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在滑膜肉瘤中,相变和重塑复合物组装对SS18-SSX致癌活性很重要

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发表时间:2022-05-25 14:26作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

癌蛋白SS18-SSX是滑膜肉瘤的标志。然而,作为SS18-SSX融合蛋白的一部分,SS18的功能仍不清楚。这里,我们描述了人类SS18/BRG1和酵母SNF11/SNF2亚复合物的结构。这两个亚复合物组装成具有相似构象的异二聚体,表明SNF11可能是SS18在染色质重塑复合物中的同源物。重要的是,我们的研究表明,固有无序区QPGY结构域的自缔合导致SS18或SS18-SSX的液-液相分离(LLPS ),以及随后BRG1募集到相分离的冷凝物中。此外,我们的结果表明QPGY结构域中的酪氨酸残基在SS18或SS18-SSX的LLPS中起决定性作用。SS18-SSX LLPS或SS18-SSX与BRG1结合的干扰削弱了SS18-SSX对NIH3T3细胞的转化。我们的数据表明,滑膜肉瘤中LLPS和装配成染色质重塑体都有助于SS18-SSX的致癌活性。

介绍

滑膜肉瘤(SyS)是一种恶性肿瘤,占所有软组织肿瘤的10-20 %,在年轻人中预后不良1。SyS的标志性遗传特征是反复出现的特异性染色体易位t(X;18)(p 11.2;q11.2),其中SS1818号染色体上的基因与X染色体上三个密切相关的基因之一融合,SSX1, SSX2,而且很少SSX42,3,4,导致框内融合基因SS18-SSX。这种显著的易位实际上存在于100%的滑膜肉瘤中,并且通常是唯一的细胞遗传学异常1。与其他软组织肉瘤中的常规易位不同,癌融合蛋白SS18-SSX缺乏DNA结合结构域,被认为通过与其他染色质修饰物结合来发挥其活性5.

ATP依赖的染色质重塑复合物BAF,也称为哺乳动物SWI/SNF复合物,是一种多亚基重塑物,对调节基因表达和发育程序至关重要。BAF复合物的失调导致神经紊乱和人类恶性肿瘤6。此外,SS18作为SS18-SSX嵌合体的一部分,通过与催化亚基BRG1或BRM相互作用与CBAF复合体结合,成为典型BAF复合体(CBAF)的一个完整亚基7,8,9,10。最近获得的人类CBAF复合体的结构提供了一些关于复合体组装和染色质重塑的结构信息,然而,关于组装的CBAF复合体中SS18的结构信息是有限的11,12。值得注意的是,SS18和SS18-SSX在CBAF复合物内组装的竞争导致生化异常复合物,从而破坏基因表达,这是SyS所特有的13,14.

据报道,癌蛋白SS18-SSX1的N-末端181个氨基酸的缺失导致其转化活性的丧失15。这一观察,连同显示SS18或SSX单独过表达不产生肿瘤的结果,暗示SS18-SSX的两个配偶体在滑膜肉瘤形成中起重要作用13,15。此外,SS18或SS18-SSX具有低复杂性序列结构域(LCD ),富含谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸(QPGY结构域),对转录活性很重要15,16。值得注意的是,据报道,oncofusion FUS/EWS/TAF15 (FET)蛋白家族的内在无序液晶显示器涉及通过一种称为液-液相分离(LLPS)的物理过程形成动态蛋白缩合物,该过程控制基因转录17,18,19。总之,通过SS18与CBAF复合体或QPGY结构域的结合来检测SS18在肿瘤融合SS18-SSX1中的作用在系统性红斑狼疮的发生和发展中具有重要意义。在这项研究中,我们报道了来源于哺乳动物CBAF复合体的人SS18/BRG1异二聚体和来源于南酿酒酵母瑞士/SNF综合体,分辨率分别为2.39和2.15。此外,我们的结果表明,SS18或SS18-SSX (QPGY结构域)的液晶可以通过酪氨酸残基介导的自缔合导致LLPS。我们的研究表明,SS18-SSX的相分离和SS18-SSX与染色质重塑复合物的结合对于癌蛋白SS18-SSX的转化活性是重要的。

