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PRMT抑制在三阴性乳腺癌中诱导病毒模拟反应

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发表时间:2022-05-27 10:21作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

三阴性乳腺癌(TNBC)是最具侵袭性的乳腺癌亚型,预后最差,几乎没有有效的治疗方法。在这里,我们鉴定了MS023,一种I型蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTs)的抑制剂,它在TNBC具有抗肿瘤生长活性。TNBC细胞系的途径分析表明,在MS023治疗前后干扰素反应的激活是一种功能性生物标记和反应的决定因素,这些观察结果扩展到一组人源性类器官。抑制I型PRMT通过抗病毒防御途径引发干扰素反应,并诱导双链RNA,其至少部分来源于反向重复Alu元件。总之,我们的结果代表了对I型PRMT抑制剂抗肿瘤机制理解的转变,并为I型PRMT抑制剂的临床开发提供了理论基础和生物标记方法。

主要的

乳腺癌是世界上最常见的癌症1。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种异质性乳腺癌亚型,缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2 (ref。2).尽管TNBC占乳腺癌病例的15-20 %,但它导致了25%的死亡2。由于复发率较高(超过30%)和转移性复发后生存期较短,TNBC患者的预后和总生存率比其他亚型更差3。由于缺乏定义其他亚型的靶向受体,TNBC治疗的选择有限,化疗是目前治疗的主要方式。尽管最近取得了一些进展,但迫切需要新的有效的TNBC靶向疗法。

表观遗传机制的改变,如DNA甲基化和染色质调节剂的改变,可以破坏正常的发育并导致癌症4。这些证据,加上最近在开发能够调节表观遗传调控的药物样小分子方面的进展,激发了人们对利用表观遗传靶点的治疗潜力的兴趣5。靶向表观遗传调节因子,如组蛋白脱乙酰酶抑制剂、BET溴域抑制剂和蛋白质精氨酸甲基转移酶5 (PRMT5)抑制剂,在TNBC和其他癌症中显示出抗肿瘤作用6,7,8,9。尽管取得了这些进展,对TNBC表观遗传脆弱性的系统理解仍然不清楚。

为了更好地了解表观遗传调控因子如何促进TNBC的发育和存活,我们用一个有效的化学探针库筛选了一组TNBC细胞系,这些探针选择性地靶向特定的表观遗传调控因子。我们的筛选揭示了TNBC的几个先前报道的表观遗传靶点,包括zeste同源物2的增强子(EZH2),BET溴域和PRMT5(参考文献。6,7,10).除此之外,我们的结果还揭示了I型PRMTs,催化不对称ω-的酶NG,NG组蛋白和非组蛋白的-二甲基精氨酸(ADMA),对TNBC的生长很重要。在I型PRMTs中,PRMT1催化大约85%的蛋白质不对称二甲基化11。PRMT1介导的精氨酸甲基化是多种细胞过程所必需的,包括转录、RNA剪接、细胞通讯和DNA修复12。mRNA剪接蛋白已被鉴定为PRMT1底物,因此提示PRMT1依赖性甲基化在RNA剪接调节中的作用13。越来越多的证据也证明了PRMT1通过直接甲基化DNA修复蛋白,如BRCA1、MRE11和53BP1,在DNA损伤反应中的功能作用(参考文献。14,15).虽然PRMT1的癌症相关突变很少见,但其异常表达通常与各种癌症类型(包括乳腺癌)的不良预后相关16。因此,已经认识到PRMT1的致癌潜力,并且最近它作为癌症的潜在治疗靶点受到了相当大的关注17。值得注意的是,GSK3368715,一种I型PRMT抑制剂,已经进入人体临床试验(NCT03666988),有可能为实体和血液恶性肿瘤的治疗开辟新的途径17。然而,在TNBC,人们对I型PRMT抑制的治疗潜力知之甚少,用于识别对I型PRMT抑制敏感的肿瘤的可靠生物标志物尚不清楚。

在这项研究中,我们开发了一种化学筛选方法来系统地研究TNBC的表观遗传依赖性,并确定了一种对I型PRMTs抑制的特异性脆弱性。然后,我们研究了细胞系特异性依赖的分子因素,并在人源模型中验证了我们的发现。我们的数据显示,I型PRMT抑制改变了mRNA剪接,导致Alu序列的表达,从而形成胞质双链RNA (dsRNA)。这反过来触发了抗病毒干扰素(IFN)介导的反应,该反应将已经由于预先存在的IFN反应信号升高而受到压力的TNBC细胞推至超过诱导细胞死亡的阈值。

