正常LS上皮的突变率没有升高
该研究招募了10名年龄在23-78岁的LS患者。从正常组织中，从8个个体中激光捕获显微切割肠隐窝(93个结肠直肠，14个小肠)，从1个个体中激光捕获显微切割子宫内膜腺，从1个个体中激光捕获胃腺。随机选择显微镜下完全正常的隐窝进行解剖(“观察隐窝”)(图。1a).然而，考虑到理论上可能只有一部分非肿瘤性隐窝可能存在MMR缺陷，根据特定的形态(包括出芽、分支和不寻常的形状)选择了另外一组。此外，我们用MLH1、MSH2或PMS2抗体对9例LS患者的正常组织进行了免疫组织化学染色，以发现阴性的个体隐窝，因此，这些隐窝可能已经丧失了DNA MMR功能。还从三个患者的三个结肠腺癌中取样隐窝，其中一个在肿瘤边缘包括腺瘤成分。总共132个非肿瘤隐窝/腺体，包括107个肠隐窝、8个子宫内膜腺体、17个胃腺和20个结肠直肠肿瘤隐窝，分别进行显微解剖和全基因组测序，覆盖范围约为33倍(补充图。1和补充数据1).
图1:LS患者非肿瘤隐窝中的突变负荷。a不同形态隐窝的典型H&E和IHC染色图像。除了MMR缺陷隐窝(用白色箭头表示)之外，H&E和IHC的图像不代表同一个隐窝。根据各个患者的种系MMR基因突变使用MMR蛋白抗体。MMR-d: MMR缺乏；IM:肠化生；腺癌:腺癌。比例尺:100微米(一、二、五、六、七、八、九、十、十六、十八)；50微米(三、四、xi、十二、十三、十四、十五、十七)。b–d显示1.5X四分位数间距(须状)、第一个和第三个四分位数(方框的界限)以及数据的中位数(中心)的箱线图。每个数据点代表一个地穴。双侧Wilcoxon检验:ns =不显著。b单碱基替换(SBS)和插入和缺失(ID)测量胃隐窝的负担(n= 5，红色)，小肠(n= 14，蓝色)，冒号(n= 37，绿色)和子宫内膜(n= 8，紫色)。c不同类型结肠隐窝中的SBS和ID负荷(调查(n= 37)、特定形态(n = 50)、MMR-d(n= 1)、肿瘤边缘(n= 5)).有和没有驱动突变的隐窝分别用粉红色和蓝色表示。d非肿瘤性隐窝中的SBS和ID负荷n= 28，粉色)和不带(n= 104，蓝色)癌症驱动基因突变。e显示PD46179中非肿瘤性隐窝之间克隆关系的系统发育树。分支长度对应于SBS突变的数量。SBS突变签名被映射到树枝上。每个隐窝都标有其标识符、隐窝类型和组织来源。
为了评估每个显微切割的隐窝是否包含源自单个成体干细胞的细胞，评估每个隐窝的变异等位基因频率(VAF)分布。所有的隐窝显示大约0.5的VAF峰和> 0.3的中值VAF，证实了它们的克隆性质(补充图。2).来自胃、小肠、结肠和子宫内膜的形态正常隐窝/腺体(即“调查”隐窝)中的中位碱基替换突变率分别为每年38.5、72.6、55.2和35.9次替换，而中位单碱基插入和缺失(ID)率分别为每年1.6、2.8、2.6和2.1次(图。1b).具有特定形态的结肠隐窝，包括出芽、分支和不寻常的形状，以及肿瘤边缘附近的正常隐窝，显示出与调查隐窝相当的SBS和ID率，并且驱动突变的存在与特定的隐窝类型无关(图。1c, d).为了测试ls患者正常结肠隐窝的突变率是否不同于野生型个体，我们将LS数据集与来自42个个体的424个隐窝的数据相结合，作为我们早期正常结肠突变景观研究的一部分(补充数据2)10,11。我们使用线性混合效应模型来检测LS和野生型隐窝之间突变率的差异。似然比检验表明，包含固定效应变量的LS状态并不能提高模型的拟合度(SBS:p= 0.11，ID:p= 0.14)，这表明如果野生型和LS隐窝的突变率之间存在差异，那么它们在这项研究中是无法检测到的。然而，有一些特定的隐窝组具有适度升高的突变负荷，包括那些来自PD43853小肠的隐窝组，这些隐窝组以前接受过化疗治疗，以及来自PD45540胃窦粘膜腺体组，这些隐窝组以前接受过化疗治疗幽门螺杆菌感染和化疗治疗(补充数据3和补充数据4).
