开发可视条形码，实现实时成像应用的多路复用
为了构建可视条形码，我们首先用慢病毒稳定感染A375黑色素瘤细胞系，该慢病毒含有融合到iRFP的核标记组蛋白2A(iRFP-H2A ),以精确区分细胞核和细胞质区室(图。1A).接下来，使用iRFP-H2A癌细胞产生五个亚克隆，每个亚克隆都用青色荧光蛋白(CFP)标记，该蛋白用独特的细胞定位序列标记，将CFP靶向到五个亚细胞位置之一:细胞核、内质网(er)、细胞质(nes)、过氧化物酶体(Peroxi)和全细胞(WC)(图。1B).因此，CFP定位被用作可以区分克隆身份的可视条形码。
图1:为多路实时成像应用开发可视条形码。A具有iRFP-H2A核标记的A375细胞系的代表性图像。BA375细胞系中五种CFP定位的代表性图像:全细胞(WC)、核输出信号(NES)、细胞核、过氧化物酶体(Peroxi)和内质网(ER)。CA375细胞系中五个CFP定位的条形码误检率(FDR)热图。DA375细胞系中使用的所有12种视觉条形码的代表性图像。E使用DMSO质控品处理的A375细胞系的所有12个可视条形码的平均条形码缺失率(n= 39).对角线上的数字代表每个条形码的灵敏度。F显示用DMSO对照处理的A375细胞系的所有12个视觉条形码的缺失率的Violin图(n= 39)或与药物(n= 75).G–I散点图显示了ImageStream系统根据荧光颜色和定位对9个具有可视条形码的A375克隆进行的分离。通过定位的分离仅在GFP阳性克隆中得到证实(I). J来自所有九个克隆的ImageStream的代表性图像。呈现来自每个克隆的两个细胞。比例尺在(A和B)是50米，英寸(D)100米及以下(J)7 m .本文提供了源数据。
为了测试视觉条形码的准确性，我们使用相位对比以及iRFP和CFP通道分别对五个亚克隆中的每一个进行成像。然后我们使用细胞轮廓仪9以:(1)分割细胞，(2)识别细胞核和细胞质区室，以及(3)提取每个细胞的CFP通道中基于纹理、形状和强度的特征(Sup代码)。CellProfiler分析师10用于根据可视条形码读数对单细胞进行分类。在我们的实现中，我们使用70%的单元作为训练集，剩余的30%作为验证集。平均误检率(假阳性条形码标签)为1.15%，而漏检率(假阴性率)为1.17%，分别代表非常高的精确度和召回率(图。1C和补充图。1A).最高的误检率和漏检率都是在核定位和ER定位之间检测到的，因此在额外的随访中不再优先考虑。
为了将视觉条形码的维度扩大到12条形码系统，我们将三种定位信号融合到四种荧光蛋白(CFP、BFP、GFP和YFP)中，产生了12种不同的视觉条形码(图。1D).条形码数量的增加仍然保持了非常高的准确性，平均误检率为1.45%，漏检率为1.34%(图。1E和补充图。1B).大多数检测错误发生在具有相同荧光颜色的亚克隆之间，在全细胞和过氧化物酶体BFP之间检测到的错误检测率最高(图。1E).为了探索系统在不同类型扰动下的稳健性，我们用75种药物分别处理每个亚克隆(补充数据1).我们发现，在药物治疗48小时后，几乎所有药物的精确度和召回率仍然非常高，只有8种药物(12%)的缺失率超过3%，其中5种强烈影响细胞增殖和生存能力。(图。1F和补充图。1B角).
请注意，进一步增加条形码数量的一种选择是将两种条形码蛋白结合到一个细胞中。通过使用四种荧光蛋白和五种定位，可以生成多达160种不同的视觉条形码。事实上，我们能够证明条形码调用具有非常高的精确度和召回率，甚至当具有相同定位但不同颜色的条形码被组合时(补充图。1D).