结果

I型PRM是TNBC增长的关键媒介

我们首先使用来自结构基因组学会(SGC)收藏的36种表观遗传化学探针进行了基于细胞的化学筛选(https://www.thesgc.org/chemical-probes)来鉴定TNBC细胞生长的表观遗传调控因子9,18(补充表格1).这个化学探针库包括选择性靶向关键表观遗传调控蛋白的工具化合物,包括目前处于临床前或临床开发中的药物的几个表观遗传靶点。在15个TNBC细胞系中评估每种化合物,并使用活细胞成像平台评估6天内的细胞融合(扩展数据图。1a).初步筛选确定了六种抑制剂,它们在至少三分之一的筛选的TNBC细胞系中显著降低了50%以上的细胞增殖(图。1a).正如先前报道的,BET溴域抑制剂(JQ1和PFI-1)对几乎所有的TNBC细胞系都表现出敏感性6。H3K27me3甲基转移酶和脱甲基酶抑制剂(UNC1999和GSKJ4)以及PRMT5抑制剂(GSK591)也对多种癌细胞具有抗增殖作用,包括TNBC7,19,20。有趣的是,I型PRMTs的选择性和细胞活性抑制剂MS023在许多TNBC细胞系中表现出生长抑制特性,而其化学相似但无活性的对照化合物MS094没有表现出任何作用(图。1a和扩展数据图。1b)21。因为I型PRMT抑制剂在多种人类癌症中具有潜在的广泛适用性13至少有一种药物目前正在临床试验中(NCT03666988),我们试图进一步描述I型PRMT抑制在TNBC的作用。

图1:36种表观遗传学探针的化学筛选确定了I型PRMTs作为TNBC的治疗靶点。
figure 1

a显示了15个TNBC细胞系中所示表观遗传化学探针在第6天时的平均细胞增殖值的热图(数据显示为的平均值±标准差n= 4);KDM,赖氨酸脱甲基酶。b用所示化学探针处理7天的三种TNBC细胞系的活细胞计数(数据显示为的平均值±标准差n= 4);数据分析采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较检验。c,来自癌症依赖性图谱数据集的TNBC细胞系I型PRMTs的基本评分(https://depmap.org/portal/). d,I型PRMT mRNA在TNBC细胞系(n=每组28个TNBC细胞系,每个点代表一个单独的细胞系);数据分析采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验;TPM,每百万份抄本。

源数据

PRMT1是type I型PRM的主要目标

鉴于MS023对所有I型PRMT成员的效力,包括PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8,我们试图了解特定的PRMT是否是TNBC的主要靶点。如细胞汇合的筛选热图所示(图。1a),特异性靶向PRMT3 (SGC707)或PRMT4 (TP-064)和PRMT6 (MS049)的抑制剂在TNBC细胞系中没有显示出显著的抗增殖作用(图。1a和补充表格2).同样,通过CellTiter-Glo发光测定法对细胞活力的评估证实了MS023对代表性TNBC细胞系的深刻抑制作用,这在其他三种抑制剂中没有观察到(图。1b).这些数据排除了PRMT3、PRMT4和PRMT6分别在维持TNBC细胞增殖中的主要作用。

公共人类癌症依赖图数据集的分析(https://depmap.org/portal/)22,23揭示了在I型PRM中,PRMT1基因敲除在一组TNBC细胞系中给出了最高的必需基因得分,表明PRMT1在TNBC起着关键作用(图。1c).在这些TNBC单元格中,重要性分数PRMT1在对MS023治疗敏感的患者中最高(扩展数据图。1c).然而,一些非基底乳腺癌细胞系也依赖于PRMT1,表明PRMT1在这些乳腺癌类型中作为治疗靶点的潜力(扩展数据图。1d).然后我们比较了15种TNBC细胞系中I型PRMTs的表达水平,发现PRMT1mRNA的表达水平高于其他I型PRMTs(图。1d和扩展数据图。1e).值得注意的是,PRMT8在TNBC几乎不表达,这与PRMT8具有脑特异性表达模式的证据一致(图。1d)24。综上所述,我们假设MS023在TNBC的疗效主要是由于抑制了PRMT1的催化活性。

PRMT1抑制抑制肿瘤生长

通过回顾来自两个大型癌症基因组图谱(TCGA)和乳腺癌国际联盟分子分类(代谢)队列的临床数据,我们进一步评估了TNBC对PRMT1的依赖性,并比较了PRMT1在TNBC与其他亚型的表达水平25,26。分析表明PRMT1基底样亚型的mRNA表达明显较高13比其他乳腺肿瘤亚型(图。2a,b).这一发现在一个独立的乳腺癌人源性异种移植物(PDX)和细胞系的小群体中得到进一步证实27队列(图。2c,d).

