高表达的DYRK2是前列腺癌的潜在靶点 为了研究DYRK2在前列腺癌中的作用，我们首先利用癌症基因组图谱(TCGA)来分析dyrk 2的表达 DYRK2 在正常和前列腺癌患者中。我们发现高表达的 DYRK2 与正常对照组相比，前列腺癌患者(图。 1a ).此外，与中等风险和65岁以下的前列腺癌患者不同的是 DYRK2 在高危和65岁以上的前列腺癌患者中分别显著增高(图。 1b，c ).重要的是，低表达乳腺癌患者的无复发生存率(RFS)。 DYRK2 明显好于那些高表达 DYRK2 (图。 1d ).因此，根据TCGA分析，DYRK2是五氯苯甲醚治疗的潜在靶点。同时，根据对TCGA的分析，其他DYRK家族成员DYRK1A、DYRK1B、DYRK3和DYRK4不是抗前列腺癌药物的重要候选靶点(补充图。 1 ).此外 DYRK2 在前列腺癌患者中，恶性前列腺癌组织的mRNA水平高于邻近的正常前列腺组织(图。 1e ).DYRK2在这些患者来源的PCa肿瘤中的免疫组织化学也证明了DYRK2在肿瘤组织中的表达比在正常组织中高得多(图。 1f ).同时，通过蛋白质印迹分析进一步测定PCa细胞中DYRK2的蛋白水平，结果显示与前列腺RWPE-1细胞相比，DYRK2在DU145、PC-3和22Rv1细胞中的表达更高(图。 第一代 ).所有这些结果表明DYRK2在前列腺癌中高表达，这可能是开发抗前列腺癌药物的潜在靶点。
图1: DYRK2在PCa中高表达。 a –c 的比较 DYRK2 肿瘤间表达(红色、 n = 51)和正常(灰色， n = 51)组织( a )，高(红色， n = 345)和中间(蓝色， n = 152)高危PCa患者( b )，年龄≤65(蓝， n = 354)或> 65(黄色、 n = 143) PCa患者( c )在TCGA的数据库里。FRKM:百万分之一碎片。箱线图的触须代表百分位数，从下到上分别是最小值、25%、中值、75%和最大值。双尾学生的 t 测试应用于 t 多重比较的hout调整(错误发现率，FDR)。 d 卡普兰-迈耶高的生存情节(红线、 n = 246)和低(蓝线， n = 246) DYRK2 表达PCa患者。对数秩检验， P = 0.015. e , f 三例前列腺癌患者DYRK2表达分析。 DYRK2 mRNA水平( e )和DYRK2表达的免疫组织化学分析( f )在肿瘤和正常组织中。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. g 不同前列腺癌细胞系中DYRK2蛋白水平。正常前列腺上皮细胞RWPE-1用作对照。源数据作为源数据文件提供。
DYRK2的敲除显著降低了PCa负担 为了进一步研究DYRK2在PCa中的作用，我们使用shRNAs在DU145和22Rv1细胞中敲除DYRK2(图。 2a，b 和补充图。 2a ).DYRK2缺失显著抑制了细胞增殖(图。 2c，d 和补充图。 2b )、迁移(补充图。 2c )和入侵(补充图。 2d )在PCa细胞中。此外，敲除DYRK2导致细胞周期的G0/G1停滞(图。 2e，f )和诱导凋亡(图。 2g，h ).在DU145 shDYRK2细胞中，促进细胞周期进程的细胞周期相关蛋白，包括p-RB，CDK4和CDK6，被下调。相反，抑制细胞周期的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKIs) P21和P27表达上调(图。 2i ).细胞凋亡相关蛋白P53和PARP被上调，XIAP被下调。还检测到E-钙粘蛋白的表达增加，这表明转移受到抑制(图。 2i ).此外，为了确定DYRK2敲除对体内PCa生长的影响，我们将DU145 shNC和shDYRK2细胞皮下植入裸鼠。肿瘤生长被显著抑制(图。 2j )而与shNC组相比，小鼠的体重正常增加(补充图。 2e ).肿瘤组织的H&E染色和Ki-67免疫组织化学分析表明，DYRK2的敲除表现出杀死肿瘤细胞和抑制PCa细胞增殖的有效功效(补充图。 2f，g ).肿瘤组织的WB分析表明，p-RB、CDK4、CDK6和XIAP在体内下调，而P27、P53和裂解的PARP在体内上调(图。 2k ).此外，我们还在小鼠皮下接种了22Rv1 shNC和shDYRK2细胞。与DU145 shDYRK2研究的结果相似，小鼠的体重正常增加，但是在22Rv1 shDYRK2组中没有检测到可见的肿瘤(补充图。 2h，我 ).总之，DYRK2的下调显著降低了体外和体内的PCa肿瘤负荷，这表明DYRK2在调节PCa中起着关键作用，并且是治疗PCa的潜在治疗靶点。