最后，我们展示了当细胞悬浮时，使用Imagestream高分辨率显微镜和流式细胞仪系统也可以分离克隆(图。1G–J).由于我们的系统缺少检测YFP的激光，我们只复用了9个亚克隆。为了证明可视条形码也可用于体内，我们混合了9个克隆，并将其植入裸鼠皮下。当肿瘤达到8 mm的直径时，将其切除，解离成单细胞，并通过Imagestream系统进行分析，证明可以检测到所有9个克隆(补充图。1F–J).
产生“信号组”报告细胞系
为了产生信号组，我们组装了12个先前发表的和充分表征的报告基因结构(补充图。2A)，每个都与不同的癌症相关信号通路的活性相关。为了实现它们的多路复用，我们用mStrawberry荧光蛋白替换了12个报告载体中每个载体的原始标记荧光蛋白。我们使用了两种不同类型的报告基因:通过特异性转录反应元件(TRE)驱动荧光蛋白表达的报告基因，或在上游信号激活时将荧光蛋白从细胞核转移到细胞质的激酶易位报告基因(KTRs )(补充图。2A).
然后我们用12个报道基因中的一个感染12个具有可视条形码的A375亚克隆(图。2A).接下来，我们验证了单细胞衍生的报道基因亚克隆的增殖速率与亲代细胞系的增殖速率没有差异(补充图。2B).我们还验证了所有12个亚克隆与亲代A375细胞系一样对BRAF抑制剂vemurafenib敏感(补充图。2C).最后，我们将产生A375信号体细胞系的所有12个亚克隆汇集在一起，并证明12个不同克隆的比例在培养48小时后保持恒定(图。2B).
图2:生成A375“信号组”报告细胞系。A用于产生A375信号体细胞系的12个克隆的图示。A375细胞首先用iRFP-H2A感染以标记细胞核。然后，用12个可视条形码产生12个克隆。最后，给每个克隆体添加一个不同的活报道分子。转录激活报道基因用金色表示，而易位报道基因用红色表示。细胞核中的结合配偶体用紫色表示。B随着时间的推移，DMSO对照孔中来自每个克隆的细胞的相对数量。C散点图显示了所有12个克隆在单独生长或作为信号体细胞系的一部分生长时，对75种药物的反应，报道分子活性得分之间的相关性。D–FA375信号体细胞系对DMSO、vemurafenib (1 M)或曲马替尼(0.125 M)的反应随时间变化的报告子活性图。蓝色和红色背景分别代表高于0.2或低于0.2的激活或抑制分数。每个报告者的平均细胞计数(D–F)分别是:656、545和530个细胞。本文提供了原始数据。
单细胞测量的一个优点是，不仅可以表征扰动对群体平均的影响，还可以表征其对全部分布的影响(即，具有低、中或高信号活性的细胞的频率)。为了量化报道活性分布的条件依赖性差异，我们使用了Kolmogorov–Smirnov(KS)检验，因为它是一种非参数检验，也可以检测分布均值未反映的分布变化(补充图。2D)11,12。为了增加KS分数，根据这些分布平均值的方向变化，给活动分数分配一个正号或负号。我们使用0.2的阈值来标记活性的显著变化，因为它代表了我们的DMSO对照孔中0.5个百分点的报道活性(补充图。2H).为了验证报告分子的活性，我们首先对每个报告分子使用已知的阳性或阴性调节剂，证明报告分子的分数和预期的药物效果之间存在完美的相关性(补充图。2F).我们还将A375信号体细胞系活性分数与单独测试时所有12个报道分子的活性进行了比较，发现两者之间有很强的相关性(r= 0.75,P < 10−16)(图。2C).正如预期的那样，我们还发现Vemurafenib和MEK抑制剂Trametinib，两者都是MAPK途径的抑制剂，对A375-Signalome细胞系具有高度相似的作用(图。2D–F).最后，为了验证我们的报告分子使用不同方法的活性，我们使用蛋白质印迹分析证明两种技术之间完全一致(补充图。2G).