图2:I型PRMT抑制抑制了TNBC亚群中的肿瘤生长。
figure 2

ad, PRMT1TCGA乳腺癌数据集中的基因表达(a),代谢乳腺癌数据集(b)、玛嘉烈医院PDX数据集(PM-PDXs;c)和玛嘉烈医院细胞系数据集(PM-细胞系;d).根据PAM50分类,这些队列被指定为基础和非基础亚型。基因表达以对数报告2(TPM + 0.001)。在盒图中,中心线标记中间值,盒界限表示第25和第75个百分位数,须状线从第25和第75个百分位数延伸到1.5倍的四分位数范围。个体的数量(n)并标注了倍数变化(FC)值。数据由不成对的双尾学生进行分析t-测试。e在所示细胞系中对MS023的反应的热图。AAC是通过17个TNBC细胞系的剂量反应分析计算出来的。数据被标准化为DMSO。AAC越高表示灵敏度越高。本文对有色细胞系进行了更详细的研究。数据显示为平均值±标准差;n= 4.f用MS023处理5天的Hs578-T和MDA-MB-468细胞的生长曲线。数据显示为平均值±标准差;n= 4.g用指定剂量的MS023和阴性对照MS094处理5天后,MDA-MD-468和Hs578-T细胞的免疫印迹。数据代表n= 3个独立实验。h免疫印迹显示强力霉素诱导的shRNA敲低PRMT1或MDA-MB-468和Hs578-T细胞中的荧光素酶对照。数据代表n= 3个独立实验;SDMA,对称二甲基精氨酸;卢克,荧光素酶。i每日一次施用60 mg kg的MDA-MB-468异种移植物模型的个体肿瘤生长–1MS023当肿瘤直径达到2 mm时。数据显示为平均值±标准差;n= 3.数据分析采用双因素方差分析和Dunnett多重比较检验。j,测量肿瘤重量作为对照(CTL)和MS023处理的小鼠的肿瘤负荷的替代物。数据显示为平均值±标准差(n= 3)并通过具有Dunnett检验的单向ANOVA进行分析。k来自在实验终点用对照或MS023处理的小鼠的肿瘤组织的免疫印迹。数据代表n= 3个独立的技术实验。

源数据

接下来,我们对17个TNBC细胞系进行了9种浓度(范围从40 nM到10 M)的MS023的剂量反应分析,并使用活细胞成像平台分析了反应,以监测细胞随时间的融合(扩展数据图。2a).我们计算了曲线上方的面积(AAC ),以获取抑制剂的功效和效力,AAC值越高,表明对MS023治疗的敏感性越高(图。2e).这些高度可重复的反应鉴定了敏感(例如MDA-MB-468)和耐药(例如Hs578-T)细胞系,表明MS023并非普遍抑制细胞生长,在TNBC模型中存在敏感性的特定决定因素。代表性实验显示了MS023在5天内对敏感和抗性细胞系中TNBC细胞生长的影响(图。2f).临床抑制剂GSK3368715在MS023敏感和MS023耐药细胞中观察到类似的差异抑制模式(扩展数据图。2b).

鉴于PRMT1是最丰富的1型PRMT酶,我们研究了MS023的抗增殖作用是否与ADMA标记的减少一致。为了解决这个问题,我们测量了MS023治疗5天后敏感细胞系(MDA-MB-468)的ADMA水平(图。2g).我们观察到在0.1 M至3 M的剂量范围内,ADMA水平以剂量依赖性方式降低,这对于MDA-MB-468细胞系的增殖具有显著的抑制作用。观察到的MS023抑制的PRMT1依赖性效应不是由于PRMT1水平的变化,因为其表达在治疗后没有改变(图。2g).在对I型PRMT抑制反应的敏感细胞和抗性细胞之间没有观察到对称二甲基精氨酸水平的显著差异,表明对MS023的抗性不是由于对称二甲基精氨酸补偿(图。2g).MS023处理也减少了耐药细胞系Hs578-T中的ADMA标记,排除了药物外排泵或其他可能简单地阻止MS023靶调节的机制导致不同敏感性的可能性。