图2:在体外和体内敲低DYRK2抑制PCa。 a , b DU145 shNC/shDYRK2中DYRK2蛋白水平( a )和22Rv1 shNC/shDYRK2( b )细胞。 c , d DU145 shNC/shDYRK2细胞的细胞活力( c )和22Rv1 shNC/shDYRK2细胞( d )在为期5天的课程中。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. e , f DU145 shNC/shDYRK2细胞的细胞周期时相分布( e )和22Rv1 shNC/shDYRK2细胞( f )通过流式细胞仪测定。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. g , h DU145 shNC/shDYRK2细胞凋亡( g )和22Rv1 shNC/shDYRK2细胞( h )通过流式细胞仪测定。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. i DU145 shNC和shDYRK2细胞中指示蛋白的蛋白质印迹分析。 j , k 将DU145 shNC( n = 6)和shDYRK2( n = 10)个单元格。小鼠肿瘤体积( j )每两天测量一次。误差线，平均值±标准偏差。shNC组在29岁被安乐死 泰国(Thailand) 日，shDYRK2组于49日实施安乐死 泰国(Thailand) 日。取出用DU145 shDYRK2和shNC细胞处理的小鼠的肿瘤组织，然后提取肿瘤中的总蛋白质并对指示蛋白质进行蛋白质印迹分析( k ).源数据作为源数据文件提供。
YK-2-69被发现是一种高选择性DYRK2抑制剂 考虑到DYRK2在前列腺癌中的高表达水平和关键调节作用，我们将DYRK2作为潜在的药物靶点，并对Specs数据库和内部文库进行了基于结构的虚拟筛选，以确定DYRK2抑制剂(图。 3a ，详见补充方法)。首先过滤出具有不良药物性质的化合物 33 ,34 ,35 ,36 ，然后通过Discovery Studio 2020 (DS2020，Accelrys，CA，USA)的Libdock和CDOCKER协议对剩余的195，483个化合物进行基于结构的虚拟筛选(DYRK2 PDB ID: 6K0J) 32 ,37 ,38 。保留2，724个配体并进一步聚类成100个簇，然后选择15个化合物用于DYRK2抑制活性评价(补充图。 3 )39 。在这15种化合物中，化合物 12 被鉴定为最成功的，其以一半最大抑制浓度(IC)显示了对DYRK2的有效抑制 50 )值为263 nM(补充表 1 ).通过系统优化(详见方法)，衍生出多个系列 16 -27 (补充图 4 )进行了合成。其中，复合 26 (重新命名为YK-2-69)显示出最强的DYRK2抑制活性 50 值为9纳米(图。 3b ).特别是，YK-2-69显示出对DYRK亚家族的选择性，对DYRK1B的选择性为60倍，对DYRK1A、DYRK3和DYRK4的选择性超过100倍(图。 3c ).为了进一步评估YK-2-69的激酶选择性，测试了其对370种激酶的抑制活性。除了DYRK2和CDK4/6 40 ，YK-2-69显示出对360+激酶的选择性(图。 三维（three dimension的缩写） 和补充图。 5 ).此外，该 K 铅化合物的d值 12 和含DYRK2的YK-2-69分别为4.21 μm和92 nM(补充图。 6a、b ).综上所述，发现YK-2-69是一种具有强抑制活性和高选择性的DYRK2配体。先前的报道显示4E结合蛋白1 (4E-BP1)是DYRK2的直接细胞靶点，DYRK2可以直接磷酸化4E-BP1 41 ,42 。同时，4E-BP1的磷酸化有助于细胞增殖和肿瘤生长 43 ,44 ,45 。我们的结果显示，p-4E-BP1 (Thr37/46)可以通过免疫沉淀试验与DYRK2相互作用(图。 3e ).此外，YK-2-69以剂量依赖的方式抑制4E-BP1的磷酸化(图。 3f ).这些结果证明YK-2-69选择性地结合DYRK2并抑制其激酶活性。
