通过近红外共聚焦激光显微内镜在活检期间在细胞水平靶向检测癌症

通过放射线检查发现的可疑结节通常通过活组织检查进行研究，但是小结节的活组织检查的诊断率很低。在这里，我们报告了一种方法——NIR-nCLE——在活检过程中实时检测细胞水平的癌症。这项技术将癌症靶向近红外(NIR)示踪剂与经修改以检测NIR信号的基于针的共焦激光显微内镜(nCLE)系统集成在一起。我们在包括人类标本在内的肺结节活检的临床前模型中开发和测试了NIR-nCLE。我们发现，当以1∶1000的比例共培养时，该技术具有在正常成纤维细胞中识别单个癌细胞的分辨率，并且可以检测直径小于2 cm的人类肿瘤中的癌细胞。NIR-nCLE技术可以快速提供图像，让非专家也能准确区分肿瘤和正常组织。这项概念验证研究将肺结节作为一个测试案例进行分析，但其结果可能适用于其他恶性肿瘤。

计算机断层扫描在医疗实践中的广泛使用以及作为扩展的癌症筛查指南的一部分，已经使得检测在放射照相术中怀疑为恶性肿瘤的全身结节变得普遍^1,2,3,4。这些结节的治疗途径通常包括组织活检以排除恶性肿瘤⁵。目前的医疗技术不能在活检过程中提供实时诊断信息，而是需要组织病理学分析，这可能需要几天才能完成⁶。特别是对于小的、难以接近的或亚固体结节，活检的诊断率较低，导致患者焦虑，并由于额外的程序和放射检查而增加了医疗费用^7,8,9.

由于这种日益增长的临床挑战，已经提出了许多技术来在细胞水平上实现癌症的实时体内光学检测，从而提高基于活检的诊断和小结节分期的诊断准确性。临床前测试中的现有技术(包括拉曼光谱、反向对比光学显微内镜和荧光寿命成像显微镜)需要分析时间，不利于实时过程内决策，非专家不能可靠地解释，或者不能提供细胞水平的分辨率^10,11,12,13.

我们小组和其他小组在实体瘤切除过程中，通过使用术中分子成像(IMI)和肿瘤靶向光学示踪剂，实现了肿瘤和正常组织之间的宏观区分，这些示踪剂在手术前全身给药^14,15。示踪剂pafolacianine由与叶酸类似物共轭的NIR荧光染料(S0456)组成，其特异性靶向过度表达叶酸受体α的恶性细胞¹⁶。在切除实体瘤的过程中，IMI和pafolacianine在区分肿瘤组织和正常组织方面表现出有效性，但是其在细胞水平定位癌症的能力还没有被评估。

基于光纤的CLE是传统显微内窥镜技术的一种改进，其中低功率激光照射感兴趣的组织，并通过柔性光纤束传输从组织反射的光，以产生高分辨率的组织图像¹⁷。基于探针的CLE (pCLE)和基于针的CLE (nCLE)都允许在全身施用荧光素后对组织进行自体荧光成像以及反向对比成像^11,13,18,19。Annema及其同事最近进行的研究表明，基于荧光素的nCLE作为支气管镜诊断和肺癌分期的诊断辅助手段具有优势^13,19.

在这项工作中，我们描述了一种整合这两种技术的方法，以实现在活检过程中在单细胞水平上实时检测癌症。这种方法——我们称之为基于近红外针的共焦激光显微内镜(NIR-nCLE)——结合了[i]使用pafolacianine的近红外成像和[ii]超薄、灵活的nCLE系统，以利用靶向NIR示踪剂的癌症特异性以及CLE的细胞水平分辨率(图。1a).作为概念验证，我们评估了在孤立性肺结节(SPNs)活检过程中识别恶性细胞的技术，这是美国每年最常见的偶发结节²⁰。使用许多临床前模型，包括手术切除的人毛玻璃样混浊(GGO)肺结节，我们发现NIR-nCLE在活检过程中实现了快速、灵敏的癌细胞检测，与正式的组织病理学分析相比，具有较高的诊断准确性。