结果

BRG1和SS18或SS18-SSX1复合物的晶体结构

SS18-SSX1致癌融合蛋白是通过用SSX1的羧基末端78-残基片段(aa 111-188)取代SS18的八个末端羧基末端残基(aa 379-387)产生的(图。1a).据报道,SS18或SS18-SSX1可以结合到染色质重塑复合物的ATP酶亚基BRG1或BRM的N-末端区域9,10。然而,SS18与重塑复合体结合的结构信息在已报道的结构中仍然有限11,12。因此,我们最初证实了BRG1的N-末端282-残基片段(aa1–282,Brg1(1-282))和SS18,在此命名为BRG1(1-282)/SS18,(“/”表示具有独立链和类似结构的蛋白质复合物,下文通过显示从大小排阻柱中共洗脱的两种蛋白质(补充图。1a).接下来,我们使用基于截断的方法结合大小排阻色谱法绘制了BRG1和SS18的每个结合区域(补充图。1b–d).值得注意的是,BRG1(172-213)和SS18(14-101)在分析尺寸排阻柱中组装成复合物(补充图中的黑线)。1c和补充图中SDS-PAGE。1d).分析超速离心进一步证实了BRG1(172-213)/SS18(14-101)复合物形成异二聚体,化学计量比为1:1,分子量为14.7 kDa(补充图中的黑线)。1f).鉴于这些结果,我们得出结论,BRG1/SS18或BRG1/SS18-SSX1亚复合物通过片段BRG1之间的相互作用形成异二聚体(172-213)和SS18(14-101).

图BRG1和SS18或SS18-SSX1复合物的晶体结构。
figure 1

a全长SS18、SSX1、SS18-SSX1和BRG1的示意图。癌蛋白SS18-SSX1包含457个氨基酸,并保留SS18的氨基末端379个氨基酸以及SSX1的羧基末端78个氨基酸。SS18的蛋白质片段(14–101)/BRG1(172–213)用于结构测定复合物用双向箭头表示,分别用青色和品红色表示。插入物中的示意图显示了突变体SS18(3M)-SSX1,其在SNH结构域中包含突变为谷氨酸的三个氨基酸I32、L54和A65,以及突变体SS18(Y19S)-SSX1,其在QPGY结构域中包含突变为丝氨酸的19个酪氨酸残基。bSS18的卡通形象(14-101)(青色)/BRG1(172-213)(洋红色)从侧面和底部看的复合体。这两种蛋白质的N-和C-末端被标记。PDB入口代码:7VRB。ce黑色框中的Ligplot图表明SS18和BRG1之间的疏水相互作用。三组疏水核心显示为辐条弧,分别在(ce). fCo-IP实验测试SS18野生型(WT)或突变型SS18(3M)与BRG1之间的相互作用。突变体SS18(3M)包含三个氨基酸突变I32E、L54E和A65E。如图所示,从用质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。底部面板显示了Myc-Brg1的3%作为每个IP的输入。

为了理解BRG1和SS18或SS18-SSX1如何相互结合,我们试图确定异源二聚体BRG1的晶体结构(172-213)/SS18(14-101)。我们成功地获得了融合BRG1产生的单一多肽的晶体(172–213)到SS18的N-末端(14–101)具有烟草蚀刻病毒(TEV)可裂解片段。纯化的BRG1单链融合蛋白(172-213)和SS18(14-101)在此命名为BRG1(172–213)-SS18(14–101)(“-”表示单链融合体中的蛋白质,下文类似结构)作为单一峰从分析尺寸排阻柱中洗脱出来(补充图中的红线)。1c和补充图中SDS-PAGE。1e)并根据沉降速度(SV)实验组装成分子量为15.8 kDa的异二聚体(补充图中的红线。1f).BRG1的晶体结构(172-213)-SS18(14-101)以2.39的分辨率测定,在一个不对称单元中有四个拷贝的复合分子(补充表1).在最终模型中,BRG1(172-213)从aa 172解析为207,包括QLQ域(图。1b和补充图。2).SS18(14-101)从aa 14到aa79都有很好的分辨率,包括SNH域(图。1b和补充图。3).BRG1的整体结构(172-213)-SS18(14-101)类似于四螺旋束,跨越BRG1中残基174–190(αA),198–205(αB)(172-213)以及SS18中的残基19–39(α1),44–74(α2)(14-101)(图。1b和补充图。23).BRG1之间的相互作用(172-213)和SS18(14-101)是通过氢键和疏水相互作用维持的。SS18上的疏水氨基酸(I32、L54和A65)和BRG1相应位置的氨基酸形成三组疏水核心(图。1c–e).

