合成代谢合成途径的抑制不同地影响癌细胞的运动潜力 为了评估不同合成代谢途径对癌细胞迁移的相对重要性，我们采用了一组针对糖酵解、线粒体电子传递链(ETC)以及脂质、蛋白质和核苷酸合成的代谢扰动(图。 1a ).正如预期的那样，所选择的代谢干预抑制了MDA-MB-468乳腺癌细胞的增殖并影响了其细胞周期进程，在48小时治疗后没有至轻度的毒性作用(图。 1b–c S1A ).糖酵解等、脂质和蛋白质合成的抑制显著减少了MDA-MB-468细胞的迁移(图。 1d ).令人惊讶的是，与所有其他生长抑制条件相反，用各种药物抑制核苷酸合成并没有减少MDA-MB-468细胞的迁移(图。 1e ).曲线下面积(AUC)的计算使我们能够定量比较伤口随时间的愈合情况(图。 1d，e )并证实在用鱼藤酮(Rot)、半乳糖(Gal)、辛伐他汀(SIM)和西罗莫司(雷帕霉素，SIR)治疗后伤口闭合显著减少。然而，在划痕试验中，与完全增殖的、未处理的对照细胞相比，用抗叶酸剂甲氨蝶呤(MTX)和培美曲塞(PEM)以及羟基脲(HU)和氯法拉滨(CLO)处理不影响或甚至显著增加伤口闭合。虽然细胞迁移与所有其他代谢干扰的细胞生长减少相关，但核苷酸合成抑制并不减少与生长抑制相关的细胞迁移(图。 1f，g ).在LN229胶质母细胞瘤和4T1乳腺癌细胞中证实了响应核苷酸合成抑制的持续迁移(图。 S1B–D ).值得注意的是，使用透析或正常的FBS没有改变结果(图。 S1E ).这一观察结果也在使用Boyden室的跨孔迁移分析中得到证实(图。 1h S1F，G ).此外，在跨孔分析中使用ECM-胶原涂层，我们发现核苷酸合成抑制对MDA-MB-468细胞的侵袭能力也没有影响(图。 1h )、LN229和4T1电池(图。 S1F，G ).为了验证MTX抗性是否导致促迁移效应，我们通过在50纳米MTX中长期培养2个月产生了MTX抗性MDA-MB-468细胞。产生的MTX抗性MDA-MB-468细胞在MTX浓度增加的情况下增殖(图。 1i )并显示出与亲代MDA-MB-468细胞系相比增强的迁移能力(图。 1j
图1:主要合成代谢合成途径的抑制不同地影响癌细胞的运动潜力。 a 代谢构件(脂质、核苷酸和蛋白质)的合成路线以及所选药物组的药理学干预点。 b 在用100 nM西罗莫司(SIR)( n = 3)，1微米辛伐他汀(SIM)( n = 3)、50纳米鱼藤酮(Rot)( n = 5)、半乳糖( n = 5)补充，50纳米甲氨蝶呤(MTX)( n = 4)，1微米·培美曲塞(PEM)( n = 4)，0.5 mM羟基脲(HU)( n = 4)，以及100纳米氯法拉滨(CLO)( n = 4).平均标准差；采用Dunnett多重比较检验的普通单因素方差分析。未标记的与Ctrl的比较都是有意义的 p < 0.0001. c MDA-MB-468细胞按照在( b ).通过流式细胞仪和膜联蛋白FITC/PI染色评估细胞死亡；独立实验的平均标准偏差( n = 8 (Ctrl)， n = 4 (SIR，SIM，PEM，CLO)， n = 3(罗特，高尔，，胡))。采用Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。 d , e MDA-MB-468细胞在( d )50纳米腐烂( n = 5)，Gal( n = 5)，1微米SIM( n = 3)，以及100纳米SIR( n = 4)或( e )50纳米MTX( n = 7)，1微米·佩姆( n = 3)，0.5毫米胡( n = 4)，和100纳米CLO (n = 4)和各自的曲线下面积(AUC)；独立实验的平均值SEMBrown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 f , g 细胞迁移的相关性(超过40小时的AUC，平均SEM，( n =如在( d , e ))和增殖(48小时后细胞生长倍数，平均值±SD( n =如在( b )).MDA-MB-468细胞按照在( b )和( d , e ). h 用50 nM MTX处理24小时的MDA-MB-468细胞的迁移和侵袭，使用无涂层(迁移)或ECM-胶原涂层(侵袭)的Boyden室。平均SEM(迁移: n = 3，入侵: n = 7 (Ctrl)，5 (MTX，3(Pem))；Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 i MTX耐药MDA-MB-468细胞在MTX指定浓度下的增殖[nM]；独立实验的平均SEM( n = 4). j 亲代和MTX抗性MDA-MB-468细胞的迁移和各自的AUC独立实验的平均值SEM(亲本 n = 15，电阻 n = 6);不成对，双尾 t -用韦尔奇校正法测试。显示了50%伤口闭合的时间点。源数据作为源数据文件提供。