aNIR-nCLE背后的原理的示意性概述:在活检针的管腔内用靶向NIR示踪剂标记的单个恶性细胞的检测。b研究中测试的三种NIR-nCLE探头的技术概述。cCLE技术的示意图。激光束通过图像束导向组织样本。所产生的发射光在到达光电探测器之前通过针孔被取回和过滤。x和y代表CLE图像的两个轴。d用三种NIR-nCLE探针拍摄的培养中的pafolacianine标记的KB细胞的代表性图像，并与用常规共聚焦显微镜获得的图像进行比较(n=来自三个独立样本的至少50个成像帧)。比例尺代表20米eKB细胞的平均荧光强度(MFI)用增加浓度的pafolacianine染色，并用三种NIR-nCLE探针成像。方框的最小值、中间值和最大值代表整个成像序列获得的MFI的第25个百分点、平均值和第75个百分点。(在0纳米时，n=探针1、2和3分别为88、100和96帧；在50纳米处，n=探针1、2和3分别为88、188和123帧；在150纳米处，n=探针1、2和3分别为71、350和66帧)。胡须代表同一序列中MFI的第5和第95百分位。使用双侧进行统计比较t测试和p数值显示在图表上。

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NIR-nCLE探针的开发和测试

开发了三种灵活的超薄NIR-nCLE探头(图。1b).探头1包含30，000个光纤束，成像深度为0–50微米，横向分辨率为3.5微米，视场为600 μm。探头2包含10，000个光纤束，成像深度为55微米，横向分辨率为3.5微米，视场为325 μm。探头3包含30，000个光纤束，成像深度为60μm，横向分辨率为1微米，视场为240 μm

将探针与市场上可买到的CLE系统(CellVizio，Mauna Kea Technologies，Paris，France)结合使用，该系统使用785 nm激光产生激发光，该激发光被光束扩展器扩展并被分色镜反射(图。1c).随后，二维扫描系统在二维平面中扫描光束。扫描后，光束被中继到物镜的后孔中，物镜将激发光耦合到NIR-nCLE探头中光纤束的近端。最后，光束通过近红外微型物镜(在成像深度)聚焦在样品上，该物镜还收集样品发出的荧光。较长波长的荧光沿着相同的路径传输，并通过分色镜和带通滤波器(800-890nm)。通过带通滤波器后，荧光被透镜聚焦，穿过位于聚光器焦点处的针孔。针孔用于排除失焦光线。最后，使用光电二极管采集光信号，并将其转换为电信号。使用X-Y扫描仪，成像速度可以达到每秒8-12帧，这使得实时成像成为可能。探头1和3的每帧由512 × 512像素组成，探头2的每帧由320 × 322像素组成。

NIR-nCLE检测来自双叶酸标记细胞的NIR信号

为了确定CLE探针是否可以检测培养物中的pafolacanine标记的细胞，用不同浓度的pafolacanine对KB细胞(一种已知FRα过表达的人宫颈癌细胞系)进行染色。KB细胞以前曾被用作基于pafolacianine成像的体外和体内评估的阳性对照，因此被用作我们研究中检测的初始细胞系²¹。随后的实验是用原代肺癌细胞系进行的。染色的细胞用三种NIR-nCLE探针成像(图。1c，d)。当用50 nM双叶酸氨酸染色时，探针2和3能够检测恶性细胞，肿瘤细胞的平均荧光强度(MFI)为368.2任意单位(arb。单位，IQR:292.6-539.8卢比。单位)和426.1 arb。单位(IQR:308.2-717.6卢比。单位)，分别为。探针1不能检测培养物中的恶性细胞，直到浓度为150 nM的双叶酸。探针1的癌细胞MFI为75.4 arb。单位(IQR:55.3-144.9卢比。单位)，其显著低于探针2或探针3的MFI(MFI = 503.2 ARB。单位[IQR:404.0-743.7卢比。单位]对于探针2，MFI = 457.4 arb。单位[IQR:363.2-711.5卢比。单位]对于探头3，p < 0.0001 in both cases). Given the equivalent performance of probes 2 and 3 in detecting malignant cells in culture as well as its smaller size, probe 2 was chosen for further testing.