信号传导的多重、时间依赖性测量的一个优点是能够区分直接和间接的药物影响。例如，虽然MAPK抑制剂(vemurafenib和曲马替尼)促进了在药物治疗1.5小时后观察到的ERK信号的可检测变化，但也观察到了这些相同药物对其他途径的影响，尽管时间要晚得多(图。2D–F).这与这些药物对MAPK途径的直接作用以及随后其他途径对抑制MAPK途径的适应性反应是一致的。事实上，以前的报告已经描述了PKA的激活13，NFkB14，HIF15、和YAP/TAZ16并提示这些适应可能有助于抵抗MAPK抑制。此外，我们观察到BRAF或MEK抑制后48小时视黄酸受体活性显著上调(P值< 6 × 10−5).有趣的是，对黑色素瘤患者的三个独立组群的检查表明，如病理学家从表达数据计算的，具有高活性的RAR/RXR途径的患者17,18总体存活率较高(补充图。2I–K).因此，继续并更好地探索RAR在黑色素瘤中的作用及其对治疗的反应可能是有意义的。这些测量还证明了Signalome系统的效率和通量:使用一个384孔板，我们筛选了75种药物(一式三份)和39种DMSO对照在多个时间点和单细胞分辨率下对12个信号分支的影响。因此，单个信号板提供了来自每个不同时间点的50万个细胞的测量值。
为了证明可视条形码和信号组系统可以很容易地应用于其他细胞系，我们使用PC9 EGFR突变的非小细胞肺癌细胞系和SK-MEL-5 BRAF突变的黑色素瘤细胞系产生了另外两种信号组细胞系。我们能够证明我们的条形码精确度和召回率在这些细胞系中也非常高(补充图。3A–D)并且可以检测到两种抑制剂对ERK的早期抑制，随后是细胞系特异性适应机制。例如，A375黑素瘤细胞系中BRAF或MEK的抑制导致YAP/TAZ途径的激活，而SK-MEL-5细胞系中BRAF/MEK抑制的效果导致YAP/TAZ途径的抑制(补充图。3E–H).在这里，我们再次发现PC9细胞中的EGFR抑制也驱动了RAR活性的上调。
信号传导中的大规模相关性表明了一种不依赖于化合物的广义反应
为了研究癌症信号传导中的相互依赖性，我们用422种充分表征的化学干扰物的文库处理合并的A375信号组细胞系(补充数据2，补充数据3和补充图。4A).在所有测试的化合物中，122种(28.9%)促进了至少一种报道的途径的显著变化(KS绝对分数> 0.2)(图。3A，补充图。4I，补充数据4和补充数据5).正如预期的那样，具有相似靶点的不同药物显示了相似的报告基因对这些药物的反应模式(补充图。4B–G).
图3:信号传导中的大规模相关性表明了一种不依赖于化合物的普遍反应。A根据活性得分对122种活性药物治疗的A375信号组细胞进行无监督的分级聚类。由于技术错误，没有对所有药物测量Geminin报告基因，因此将其丢弃。来自所有12个报告者的结果可以在补充图中看到。4I对于有Geminin数据的药物子集。B散点图显示了用122种活性药物治疗48小时后p38和p53报道基因的活性之间的相关性。C显示用122种活性药物治疗48小时后，不同A375信号组克隆之间成对皮尔逊相关性的热图。D提出具有不同机制的药物如何汇聚成两种主要信号状态的模型。虽然每种药物都有不同的靶标，但许多靶标影响相同的传感机制，该机制后来控制p53-vs p38-信号状态。本文提供了原始数据。
令人惊讶的是，除了靶特异性信号，报告分子活性分数的无监督聚类也表明了一个更高的结构，该结构将信号转导信号分成三个聚类，其中两个似乎是反相关的(图。3A和补充图。4I).簇A类化合物似乎全部激活PKA、AKT、ERK、p38和JNK途径，同时抑制WNT、p53、NFkB、RAR、HIF和YAP \ TAZ而簇B包含协调相反反应的药物。类别C包含不符合这种二分法的药物。大量具有不同作用机制的药物导致信号簇A和B，表明对药物治疗的协调反应涉及我们所有测量的信号分支，并且令人惊讶地独立于药物靶点。作为一个恰当的例子，图。3B显示了p53和p38活性之间的负相关，这种负相关在各种各样的化学扰动中持续存在。降低p38活性的药物与p53活性的相应增加相关，反之亦然(Pearson的r= −0.517,P < 2.2 × 10−16)(图。3B).更一般地，当比较来自簇A的途径和来自簇B的途径时，药物促进簇A或B内的途径之间的正相关性(簇内相关性)和负相关性(簇间相关性)。为简单起见，我们将这两个集群称为p38信号状态(聚类A)和p53信号状态(聚类B)(图。3A).