总之，任何主要合成代谢途径的干扰都会导致生长抑制。然而，对细胞迁移的影响高度依赖于靶向代谢途径，核苷酸合成是消除细胞运动性的无效靶点。此外，在耐药细胞中延长的核苷酸合成抑制对更活跃的癌症亚群起到选择压力的作用。
活性氧驱动的EMT表型支持MTX的持续运动 因为MTX诱导了最强的生长抑制而没有增加细胞死亡(图。 1b，c )，我们将它作为一种工具化合物来区分增殖和迁移，以研究支持癌细胞迁移的代谢过程。测试多个浓度后(图。 S2A )，我们为随后的实验选择了浓度为50纳米的MTX。50纳米MTX在MDA-MB-468细胞中显著抑制生长和细胞周期(图。 1b S1A )并且也显示在治疗窗口内 26 ,27 ,28 ,29 。因为50 nM的浓度与早期的体外研究相比明显较低 20 ,30 ,31 ,32 ,33 2a ).MTX耐药MDA-MB-468细胞显示了相似的形态学改变(图。 S2B ).而MTX处理后观察到的细胞周期和增殖停滞是快速可逆的(图。 S2C特区 )一旦MTX被免职，[U- 13 c]丝氨酸示踪和代谢通量分析证实，50纳米MTX确实强烈抑制核苷酸合成(图。 2b ).值得注意的是，核苷酸合成在MTX耐药MDA-MB-468细胞中部分恢复(图。 S2E ).细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)和定量蛋白质组学分析进一步证实了所选MTX剂量的功效，因为MTX的机制靶点如二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷酸合酶(TYMS)和胸苷激酶(TK1)如预期的那样通过治疗上调(图。 S2F ).DHFR的表达在MTX抗性细胞中也增加了，而FolRa的表达略有减少(图。 S2G ).此外，超氧化物歧化酶(SOD)是治疗反应中最显著上调的蛋白质之一(图。 S2F )，这与先前描述MTX是氧化应激的有效诱导剂的报道一致 30 ,34 ,35 。我们通过测量急性MTX治疗后和MTX耐药细胞中线粒体和胞质活性氧化剂(ROS)的中度但显著增加，用低剂量的MTX验证了这些先前的发现(图。 S2H，我，J ).随着ROS水平的增加，我们观察到NRF2的稳定，然而，这并没有导致BACH1轴的激活，正如早期报道的转移性肺癌 36 ,37 (图。 S2K，我 ).MTX中ROS水平的增加与早期的报道一致，这些报道强调了氧化应激作为通过上皮-间质转化(EMT)的癌细胞转化的驱动力的潜力 38 ,39 ,40 ,41 ,42 ,43 ,44 。EMT也是已知的逃避化疗诱导效应的一般机制。
图2:ROS驱动的EMT表型支持MTX下运动性的增强。 a 48小时50纳米MTX后MDA-MB-468细胞的形态。明场图像代表3个独立的实验。比例尺对应60和300 μm b 细胞内ATP在[U-上的质量同位素分布 13 c]在MDA-MB-468细胞中响应24小时50纳米MTX的丝氨酸示踪剂。5个独立实验的平均值SEM，每个实验在三个孔中测量。 c MDA-MB-468细胞中指定靶基因的mRNA表达在50纳米MTX下在指定时间点通过实时RT-qPCR测量。平均SEM( n = 3 (24小时，48小时)，6 (72小时，144小时)。在72小时没有测量到段塞表达的数据 d 240小时50纳米MTX后MDA-MB-468细胞中波形蛋白的表达:β-肌动蛋白作为加载对照。波形蛋白信号相对于总蛋白染色的定量。平均标准偏差( n = 3);不成对，双尾 t -用韦尔奇校正法测试。 e MDA-MB-468细胞对10mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)和50 nM MTX的迁移潜力，作为砧细胞中相对伤口密度和各自AUC的量化。图表显示了独立实验的平均SEM( n = 3);Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验和Games-Howell多重比较检验。 f 在10 mM NAC和50 nM MTX下，MDA-MB-468细胞中指定靶基因的mRNA表达在72小时时通过实时RT-qPCR测量。平均SEM( n = 3).源数据作为源数据文件提供。