图3:高选择性DYRK2抑制剂YK-2-69的发现。 a 发现hit DYRK2抑制剂化合物的虚拟筛选流程图 12 . b YK-2-69的化学结构和活性。 c YK-2-69对DYRK1A、1B 2、3和4的抑制活性。 d YK-2-69 (1 M)的激酶选择性实验在反应生物公司( https://www.reactionbiology.com/ ).点的大小表示抑制率。圆点代表一种激酶，红点代表DYRK2。 e 通过免疫共沉淀试验验证对-4E-BP1 (Thr37/46)与DYRK2的相互作用。将1%体积的细胞裂解物用作输入。 f 用DMSO或YK-2-69处理48小时后，对指示的蛋白质进行蛋白质印迹分析。用箭头显示了4E-BP1和p-4E-BP1的特殊条带。源数据作为源数据文件提供。
为了探索YK-2-69与DYRK2的确切相互作用并阐明其机制，我们以2.5的高分辨率测定了YK-2-69与DYRK2的共晶体结构(PDB ID: 7EJV，图。 4a 和补充表格 2 ).共晶体结构显示YK-2-69占据了DYRK2的ATP结合口袋，从而阻止了DYRK发挥其酶活性(图。 4b ).ATP结合口袋的占据情况与所有报道的共晶体结构相同 31 ,32 ,46 ,47 ,48 。苯并噻唑和嘧啶环位于ATP结合位点的深处。这种取向将嘧啶环置于Lys-231附近。Lys-231在先前的共晶体结构(PDB ID: 3KVW，4AZF，6HDR)中的氢键形成中发挥了关键作用 46 。YK-2-69的嘧啶环和相连的仲胺也与Lys-231相互作用形成两个氢键。尾哌嗪环向外延伸，相连的羰基与Asn-234的氨基侧链形成氢键(图。 4c
图4:YK-2-69与DYRK2的共晶体结构。 a F O -F C 省略的地图轮廓为3.0 σ，显示为蓝色网格，显示了YK-2-69的存在。DYRK2显示为带状。PDB ID: 7EJV。 b YK-2-69占据了DYRK2的ATP结合口袋。DYRK2显示为表面，YK-2-69显示为球体。 c 共晶体结构中YK-2-69和DYRK2之间的详细相互作用。
YK-2-69在体外显著抑制前列腺癌细胞的生长和迁移 一旦我们证实YK-2-69是一种有效的选择性DYRK2抑制剂，我们进一步研究了它对前列腺癌细胞的作用。YK-2-69显示出对DU145、PC-3和22Rv1细胞增殖的有效抑制活性(补充图。 7a–c ).但是对于DU145和22Rv1 shDYRK2细胞，YK-2-69甚至在80微米下也几乎没有显示出对增殖的抑制活性(图。 5a )，这进一步证实了YK-2-69对DYRK2的选择性对靶活性。同时，YK-2-69以剂量依赖性方式显著抑制DU145、PC-3和22Rv1细胞的细胞增殖(图。 5b–e 和补充图。 7d，e )，这类似于在PCa细胞中敲除DYRK2。与去除DYRK2减少EMT一样，YK-2-69也以剂量依赖的方式显著抑制DU145、PC-3和22Rv1细胞的迁移和侵袭(图。 5f–I 和补充图。 7f，g ).所有这些结果证实YK-2-69通过抑制DYRK2减少细胞增殖和EMT。
图5: YK-2-69抑制PCa细胞的细胞生长和转移，并诱导其凋亡。 a YK-2-69对DU145和22Rv1 shDYRK2细胞的抗增殖活性。误差线，平均值±SD， n = 3. b , c YK-2-69 (4、8、12 M或0.5、1、2 M)、帕波奇利(2或0.5 M)或恩扎鲁胺(40或20 M)治疗对DU145( b )和22Rv1( c 5天过程中的细胞生存力。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. d , e DU145的定量( d )和22Rv1( e )细胞集落数。