为了证实正常LS组织的突变率通常不升高，从来自两个患者(PD45539和PD45540)的正常胃肠成体干细胞(ASCs)建立克隆器官样培养物，并进行全基因组测序(补充图。3a).这些患者一生中的突变率和突变特征与野生型个体的类器官相当(补充图。3b，c和补充数据5).此外，与来自野生型个体的类器官相比，ls类器官的超过4个月的延长培养没有显示增加的体外突变率，证实了来自LS患者的正常细胞中基因组的稳定性(补充图。三维（three dimension的缩写）和补充数据6).
形态正常的隐窝显示早期MMR缺乏
我们用免疫组织化学方法检测了9例LS患者的肠、子宫内膜和胃上皮细胞的MLH1、MSH2或PMS2蛋白。在一名具有种系的年轻患者(PD46179)中，发现一个结肠隐窝(lo0054)的MSH2染色呈阴性MSH2突变。该隐窝的后续显微解剖和全基因组测序显示，与调查隐窝相比，SBS和ID比率升高，突变率估计为每年197个SBS和37个ID(图。1c).突变率的增加主要是由于SBS1和SBS44以及ID1和ID2的比率增加(图。1e和补充图。4d).可以想象，SBS1(主要以CG二核苷酸的C > T突变为特征的突变信号)的比率升高是由于G:T错配(MMR系统的一个已知功能)的缺陷处理，而SBS44是已知与缺陷DNA MMR系统相关的信号。地穴隐藏着两个潜在的驱动突变，NF2R172fs和PIK3R1L30fs。综上所述，证据表明这种形态正常的隐窝已经有缺陷的DNA MMR功能，因此可能代表了LS发病机制的极早期阶段。
有趣的是，尽管仔细搜索，这个墓穴没有显示一个躯体MSH2突变或杂合性缺失事件不会导致野生型的失活MSH2等位基因。缺少一个MSH2第二次打击，尽管突变负荷增加和MSI的证据，表明在LS中MMR功能某种程度的丧失和MSI表型的出现有时可能先于野生型MMR基因等位基因的失活。导致正常隐窝MMR缺乏的躯体事件的性质尚不清楚。然而，这一观察结果可能提示了一个多步骤模型，即正常隐窝首先通过一种目前未知的机制获得一定程度的MMR缺乏，导致SBS和ID突变率升高。反过来，这导致遗传的野生型MMR等位基因的突变和失活，导致更大程度的MMR缺乏和更高的突变率，导致肿瘤性变化。
正常LS上皮中的驱动突变
在来自正常上皮的132个腺体/隐窝(包括肠、胃和子宫内膜腺体/隐窝)中，28个(21.2%)具有推定的癌症驱动突变。在这28个腺体中，23个(17.4%)有一个驱动突变，5个(3.8%)有两个(图。2a).总共有30个独特的驱动突变事件，涉及24个癌症驱动基因，并且都是杂合的(图。2b和补充数据7).在胃肠道中观察到的大多数癌症驱动因素涉及肿瘤抑制基因。美国动力会议CRCs中突变的最常见的癌症基因在两个隐窝中突变，一个(美国动力会议T1556fs)和另一个(美国动力会议Q8X)从盲肠(图。3a，b).没有证据表明携带驱动基因突变的隐窝存在发育异常改变或突变负荷差异。癌基因的突变，包括喀斯特地貌, PIK3CA，和ERBB2，在子宫内膜腺体中观察到，也没有如先前在野生型个体中报道的形态学或突变率的明显变化12(图。3c).鉴定了4个拷贝数变异体(CNVs)和20个结构变异体(SVs)，影响了15.2%的隐窝(图。2c)，频率与野生型个体相似。CNVs/SVs的数量有随年龄增长而增加的趋势(图。2d).没有观察到纯合性缺失，结构变异的断点没有与任何癌症驱动基因交叉。有趣的是，在具有种系的PD45539患者的阑尾隐窝(lo0002)中发现了染色体3p单亲二体(UPD)事件MLH1N38K突变(图。3b).然而，这次UPD事件恢复了血统MLH1突变回野生型，重新赋予隐窝两个功能副本MLH1.