与之前的报告一致，我们发现 ZEB1 和 ZEB2 表达以及 精力 在急性MTX治疗和MTX耐药细胞系中，表达以时间依赖性方式上调(图。 2c，d S2F，M，N ).MTX处理也诱导了胶原酶的表达 金属蛋白酶9 (图。 S2O )，一种在癌细胞入侵过程中参与细胞外基质降解的酶 45 。用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理细胞降低了MTX处理的MDA-MB-468细胞中的ROS水平(图。 S2P )并导致MTX诱导的细胞迁移显著减少(图。 2e )和EMT表型诱导(图。 2f ).这些发现证实了所选择的低剂量MTX足以以ROS依赖的方式促进EMT，支持了早期的报告，该报告表明在使用高剂量MTX的情况下，在肺纤维化的背景下发生EMT 46 ,47 。MTX后细胞ROS水平的适度增加可能有助于促迁移刺激，随后导致观察到的持续迁移。
MTX处理的细胞维持高代谢率并增强丝氨酸的重新合成 除了这里报道的MTX对ROS和EMT的特异性作用，我们想利用MTX效应(持续迁移)来确定支持细胞迁移的生长非依赖性代谢责任。
为此，我们使用[U-1]描绘了中枢碳代谢 13 谷氨酰胺和 13 c]葡萄糖示踪，通过TCA循环监测糖酵解活性和谷氨酰胺或葡萄糖衍生的碳氧化(图。 3a，d ).谷氨酰胺和谷氨酸盐的绝对消耗和释放(核心)速率在MTX治疗后保持不变(图。 3b )，而相对TCA循环通量的[U- 13 c]谷氨酰胺在对MTX的反应中显著增加(图。 3c ).葡萄糖和乳酸核心速率的绝对量化也揭示了MTX治疗后持续的高糖酵解速率(图。 3e ).这是令人惊讶的，因为乳酸盐的释放速率与细胞生长速率相关 48 。在MDA-MB-468细胞中，糖酵解速率和相关的乳酸盐释放保持在恒定的高水平(图。 3e )表明，即使在抑制生长的MTX条件下合成代谢反应的能量需求减少的情况下，糖酵解来源的ATP也在不断产生。因此，[U- 13 c]MDA-m b-468细胞中的MTX处理维持了TCA循环中的葡萄糖分布(图。 3f )以及4T1和LN229单元中(图。 S3A，B ).先前已经表明MTX抑制HCT116细胞中的耗氧率(OCR) 18 。我们可以复制这一发现，并观察到MTX后HCT116细胞中的OCR减少了约30 %(图， S3C )，而MDA-MB-468、LN229和4T1细胞中的OCR得以维持(图。 3g ).这表明MTX对OCR的细胞系特异性作用。此外，MTX处理显著增加了葡萄糖到丝氨酸的相对流量，尽管降低了核苷酸合成的合成代谢需求(图。 3h S3D ).在多种细胞系中，对MTX处理的反应中，催化从葡萄糖重新合成丝氨酸途径的PHGDH、PSPH和PSAT1的蛋白水平没有改变(图。 S3E–H ).与Diehl等人的观点一致 49 。谁证明了NAD的变化 + /NADH比率可以增加PHGDH活性，从而增加丝氨酸从头合成速率，我们观察到NAD增加 + /NADH比率在MTX(图。 3i ).由于MTX被很好地描述为DHFR和1C代谢的抑制剂，我们惊讶地发现MTX治疗也增加了来源于[U-1]的胞外甲酸盐M + 1同位素的丰度 13 c]葡萄糖通过丝氨酸和线粒体1C代谢(图。 3j S3I
图3: MTX处理的细胞维持高代谢率并增强丝氨酸的从头合成。 a 糖酵解和三羧酸(TCA)循环与代谢的相互依赖 13 c标签图案来自[U- 13 c]谷氨酰胺。 b 在24小时50纳米MTX后，MDA-MB-468细胞的培养基中谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸盐(Glut)的绝对消耗和释放(核心)速率。圆点代表由三个孔组成的单个实验的平均值；平均SEM(n = 3). c Gln、Glut、α-酮戊二酸(αKG)、富马酸盐(Fum)、苹果酸盐(Mal)、天冬氨酸盐(Asp)和柠檬酸盐(Cit)的选定同位素在[U- 13 c]谷氨酰胺示踪剂在MDA-MB-468细胞中对24小时50纳米MTX的反应。圆点代表三个孔中独立实验的平均值；平均SEM不成对，双尾 t -用韦尔奇修正进行测试( n = 3). d 糖酵解和TCA循环与代谢的相互依赖 13 c标签图案来自[U- 13 c]葡萄糖。 e 24小时50纳米MTX后MDA-MB-468细胞培养基中乳酸和葡萄糖的绝对核心率。圆点代表由三个孔组成的单个实验的平均值；平均SEM(n = 3). f 丙酮酸盐(Pyr)、Cit、αKG、Fum、Mal和Asp的选定同位素在[U- 13 c]在MDA-MB-468细胞中响应24小时50纳米MTX的葡萄糖示踪剂。圆点代表由三个孔组成的单个实验的平均值；平均SEM不成双的t -用韦尔奇修正进行测试( n = 3). g MDA-MB-468、LN229和4T1细胞在24小时50纳米MTX下的基础细胞呼吸，作为线粒体耗氧率(OCR)的量化。圆点代表由六个技术重复组成的单个实验的平均值；平均SEM(n = 3 (LN229)，4 (MDA-MB-468，4T1))。 