为了验证在BRG1结构中观察到的相互作用(172-213)–SS18(14-101)复杂,我们进行了一系列的诱变研究。在SS18或SS18-SSX1中,残基A65、L54和I32突变为谷氨酸,本文分别称为SS18(3M)和SS18(3M)-SSX1(图。1c–e).正如所预期的,免疫共沉淀(co-IP)分析显示SS18或SS18-SSX1中的3M突变可以极大地破坏SS18的结合(图中泳道3与泳道2相比)。1f)或SS18-SSX1(在补充图中,通道4与通道2相比较。4a)到BRG1。我们使用圆二色性来证实野生型(WT)和突变型SS18之间的相似行为(14-101),这确保了BRG1结合活性的任何损失不是由于SS18的降低(14-101)蛋白质稳定性(补充图。第一代).此外,根据BRG1之间的氢键相互作用(172-213)和SS18(14-101)BRG1的残基Q176和Q183被丙氨酸取代(补充图。1h).值得注意的是,双突变(Q176A,Q183A)或单突变(Q183A)几乎完全消除了BRG1与SS18的结合(补充图。1i).总之,这些结果证实了BRG1结构揭示的相互作用模式(172-213)-SS18(14-101).

SNF11和SNF2具有与SS18和BRG1相似的结合模型

先前的研究已经报道了酵母SWI/SNF复合物的结构20,21。然而,关于SNF11的结构信息有限,因为它是综合体不可或缺的一部分22。根据序列比对,我们发现酵母SNF11与人SS18的SNH结构域高度保守,该结构域参与结合BRG1的QLQ结构域(图。1和补充图。3).这一观察结果,加上序列比对显示BRG1的QLQ结构域和BRG1的酵母同源物SNF2高度保守,表明SNF11可能通过结合SNF2的QLQ结构域装配到SWI/SNF复合物中(补充图。2).因此,我们共表达了SNF11和一个60个残基的片段,包括SNF2的QLQ结构域(aa 248–308,SNF2(248-308)),并确认SNF11和SNF2(248-308)组装成异聚体复合物,如它们从分析尺寸排阻柱中共流出所示(补充图。5a).接下来,我们将SNF11上的SNF2结合区映射到一个132残基片段(aa 38-169,SNF11(38-169);图。2a和补充图。5b).分析超速离心进一步证实了SNF11(38-169)/SNF2(248-308)复合物形成化学计量比为1:1、分子量为20.0 kDa的异二聚体(补充图。5c).根据这些结果,我们得出结论,SNF11亚单位通过片段SNF11之间的相互作用形成异二聚体,从而组装成SWI/SNF复合体(38-169)和SNF2(248-308).

图2:配合物SNF11和SNF2的晶体结构。
figure 2

a全长SNF11和SNF2的原理图。SNF11的蛋白质片段(38-169)/SNF2(248-308)用于结构测定复合物用双向箭头表示,分别用橙色和绿色表示。bSNF11的卡通形象(38-169)(橙色)/SNF2(248-308)(绿色)从侧面和底部看的复合体。这两种蛋白质的N-和C-末端被标记。PDB入境代码:7VRC。c黑框中的Ligplot图表示SNF11和SNF2之间的氢键相互作用。氢键显示为黑色虚线。线上方的数字代表距离,单位是。黑色实心点代表碳原子,蓝色实心点代表氮原子,红色实心点代表氧原子。dCo-IP实验测试野生型SNF2(WT)或突变型SNF 2和SNF11之间的相互作用。如图所示,从用质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。底部面板显示了3%的Myc-SNF2作为每个IP的输入。

为了揭示SNF11和SNF2的结合模式,我们确定了SNF11的晶体结构(38-169)/SNF2(248–308)分辨率为2.15的复合物,在一个不对称单元中有两个复合物分子拷贝(补充表1).在最终的模型中,所有的残基都是可见的,除了SNF11的残基38-54(38-169)和SNF2的残基298-308(248-308)。酵母SNF11的结构叠加(38-169)/SNF2(248-308)和人类BRG1(172-213)-SS18(14-101)异二聚体表明人类SS18/BRG1和酵母SNF11/SNF2亚复合物共享相似的异二聚体装配模型(补充图。5d).SNF11的整体结构(38-169)/SNF2(248–308)类似于六螺旋束,其中SNF2(248-308)由三个α螺旋[残基251–267(αA ')、274–285(αB ')和289–296(αC ')]和SNF11组成(38-169)也由三个α螺旋组成[残基61–94(α1 ')、99–130(α2 ')和155–168(α3 ')](图。2b和补充图。23).SNF11与SNF2的结合主要是通过包括Q63在内的几对氨基酸之间的氢键介导的SNF11与Q252结合SNF2和L70SNF11,N73SNF11,或S74SNF11与Q259结合SNF2,单独(图。2c).此外,SNF2残基Q252和Q259从酵母到人是保守的(补充图。2).为了验证异二聚体结构中SNF2和SNF11之间的相互作用,残基Q252和Q259被丙氨酸取代。正如预期的那样,co-IP分析表明,单个突变Q259A显著削弱了SNF2与SNF11的结合(图3中泳道3与泳道2相比)。2d),并且双突变Q252A和Q259A完全消除了SNF2和SNF11之间的相互作用(图中泳道4与泳道2相比)。2d).总之,这些结果证实了由SNF11的结构揭示的SNF2和SNF11之间的相互作用模式(38-169)/SNF2(248-308)异二聚体。