在铺在24孔平板上用于集落形成之前，DU145和22Rv1细胞用DMSO、YK-2-69 (2、4、8或0.5、1、2 M)、palbociclib (2或0.5 M)或enzalutamide (40或20 M)处理48小时 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. f , g DU145迁移能力的定量( f )和22Rv1( g )用DMSO、YK-2-69 (2、4、8 M或0.5、1、2 M)、palbociclib (2或0.5 M)或enzalutamide (40或20 M)处理48小时后的细胞 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. h , i DU145侵袭能力的定量( h )和22Rv1( i 2)用DMSO、YK-2-69 (2、4、8或0.5、1、2 M)、帕博西利布(2或0.5 M)或恩扎卢胺(40或20 M)处理48小时后的细胞 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. j , k DU145细胞凋亡( j )和22Rv1( k 2)用DMSO、YK-2-69 (2、4、8或0.5、1、2 M)、帕博昔布(2或0.5 M)或恩扎鲁胺(40或20 M)处理48小时后的细胞，通过流式细胞仪测定。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. l , m DU145的细胞周期时相分布( l )和22Rv1( m 2)用DMSO、YK-2-69 (2、4、8或0.5、1、2 M)、帕博昔布(2或0.5 M)或恩扎鲁胺(40或20 M)处理48小时后的细胞，通过流式细胞仪测定。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3.源数据作为源数据文件提供。
为了研究YK-2-69对细胞周期和凋亡的可能作用，我们进行了流式细胞术分析。用YK-2-69处理DU145、PC-3和22Rv1细胞导致凋亡细胞群显著增加(图。 5j，k 和补充图。 7h )并将细胞周期阻滞在G0/G1期(图。 5l，m 和补充图。 7i )以浓度依赖的方式。此外，用YK-2-69处理的DU145细胞降低了p-RB、CDK4和CDK6的细胞周期相关蛋白水平，也增加了P21，增加了P53和切割的PARP的凋亡相关蛋白水平，也降低了XIAP，还增加了E-钙粘蛋白的表达(补充图。 7j ).总之，敲除DYRK2和小分子抑制剂YK-2-69在体外对PCa细胞表现出相似的作用，通过G0/G1阻滞和凋亡诱导抑制细胞生长，并降低EMT活性。
DYRK2 KD靶向与YK-2-69处理相似的抑制前列腺癌细胞增殖的信号通路 为了研究DYRK2抑制剂抗前列腺癌功能的信号通路，我们对DYRK2 KD-和YK-2-69处理的人DU145和22Rv1细胞以及对照细胞进行了转录组范围的RNA测序分析 49 ,50 。由DYRK2 KD调节的许多信号通路也可以被YK-2-69处理调节，尤其是绝大多数通路(34个中的28个，82.4%；48个中的46个，95.8%)被DYRK2 KD抑制，也被YK-2-69处理抑制(图 6a 和补充图。 8a ).通过对两个不同比较的独立分析，我们发现DYRK2 KD和YK-2-69处理均诱导MYC靶的显著抑制(图。 6b 和补充图。 8b )，这可能有助于DYRK2 KD和YK-2-69处理对细胞周期和增殖的抑制作用。此外，我们将shDYRK2和YK-2-69作为一组，并重新分析该组与其对照组(shNC组和DMSO组)之间的测序数据。我们一致地发现，YK-2-69处理和DYRK2 KD抑制细胞周期和增殖相关的信号通路MYC靶向V1，MYC靶向V2，E2F靶向(图。 6c ).DYRK2 KD和YK-2-69处理显著下调了MYC靶V1、MYC靶V2和有丝分裂纺锤体中富集的基因(图。 6d ).然后，我们还发现DYRK2 KD和YK-2-69治疗不影响雄激素反应信号通路，而恩扎鲁胺显著抑制雄激素反应信号通路(图。 6e 和补充图。 8c ).总之，这些数据表明DYRK2 KD和YK-2-69处理在细胞增殖抑制中起着重要和相似的作用。