NIR-nCLE在培养的单细胞水平上区分癌症和正常细胞

为了确定NIR-nCLE区分恶性细胞和良性细胞的能力，将GFP转染的人肺腺癌(A549-GFP)细胞与正常肺成纤维细胞(HD28)细胞以不同比例(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10，000)共培养。细胞用50 nM的pafolacianine染色，2小时后用NIR-nCLE成像(补充图。1).然后将图像与GFP波长的常规共焦显微镜进行比较(图。2a).NIR-nCLE荧光和GFP荧光之间有很高的一致性(图。2b, R²= 0.9733)，通过NIR-nCLE(趋势线:y= 1.0634x + 0.0571)。每个高能场检测单个恶性细胞的下限是当A549-GFP细胞和HD28细胞以1∶1000的比例共培养时(图。2c).单个癌细胞显示出明显高于正常背景细胞的荧光强度，信号-背景比(SBR)范围为2.5至4.2(图。2d).

aGFP转染的肺腺癌(A549-GFP)细胞与正常肺成纤维细胞(HD28)细胞共培养的成对共聚焦显微镜和NIR-nCLE图像。白色箭头表示NIR-nCLE荧光与GFP波长的共聚焦显微镜一致，红色箭头表示不一致的荧光。比例尺代表20米b在单个静止图像中通过NIR-nCLE检测到的癌细胞数量的相关性，并与在GFP波长下作为金标准的成对共焦显微镜图像检测到的数量进行比较。c当A549-GFP和HD28细胞以1∶1，000的比例共培养时，通过NIR-nCLE检测单个恶性细胞。比例尺代表20米d单个恶性细胞的NIR-nCLE图像的荧光强度横截面图，说明NIR-nCLE成像的培养物中癌细胞的高SBR(范围2.5-4.2)。

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在原位鼠模型中NIR-nCLE区分恶性细胞和正常肺实质

为了确定NIR-nCLE是否可以在体内检测恶性细胞，携带荧光素酶转染的肺腺癌(TC1-luc)肿瘤的小鼠(n= 4)施用帕叶酸胺(2毫克/千克)并收获肺全体示踪剂注射后24小时(图。3).在19 G活检针的内腔中进行肿瘤和正常肺的NIR-nCLE和活检。NIR-nCLE对肿瘤组织的MFI为75.0 arb。单位(IQR:62.0-80.3 ARB。单位)和9.6 arb。单位(IQR:8.1-12.2 ARB。单位)对于正常肺(p < 0.0001). NIR-nCLE fluorescence was concordant with fluorescence detected on immunofluorescence microscopy in all biopsy specimens. Mean TBR for orthotopic TC1-luc tumors was 10.8 (TBR range: 4.7–17.5). As a negative control, mice bearing orthotopic TC1-luc tumors (n= 3)施用PBS载体，并收获肺全体注入示踪剂后24小时。如上进行NIR-nCLE和组织活检，正常肺和肿瘤组织的MFI之间没有显著差异(补充图。2肿瘤的平均MFI = 3.6 ARB。单位对2.4 arb。正常肺的单位，p= 0.22).

a使用NIR荧光素类似物的生物发光成像评估原位鼠肺腺癌(TC1-luc)肿瘤的生长。b10天时典型肿瘤的呼吸门控CT图像，用红色箭头标记肿瘤。c, d输注帕佛拉氨酸(2 mg/kg)后24小时原位和离体原位肿瘤的白光图像。在胸腔暴露、器官收获和图像采集之前杀死动物。e原位肿瘤的NIR图像显示清晰的宏观荧光信号。f, g正常组织和肿瘤组织的代表性NIR-nCLE图像。h, i从NIR-nCLE成像部位获取的苏木精和曙红染色的活检切片。比例尺代表5毫米。j, k分别来自正常肺和肿瘤组织的活检切片的荧光显微镜检查。比例尺代表5毫米。l在对每只小鼠的正常肺和肿瘤组织进行活检期间获得的NIR-nCLE序列的平均荧光强度(MFI)。方框的最小值、中间值和最大值代表整个成像序列获得的MFI的第25个百分点、平均值和第75个百分点。（n=对于小鼠1、2、3和4的正常肺活检，分别为117、117、117和118帧；n= 116, 111, 110.和117帧分别用于小鼠1、2、3和4的肿瘤活检)。胡须代表同一序列中MFI的第5和第95百分位。使用双侧进行统计比较t测试和p数值显示在图表上。m原位TC1-luc肿瘤的肿瘤-背景比(n= 4个生物学上独立的动物)。每个肿瘤由一个点表示，同时还显示了平均线和标准误差线。

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NIR-nCLE可以在小动物模型的肺部肿瘤的经胸和经支气管活检期间诊断恶性肿瘤