SS18在体外和体内经历液-液相分离

如前所述,我们的结构和生化研究表明,人SS18或oncofusion SS18-SSX1与BRG1的结合以及酵母SNF11与SNF2的结合具有相似的装配模式。与SNF11相比,SS18含有一个额外的羧基区,包括QPGY结构域(图。1一个和2a和补充图。3).有趣的是,IUPred分析表明SS18的羧基区域本质上也是无序的23(图。3a).根据这些数据,以及显示QPGY结构域富含酪氨酸残基(参与多价相互作用以驱动蛋白质LLPS)的观察结果,我们推断SS18可能在体外和体内形成缩合物18,24。正如预期的,纯化的荧光标记的SS18蛋白(Alexa488-SS18)在液滴形成缓冲液中自发形成微米大小的液滴。液滴以蛋白质浓度依赖的方式,在数量和大小上增长,这是LLPS的特征现象(图。3b).此外,当向溶液中加入5% 1,6-己二醇时,冷凝液滴的形成被大大抑制,这表明疏水相互作用参与了该过程。1,6-己二醇是一种脂肪族分子,据报道其在体外和体内都会干扰疏水相互作用诱导的相分离组装25,26,27。随后的光学显微镜分析显示,SS18球形液滴也经历动态融合事件,这表明了动态的、类似液体的性质(图。3c).在蛋白质纯化过程中,我们发现不同的蛋白质储存条件,如温度,会导致SS18蛋白质溶液变得乳白色。因此,我们通过离心从大量水溶液中分离出浓缩的液相,并发现SS18的LLPS可以在很宽的温度范围内发生(测定温度为4–37°C)28。较低的温度可以促进SS18的相变(图。3d,e).

图3: SS18在体外和体内经历了液-液相分离(LLPS)。
figure 3

aSS18 387氨基酸蛋白质序列分析。已知域名SNH和QPGY。红线预测内在无序趋势的内在非结构化区域(IUPred)得分;> 0.5被认为是无序的。b不同蛋白质浓度下SS18液滴的荧光和明场图像。将1,6-己二醇(Hex,5%)加入SS18蛋白(60 M)中以破坏液滴形成。液滴富含Alexa Fluor 488标记的SS18(标记的与未标记的SS18的摩尔比为1∶100)。除非另有说明,该蛋白质标记比率在整个研究中使用。比例尺指示10 μm。c在室温下,小液滴在包含50 mM Tris-HCl pH 7.5和150 mM NaCl的缓冲液中经历时间依赖性动态融合。代表性的SDS-PAGE分析(d)和量化数据e显示了在不同温度下SS18蛋白质(30 μm)在水溶液/上清液(S)和浓缩液滴/沉淀(P)部分之间的蛋白质分布。用Image J v1.8.0软件定量蛋白质的条带强度。定量数据代表来自三个独立批次的沉降实验的结果,并以平均值SEM绘制。fHEK293T细胞中GFP-SS18和GFP-SNF11的活细胞成像(GFP)和同步相衬成像。比例尺指示5 μm。g代表性的延时FRAP图像显示,在HeLa细胞中,泪点内的GFP-SS18信号在几秒钟内恢复。红色方框显示放大的区域。h来自独立的六个HeLa细胞的六个GFP-SS18点的FRAP恢复曲线,误差棒表示平均值SEM。时间0是指光漂白脉冲的时间点。

为了测试SS18是否可以在活细胞系中经历LLPS,外源GFP标记的SS18 (GFP-SS18)在HEK293T细胞中瞬时表达。值得注意的是,GFP-SS18在细胞核中显示出特征性的点状模式,焦点的大小范围为0.2至1 m,这与先前研究中的观察结果一致29,30。相反,GFP标记的SNF11 (GFP-SNF11)缺乏固有的无序区域,弥散分布在整个细胞中(图。3f和补充图。6a).此外,在HeLa细胞中进行的漂白后荧光信号恢复(FRAP)实验显示,焦点中大约72.8%的GFP-SS18分子与其在周围主体溶剂中的对应物交换,平均恢复半衰期为6.9秒(图。3g,h).该结果表明SS18在细胞中以点状形成的类液相液滴中浓缩。总之,SS18在体外形成相分离的液滴,在体内形成动态的液体状冷凝物。