h 丝氨酸M + 3同位素在[U-上的富集 13 c]葡萄糖在MDA-MB-468细胞中的24小时50纳米MTX。圆点代表三个孔中独立实验的平均值；平均SEM不成对，双尾 t -用韦尔奇修正进行测试( n = 3). i 绝对细胞内NAD比率 + 24小时50纳米MTX作用于MDA-MB-468细胞中的NADH。点代表由三个孔组成的单个实验的平均值；平均SEM不成双的t -用韦尔奇修正进行测试( n = 3). j [U-]MDA-m b-468细胞胞外甲酸盐的M + 1同位素组成 13 c]葡萄糖在24小时50纳米MTX。圆点表示在三个孔中测量的独立实验的平均值；平均SEM( n = 4).源数据作为源数据文件提供。
总之，代谢谱表明，尽管对生物质生产的代谢需求降低，但MTX处理的细胞维持了与完全增殖的细胞相当的高代谢率。此外，与一般假设相反，胞质DHFR抑制导致丝氨酸合成和下游线粒体甲酸排泄速率增加，表明线粒体1C代谢与胞质1C代谢解偶联。
线粒体通过胞质1C途径抑制来保护1C代谢依赖性丝氨酸分解代谢 我们发现[U- 13 c]MTX下葡萄糖衍生的M + 1甲酸盐排泄(图。 3j S3I)，允许这样的假设，即当胞质1C代谢失活时，线粒体1C代谢可以以自给自足的方式发挥作用(图。 4a ).为了证实这个假设，我们采用了[U- 13 c]丝氨酸追踪以监测通过1C代谢的丝氨酸流量。我们观察到，在MDA-MB-468或LN229细胞中，通过MTX阻断1C代谢的胞质不会降低丝氨酸、甘氨酸和甲酸的交换速率(图。 4b，C S4A，C ).相比之下，甲酸盐释放速率显著增加，标记甲酸盐比例的增加证明大部分释放的甲酸盐来源于[U- 13 c]丝氨酸，而不是来自在MTX存在下能够选择性产生甲酸的其他碳源。值得注意的是，持续的丝氨酸消耗和DHFR抑制后通过1C代谢的甲酸溢出也可以在Plasmax培养基中得到证实 50 ，这是一种更接近人体生理的培养基(图。 S4D ).因为细胞干物质组成由大约60%的蛋白质构成 51 生长抑制条件通常导致蛋白氨基酸的消耗速率降低。事实上，观察到必需氨基酸消耗减少的总趋势(图。 S4b ).因此，生长停滞后持续的丝氨酸消耗速率表明，原本用于合成代谢过程如核苷酸合成的多余丝氨酸被用于支持细胞运动和存活的替代代谢途径。
图4:胞质1C途径抑制时，线粒体保护1C代谢依赖性丝氨酸分解代谢。 a 细胞质和线粒体1C代谢和MTX的药物干预点。 b MDA-MB-468细胞在24小时50纳米MTX下丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的绝对消耗和释放(核心)率。圆点代表在三个孔中分别测量的单个实验的平均值；平均SEM(n = 6). c [U-时甲酸盐释放速率 13 c]24小时50纳米MTX后MDA-MB-468细胞中的丝氨酸；三个独立实验的平均SEM，每个实验在三个孔中测量；不成双的 t -使用Welch的M + 1等值线校正进行测试( n = 3). d [U-上的胞内丝氨酸中部 13 c]24小时50纳米MTX后MDA-MB-468细胞中的丝氨酸；四个独立实验的平均值SEM，每个实验在三个孔中测量。 e MDA-MB-468细胞中24小时50纳米MTX后绝对胞内丝氨酸和甘氨酸的比率。圆点代表三个孔中独立实验的平均值；平均SEM( n = 5). f [U-上的胞内丝氨酸中部 13 SHMT1、MFT、SHMT2和FPGS缺失的HAP1细胞中的丝氨酸；在三个孔中分别测量的独立实验的平均SEM( n = 8用于CTRL、SHMT1ko和SHMT2ko n = 5代表MTX； n = 2适用于FPGSko、MFTko和MFT/SHMT1ko)。 g SHMT1、MFT、SHMT2和FPGS耗尽的HAP1细胞中绝对胞内丝氨酸和甘氨酸水平的比率。圆点代表三个孔中独立实验的平均值；平均SEM( n = 8对于CTRL和SHMT2ko， n 对于shmt 1ko = 7， n = 6代表MTX， n = 2适用于FPGSko、MFTko和MFT/SHMT1ko)。 h 24小时50纳米MTX下WT和SHMT1-或shm T2-耗尽的HAP1细胞的甲酸盐绝对核心率。每个点表示在三个孔中测量的单个实验的平均值；Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验与Dunnetts多重比较检验。平均SEM(n = 4为CTRL，MTX，SHMT2ko，shm T2 ko MTX； n = 3适用于SHMT1ko和SHMT1ko MTX) i 在24小时50纳米MTX下，来自WT和mth fd1 l-耗尽的MDA-MB-468细胞的甲酸盐的绝对核心率。