为了确定NIR-nCLE是否可以在活检过程中区分肿瘤细胞和正常肺组织，我们开发了经胸针吸活检的动物模型(补充图。3)和支气管镜针吸活检(补充图。4).在经胸活检模型中，小鼠(n= 8)对患有人非小细胞肺癌(A549或H1264)的原位异种移植物进行了CT引导的NIR-nCLE和肿瘤和正常肺的活组织检查(图。4a).在支气管镜活检模型中，我们植入了山羊肺(n= 3)与从切除前已经施用了pafolacianine的裸无胸腺小鼠收集的A549侧翼异种移植物。我们随后使用临床级支气管镜对肺部进行插管，并使用柔性19G活检针对肿瘤和正常肺进行NIR-nCLE和活检(图。4b).

a经胸活检模型概述。携带原位人非小细胞肺癌异种移植物的裸、无胸腺小鼠(n= 8)接受了CT引导的近红外nCLE和活检。未遂和成功活检的典型CT和NIR-nCLE图像用红色箭头标记肿瘤位置。b支气管镜活检模型概述。尸体山羊肺(n= 3)植入在双叶酸指导下切除的鼠侧人非小细胞肺癌异种移植物。使用标准治疗性支气管镜和NIR-nCLE对肿瘤进行定位，并使用19G柔性活检针通过支气管镜的工作端口进行活检。显示了肿瘤活检期间代表性的支气管镜和NIR-nCLE图像。c, d分别对正常肺和肿瘤进行代表性苏木精和伊红染色的活检载玻片和成对荧光显微镜检查。比例尺代表5毫米。e在经胸廓(n= 10只生物学独立的动物)和支气管镜检查(n= 3只生物学上独立的动物)活检模型。方框的最小值、中间值和最大值代表整个成像序列获得的MFI的第25个百分点、平均值和第75个百分点。(对于经胸活检n=正常肺和肿瘤活检分别为922和1408帧；用于支气管镜活检n=正常肺和肿瘤活检分别为423和471帧)。胡须代表同一序列中MFI的第5和第95百分位。使用双侧进行统计比较t测试和p数值显示在图表上。f当由5名非专家评分者分析时，NIR-nCLE序列的诊断性能，对与每个序列相关的最终组织病理学诊断一无所知。

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在这两个模型中，通过苏木精和伊红染色和免疫荧光显微镜检查评估，NIR-nCLE荧光与恶性肿瘤一致(图。4c，d)。在经胸活检模型中，NIR-nCLE的MFI为49.2 arb。单位(IQR:42.0-59.8卢比。单位)和8.2 arb。单位(IQR:6.0-11.2 ARB。单位)用于正常肺(图。4e, p < 0.0001). In the bronchoscopic biopsy model, MFI of NIR-nCLE was 48.0 arb. units (IQR: 41.7–58.3 arb. units) for tumor tissue and 6.7 arb. units (IQR: 5.0–9.7 arb. units) for normal lung (p < 0.0001). SBR for tumor biopsies ranged between 3.4 and 10.4.

为了评估NIR-nCLE的诊断性能，所有成像序列(n= 44)被随机化。有22个序列对应于恶性组织活检，22个序列对应于非恶性组织活检。在介绍NIR-nCLE的概念以及恶性和非恶性活检序列的代表性实例(< 5分钟)的简短培训会议之后，五名盲法审查者根据荧光细胞的存在独立地为每个NIR-nCLE序列指定诊断。盲评人在NIR-nCLE序列的获取或分析中没有作用。盲评人对NIR-nCLE视频的总体灵敏度和特异性分别为100%和92%(图。4f).重要的是，在220个个体评级中没有假阴性诊断。五个评价者的总体观察者间一致是极好的(κ= 0.92).