酪氨酸残基对于SS18相分离非常重要

SS18的QPGY结构域主要由谷氨酰胺、脯氨酸和甘氨酸组成,酪氨酸残基以可变的间隔出现并形成同源寡聚体9。考虑到蛋白质LLPS中酪氨酸残基之间多价相互作用的出现,我们在SS18的固有无序区(本文称为SS18(Y21S))将21个酪氨酸残基突变为丝氨酸,以破坏SS18的多聚化(补充图。3)18,24。正如所预料的,co-IP分析显示突变SS18(Y21S)失去了其自我结合的能力(图中泳道4与泳道2相比)。4a).当与野生型SS18 (SS18-WT)蛋白比较时,沉降实验显示所有突变蛋白SS18(Y21S)在离心后保留在水性上清液中(泳道5和6与图中泳道1和2相比)。4b, c).与这一观察结果一致,纯化的SS18(Y21S)蛋白在HEK293T细胞中呈弥散分布,不能形成任何液滴(图。4d,e).为了进一步检测酪氨酸残基在相分离中的作用,将SS18的QPGY结构域融合到SNF11的羧基末端,并将该嵌合体命名为SNF11-QPGY。补充图5e, f提供了几条证据证明SNF11-QPGY嵌合体也可能通过QPGY结构域介导的自结合经历相分离。总之,这些结果表明酪氨酸残基介导的多聚化对于SS18相分离是重要的。

图4:通过酪氨酸残基介导的多聚化,BRG1特异性募集到SS18相分离的缩合物中。
figure 4

aCo-IP实验测试SS18或其突变体的自结合能力。如图所示,从用质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。底部面板显示了Myc-SS18的3%作为每个IP的输入。代表性的SDS-PAGE分析(b)和定量数据(c)用于SS18 WT、突变体或各种SS18/BRG1的沉降分析(1-282)混合物,如所示。每种蛋白质的浓度为60 M。用Image J v1.8.0软件对蛋白质的条带强度进行定量。统计数据代表来自三个独立批次的沉降实验的结果,并以平均值SEM绘制。d蛋白质浓度为60 M时SS18 WT或突变体液滴的荧光和明场图像。液滴富含Alexa Fluor 488标记的SS18 WT或突变体。比例尺指示10 μm。eHEK293T细胞中GFP-SS18(WT)、GFP-SS18(Y21S)和GFP-SS18(3M)的代表性荧光图像。比例尺指示5 μm。fGFP-SS18-WT或突变体和Cherry-BRG1在HEK293T细胞中的共定位。比例尺指示5 μm。gAlexa Fluor 488标记的SS18或突变体(60 M)和Cy3标记的BRG1的混合物的代表性荧光和明场图像(1-282)(60 M)在室温下,在包含50 mM Tris-HCl pH 7.5和150 mM NaCl的缓冲液中。比例尺指示10 μm。

SS18将BRG1补充到分相冷凝物中

作为几种染色质重塑复合物的催化亚单位,BRG1特异性结合SS18的SNH结构域,如前图所示。1。因此,我们推断核SS18凝聚体可能将BRG1区室化。为了验证这一假设,我们在HEK293T细胞中表达了GFP-SS18和mCherry标记的BRG1 (Cherry-BRG1)。正如预期的那样,我们发现当与SS18共表达时,BRG1容易在SS18核凝聚体中募集,但当SS18不存在时,br G1在核中呈扩散分布(图。4f).有趣的是,当与突变体SS18(3M)共表达时,BRG1与浓缩物完全分离(图。4f).这些结果与显示突变体SS18(3M)不能与BRG1结合的观察结果一致,如前面图1所示。1d但是能够LLPS(图4b–e).此外,我们发现BRG1与突变型SS18(Y21S)广泛共存,该突变型SS18含有LLPS的缺陷,但能够与BRG1结合(图。4f).我们一直发现BRG1(1-282)在SS18-WT浓缩物中富集或用SS18-WT沉淀,而突变体SS18(3M)既不能募集BRG1(1-282)成液滴也不沉淀下来BRG1(1-282)(图。4b,c,g).突变体SS18(Y21S)用作对照,因为它本身和BRG1不能形成任何液滴或沉淀(1-282)。总之,这些数据表明SS18的相分离通过SS18和BRG1之间的特定相互作用导致BRG1富集到核冷凝物中。