平均SEM( n = 6为CTRL和CTRL n = 3(对于MTHFD1Lko + /- MTX ));Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验与Dunnetts多重比较检验。j 24小时50纳米MTX下SCR和MTHFD2 KD MDA-MB-468细胞甲酸盐的绝对核心率。圆点代表在三个孔中测量的单个实验的平均值；平均SEM（n = 3) Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验和Dunnetts多重比较检验。 k 用2.5 mM二甲双胍和50 nM MTX处理24小时后MDA-MB-468细胞甲酸盐的绝对核心率。圆点代表在三个孔中测量的单个实验的平均值；平均SEM(n = 2).源数据作为源数据文件提供。
从机理上讲，1C代谢遵循一个循环，其中丝氨酸可以在细胞质和线粒体中通过丝氨酸羟甲基转移酶1和2 (SHMT1，SHMT2)从甘氨酸重新合成(图。 4a ).由于SHMT反应是高度可逆的，来自[U-的丝氨酸标记模式 13 c]丝氨酸由M + 1、M + 2和M + 3同源物的混合物组成，其代表与标记的和未标记的甘氨酸和甲酸的不同重组事件 16 ,21 ,52 。因此，当完全抑制1C代谢时，M + 1和M + 2丝氨酸同源物预计是不存在的。有趣的是，用MTX抑制胞质DHFR既没有完全消除丝氨酸M + 1和M + 2同源物 13 c]丝氨酸也没有显著影响MDA-MB-468或LN229细胞中丝氨酸与甘氨酸的水平比(图。 4d，e S4E，F )，进一步支持了我们关于DHFR抑制后持续的线粒体1C代谢的假设。为了从机制上从线粒体1C代谢中分离出胞质，我们分析了一组HAP1细胞中的CRISPR敲除，在这些细胞中，1C代谢的胞质(SHMT1)，线粒体(MFT，SHMT2)或两个区室(FPGS，MFT + SHMT1)被取消 53 。这里，细胞溶质 SHMT1 KO不能消除来自[U-1]的中间M + 1和M + 2丝氨酸同型异构体 13 c]丝氨酸与MTX处理相当，而线粒体或细胞溶质和线粒体联合抑制1C代谢 总燃料跳闸 KO， SHMT2 KO， 叶酸聚谷氨酸合成酶 KO和 总燃料跳闸 + SHMT1 KO导致M + 1和M + 2丝氨酸同源物的完全丧失(图。 4f ).在仅完全抑制1C代谢或线粒体1C代谢的突变体中，我们还观察到丝氨酸与甘氨酸水平的比率增加，而MTX处理和 SHMT1 KO没有显著增加丝氨酸与甘氨酸的比率(图。 第四代移动通信技术
值得注意的是，线粒体丝氨酸分解代谢酶的蛋白质丰度在MTX上没有增加。MTHFD2丰度甚至在MTX时下降，然而，这显然不影响丝氨酸分解代谢的速率(图。 S4G，H
为了测试线粒体丝氨酸分解代谢的敲除是否阻止甲酸溢出，我们在SHMT1或SHMT2缺陷的HAP1细胞中监测MTX上的甲酸释放通量。正如所料，SHMT2的损失完全消除了甲酸盐溢出，而SHMT1 KO增加了甲酸盐溢出(图。 4h ).该实验随后在MDA-MB-468细胞中得到验证 MTHFD1L 击倒取胜 20 或shRNA介导的 MTHFD2 拆卸和 MTHFD2 KO(图。 4i，j S4I-M ).在MTX治疗过程中，所有的基因干预都导致了甲酸溢出的强烈抑制，这进一步表明MTX上甲酸溢出的增加依赖于通过叶酸途径的线粒体丝氨酸分解代谢(图。 4i，j S4J，M
作为基因沉默的替代方法，我们使用二甲双胍靶向电子传递链(ETC)的复合物1。我们之前已经表明线粒体甲酸盐的产生依赖于活性ETC 21 ,22 。在这里，我们证明了在基线和MTX存在的情况下，复合物1与二甲双胍的靶向作用强烈抑制了线粒体甲酸生成，进一步支持了我们的发现，即在MTX存在的情况下，甲酸生成依赖于线粒体1C代谢(图。 4k ).为了证明二甲双胍确实抑制应用条件下的呼吸，我们进行了海马实验，以测量氧消耗率的预期下降(图。 S4N ).我们还监测到增殖的减少(图。 S4O )我们表演了[U- 13 c]谷氨酰胺示踪，以监测还原性羧化的预期强烈增加(图。 S4P问 )，这是ETC抑制的一个众所周知的现象 54 ,55
总之，这些结果表明，线粒体提供了一个受保护的细胞环境，允许自给自足的叶酸介导的丝氨酸分解代谢不依赖于细胞溶质的叶酸代谢。