图PCa DU145细胞中转录组范围的RNA测序分析。 a 在暴露于YK-2-69(3m)48小时的DU145细胞上进行的RNA测序的转录组策略。shNC、shDYRK2、DMSO和YK-2-69组都包含两个生物复制品。DYRK2 KD和YK-2-69处理的DU145细胞中上调和下调信号通路的文氏图。每个信号通路中的基因数量大于50。标准化富集分数(NES) >1或< 1； P < 0.05; FDR < 0.25. b 通过基因集合富集分析(GSEA)获得不同组中富集的信号通路。 c 与shNC和DMSO组相比，shDYRK2和YK-2-69治疗组的核心富集的信号通路分别减少(蓝色)和增加(红色)。的信号通路 P < 0.05 are presented. d 在DYRK2 KD-和YK-2-69-处理的DU145细胞中，涉及MYC靶V1、MYC靶V2和有丝分裂纺锤体的基因的相对丰度。 n = 2.箱线图的触须代表百分位数，从下到上分别是最小值、25%、中值、75%和最大值。双尾学生的 t 应用测试时未进行多重比较调整(FDR)。 e 使用GSEA分析DYRK2 KD或YK-2-69处理对DU145细胞中雄激素反应信号通路的影响。 f 显著受影响基因的火山图(绝对倍数变化> 2， P < 0.05) in DU-145 shDYRK2 group relative to shNC group and YK-2-69 group relative to DMSO group. The negative binomial distribution test of DESeq2 software was used. g DYRK2 KD或YK-2-69治疗对 RRS1 , GRWD1 , CCNG2 ，以及 YPEL3 DU145细胞的mRNA水平。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. h 主成分分析用于鉴定两个样品之间的转录组差异。 i 通过GSEA获得的DYRK2 KD和YK-2-69处理组中富集的不同信号通路。源数据作为源数据文件提供。
通过在转录组范围的RNA测序中分析shDYRK2和YK-2-69处理的样品之间的差异表达基因(DEG )(图。 6f 和补充数据集 1 )和进一步的实验证实，我们发现人类调节核糖体合成1的表达发生了显著的变化( RRS1 )，富含谷氨酸盐WD40重复序列含有1( GRWD1 )，细胞周期蛋白G2( CCNG2 )，以及Yippee-like-3( YPEL3 ).RRS1是一种参与核糖体生物合成的重要核蛋白，在一些人类癌症中过度表达 51 RRS1的下调导致细胞周期的G1停滞 52 。GRWD1是P53的负转录调节因子，在人类癌症中发挥致癌活性 53 ,54 。同时，先前的研究表明CCNG2的过表达可以诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖 55 ,56 。据报道，P53调节基因YPEL3表现出生长抑制和EMT抑制活性 57 ,58 。qRT-PCR的实验结果表明癌基因 RRS1 和 GRWD1 下调和肿瘤抑制因子 CCNG2 和 YPEL3 无论敲除DYRK2或YK-2-69治疗都上调(图。 6g 和补充图。 8d ).这些结果表明 RRS1 , GRWD1 , CCNG2 ，以及 YPEL3 可能在DYRK2调节机制和YK-2-69对前列腺癌细胞的治疗中发挥重要作用。
主成分分析表明DYRK2 KD和YK-2-69处理也诱导了一些不同的转录组变化(图。 6小时 ).因此，在shDYRK2和YK-2-69之间进行了进一步的基因集合富集分析(GSEA ),这表明YK-2-69处理诱导了DNA修复和TGF β信号通路的抑制，而DYRK2 KD对这两条信号通路没有显著影响(图。 6i ).抑制DNA修复是一种成功的癌症治疗策略，市场上有几种已获批准的药物 59 ,60 ,61 。TGF-β还作为肿瘤促进剂在晚期癌症中发挥关键作用 62 ,63 ，已经开发了许多抑制TGF β信号通路的药物，并在临床试验中进行了评价 64 。因此，与DYRK2 KD相比，YK-2-69可能调节一些不同的信号通路以产生有效的抗肿瘤活性。
YK-2-69表现出良好的安全性和药代动力学特征 为了评价DYRK2抑制剂YK-2-69在体内的毒性作用，ICR小鼠( n = 10/组)分别以2500毫克/千克、5000毫克/千克和10，000毫克/千克的单剂量口服施用YK-2-69。14天内各组小鼠未见异常和死亡。此外，在小鼠体重中没有检测到差异(补充图。 9a )和主要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，在药物治疗组和对照组之间的差异(补充图。 9b，c ).这些数据证实了YK-2-69在体内良好的安全性。