SS18-SSX1经历LLPS并将BRG1募集到冷凝物中

如前所述,肿瘤融合蛋白SS18-SSX1几乎包含SS18的整个QPGY结构域,并保留了通过与BRG1结合的SNH结构域稳定整合到CBAF复合物中的能力(图。1和补充图。4a)13。此外,SSX1的阻遏结构域(RD结构域)可以特异性地将转录调节因子募集到特定的基因组位点14,31。IUPred分析表明,SS18-SSX1的羧基区,包括QPGY和RD结构域,也是内在无序的(补充图。6b).由于这些观察,我们想要测试SS18-SSX1是否仍然保留相分离的能力,并将其与在正常组织和细胞中广泛表达的SS18相区分。首先,我们发现纯化的SS18-SSX1融合蛋白在与SS18相同的溶液组成和蛋白浓度下不形成浓缩的液滴。有趣的是,我们注意到SS18-SSX1溶液变浑浊,并且当缓冲液含有10%的Ficoll模拟细胞核的拥挤环境时,液滴形成以浓度依赖的方式发生(图。5a).此外,在最初的15秒内,小液滴逐渐聚结成较大的液滴(图。5b).我们还观察到,在10% Ficoll存在下,从凝聚相(沉淀部分)中回收了大约40%的SS18-SSX1蛋白(图中的泳道7和8)。5c, d).与10% Ficoll结合,1,6-己二醇(5% Hex)导致凝聚相的分散(泳道13和14与图1中的泳道7和8相比)。5c, d).然而,我们发现纯化的SSX1(111-188)自身不能在与SS18-SSX1蛋白相同的条件下经历LLPS(补充图。6c).总之,这些结果表明在拥挤试剂存在下,肿瘤融合蛋白SS18-SSX1在体外经历LLPS。

图5: SS18-SSX1经历LLPS,将BRG1募集到凝聚体中。
figure 5

a融合蛋白SS18-SSX1在不同蛋白浓度下的代表性荧光图像。液滴富含Alexa Fluor 488标记的SS18-SSX1。液滴形成缓冲液包含50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl和10% Ficoll。比例尺显示10米。b在不同时间点对SS18-SSX1蛋白进行相差成像,以显示两个液滴的动态融合。代表性的SDS-PAGE分析(c)和定量数据(d)SS18-SSX1蛋白或突变体在含有或不含10% Ficoll的缓冲液中的沉降试验。向SS18-SSX1蛋白中加入1,6-己二醇(Hex,5%)以破坏液滴形成。每种蛋白质的浓度为60 M。用Image J v1.8.0软件对蛋白质的条带强度进行定量。统计数据代表来自三个独立批次的沉降实验的结果,并被绘制为平均值SEM。eAlexa Fluor 488标记的SS18-SSX1或突变体(60 M)和Cy3标记的BRG1的混合物的代表性荧光和明场图像(1-282)(60 M)在包含50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl和10% Ficoll的缓冲液中。比例尺指示10 μm。fHEK293T和HS-SY-II细胞中GFP-SS18-SSX1、GFP-SS18(3M)-SSX1和GFP-SS18(Y19S)-SSX1的活细胞成像。比例尺指示5 μm。g来自三个独立HeLa细胞的GFP-SS18-SSX1、GFP-SS18(3M)-SSX1和GFP-SS18(Y19S)-SSX1点的FRAP恢复曲线,误差条指示平均值SEM。时间0是指光漂白脉冲的时间点。hGFP-SS18-SSX1或突变体和Cherry-BRG1在HEK293T和HS-SY-II细胞中共表达。比例尺指示5 μm。