限制丝氨酸的可用性会减少甲酸盐溢出和癌细胞迁移 由于我们观察到葡萄糖来源的丝氨酸合成增加，以及随后通过线粒体1C代谢的丝氨酸下游分解代谢，我们研究了干扰丝氨酸合成是否能有效减少在药理学抑制胞质1C代谢后的持续细胞迁移。首先，为了确定丝氨酸从头合成的有效抑制剂，我们测试了多种可用的变构抑制剂和一种PHGDH竞争性抑制剂。标记丝氨酸的强烈消除表明，我们观察到竞争性抑制剂BI-4916 (BI) 12 与变构抑制剂WQ-2101 (WQ)相比具有更好的功效 11 ，NCT-502 (NCT) 9 和CBR-5884 (CBR) 15 (图。 5a ).从[U-中释放出M + 1甲酸盐 13 c]在单独或与MTX联合使用BI治疗后，葡萄糖也被有效抑制(图。 5b ).此外，代谢副作用的常规筛查显示，用变构抑制剂WQ、NCT和CBR治疗确实导致线粒体OCR显著降低(图。 5c )，这在竞争性抑制剂BI中没有观察到(图。 5c ).WQ和NCT也对TCA循环活动产生负面影响，表现为TCA循环相关代谢物的M + 2同位素丰度减少(图。 5d ).与其他抑制剂相比，BI对TCA循环活性和增殖率没有不利影响，因此在所有后续实验中成为优选的PHGDH抑制剂(图。 5d S5A–D ).与特异性PHGDH抑制剂BI的联合治疗显著减少了MTX介导的细胞迁移(图。 5e ).这种抑制作用在组合的PHGDH抑制和丝氨酸和甘氨酸(S/G)饥饿时进一步增强(图。 5f ).虽然单独的S/G饥饿对MTX处理的细胞的迁移仅产生中等程度的抑制作用，但是与PHGDH抑制的组合处理完全钝化了细胞迁移(图。 5f ).在4T1细胞中观察到类似的结果(图。 S5F ).因为所有MTX条件都导致完全生长停滞(图。 S5E )，这一发现表明线粒体1C代谢在细胞运动中的作用不依赖于丝氨酸的合成代谢功能来支持生物合成过程。
图5:限制丝氨酸可用性降低甲酸溢出和癌细胞迁移。 a MDA-MB-468细胞在[U- 13 c]葡萄糖和24小时10微米WQ-2101，10微米NCT-502，30微米CBR-5884，15微米BI-4916和50纳米MTX；平均SEM( n = 10为CTRL n = 3为WQ，，WQ，BI，BI； n NCT = 2； n = 1用于CBR)的独立实验，每个实验在三个孔中测量。 b MDA-MB-468细胞中甲酸M + 1同位素交换率 13 c]葡萄糖和治疗如在( a ).圆点表示在三个孔中测量的独立实验；平均SEM( n = 10为CTRL n = 3为WQ，，WQ，BI，BI； n NCT = 2； n = 1表示CBR)。 c 与对照组相比，MDA-MB-468细胞中10个微米WQ-2101、10个微米NCT-502、30个微米CBR-5884和15个微米BI-4916在24小时后的基础细胞呼吸为线粒体OCR的倍数。圆点代表由六个技术重复组成的单个实验；平均SEM(n CTRL = 10， n 对于WQ = 7， n BI = 3， n NCT = 2， n = 1表示CBR)。 d MDA-MB-468细胞中选定的TCA代谢物在[U- 13 c]葡萄糖和治疗如在( b ).圆点表示在三个孔中测量的独立实验；平均SEM( n = 7为CTRL， n = 3表示WQ，BI， n NCT = 2， n = 1表示CBR)。 e MDA-MB-468细胞在50纳米MTX、15微米BI-4916和 f 丝氨酸和甘氨酸饥饿和各自AUC独立实验的平均SEM( n = 5 for( e ), n = 4 for( f ));Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 g 通过实时RT-qPCR测量MDA-MB-468细胞在72小时50纳米MTX、15微米BI-4916和丝氨酸-和甘氨酸饥饿时指示基因的mRNA表达。平均SEM( n BI = 4，BI + MTX， n = 3为MTX-SG，MTX-SG + BI， n = 2代表-SG， n = 1表示双SG)。 h 通过流式细胞术和AnnexinV-FITC/PI-染色评估在48小时50纳米MTX、15微米BI-4916和丝氨酸-和甘氨酸饥饿后MDA-MB-468细胞中的细胞死亡诱导；独立实验的平均标准偏差( n = 3).采用Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。 i MTX抗性MDA-MB-468细胞在50 nM MTX和15微米BI-4916上的迁移和各自的AUC独立实验的平均SEM( n = 4);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 j 1C代谢的胞质和线粒体区室以及MTX和PHGDH抑制剂的药理学干预点。源数据作为源数据文件提供。