NIR-nCLE准确地区分人体切除标本中的肿瘤和正常组织

为了确定NIR-nCLE是否可以区分人类肿瘤中的肿瘤和正常肺，我们在正在进行的1期临床试验的一部分中，对5名接受pafolacianine引导的肺癌切除术的患者的切除标本中的肿瘤和正常肺组织进行了NIR-nCLE引导的活检(图。5和补充图。5).研究中包括的患者倾向于女性(n= 4，80%)、中年人(平均年龄:67.4岁)和曾经吸烟者(15.5平均包年)。本研究中成像的所有结节均为磨玻璃样混浊(GGOs)。ggo是SPN的一个子集，通常是早期腺癌谱病变。它们具有软组织结构，通过现有的支气管镜技术进行定位和诊断尤其具有挑战性²²。平均病灶大小为1.9厘米。通过最终的组织病理学分析，切除的病变大部分是侵袭性腺癌(n= 3，60%)，其中1例为微创腺癌，1例为原位腺癌。肿瘤活检的NIR-nCLE平均MFI为22.1arb .单位，正常肺的平均MFI为8.56 arb。单位(p < 0.0001). Mean TBR for pulmonary tumors was 2.7 (range: 2.0–4.2). Receiver operating characteristic (ROC) analysis showed that a high area under the curve (AUC) was obtained for MFI (AUC = 0.996, Fig. 5e).

a一个有小磨玻璃样阴影(GGO，用红色箭头标记)的代表性患者的术前和术中影像，该患者术前输注了帕福拉宁。病变不能通过白光成像来识别，但是在NIR成像上被清楚地标记。b取自离体标本的正常肺和肿瘤的NIR-nCLE图像。c在NIR-nCLE成像部位进行活检标本的H&E和荧光显微镜检查。比例尺代表5毫米。d近红外光谱序列的荧光分析。黑条和白条分别代表肿瘤和正常肺活检序列的MFI，是所有活检标本的平均值(n=来自生物学独立样本的10份肿瘤活检，以及n=来自生物学上独立的样本的10个正常肺活检)。数据以平均值SEM表示。彩色线代表个体研究参与者的肿瘤和正常肺的MFI。彩色条代表个体受试者的肿瘤与背景的比率，颜色对应于描绘MFI的线条的颜色。使用双侧进行统计比较t测试和p数值显示在图表上。e受试者工作特征(ROC)分析显示MFI获得了较高的曲线下面积(AUC )( AUC = 0.996，95% CI:0.986–1.000)。f当由5名非专家评分者分析时，NIR-nCLE序列的诊断性能，对与每个序列相关的最终组织病理学诊断一无所知。

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为了评估NIR-nCLE在人类肿瘤中的诊断性能，在人类研究中捕获的所有成像序列(n= 20)被随机分组，并由五名未参与NIR-nCLE序列采集的盲法审查者进行诊断(图。5f).有10个序列对应于恶性组织活检，10个序列对应于非恶性组织活检。盲评人评估NIR-nCLE视频的总体灵敏度和特异性分别为100%和92%。同样，在100个个体评价中没有假阴性诊断。总体诊断准确率为96%，观察者之间的一致性非常好(κ= 0.91).

总之，我们已经建立了一种方法的可行性，在对怀疑为恶性肿瘤的结节进行活检的过程中，在细胞水平上实时检测癌症。这种技术，我们称之为NIR-nCLE，将使用癌症靶向示踪剂的NIR成像与经修改以检测NIR光谱中的光学信号的基于针的CLE系统相结合。我们发现，当以1∶1000的比例共培养时，该技术具有在正常成纤维细胞中识别单个癌细胞的分辨率，并且可以在直径< 2 cm的人肺亚固体结节中识别小体积的疾病。此外，该技术实时提供易于解释的图像，允许非专业观察者高度准确地区分肿瘤和正常组织。我们的研究具体分析了肺结节作为一个测试案例，但结果很可能推广到其他恶性肿瘤，并为提高基于活检的诊断和小结节分期的诊断率提供了很大的希望。

NIR-nCLE代表了两种现有技术的协同集成，从而大大推进了肿瘤靶向NIR成像和光学显微内镜检查。肿瘤的靶向NIR成像已经被广泛研究，作为外科医生在癌症切除期间区分肿瘤和正常周围组织的能力的辅助手段^23,24。现有的NIR成像模式可以在宏观水平上识别肿瘤，但这项研究展示了体内癌细胞的微观NIR识别。之前已经研究了CLE用于各种器官系统中结节的内窥镜评估^19,25,26,27。nCLE成像的先前工作依赖于全身施用荧光素后在远红光光谱中的组织自体荧光或反向对比成像^11,18。通过直接靶向肿瘤细胞，NIR-nCLE可以可靠地检测非常少量的癌细胞，并且还提供具有二进制读数(荧光细胞的存在或不存在)的图像，非专家可以实时解读这些图像，观察者之间的一致性非常好。