图2:LS患者非肿瘤隐窝中的基因组稳定性。a具有驱动突变和拷贝数或结构变异的非肿瘤性隐窝的分布。b非肿瘤性隐窝中的驱动突变。星号表示微卫星区域的移码突变(重复长度≥ 5)。c非肿瘤性隐窝中的拷贝数变异和结构变异。拷贝数中性杂合性丢失。d每个LS患者中具有拷贝数或结构变异的非肿瘤性隐窝的百分比。
图3:LS患者正常上皮中的SBS突变特征。显示7例患者非肿瘤性隐窝之间克隆关系的系统发育树(a, b, e, f, g肠道；c子宫内膜；d胃)。分支长度对应于SBS突变的数量。SBS突变签名被映射到树枝上。每个隐窝都标有其标识符、隐窝类型和组织来源。癌症驱动突变和拷贝数变异被标记在相应的树枝上。微卫星区域的移码突变(重复长度≥ 5)以粗体显示。致癌基因的激活突变用红色表示。肿瘤抑制基因的失活突变用黑色表示。c 喀斯特地貌G12V是一个早期事件，因此被标注在包含该突变(红色虚线箭头)的4个隐窝的共同分支(红色箭头)上。
LS上皮的突变过程
为了研究LS患者隐窝中的基因组特征和突变过程，构建了隐窝的系统进化树，然后提取每个患者的突变特征。LS患者正常上皮细胞的突变过程与野生型个体相似10,12。LS患者的所有隐窝/腺体主要显示钟状信号SBS1和SBS5，一些患者的一些隐窝/腺体中也存在SBS2、SBS13、SBS17b、SBS18、SBS35和SBS88(图。3).SBS35，与铂类药物使用相关的标志13在手术前接受5-氟尿嘧啶(5-FU)、醛氢叶酸和奥沙利铂(FOLFOX)联合治疗的PD43853患者的每一个肠隐窝中都发现了。3a).SBS2和SBS13，两个与APOBEC酶活性相关的突变信号14,15，在PD43853的一些十二指肠和回肠隐窝中观察到，这可能反映了小肠中胞苷脱氨酶对局部DNA编辑的存在(图。3a).SBS17b，SBS17的一个亚标记，在某些情况下与5-FU暴露和氧化应激环境有关16在已经用5-FU治疗的PD45540中，在幽门窦的大多数隐窝中观察到，但在胃体中没有观察到(图。三维（three dimension的缩写）).在一个有血统的家庭里分子缺失，SBS88，一种与大肠杆菌素暴露相关的特征10,17在两个二十出头的兄弟姐妹(PD46176和PD46177)的每个墓穴中都发现了，但在他们的祖母(PD46178)中没有(图。3e–g).大肠杆菌素是一种由pks+分泌的基因毒素大肠杆菌，通常存在于肠道微生物群中18,19。SBS88在两个兄弟姐妹中的广泛存在表明他们之间有共同的微生物组。
我们比较了三名LS患者成对的正常和肿瘤(“腺瘤”和“腺癌”)隐窝中的突变负荷，这些患者的这些组织是可用的。在所有三名患者中，肿瘤隐窝的SBS和ID负荷分别比同时取样的正常隐窝高约100倍和2000倍(图。4a).突变信号分析显示，所有肿瘤隐窝显示SBS1、SBS5、先前描述的DNA MMR缺陷相关信号SBS20、SBS21、SBS26、SBS44和未知信号N414,20。系统发育树重建显示，肿瘤隐窝形成了一个与正常隐窝不同的簇，肿瘤树分支起源于至少50，000个SBS和多个驱动突变的单一主干(图。