然后我们表演了PRMT1基因敲除试验证实I型PRMT抑制的靶效应。击倒PRMT1使用三种不同的诱导型短发夹RNA(shrna)降低了两种细胞系中的PRMT1表达和ADMA标记(图。2h和扩展数据图。2c).正如用MS023处理所观察到的,PRMT1敲除基本上抑制了敏感细胞系(MDA-MB-468,HCC1143和SUM149-PT)中的细胞生长,但不抑制抗性细胞系(Hs578-T,CAL-120和HCC1806扩展数据图。2d–g).综上所述,这些数据支持MS023在TNBC细胞系亚群中的抗增殖作用是由于对PRMT1活性的抑制。

为了确定上述观察到的体外效应是否可以转化为体内抗肿瘤活性,我们接下来评估了MS023在体内的疗效和耐受性。分别用对照(水)或MS023处理携带MDA-MB-468异种移植物的小鼠。MS023耐受性良好,在35天内,用MS023治疗的动物与对照治疗的动物的体重没有差异(扩展数据图。2h).每日一次,剂量为60毫克/千克–1在具有可触知肿瘤的小鼠中开始的MS023显著降低了肿瘤生长和最终肿瘤重量(图。2i,j)28。值得注意的是,MS023治疗减少了异种移植组织的ADMA标记,表明肿瘤大小的减少与PRMT1酶功能的破坏一致(图。2k).虽然这种探索性试验需要更多的体内研究进一步证实,但我们的数据共同表明,I型PRMT抑制,主要是通过PRMT1抑制,可能是治疗TNBCs亚群的一种有前途的治疗策略。

先前存在的IFN信号与MS023敏感性相关

尽管PRMT1涉及多种生物学过程,如转录调节、前mRNA剪接和受体信号传导13这些途径中的任何一种对TNBC肿瘤细胞的PRMT1依赖性的影响程度尚不清楚。先前的研究已经确定了PRMT1抑制的敏感性和甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)水平之间的相关性,尽管这种相关性在乳腺癌中不如在淋巴瘤中那么强17。我们的数据显示,对PRMT1抑制的反应和MTAP缺陷之间没有相关性(扩展数据图。3a).最近的一份报告显示,富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子2 (SRSF2)的突变使白血病细胞对I型PRMT抑制敏感28。然而,我们发现SRSF状态或其他剪接因子突变似乎与to PRMT1敏感性无关(扩展数据图。3b).鉴于PRMT1和PRMT5之间的协同效应(参考文献。29),我们研究了PRMT5表达和MS023敏感性。PRMT5的mRNA和蛋白水平都不能预测MS023的反应(扩展数据图。3c,d).排除这些候选者后,我们对我们的17个TNBC细胞系进行了系统的基础基因表达的全局分析27并计算MS023活性的皮尔逊相关系数(通过图1中MS023剂量-反应曲线的AAC值测量)。2e)与个体基因表达水平(图。3a).然后我们对这些有序排列的基因列表进行基因集合富集分析(GSEA)。IFNα反应途径是最丰富的途径,还有几个额外的免疫相关途径,包括通过NF-κB途径的IFNγ反应和肿瘤坏死因子-α信号,也是MS023敏感系中最丰富的途径(图。3b,c).鉴于复制应激和IFN反应之间的联系,我们计算了每个TNBC细胞系的倍增时间,发现增殖率和MS023敏感性之间没有相关性(扩展数据图。3e).总之,我们的结果表明,预先存在的参与IFN信号通路的基因表达增强可能预测对MS023的反应性。

图3:增加的IFN反应是对I型PRMT抑制反应的基础。
figure 3

a对个体基因表达和MS023活性进行Pearson相关分析。原木火山图2显示了在敏感系(红色,左)或抗性系(蓝色,右)中显著上调的所有基因的倍数变化值。数据由不成对的双尾学生进行分析t-多重比较测试。b,前九个途径与MS023敏感性显著相关。数据采用单尾Fisher精确检验进行多重比较分析;FDR,错误发现率;上皮间质转化。c,GSEA,用于与在敏感的TNBC品系中富集的IFN反应相关的基因组。数据采用单尾Fisher精确检验进行分析。d用DMSO或MS023处理的不同类器官模型的图像;比例尺,100 μm。显示的图像代表n= 4个独立实验。e类有机物对MS023处理的不同反应。数据显示为平均值±标准差;n= 2.f热图显示了敏感和耐药模型之间IFN应答基因的差异表达。g,qRT-PCR验证MS023敏感和MS023抗性类器官模型中指定基因的表达。数据显示为平均值±标准差;n= 3.