虽然单独的BI处理或单独的S/G饥饿都不足以阻止所观察到的EMT表型的诱导，但是联合抑制和饥饿确实最小化了 ZEB1 , ZEB2 ，以及 精力 DHFR抑制的上调(图。 5g ).这表明丝氨酸代表了DHFR抑制后EMT发作的潜在要求。重要的是，S/G饥饿在MTX和BI联合处理后没有进一步增加细胞死亡(图。 5h ).值得注意的是，我们还发现BI治疗可有效降低MTX耐药、促迁移的MDA-MB-468细胞的迁移能力(图。 5i ).总之，使用MTX作为工具化合物来研究没有增殖时的细胞迁移，揭示了丝氨酸对于维持完整的癌细胞迁移能力是必需的(图。 5j
线粒体1C代谢支持细胞运动，并依赖于线粒体THF的可用性 由于丝氨酸的去除可以影响细胞生理学的不同方面，我们旨在更具体地研究线粒体1C代谢在促进细胞迁移中的作用。类似于图1所示的干预措施。 4i–k ，我们使用二甲双胍针对ETC，使用基因干预针对 MTHFD2 或者 MTHFD1L 在MDA-MB-468和4T1细胞中。
MTX暴露(生长停滞)细胞的二甲双胍治疗减少了MDA-MB-468细胞的迁移(图。 6A )，表明ETC的一个功能是支持细胞迁移。
图6:线粒体1C代谢支持细胞运动，并依赖于线粒体THF的可用性。 a MDA-MB-468细胞在2.5 mM二甲双胍和50 nM MTX上的迁移和各自的AUC独立实验的平均SEM( n = 3);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 b MTHFD2敲低和50纳米MTX及各自AUC时MDA-MB-468细胞的迁移；独立实验的平均SEM( n = 4);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 c Mthfd2敲低和75 nM MTX时4T1细胞的迁移和各自的AUC独立实验的平均SEM( n = 3);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 d Mthfd1l敲除和75 nM MTX后4T1细胞的迁移和各自的AUC独立实验的平均SEM( n = 3);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 e MTHFD1L敲除和50纳米MTX及各自AUC后MDA-MB-468细胞的迁移；独立实验的平均SEM( n = 3);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 f MDA-MB-468和4T1细胞中ALDH1L2和MTHFD1L蛋白的表达。 g 蛋白质印迹上ALDH1L2的信号强度相对于作为加载对照的β-肌动蛋白进行定量。平均SEM( n = 3);不成双的 t -用韦尔奇校正法测试。 h 线粒体1C代谢中的MTHFD1L-和ALD h1l 2-依赖性反应。 i MTHFD1L敲除、ALDH1L2敲除和50纳米MTX及各自AUC后MDA-MB-468细胞的迁移；独立实验的平均SEM( n = 3);Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。 j 总结线粒体和胞质1C代谢的自给自足活性及其各自与细胞迁移和细胞增殖的相关性的模型。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们通过监测MTX处理的迁移，直接研究了线粒体丝氨酸分解代谢在迁移中的作用 MTHFD2 或者 MTHFD1L 沉默的MDA-MB-468和4T1细胞。也不值得注意 MTHFD2 也不 MTHFD1L 沉默降低了细胞增殖或对MTX生长抑制作用的敏感性(图。 S6A–D ).此外，MTX的细胞死亡率不受 MTHFD2 或者 MTHFD1L 静音(图 S6E–H ).划痕试验分析表明 MTHFD2 沉默显著降低了MDA-MB-468和4T1细胞中MTX介导的细胞运动性(图。 6b，c ).就像shRNA曾经让人类和鼠类沉默一样 MTHFD2 是不同的，我们不期望shRNA特异性脱靶效应。然而，我们在MDA-MB-468细胞中证实了shMTHFD2 KD结果。 MTHFD2 敲除细胞(图。 S6I
Mthfd1l MTX处理的4T1细胞的沉默也导致迁移减少(图。 6d ).有点令人惊讶的是，失去 MTHFD1L 在MDA-MB-468细胞中，MTX处理的细胞的迁移没有负面影响(图。 6e ).通过遵循不同的假设和各种实验，我们认识到，在4T1和MDA-MB-468细胞中，ALDH1L2的表达存在显著差异，而MTHFD1L的表达在这两种细胞系之间是可比的(图。 6f，g