4b–d).这表明在多轮克隆扩增后，许多突变已经在每个肿瘤的最近共同祖先细胞中积累，随后的克隆扩增导致腺瘤或癌的形成。我们注意到，与树枝相比，SBS1在树干中的作用更大，MMR缺乏相关的信号导致了树枝中的大多数突变。然而，这种现象背后的确切机制尚不清楚。在PD46175中，腺癌从最近的祖先细胞进化而来，其也进化产生邻近的腺瘤(图。4c).在所有三种肿瘤中，相关MMR基因的体细胞野生型等位基因失活美国动力会议双等位基因突变存在于所有的肿瘤隐窝中，并被定位到肿瘤簇的主干上，这与LS中肿瘤形成途径之一的现有知识相一致，在LS中，腺瘤形成需要MMR缺陷和MMR缺失。美国动力会议钝化21,22.
图4:LS患者肿瘤隐窝中的SBS突变信号。a在具有成对结肠肿瘤组织的三个患者中，肿瘤隐窝(蓝色)与调查隐窝(黑色)相比的单碱基置换(SBS)和插入和缺失(ID)突变密度。双侧Wilcoxon试验:PD46174(调查:n= 3;肿瘤:n= 6;p= 0.024)、PD46175(调查:n= 3;肿瘤:n= 10;p= 0.007)、PD46179(调查:n= 4;肿瘤:n= 4;p= 0.029)用于SBS和ID。b–d显示具有配对肿瘤样本的三名患者隐窝之间克隆关系的系统发生树。分支长度对应于SBS突变的数量。SBS突变签名被映射到树枝上。每个隐窝都标有其标识符、隐窝类型和组织来源。癌症驱动突变和拷贝数变异被标记在相应的树枝上。微卫星区域的移码突变(重复长度≥ 5)以粗体显示。致癌基因的激活突变用红色表示。肿瘤抑制基因的失活突变用黑色表示。对于肿瘤隐窝，仅标注主要树枝上的关键癌症驱动因子突变。肿瘤隐窝中的大多数突变是微卫星区域的移码突变，这是MSI的结果。注释中省略了这些突变。系统发育树右侧的肿瘤切片的H&E染色显示了每个肿瘤隐窝的取样位置。c对于PD46175，腺瘤隐窝用蓝色括号标注。d对于PD46179，红色括号内区域的插入片段显示从另一个组织切片取样的隐窝。这些隐窝的图像叠加在肿瘤切片上以显示其相对位置。肿瘤切片比例尺:2.5 mm (PD46174和PD 46179)；5毫米(PD46175)。
由于在肿瘤隐窝中产生了许多ID，所以在三名患者中也提取了ID突变标记。所有的肿瘤隐窝都显示了突变信号ID1、ID2、ID7和一个未知信号N3(补充图。4a–c).ID1和ID2分别以多聚T区胸腺嘧啶的单个插入和缺失为特征，由于DNA复制过程中的聚合酶滑动，ID1和ID2是普遍存在的标记，在MMR缺乏的样品中观察到暴露增加14,20。另一方面，ID7的特征在于微卫星区域的单核苷酸和双核苷酸缺失，并且与MMR缺陷相关14,20。未知签名N3的特征是在不同重复长度的序列上≥5 bp缺失。对这些缺失的检查显示，N3代表微卫星区域的多核苷酸缺失，推测是由于MMR缺乏时微卫星的持续回缩(补充图。4e).PD46179的形态正常但MMR缺陷的隐窝(lo0054)显示突变特征ID1和ID2，而不是ID7或N3，这表明MMR缺陷处于早期状态，其中复杂的ID尚未在基因组中积累(补充图。4d).