源数据

为了在更具临床相关性的TNBC模型中更好地解决这一假设,我们测试了IFN信号基因特征和MS023敏感性之间的相关性是否在人源TNBC样本中也很明显。三维癌症器官样模型被认为能更好地概括TNBC的临床疾病和上皮异质性,因此被认为是评价药物反应的优越工具30。用剂量范围从0 M到10 M的DMSO或MS023处理四种不同的类器官模型,并通过显微镜评价和染色前染色进行评估。这些类器官模型的代表性图像(图。三维(three dimension的缩写))并且显示了每个模型和处理条件的定量细胞存活力百分比(图。3e).使用匹配这些类器官模型的肿瘤转录组数据,研究了MS023敏感和MS023抗性类器官模型之间IFN反应基因的差异表达(图。3f).一致地,具有较高基础IFN基因表达的类器官对MS023处理更敏感,而具有较低IFN基因表达的类器官更具抗性。从类器官中提取的RNA的定量实时PCR(qRT–PCR)进一步证实了1型辅助T细胞趋化因子的上调(例如,CCL2CCL5)和抗原呈递基因(例如,B2MBTG1)在敏感模型中(图。3g).总之,我们在一系列人源模型中的发现表明,预先存在的IFN应答信号水平与I型PRMT抑制的敏感性程度相关。

I型PRMT抑制触发IFN反应

为了更好地了解type I型PRMT抑制作用的潜在机制,我们在用MS023治疗5天后对MDA-MB-468细胞进行了RNA测序(RNA-seq ),并鉴定了2085个显著差异表达的基因(P < 0.05, false discovery rate < 0.05; Fig. 4a).Hallmark enrichment分析显示,在MS023处理后,E2F靶和G2M检查点途径下调,表明I型PRMT抑制影响细胞周期调节基因的表达(图。4b).一致认为,MS023治疗导致S期适度但显著的减少,同时G1期增加(扩展数据图)。4a)17。也与在敏感细胞系中观察到的MS023的抗肿瘤作用一致,GSEA揭示了MS023处理后诱导的凋亡途径(扩展数据图。4b).MS023处理后凋亡细胞数量的增加证实了这一点(扩展数据图。4c).除了可能反映I型PRMT抑制的下游结果的上述效应之外,MDA-MB-468(敏感)和Hs578-T(抗性)品系中差异基因表达模式的比较显示,用MS023处理5天降低了敏感品系中DNA修复基因的表达,但没有降低抗性品系中DNA修复基因的表达(图。4c和扩展数据图。4d,e).MDA-MB-468细胞的蛋白质印迹显示,组蛋白H2AX在Ser 139 (pH2AX)处的磷酸化(DNA损伤的标志)在MS023处理后增强(图。4d).为了排除化合物毒性诱导的潜在非特异性效应,我们再次用MS023处理MDA-MB-468细胞,但仅处理2天。4f),E2F/G2M通路下调(扩展数据图。第四代移动通信技术)、DNA损伤或dsRNA积累(扩展数据图。4h,我)是在这个较早的时间点观察到的,与生长抑制机制一致,而不是急性毒性。

图4: MS023治疗引发IFN反应。
figure 4

a,火山图的日志2MDA-MB-468细胞系中MS023处理5天后,基因显著上调(红色,右)或下调(蓝色,左)的倍数变化。数据由不成对的双尾学生进行分析t-测试;NS,不显著。b在所有排列的差异表达基因中,GSEA。数据分析采用单尾Fisher精确检验;NES,标准化浓缩分数。c显示MDA-MB-468和Hs578-T细胞系中MS023处理5天后与DNA修复相关的基因的热图。d免疫印迹显示在MDA-MB-468和Hs578-T细胞系中用DMSO或MS023处理的DNA损伤标记pH2AX的表达水平。数据代表n= 3个独立实验。e显示用DMSO或MS023处理5天的MDA-MB-468细胞中指示基因的RNA-seq数据的热图fqRT-PCR分析了用DMSO或MS023处理5天的MDA-MB-468细胞中指示的IFN应答基因的表达。数据显示为平均值±标准差;n= 5 forSTING1, OAS1, MX1, TLR3磷酸甘油醛脱氢酶; n= 3 forIFNB1干扰素。数据分析采用双因素方差分析和Dunnett多重比较检验。gMS023处理5天后MDA-MB-468细胞中所示蛋白质的免疫印迹。标有归一化的带强度。数据代表n= 3个独立实验;p-STAT1,磷酸STAT1;p-IRF3,磷酸-IRF3。