化学扰动可以通过同时影响一个以上的目标而产生相关的影响。然而，这种相关的影响应该是化合物特异性的，涉及不同化合物之间不同的靶亲和力。相比之下，我们发现，在大量药物中，相同的通路对是正相关或负相关的(n= 122)具有多个非常不同的目标。(图。3B角).为了证明这种划分不是细胞系特异性的，我们用247种药物处理PC9信号组细胞系，发现非常相似的分叉为两个反相关的通路簇(补充图。4H和补充数据6).因此，问题如下:如此多种多样的扰动，每一种都与不同的目标有关，怎么可能只集中到两个主要结果上呢？我们推断，将信号通路分成两个簇表明了一个调控过程，该过程是我们测量的所有信号分支的共同上游(图。三维（three dimension的缩写）).
信号的大规模相关性存在于治疗前，并随着时间的推移由多种药物增加
为了深入了解这种上游调节过程的本质，我们首先进行了时间过程测量，以询问药物治疗后多久两两相关变得明显？我们发现，在药物治疗后的48小时内，通路活性的成对相关性变得越来越显著(图。4A湾).药物治疗后两种信号状态的分离也可以从时间过程测量的视觉检查中明显看出(图。4C–H).报告分子对化学性质不同且与不同靶标相关的六种代表性药物的反应轨迹表明，尽管三种药物促进了p38信号状态(图。4C–E)，其他三个激活p53信号状态(图。4F–H).总之，这些结果通过显示各种不同的药物(每种药物与不同的靶标相关)汇聚促进两种主要的信号状态结果，证明了信号通路的二元划分。
图4:药物治疗增加了途径活性之间的相关性。A在用122种活性药物治疗之前和之后的多个时间点，A375信号体细胞系中p38和p53报告基因的活性分数散点图。每个点代表一种不同的药物。皮尔逊的r描绘了每个时间点。B在用122种活性药物治疗之前和之后的不同时间点，计算A375信号组细胞系中每对通路的皮尔逊相关系数。每个数据点代表所有122种活性药物的一对给定途径的相关值。p38和p53途径的活性分数之间的相关性用红圈标记。C–H显示了六种代表性药物治疗的两种信号状态中每一种的所有报告基因的局部加权平滑(Lowess)回归，每种治疗与不同的药物靶点相关。而三种药物驱动p53信号状态(C–E)，其他三种药物驱动p38信号状态(F–H).粗线(红色和蓝色)和灰色套管分别代表平均值和+/-SEM。本文提供了原始数据。
这些结果表明，p38和p53信号状态是由一个过程介导的，该过程响应药物治疗，随时间逐渐增加其影响或活性。由于药物治疗很可能只是促进了一个已经存在的过程的活性，我们很好奇为什么图。3C似乎不存在于未受干扰的细胞中(图。4B)?一种可能性是，在药物治疗之前，信号通路同时受到几种相互竞争的调节需求的影响，每种需求都朝着不同的方向发展。根据这一解释，药物治疗通过增加一个特定调节过程(最有可能是应激反应)的相对权重来促进相关信号传递，从而其效果不再被竞争性影响平均化。这个模型提出了一个可检验的假设:如果测量值对独立存在的相关性进行标准化，那么在未处理的细胞中，12个途径的二元划分应该变得明显。