为了进一步探索YK-2-69的药代动力学特征，Sprague-Dawley (SD)大鼠( n = 3/组)通过口服和静脉内注射施用YK-2-69(表 1 ).在静脉注射组中，半衰期( t 1/2 ), C 最大 ，和AUC 0-∞ 数值为3小时、974纳克/毫升和1503小时 * ng/mL。在口服给药组，YK-2-69显示的药代动力学参数如下: t 1/2 = 5小时， C 最大 = 674纳克/毫升，AUC 0-∞ = 8384小时 * 纳克/毫升。此外，YK-2-69的口服生物利用度为56%。总之，这些结果证明了YK-2-69具有良好的成药性以及良好的安全性和体内药代动力学特征。
表1化合物YK-2-69在SD大鼠体内的药代动力学参数 a .YK-2-69在体内显示出比一线药物恩扎卢他胺和帕波奇利更强的PCa抑制作用 为了评价YK-2-69的体内抗肿瘤活性，首先建立DU145异种移植小鼠模型。一线PCa药物Enzalutamide和市场上的选择性CDK4/6抑制剂palbociclib被选为阳性对照，因为CDK4/6在用YK-2-69处理时在DU145细胞中下调。连续七周每天口服一次。低剂量的YK-2-69 (100毫克/千克)显示出与恩扎卢他胺相似的抗肿瘤活性，但活性优于帕波奇利。而高剂量的YK-2-69 (200 mg/kg)显示出比恩扎卢他胺和帕波昔布更好的抗肿瘤活性(图 7a、c、d ).特别是，与仅延缓肿瘤生长的enzalutamide和palbociclib不同，高剂量的YK-2-69不仅抑制了肿瘤的生长，而且从31 标准时间 天(图。 7a ).值得注意的是，高剂量组小鼠的体重也逐渐增加(图。 7b ).肿瘤组织的H&E染色和Ki-67表达的免疫组织化学分析表明，YK-2-69在杀死PCa细胞和抑制细胞增殖方面表现出强大的功效(图。 7e，f ).与体外数据类似，从DU145异种移植小鼠切除的肿瘤组织的WB分析也表明，细胞增殖和凋亡相关蛋白p-4E-BP1、p-RB、CDK4/6、RRS1和XIAP去调节，P27、P53、CCNG2和切割的PARP上调(图。 7g ).同时，YK-2-69也显著抑制了PC-3异种移植小鼠模型中的肿瘤生长。此外，与YK-2-69在DU145异种移植模型中减小肿瘤大小相同，高剂量的YK-2-69也可以减小PC-3异种移植模型中的肿瘤体积(补充图。 10 ).综上所述，YK-2-69在体内表现出比一线药物恩扎卢他胺和帕波奇利更好的抗肿瘤活性。
图7: YK-2-69在体内表现出显著的抗肿瘤活性。 a –d BABLc裸鼠接受皮下注射1 × 10 7 右侧DU145细胞。当肿瘤长到80-100毫米时 3 ，老鼠( n = 10/组)每天口服给药赋形剂、帕波奇利(100毫克/千克)、恩扎卢他胺(100毫克/千克)和YK-2-69 (100和200毫克/千克)。肿瘤体积( a )和小鼠体重( b )每2天测量一次。35天后，对照组的小鼠被杀死。49天后，杀死治疗组的小鼠。称重各组的肿瘤组织( c )然后拍照( d ).不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 10. e 用赋形剂、palbociclib、enzalutamide和YK-2-69治疗的小鼠的肿瘤石蜡切片的H&E和Ki-67染色的代表性图像。 f 量化用赋形剂、帕博昔利、恩扎卢他胺和YK-2-69治疗小鼠的肿瘤的Ki67阳性率。不成对的双尾学生的 t 测试。误差线，平均值±SD， n = 3. g 提取肿瘤中的总蛋白质并用于指示蛋白质的蛋白质印迹分析。4E-BP1和对-4E-BP1的特异条带用箭头表示。 h YK-2-69抑制DYRK2治疗前列腺癌的模型。源数据作为源数据文件提供。
基于这些结果，YK-2-69选择性地结合DYRK2并抑制其激酶活性以抑制4E-BP1的磷酸化，这导致细胞增殖的抑制(图。 7h ).YK-2-69对DYRK2的抑制也可以下调RRS1，并进一步上调P21和P27以抑制CDK4/6 51 ,52 。RRS1-P21/27-CDK4/6轴可以抑制细胞周期从G1向S期的转变，最终抑制细胞增殖。同时，YK-2-69下调DYRK2可以增加P53和CCNG2水平，从而促进细胞凋亡 55 ,56 。总之，这强调了YK-2-69对DYRK2的抑制是抑制增殖和促进凋亡的有前途的组合，这提供了PCa的“一举两得”方案。