源数据

GSEA进一步提出了一种先天免疫反应机制,这可能有助于抗增殖表型。在MDA-MB-468细胞中,IFNα和IFNγ先天免疫反应途径的上调是由I型PRMT抑制触发的显著GSEA信号(图。4b,c).在MS023处理后最高上调的基因中,我们观察到基因表达增加,如IFNβ和IFNγ的IFN应答基因和STING1和TLR-3的dsRNA感应途径基因。在RNA-seq和随后的qRT-PCR验证中都观察到了抗病毒应激反应的这些标记(图。4e,f).类似地,western blotting鉴定了dsRNA感应途径的激活,这反映在敏感细胞系MDA-MB-468中MS023处理后STAT1和IRF3磷酸化的增加以及STING1和MAVS的表达(图。第四代移动通信技术).总之,这些结果确定了对dsRNA升高的应激反应是I型PRMT抑制的潜在结果,这可能是其抗增殖和细胞毒性作用的基础。

I型PRMT抑制诱导dsRNA积累

为了研究MS023治疗是否以及如何在TNBCs中引发病毒拟态反应,在MDA-MB-468(敏感)和Hs578-T(耐药)细胞系中进行了基因本体论(GO)分析。MS023在敏感系中诱导免疫相关反应的程度比抗性系大得多(图。5a和扩展数据图。5a).基因组包括对dsRNA的细胞反应和dsRNA感应信号(核内体空泡途径)是两个最重要的正向富集途径(图。5b,c).为了进一步验证dsRNA的形成,用J2抗体(dsRNA检测的金标准)进行免疫荧光染色31)确定了PRMT1的遗传或药理学抑制诱导MS023敏感细胞系中胞质dsRNA的大量增加(图。5d,e和扩展数据图。5b–d)但不在MS023抗性品系中(扩展数据图。5e–g).我们还比较了MS023敏感(MDA-MB-468)和MS023耐药(Hs578-T)细胞系中dsDNA的形成,发现MS023处理后,两种细胞系中dsDNA的积累程度相似,排除了dsDNA在MDA-MB-468细胞中不同IFN活化中的主要作用(扩展数据图)。5h,我).

图5:由于内含子保留增加,I型PRMT抑制诱导细胞质dsRNA形成。
figure 5

acI型PRMT抑制导致MS023敏感细胞中免疫信号的激活。a,MS023处理后MDA-MB-468细胞系中富集的上调基因组的柱状图。与免疫反应相关的基因是红色的。数据采用单尾Fisher精确检验进行分析。b,GSEA,研究与dsRNA感应核内体液泡途径相关的基因组。数据采用单尾Fisher精确检验进行分析。c,GSEA,用于与细胞对dsRNA的反应相关的基因组。数据采用单尾Fisher精确检验进行分析。d,通过抗dsRNA (J2)免疫荧光评估细胞dsRNA;比例尺,10 μm。显示的图像代表n= 3个独立实验。e细胞质dsRNA信号强度的定量;AU,任意单位。数据显示为平均值±标准差;n=每组分析至少85个细胞的3个独立生物实验。数据分析采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。

源数据

MDA5 (IFIH1)、RIG-I (DDX58)和TLR-3是与细胞内dsRNA结合的受体32。为了了解这些dsRNA传感器在IFN激活中的单独作用,我们用有效的shRNAs或短干扰RNA减少了它们在MDA-MB-468细胞中的表达。击倒DDX58或者TLR-3降低MS023介导的IFN基因上调IFNB1, MX1OAS1并挽救了MS023的生长抑制作用(图。6a–g).然而,IFIH1敲除对MS023诱导的IFN基因表达和细胞生长没有显著影响(图。6a、e).这些结果表明,优先识别不同dsRNA库的RIG-I (DDX58)和TLR-332负责响应MS023治疗的IFN活化。