我们发现，当与正常肺成纤维细胞以高达1∶1000的比例共培养时，NIR-nCLE可以检测单个恶性细胞。这是一个重要的发现，因为肿瘤由大量的非恶性细胞和组成肿瘤微环境的细胞外成分组成²⁸。特别是肺癌，含有大量的非癌元素，包括肿瘤相关的纤维化²⁹。在最近对64个切除的肺结节进行的体外研究中，肿瘤相关纤维化的百分比在结节之间变化很大，从肿瘤体积的0.2%到83.9%³⁰。在本研究中，从NIR-nCLE的体外灵敏度的保守推断表明，该技术将能够检测恶性细胞，即使是在具有非常高程度纤维化的肿瘤中。

我们在肺结节活检的多个临床前模型中评估了NIR-nCLE，并证明了该技术在指导经胸和经支气管镜活检SPN方面的实质性功效。在评估该技术对人类孤立性肺结节的疗效时，我们特别选择了具有小的亚固体、毛玻璃样阴影(GGOs)的患者。ggo是诊断性活检中最难评估的肺部病变，因为它们通常是早期腺癌谱病变，其软组织结构不容易与正常肺实质区分开来²²。与实性结节不同，使用透视和支气管内超声(EBUS)无法发现GGOs，也没有技术可用于实时可视化GGOs^6,31,32。在这项研究中评估的所有五个ggo中，在活检期间在病变中识别出荧光癌细胞。在临床前模型中，GGO肿瘤活检的总体MFI低于小鼠肿瘤活检的MFI。我们假设这是由于人类肿瘤的异质性组成，包括表达FRα的癌细胞和构成肿瘤微环境的非癌细胞。鼠侧异种移植物主要包含过度表达FRα的恶性细胞克隆群，从而解释了更高程度的双叶酸摄取和总体更高的MFI。盲的非专业观察者能够准确、一致地将ggo内的NIR-nCLE成像序列与正常肺实质中获得的序列区分开来，表明该技术作为ggo支气管镜或经胸活检的辅助手段的临床实用性。

虽然我们专门分析了肺结节作为一项原则验证研究，但我们预计NIR-nCLE可能是基于活检的诊断和其他器官可疑恶性肿瘤结节分期的有益辅助手段。这两种技术——近红外术中成像和基于探针的CLE或基于针的CLE——已经独立证明对一系列恶性肿瘤有效，包括头颈癌^33,34，乳腺癌^35,36，胃癌^26,37和结肠直肠癌^38,39。因此，通过NIR-nCLE将这两种技术结合起来也可能证明在这些癌症中是有用的。我们预计NIR-nCLE将提高一系列恶性肿瘤活检程序的诊断率，分子成像技术将为传统的细胞学评估和诊断提供重要的辅助手段。

这项研究有几个重要的局限性。首先，NIR-nCLE需要在活组织检查过程中进行体内评估，以评估呼吸变化、血液循环和运动伪影对该技术功效的影响。接下来，使用荧光强度信号来区分肿瘤和正常组织固有地受到许多因素的限制，包括焦平面位置、组织异质性、受体表达谱、信号穿透深度和特定视图内标记细胞的数量，以及其他因素。确定明确识别恶性肿瘤的荧光强度阈值是我们实验室正在进行的研究的主题，并可能最终消除人类观察者对主观图像解释的需要。此外，随着该技术在临床翻译的道路上经历进一步的迭代，机器学习方法可能有助于图像标准化和解释。在体外和体内模型中也有少量的假阳性诊断。我们将这些假阳性病例归因于CLE装置的动态荧光标度，该装置将视野调整到该单个视野中的最高荧光强度值。因此，如果在整体荧光强度低的场中成像，具有小的绝对荧光强度的区域可能看起来具有高的相对荧光强度。如上所述，随着技术的进一步发展，将需要固定荧光标度和阈值的优化。

在这项研究中，我们使用了一种叶酸受体靶向的NIR示踪剂，pafolacianine，来检测恶性细胞，并注意到这种示踪剂可能对叶酸受体α不过度表达的肿瘤无效。然而，我们预计NIR-nCLE将能够检测大范围的NIR示踪剂，并且示踪剂的选择可以根据所讨论的结节的位置针对个体患者进行定制。这项研究表明了NIR-nCLE的临床前景，但需要在NIR-nCLE的人体试验中进行进一步评估，以指导可疑恶性肿瘤结节的活检。