MITF蛋白的KDM5B剂量滴定增加,而间充质细胞表型的典型标记如CDH2、AXL、ZEB1或SMAD1蛋白减少(图。6c).Cpd1在蛋白质水平上对这些标记的调节的相似趋势得到了证实(图。6d).最后,Cpd1治疗后同系黑色素瘤的免疫染色切片(图。2m)证实体内富集的MITF蛋白表达(图。6e上排)。Fontana-Masson染色还显示了细胞内黑色素生成的局部增加(图。6e下排)。

接下来,我们在临床前模型中测试了Cpd1对谱系定向黑色素瘤细胞的敏化作用。我们在体外测试了Cpd1与TMECG在三种黑素瘤细胞系中的组合(WM3734,MaMel63a,WM983B,图。6f和补充图。9).MTT分析显示,TMECG与Cpd1的组合在用Cpd1预处理3天的细胞中更有效。这补充了我们先前的观察,即KDM5B指导的细胞重编程向细胞分化是一个时间依赖的过程(图。4c和补充图。8e).单独使用TMECG对细胞数量的影响有限,因此,仅次于Cpd1,被定义为后续体内联合治疗的单一治疗对照(图。6g).预先评估了单独的Cpd1与载体对照相比对体内肿瘤生长的影响(图。2l).为了研究体内TMECG和Cpd1的时间顺序的影响,我们建立了一个治疗模型,其中WM3734细胞被异种移植以在免疫缺陷的NMRI-(nu/nu)-裸鼠的背部建立肿瘤超过20天(图。6g,左)。Cpd1和TMECG的共同治疗同时或相继开始,即在加入TMECG之前用Cpd1预处理肿瘤一周。与我们的体外观察一致,在状态特异性消除开始之前,当已建立的肿瘤开始分化时,黑色素瘤肿瘤生长显著降低(图。6g,对;p < 0.05, Mann–Whitney test). Concurrent treatment of Cpd1 and TMECG failed to reduce tumor size within the time span of our animal protocol. A possible long-term effect of Cpd1 also in the concurrent setting could not be assessed in this model.

总之,我们的研究为黑色素瘤的双重打击策略提供了概念证明,其中持续的状态导向转变限制了细胞状态的可塑性,并使肿瘤细胞朝着分化特异性消除的方向发展(图。7).

图7:黑色素瘤中的表型特异性双重打击策略。
figure 7

KDM5B持续的状态导向转变限制了肿瘤的可塑性和异质性,并使黑色素瘤细胞朝着谱系特异性消除的方向发展。

讨论

除了遗传肿瘤进化,特别是表型细胞可塑性是癌症治疗中的一个新问题46。由于黑色素瘤细胞在不同的转录、细胞增殖和分化程序之间快速转换,这些表型可能会短暂重叠,并迅速适应任何特异性攻击单一耐药机制的策略1,2,3,47。因此,这项研究的一个问题是,限制表型细胞状态动力学是否可以成为黑色素瘤双重打击策略的起点。慢循环KDM5B高的黑色素瘤细胞表型被用作概念验证的模型。

到目前为止,慢循环KDM5B的真正本质高的黑色素瘤中的持久性细胞尚不清楚。我们的数据表明,KDM5B指导黑色素瘤细胞从未分化到黑素细胞谱系分化的转录特性。治疗前的KDM5B诱导改变了固有抗性黑色素瘤细胞的频率,类似于最近报道的DOT1L抑制状态3。在CRISPR-Cas9筛选中通过基因敲除抑制组蛋白H3K79甲基转移酶DOT1L有利于神经嵴细胞分化程序(NGFR高的/EGFR高的状态),并在BRAF抑制剂治疗前增加了引发抗性的细胞数量。如果KDM5B诱导和DOT1L抑制将细胞同一性推向同一个终末阶段,以及这些影响有多强取决于实际活跃的基因表达水平和表型重编程所需的时间,未来对单细胞转录和蛋白质组水平的研究必须破译。

根据关于KDM5B依赖性细胞命运决定和其他组织类型(例如神经分化)中谱系定型的报道34或者造血48),我们的研究表明KDM5B在黑色素瘤中作为分化和细胞分裂程序的高度动态协调者。我们发现KDM5B通过下调基因有效抑制细胞增殖,这些基因控制细胞骨架依赖的胞质分裂,如极光激酶, KIF4A, UBE2C,以及SHCBP130,31,32。我们的中间体分析估计,相当一部分KDM5B增强的黑色素瘤细胞需要延长的时间来完成细胞脱落,这可能有助于观察到的整体细胞周期延迟。根据目前可用的基因谱数据,如TCGA(CBioPortal的突变频率为5.9%),KDM5B不受大多数黑色素瘤中失活突变的影响,因此它可能是黑色素瘤细胞的理想方法,无论其突变背景如何,只要需要就能确保慢循环状态。从概念上讲,这可能意味着黑色素瘤细胞利用了慢周期分化的KDM5B高的声明立即在选择性压力下存活,但必须再次降低KDM5B表达并恢复细胞周期进程,以利于更多增殖细胞表型,从而确保长期肿瘤再生(可塑性成瘾)。

尽管我们认为KDM5B高的分化的表型,我们知道任何用于描述黑色素瘤细胞表型状态的术语都需要谨慎使用,因为它们具有高度不稳定性。在延长的KDM5B诱导下,我们观察到RNA信号和蛋白质标记谱随时间的变化。根据选择用于实验读出的时间点,标记星座,或甚至像细胞增殖的功能行为,对于评估某种细胞状态对于肿瘤细胞存活或药物杀伤是有利还是不利可能是误导的。在这方面,我们的结果揭示了KDM5B的“两面派”角色高的黑色素瘤细胞状态。一方面,当慢循环状态持续时,黑色素瘤的生长和细胞侵袭受到损害。另一方面,黑色素瘤细胞可以利用这种状态在靶向或细胞毒性治疗中立即存活。然而,正如这里所演示的,当KDM5B高的状态导向转换与状态特异性消除策略(而不是非特异性减瘤药物)相结合,控制肿瘤生长是可能的。事实上,细胞状态定向消除的多种应用现在是可以想象的;特别是作为一种抢救策略或在最先进的癌症治疗后加深对残余疾病的反应。因此,我们计划在未来的研究中系统地测试Cpd1/TMECG在序贯治疗方案中与其他疗法的结合,理想情况下使用具有最佳溶解度的Cpd1的化学改良版本。


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