图6: MS023激活dsRNA传感器诱导IFN信号传导。
figure 6

a,的表情IFIH1并指出在scramble处理的(shCTL)、MS023处理的和IFIH1-通过qRT–PCR分析敲除/MS023处理的MDA-MB-468细胞。b,的表情DDX58并指出在scramble处理的、MS023处理的和DDX58-通过qRT–PCR分析敲除/MS023处理的MDA-MB-468细胞。c,的表情TLR3并指出在scramble处理的、MS023处理的和TLR3-通过qRT–PCR分析敲除/MS023处理的MDA-MB-468细胞。数据输入ac显示为平均标准差(n= 3)并使用Dunnett多重比较检验进行单向ANOVA分析。d加扰处理的细胞融合,IFIH1击倒对手,DDX58-击倒和TLR3-敲除MDA-MB-468细胞。数据显示为平均值±标准差(n= 4)并使用Dunnett多重比较检验进行单向ANOVA分析。e,scramble处理、MS023处理和IFIH1-敲除/MS023处理的MDA-MB-468细胞。f,scramble处理、MS023处理和DDX58-敲除/MS023处理的MDA-MB-468细胞。g,scramble处理、MS023处理和TLR3-敲除/MS023处理的MDA-MB-468细胞。数据输入eg显示为平均标准差(n= 4)并使用Dunnett多重比较检验进行双向ANOVA分析。h显示属于每个主要选择性剪接类别的as数量的柱状图。i显示内含子仅与对中的第一个Alu相交的IR对的计数的柱状图(1;白色),只有对中的第二个Alu(2;灰色)或与该对中的两个alu(1/2;红色)。j,qRT–J2免疫沉淀后指定基因的PCR分析。数据显示为平均值±标准差(n= 4)并使用Dunnett多重比较检验进行单向ANOVA分析;ssRNA,单链RNA。

源数据

在观察到胞质dsRNA对I型PRMT抑制的反应后,我们试图确定dsRNA的来源及其与I型PRMT抑制的关系。不同于其他表观遗传抑制剂,例如DNA甲基转移酶抑制剂和赖氨酸特异性去甲基化酶抑制剂33,34,35诱导内源性逆转录病毒(ERV)表达,MS023处理没有显著增加ERV表达(扩展数据图。6a、b).最近有报道称,通过抑制剪接调节途径来破坏mRNA剪接,可以通过诱导错误剪接的RNA来引发抗病毒反应。特别是,带有保留内含子的错切mRNAs形成双链结构,积聚在细胞质中36。鉴于I型PRMTs对mRNA剪接的广泛影响12,28我们假设,响应MS023处理的dsRNA形成的诱导是由于RNA剪接的直接失调。为了验证这一假设,分析了RNA-seq数据,以确定与MS023治疗相关的破坏性可变剪接事件(as)。通过qRT–PCR验证了剪接分析预测的ASEs子集(扩展数据图。6c,d).在MS023治疗后,总共鉴定了546个具有统计学意义的差异剪接事件,包括外显子跳跃、3’或5’位点的选择性剪接(A3SS/A5SS)和保留内含子,分布在422个基因中(图。6小时).重要的是,保留的内含子是主要的酶之一,表明I型PRMT抑制对剪接的主要作用是诱导内含子保留。

最近的研究表明,内含子正弦元件,特别是反向重复(IR) Alu元件(IR-Alus),在用DNA去甲基化剂处理后诱导,导致免疫原性dsRNA35,36,37,38。我们询问保留内含子内的IR-Alus是否可能是MS023处理诱导的dsRNA的来源。对能够在MS023相关的保留内含子中形成IR-Alu的序列的搜索揭示了总共152个保留内含子中的62%具有与IR-Alu交叉的序列,并且大约50%的保留内含子具有在有义和反义方向双向转录的IR-Alu序列对(图。6i).然而,在抗性Hs578-T细胞中仅鉴定到10个位于48个保留内含子中的IR-Alu序列,这比在MDA-MB-468细胞中少得多(152个保留内含子中的66个IR-Alu;扩展数据图。6e,f).这种低数量的IR-Alu对可能不足以触发dsRNA积累和随后的抗病毒介导的IFN反应。在MDA-MB-468细胞中对dsRNA进行免疫纯化,然后进行qRT–PCR,结果显示用IR-Alus(CD46ASH1L)而不是两种代表性的宿主mRNAs(塔布肌动蛋白;图。6j),证实了它们对MS023敏感细胞系中响应I型PRMT抑制的dsRNA库的贡献。总之,这些结果表明,I型PRMT抑制导致IR-Alus保留内含子,导致dsRNA积累。因为我们没有检测到MS023敏感和MS023耐药细胞系之间dsRNA积累或保留内含子富集的任何预先存在的差异,需要进一步的研究来确定基础IFN反应基因表达特征的影响因素,以及这些因素如何使TNBC细胞对MS023敏感(扩展数据图。7a,b).