接下来,我们试图测试两种突变体SS18(3M)-SSX1和SS18(Y19S)-SSX1的相分离能力,其中在SS18中分别包含三个突变(I32E、L54E和A65E)和19个突变为丝氨酸的酪氨酸残基(图。1a和补充图。3).正如所预料的,从凝聚相中回收了相似量的突变SS18(3M)-SSX1和SS18-SSX1-WT蛋白(图9中的泳道9和10与泳道7和8相比)。5c, d).这些结果与补充图中的早期co-IP分析一致。4b这表明突变体SS18(3M)-SSX1和SS18-SSX1-WT能够自我结合(补充图。4b).此外,突变体SS18(Y19S)-SSX1没有从凝聚相中恢复,进一步证明SS18的QPGY结构域的酪氨酸残基介导的多价相互作用是SS18-SSX1的LLPS的驱动力(图中的泳道11和12)。5c, d).还需要注意的是,只有野生型SS18-SSX1能够募集BRG1(1-282)凝结成液滴(图。5e).尽管具有结合BRG1的能力,但突变体SS18(Y19S)-SSX1不能形成任何凝结的液滴,而突变体SS18(3M)-SSX1能够形成凝结的液滴,但不能募集BRG1(图。5e).随后,我们观察到SS18-SSX1和突变SS18(3M)-SSX1都显示出更密集的点状簇,分布在细胞HEK293T和滑膜肉瘤细胞系HS-SY-II或CME-1中。4e(图。5f和补充图。4c).相反,突变体SS18(Y19S)-SSX1在这些细胞中扩散,并且观察到少量的蛋白质聚集(图。5f和补充图。4c).为了详细说明puncta簇的性质,我们使用FRAP来监测SS18-SSX1或puncta簇中的两种突变体分子与其在周围散装溶剂中的对应物的交换率。漂白后,大约54-58%的GFP-SS18-SSX1和GFP-SS18(3M)-SSX1点状信号分别在38.7秒和49.8秒的平均半衰期内恢复,这比SS18慢(图。3h和5g).值得注意的是,簇中大约76%的GFP-SS18(Y19S)-SSX1荧光在28.2秒的平均半衰期时间内恢复,表明QPGY结构域中酪氨酸到丝氨酸的突变导致该突变体的更动态特征(图。5g).突变体SS18(3M)-SSX1证明其不能与BRG1共定位,而SS18-SSX1-WT能够将BRG1募集到HEK293T细胞和滑膜肉瘤细胞系HS-SY-II或CME-1的相分离凝聚物中(图。5h和补充图。4d).此外,观察到突变SS18(Y19S)-SSX1(其不能相分离)在细胞系中也具有BRG1的扩散分布(图。5h和补充图。4d).综上所述,这些结果表明oncofusion SS18-SSX1通过SS18-SSX1和BRG1之间的特异性相互作用将BRG1募集到相分离的冷凝物中。

LLPS和结合BRG1有益于SS18-SSX1的转化活性

接下来,我们想要探索SS18-SSX1相分离和BRG1结合在SyS开发中的作用。为了解决这个问题,我们重建了稳定过表达SS18-SSX1、SS18(3M)-SSX1和SS18(Y19S)-SSX1的三种NIH3T3成纤维细胞系。蛋白质印迹结果显示,SS18-SSX1、SS18(3M)-SSX1和SS18(Y19S)-SSX1在每个细胞系中的表达水平相当,并且与对照相比显著增加(图。6a).为了测试SS18-SSX1在肿瘤发生中的作用,我们进行了EdU细胞增殖和克隆形成试验来检测DNA的合成和克隆形成能力。值得注意的是,EdU增殖实验证明,与对照相比,野生型SS18-SSX1的过表达有效促进NIH3T3细胞增殖,而突变体SS18(3M)-SSX1和SS18(Y19S)-SSX1在促进细胞增殖方面表现出部分缺陷(图。6b,c).集落形成实验确定,与野生型相比,表达突变体SS18(3M)-SSX1或突变体SS18(Y19S)-SSX1的NIH3T3细胞形成较少和较小的克隆(图。6d).此外,我们测试了NIH3T3细胞稳定表达WT SS18-SSX1以及突变体的迁移和侵袭能力。这些结果表明,野生型SS18-SSX1,而不是突变体,促进NIH3T3细胞的迁移和侵袭(图。6e–h).总之,这些结果表明,癌蛋白SS18-SSX1的相分离及其组装成染色质重塑复合物对于其在成纤维细胞NIH3T3中的转化活性是重要的。

图6:SS18-SSX1的相分离和与BRG1的结合对SS18-ssx 1的致癌活性很重要。
figure 6

a在NIH3T3细胞中过度表达的SS18-SSX1 WT或突变体的蛋白质水平。b过表达SS18-SSX1 WT或突变体的NIH3T3细胞系的EdU分析。EdU阳性细胞核(Alexa Fluor 488叠氮化物标记;绿色)和1× Hoechst染色的所有细胞的细胞核(蓝色)通过荧光显微镜观察。c年EdU检测的统计图(b).误差棒代表平均值SEM、单因素方差分析、Tukey多重比较检验;n= 5个独立实验,****P < 0.0001. d过表达SS18-SSX1 WT和突变体的NIH3T3细胞系的平板集落形成。菌落用0.1%结晶紫染色。细胞迁移(e)和入侵g过表达SS18-SSX1 WT和突变体的NIH3T3细胞系的分析。细胞用1%结晶紫染色,并用明视野显微镜观察。f, h细胞迁移和侵袭试验的统计图。误差棒代表平均值SEM、单因素方差分析、Tukey多重比较检验;n= 3个独立实验,****P < 0.0001.