这一观察提醒我们，在MDA-MB-468细胞中，ALDH1L2可以作为将甲酰THF氧化成一氧化碳的替代出口 2 从而再生线粒体THF(与4T1相反)。也就是说，在MTHFD1L缺陷型细胞中，ALDH1L2状态可能是THF能否再生或THF是否会作为10-CHO-THF被困在线粒体中的决定性因素。游离THF的丢失将潜在地抑制自给自足的线粒体循环，否则在存在MTX的情况下可以发挥作用(图。 6小时 ).为了支持这一假设，我们还测量了与MDA-MB468相比，4T1细胞中甲酸释放通量的增加(图。 S6J )，表明在4T1细胞中，较少的10-CHO-THF通过Aldh1l2被氧化，而是通过Mthfd1l被分解代谢。
为了测试这个假设，我们瞄准了 ALDH1L2 在MTHFD1L KO细胞中并监测迁移。我们发现组合损耗 MTHFD1L 和 ALDH1L2 在MDA-MB-468细胞中，与单次耗尽相比，至少减少了MTX上的迁移 MTHFD1L 一个人。这在shRNA和siRNA介导的敲低shRNA中都观察到了 ALDH1L2 (图。 6i S6K
总之，这些结果揭示了线粒体1C代谢对癌细胞运动的非生长依赖性作用。有趣的是，游离THF池可能与自给自足的线粒体1C循环的功能有关，当MTHFD1L缺失时，ALDH1L2可以作为再生THF的替代出口(总结于图。 6J
线粒体1C代谢的遗传靶向减少体内转移形成 根据我们的模型，我们预测单独抑制线粒体1C代谢可能足以并有效减少癌细胞从原发性肿瘤逃逸和随后的转移形成。为了验证这一假设，我们使用了4T1细胞 Mthfd1l KD研究体内原位肿瘤的转移级联。
首先评估Mthfd1l KD细胞是否更易于氧化应激，这可能影响体内转移播散 56 ，我们测量了基线时和MTX治疗后MTHFD1L沉默的MDA-MB-468和4T1细胞中的ROS水平。在基线时，MTHDF1L沉默和对照细胞之间的ROS水平没有变化。MTX处理诱导ROS水平达到相当的范围 2 O2 处理确实诱导了与对照组细胞相当的细胞死亡率(图。 S7A–C ).总之，这些实验没有表明MTHFD1L的缺失导致细胞ROS水平增加或对氧化损伤的易感性增加。
然后我们注射沉默或不沉默的4T1细胞 Mthfd1l 进入免疫活性BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫以形成原位肿瘤(图。 7a ).在6周内监测原发性肿瘤的生长。与体外数据一致，原发性肿瘤生长未受影响，与对照组相比，终点肿瘤重量无差异(图。 7b，c ).通过蛋白质印迹证实了原发性肿瘤中Mthfd1l的敲除(图。 7d S7D–F ).与我们的假设一致，在携带Mthfd1l缺陷型肿瘤的小鼠中，肉眼可见的肺转移数量显著减少(图。 7e ).虽然所有注射了表达Mthfd1l的4T1细胞的小鼠都表现出肺转移，但超过50%的注射了mth FD 1 l的小鼠 Mthfd1l KD细胞未显示肉眼可见的转移病灶。值得注意的是，两组间原发性肿瘤中EMT相关基因的表达没有变化(图。 S7G ).肺的H&E染色和每肺转移面积的量化证实了Mthfd1l缺陷型肿瘤的转移减少(图。 7f，g
图7:线粒体1C代谢的遗传靶向减少体内转移形成。 a 用非靶向对照(SCR， n = 9)和KD为的4T1细胞 Mthfd1l (n = 9)注射到免疫活性雌性Balb/c小鼠的乳房脂肪垫中。监测原发性肿瘤生长，并在终点评估肺转移形成。 b 测量原发肿瘤大小并计算每组的平均肿瘤体积；平均SEM( n = 8 (Scr)和9 (Mthfd1l KD))。 c 在终点测量原发肿瘤重量。圆点表示个体动物；平均SEM(n = 9);不成对，双尾 t -用韦尔奇校正法测试。 d 通过蛋白质印迹分析原发性肿瘤组织的Mthfd1l蛋白表达，并相对于作为加载对照的β-肌动蛋白进行定量。圆点表示个体动物；平均SEM(n = 7 (Scr)和8(mth FD 1 l KD))；不成对，双尾 t -用韦尔奇校正法测试。来自Mthfd1l和β-肌动蛋白表达相对于总蛋白显著较低的肿瘤的蛋白裂解物被判定为非纯肿瘤裂解物，并从分析中丢弃(见图 S7D–F 详情)。 e 对肉眼可见的肺转移瘤进行计数，并描述为每个肺的转移瘤数量。圆点表示个体动物；平均SEM(n = 9);不成对的，有韦尔奇修正的双尾t检验。 f 将肺组织包埋在石蜡中并用H&E染色。每组提供2张代表性图像以显示微观肺转移；比例尺对应100 μm。 g 量化每个肺的转移面积，并表示为肺组织面积的百分比。圆点表示个体动物；平均SEM(n = 7 (Scr)和9(mth f1l KD))；不成对，双尾 t -用韦尔奇校正法测试。源数据作为源数据文件提供。
这些体内发现进一步加强了线粒体1C代谢作为支持癌细胞迁移的基石的关键相关性，而不依赖于原发性肿瘤生长和癌细胞增殖率。