为此，我们使用了主成分分析(PCA)，这是一种将数据集转换为独立存在的多元相关性的线性组合的技术。正如预期的那样，PCA通过确定一个单一的主成分(PC1)证实了高度的相关性，该主成分解释了处理48小时后几乎50%的方差(图。5A).此外，第一主成分清楚地确定了两个信号状态；促进新陈代谢的药物p38信号传导或者p53信号传导状态分别由PC1的负值或正值来表征(图。5B).接下来，我们重复PCA，但这次是在药物治疗之前收集的测量值(时间零点)。请注意，在后一种PCA实施方式中，测得活性的变化并不反映药物反应的差异，因为还没有应用药物，而是孔与孔之间的微小变化，如蒸发速率或氧浓度的差异。在早期里程碑式的研究中19,20这种细胞分裂速率和细胞大小的孔与孔(或样品与样品)之间的差异是动物细胞中细胞大小检查点功能的关键证据21。由于signalome在每个孔中提供了12种途径的测量，它可以测试这些微小的变化是否会导致PCA可以检测到的信号状态的孔特异性变化。事实上，PCA还在未受干扰的细胞中显著识别了p38和p53信号状态(图。5C).
图5:五氯苯甲醚表明p38和p53信号状态存在于预处理中，并随时间推移而增加。A用122种药物治疗48小时后11个信号通路的活性得分的PCA。每种药物的颜色表示其在图中的簇。3A. B, C柱状图代表药物治疗48小时后各途径的PC1负荷(B)或预处理(C). D当投射到由未暴露于药物治疗的细胞的测量值计算的主成分上时，途径活性的方差。本文提供了原始数据。
为了进一步探索p38和p53信号状态是否先于药物治疗，我们测试了对未暴露于药物治疗的细胞的测量是否可以预测药物治疗后观察到的特定相关性(补充图。5).这一分析确定了动态，这是稳态的典型特征(图。5D).在药物处理后的第一个小时，化学干扰有效地消除了未受干扰细胞中连接不同信号分支的相关活动。然而，药物治疗几个小时后，相关的活动恢复了，事实上，变得更加突出。这些结果表明一般的应激程序:(A)在未接受药物治疗的细胞中发挥作用，(B)在药物治疗的第一个小时内被有效消除，以及(C)在药物治疗后的几个小时内恢复活性。这个观察结果也可以在图2中看到。4C–H，其中两种信号状态在时间零点(药物治疗前)是明显的，在一小时后消失，并在后面的时间点获得显著性。
p38和p53信号状态与细胞大小的扰动有关
面对不同的化学扰动，这两种信号状态的恒定性表明，这些信号状态描述的大规模相关性起着支持一些在我们的细胞系中至关重要的过程的作用。由于我们的测量是在癌细胞上进行的，我们进一步推断，这个过程可能与连续细胞分裂的需求有关。为了维持体内平衡，增殖的细胞必须在连续的细胞分裂之间加倍它们的质量。在癌症中，这一要求可能更为关键22,23,24。如果癌细胞无法满足癌基因的增殖需求，生物合成也会相应增加，细胞大小会随着时间的推移而减小21。因此，我们想知道观察到的协同信号模式是否来自应激感应系统，该系统对细胞生长和细胞分裂不平衡导致的细胞大小变化做出反应(图。6A).