讨论

在这项研究中,我们采用了一种无偏见的表观遗传化学筛选方法,并确定I型PRMT抑制剂MS023能够抑制TNBC细胞亚群的增殖。由于I型PRMTs在许多癌症类型中过度表达,并且发现它们的抑制作用在许多情况下是肿瘤抑制性的,因此最近I型PRM ts作为有希望的靶点而受到关注12,17。具体来说,在TNBC,我们的研究表明,对PRM t1(I型PRMTs中的主要靶点)的遗传和药理学抑制可诱导细胞周期停滞和凋亡,从而抑制部分TNBC的肿瘤。此外,临床前模型显示,I型PRMT抑制抑制了体外和体内人源模型中的肿瘤生长。

基于分子的药物反应预测是精确肿瘤学的主要目标。鉴于TNBC的复杂性和异质性,开发药物反应的可靠分子预测指标既是机遇也是挑战。尽管一些因素,如基因组缺失或表观遗传沉默磷酸化酶或者SRSF突变与对I型PRMT抑制的反应性相关,在TNBC的情况下,这些分子标记中没有一个与MS023的敏感性相关17,28。然而,我们的基因表达数据显示,对MS023治疗最敏感的TNBC细胞具有富含IFN应答和抗病毒信号的基因表达特征。这种相关性在人类衍生的类器官中得到证实,它为开发先天免疫反应的标记物提供了机会,以对最有可能受益于I型PRMT抑制的个体进行分层。我们的生长抑制结果与结肠直肠癌类器官和人源胶质母细胞瘤干细胞系中MS023敏感性的报道一致39,40,提供了额外的模型来评估对PRMT1抑制剂(如MS023)敏感性的先天免疫反应的依赖性,但其潜在机制尚未研究。需要进一步的研究来评估我们在TNBC的观察是否可以推广到其他人类肿瘤。

新出现的证据支持一些表观遗传靶向分子,如靶向DNA甲基转移酶的抑制剂34,35,EZH2(参考41),LSD1(参考33),SETDB1(引用。42)和CARM1(参考43),能够诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。这些效应是诱导的“病毒模拟效应”、增加的肿瘤抗原表达/呈递、T细胞活化、重塑的肿瘤微环境或其组合的结果。在这里,我们发现了I型PRMT抑制和先天抗肿瘤免疫之间的新联系。I型PRMT的药物抑制通过诱导敏感TNBC系中胞质dsRNA的积累而放大了预先存在的IFN反应。与诱导ERV表达的许多其他表观遗传抑制剂不同,MS023处理触发内含子保留的RNA积累dsRNA。虽然PRMT酶通常根据其组蛋白底物被归类为表观遗传靶标,但PRMT具有更广泛的靶标,尤其是参与mRNA剪接的RNA结合蛋白。鉴于I型PRMT在RNA剪接上的广泛作用,我们的发现与最近的报告一致,该报告显示剪接体靶向治疗诱导内含子保留的转录物和dsRNA形成36.

总之,我们的结果表明,I型PRMT抑制导致有效的抗肿瘤活性,这种活性与IFN应答增加和来自错切RNA的dsRNA积累有关。值得注意的是,I型PRMT抑制的先天免疫效应仅限于具有预先存在的升高的IFN应答基因表达特征的TNBC细胞,这表明MS023治疗可能会将已经受到应激的TNBC细胞推到诱导细胞死亡的阈值以上。I型抑制敏感性生物标志物的鉴定为这类治疗在TNBC和其他癌症中的靶向发展提供了重要的见解。此外,鉴于I型PRMT抑制剂在刺激dsRNA和IFN应答信号中的一般作用,靶向I型PRMT结合免疫检查点抑制可能为癌症免疫治疗提供潜在的新机会。


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