讨论

在这项研究中,我们发现人类SS18与BRG1结合,酵母SNF11与BRG1的酵母同源物SNF2结合,具有相似的异二聚体结构(图。1b和2b和补充图。5d).这表明SNF11和SS18的N-末端SNH结构域之间的保守性。根据这一观察以及SNF11和SS18的SNH结构域在广泛物种中的序列相似性,我们能够得出结论,SNF11可能是SS18的同源物南酿酒酵母(补充图3).SS18有一个额外的内在无序区,包括QPGY结构域,通过多价疏水相互作用介导LLPS,而其酵母同源物SNF11不具有相分离的能力(图。3).此外,嵌合体SNF11-QPGY也表现出相分离(补充图。5e,f).考虑到这一点,我们推测SS18获得了一种相分离的特性,以参与特定的生理功能脊索动物门在进化的过程中。有趣的是,最近的一项研究表明,SS18通过相分离介导CBAF组装,从而调节多能-体细胞转换,这与我们的推测一致32。在他们的研究中,作者发现SS18的C-末端固有无序区在异位过表达的条件下调节其形成微观缩合物,并且SS18的N-末端70aa是其与CBAF结合所必需的。这些观察结果与我们的结果一致。此外,我们使用纯化的重组蛋白在体外证实了SS18 LLPS,并揭示了SS18和BRG1相互作用的结构基础。

我们使用异位过表达系统评估了活细胞中SS18或SS18-SSX1的相分离(图。35).此外,我们注意到内源性SS18或SS18-SSX1在小鼠胚胎干细胞或滑膜肉瘤细胞中的点状分布与在HeLa、HEK293T或滑膜肉瘤细胞中的过度表达相似30,32(图35).然而,不可否认的是,LLPS是一个浓度依赖的过程。尽管很难在本土国家体系中评估LLPS33未来的研究需要在合适的体内系统中验证SS18或SS18-SSX1 LLPS。

我们的结果表明,SS18和SS18-SSX1形成的液滴/冷凝物的特征略有不同,尽管经历LLPS的驱动力相似(图。35).具体地,与SS18相比,SS18-SSX1仅在一定浓度的聚集试剂存在下才能形成相分离的液滴。此外,SS18-SSX1荧光分子与它们在本体溶剂中的对应物的交换速率比SS18慢得多(图。35).这些结果表明融合伴侣SSX1(111-188)可能有助于或调节致癌物SS18-SSX1的LLPS。也有报道称,SSX蛋白广泛分布于SyS或纤维肉瘤细胞的细胞核中,并伴有一些核点34,35。我们的结果始终显示纯化的SSX1(111-188)本身不能在体外发生相分离(补充图。6c).因此,SSX1的确切机制(111-188)在调节相分离中SS18-SSX1及其潜在的生物学意义仍需进一步研究。

基于染色质的基因调节系统的失调被认为是系统性红斑狼疮发病机制的主要驱动因素36。先前的研究指出了SS18-SSX的一个有趣的能力,它招募多梳抑制复合物2 (PRC2)到ATF2靶基因,以抑制由CDKN2A基因座编码的肿瘤抑制基因37。另一方面,其他研究表明,SS18-SSX改变BAF基因组分布和亚型水平,因此增加了复合物破坏PRC2功能的能力。这种破坏可以通过组蛋白H3K4甲基化酶的COMPASS家族介导基因表达的激活,并协调异常的致癌转录程序13,38,39。Banito等的一项研究发现,SS18-SSX融合与KDM2B-PRC1.1(一种非克隆多梳抑制复合物1)相关,异常激活多梳介导的基因抑制的靶转录因子40。随后的研究阐明,BAF复合物的SS18-SSX特异性构象表现出对H2AUbK119标记的核小体的强烈偏好,支持它们对多梳修饰的染色质区域的偏好31。这些观察以及我们的结果表明,相分离是一个重要的机制。这种机制使SS18-SSX1缩合物能够以有效和特异的方式作为分隔染色质重塑复合物的中枢,驱动滑膜肉瘤的形成。未来的研究需要进一步详细说明SS18-SSX LLPS在动物模型中的效果和作用。

针对LLPS相关机制治疗一系列疾病是一个很有希望的想法41。例如,开发了核PARP-1/2活性的小分子抑制剂,通过减少哺乳动物细胞中细胞质TDP-43聚集体的形成来治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)42。考虑到我们的结果和这些以前的研究,靶向SS18-SSX1相分离的小分子可能是SyS的一种有吸引力的治疗形式。


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