图6:细胞生长和增殖受到严格调控，并与p38和p53信号状态相关。A一种模型，展示了细胞大小的感知如何影响细胞生长和增殖，以保持细胞大小的稳态。B散点图显示了雷帕霉素或SNS-032对Rpe1细胞的平均细胞生长率和分裂率的初始和长期影响。数据点表示测量的平均生长和分裂速率:(1)在药物治疗的第一个24小时期间和(2)在药物治疗的第24-60小时期间。C用生长抑制剂(红色)或cdk1/2抑制剂(蓝色)处理的五种细胞系(Rpe1、HeLa、U2OS、SAOS2、16HBE)的平均生长率对分裂率。每个细胞系中的测量值由同一细胞系的未处理对照样品(灰色)的测量值标准化。所用的生长抑制剂为:不同剂量的环己酰亚胺、Torin-2和雷帕霉素(详见“方法”)。所用的cdk1/2抑制剂为:SNS-032、PHA848125、Cdk2抑制剂III和地那昔布，剂量不同(详见“方法”)。D, E给定药物的平均细胞大小与其PC1值相关，PC1值是根据Kaufman等人的数据的报告者活性计算的(D)和刘看着艾儿。（E). F在Signalome筛选中A375细胞的平均生长率对分裂率。每个圆圈代表一个筛选条件(药物治疗)。圆圈的颜色表示该条件下PC1的值。等高线显示PC1的平均值作为生长率和分裂率的函数。Gp38(上图)和p53(下图)活性的平均水平是生长率和细胞周期长度的函数。H提出影响细胞分裂的药物如何激活p53信号状态，而影响细胞生长的药物如何激活p38信号状态的模型。每个状态反过来激活补偿机制，导致新的平衡。本文提供了原始数据。
作为第一步，我们询问选择性干扰生物合成速率的药物是否会触发代偿机制，从而帮助细胞在生长和增殖速率之间达到新的稳态。我们首先使用视网膜上皮细胞系RPE1，一种hTERT永生化非癌细胞系，因为它非常适合于细胞大小的研究21。为了抑制细胞分裂速率，我们使用了各种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的化学抑制剂，如SNS-03221而为了降低生物合成活性(细胞生长)，我们或者用环己酰亚胺抑制蛋白质合成，或者用雷帕霉素和托林抑制mTOR活性。在所有情况下，药物剂量都经过精心优化，以确保细胞仍在增殖，并且没有经历完全的细胞周期停滞。对于细胞生长(每单位时间的蛋白质合成)的定量测量，我们遵循先前描述的使用标记所有蛋白质的荧光标记琥珀酰亚胺酯(SE)的总大分子蛋白质质量的单细胞测量方案(补充方法)21,25,26.
我们的结果表明，在雷帕霉素治疗的最初几个小时，虽然细胞生长被迅速抑制，但细胞分裂率相对不受影响(图。6B).相反，CDK2抑制剂SNS-032降低细胞分裂速率，但不影响细胞生长(图。6B).然而，在稍后的时间点，生长和增殖的协调被重新建立，但是在稍微不同的设定点。通过促进更长时间的生物合成活性(更长的细胞周期)来适应生物合成速率受抑制的细胞。然而，这种细胞周期的延长没有达到完美的适应，导致成对的生长和分裂值略低于比例线。类似地，为了适应CDK2抑制剂带来的更长的生长期，细胞降低了单位时间内合成的蛋白质数量。然而，在这里，补偿也是不完全的，导致成对的值位于线以上。将这些结果扩展到跨五种细胞系的多细胞周期或细胞生长抑制剂，证明生长和增殖速率的不完全补偿是一种普遍现象(图。6C).总之，我们的结果表明:(A)扰乱生物合成速率的药物触发分裂速率的补偿性变化，反之亦然；(B)生长率和分裂率对药物治疗的适应通常是不完全的，导致生长率和分裂率的成对值位于比例线之上和之下。
为了研究我们观察到的p38和p53信号状态与细胞大小的稳态相关的可能性，我们询问诱导这两种状态的药物对细胞大小的影响是否不同。为此，我们根据每种化合物促进p38信号传导状态相对于p53信号传导状态的程度对其进行评分(补充方法)。然后，我们使用signalome单细胞分辨率测量来计算每种药物对细胞分裂速率和细胞大小的影响。与我们的假设一致，我们发现促进p38状态的药物治疗与较小的细胞大小相关，而促进p53状态的药物与增大的细胞大小相关(Pearson’sr= −0.625,P= 1.68 × 10−23)(图。6D).
为了进一步加强我们的模型，我们询问了促进p53和p38信号状态的药物靶点以前是否被认为是细胞大小稳态的调节剂。在哺乳动物细胞中，Liu等人描述了对细胞大小稳态机制的全面筛选。25。在那项研究中，对NIBR MoA药物库查询的细胞进行了高度定量的细胞大小测量27—一个高度特征化的化学库，旨在探究作用机制。为了提取靶特异性细胞大小的影响，我们实施了线性回归模型(补充方法)。这就产生了一系列基因，每一个都预测了对细胞分裂速率和细胞大小的影响。数字6E揭示了药物靶标对细胞大小的影响之间的显著相关性(如Liu等人，补充数据7).具体来说，刘等人描述为细胞生长抑制剂的靶点在我们的研究中被独立地鉴定为促进p38信号状态激活的靶点。反之，刘等人所刻画的目标。25在我们的研究中，减慢细胞分裂的速率被独立地确定为促进与p53信号状态相关的信号分子激活的靶点。注意，虽然信号组数据是在A375黑素瘤细胞上产生的，但刘等人的数据。25是用HeLa宫颈癌细胞产生的。A375细胞的信号转导测量值和HeLa细胞的细胞大小测量值之间的相关性表明，这两种状态与细胞大小的联系在不同的细胞系中是常见的。
接下来，我们使用信号组来测试这两种信号状态是否与细胞生长和分裂速率的不平衡相关。我们发现不成比例地降低生长率的药物(即对角线以下的数据点)与p38信号状态相关，而不成比例地降低增殖的药物(即对角线以上的点)诱导p53信号状态(图。6F，G).
p38-和p53-信号状态与细胞生长和细胞分裂的不同关联的额外支持来自使用字符串数据库(http://string-db.org/)28,29,30,31。根据选择性促进p38或p53信号状态的药物列表，我们询问促进p38或p53信号状态的药物靶点是否在功能上不同。事实上，我们发现，虽然促进p53信号状态激活的药物富含细胞分裂周期的抑制剂，但促进p38状态激活的药物明显富含合成代谢活性的调节剂，包括胰岛素/mTORC1途径，以及葡萄糖、糖原和碳水化合物代谢的调节剂(补充图。6A湾).
在癌症中，生长和分裂的不均衡变化可由细胞内遗传变化或外部压力(包括营养或生长因子缺乏)自发产生。为了测试p38和p53信号状态是否存在于人类癌症中，我们研究了TCGA(https://www.cancer.gov/tcga)从跨越32种不同类型癌症的8167种人类肿瘤中检索蛋白质组测量结果32,33。为了将信号组报告基因与TCGA进行比较，我们收集了8种已知与信号组中所含途径活性相关的蛋白质或磷蛋白。使用这些蛋白质作为通路活性的替代物，我们分别分析了32种癌症中每一种的相关信号。具体来说，对于每种癌症，我们计算了所有与信号通路相关的成对相关系数。我们的结果表明，除了胆管癌，类似的信号分叉出现在所有其他类型的癌症中，如补充图所示。6F。这进一步表明了我们测量的所有信号分支上游的共同调节过程(图。三维（three dimension的缩写）).
作为最后一个问题，我们询问C组中的药物有何不同(图。3A)使它们逃脱与p53或p38信号状态的互斥关联？一种可能的假设是，这类药物通过解偶联平衡细胞增殖和细胞生长的细胞反馈机制，靶向对维持细胞大小稳态至关重要的机制。在这种情况下，指出CDK4抑制剂是该组中得分最高的药物之一是很有趣的。事实上，最近，我们和其他人已经证明细胞大小的稳态关键取决于CDK434(但不是CDK2 ),这可以解释为什么CDK4抑制剂不坚持p38- pr p53信号状态(补充图。6C–E和7).需要进一步的研究来更好地理解驱使其他药物聚集c群的机制。
