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HDLBP通过多价相互作用结合ER靶向mRNAs,促进跨膜和分泌蛋白的蛋白合成

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发表时间:2022-05-25 14:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

RNA结合蛋白在分泌途径中的生物学作用尚未完全确定。在这里,我们描述了人类HDLBP/Vigilin直接与超过80%的ER定位mRNAs相互作用。PAR-CLIP分析显示,这些转录物代表高亲和力的HDLBP底物,并特异性结合于其编码序列(CDS ),与CDS/3’UTR结合的胞质mRNAs相反。HDLBP与长的富含铜的基序强烈交联,这些基序经常位于ER定位的mRNAs的CDS中,并导致高亲和力的多价相互作用。除了HDLBP-ncRNA相互作用组,HDLBP近端蛋白质组的定量证实了与翻译装置和信号识别颗粒的成分的关联。缺乏HDLBP导致HDLBP靶mRNAs的翻译效率降低,模型细胞系中蛋白质合成和分泌受损,以及肺癌小鼠模型中肿瘤生长降低。这些结果强调了HDLBP在ER定位mRNAs翻译中的一般功能及其与肿瘤进展的相关性。

介绍

在真核细胞中,功能蛋白产物的定位很大程度上取决于它们的翻译位点。当可溶性蛋白质在胞质溶胶中翻译时,靶向内质网(ER)的共翻译使新合成的蛋白质能够进入分泌途径,导致其分泌或膜整合1,2,3,4。典型的分泌途径始于胞质溶胶中疏水性靶向信号(信号肽或跨膜结构域)的合成5。随后信号识别颗粒(SRP)与新生肽的结合导致核糖体延伸停滞和核糖体新生链复合物(RNCs)的形成6。这使得胞质SRP-RNC通过SRP受体重新定位到内质网膜上,新生肽转移到内质网腔中7。近年来,在酵母中发现了一种非典型的SRP非依赖性途径8以及SRP在核糖体参与之前募集到mRNA的证据9和独立于SRP的ER靶向10,11,12。这增加了识别膜结合mRNAs的未知机制存在的可能性。

mRNA序列中调控元件对于核糖体延伸阻滞和新生链识别的潜在作用知之甚少。一些研究已经鉴定了编码序列(CDS)和3’非翻译区(3’UTRs)中的元件,这些元件可以区分内质网结合的mRNAs和胞质的mRNAs13,14,15,16,17。然而,可能负责识别这些元件的反式作用因子是未知的。最近,观察到编码可溶性蛋白的一小组mRNA也可以在内质网定位和翻译,表明调节定位mRNA命运的其他机制18。虽然有证据表明在肌肉中存在与丙酮酸激酶相互作用的内质网相关核糖体亚库19,胞质和内质网结合的核糖体的组成、装配和活性翻译状态的全面差异尚未确定20,21,22。此外,在内质网上发现了一种以前未知的依赖核糖体的无意义介导的衰变(NMD)途径的变体,提示内质网结合的mRNAs有一个额外的调节层23。总之,编码可溶性蛋白和膜蛋白的mrna的翻译命运可能受到反式作用因子如RNA结合蛋白的严格调控,其功能可能超出了典型的SRP依赖模型。

HDLBP(也称为VIGILIN)是一种保守且普遍表达的RBP,定位于细胞质和内质网膜24,25。它包含15个hnRNPK同源(KH) RNA结合域(RBDs)26。KH结构域是高亲和力RNA识别元件(RREs),最常见的是FMRP中观察到的四核苷酸27、SF1、HNRNPK和其他28。一些也可以识别二分基序,例如IGF2BP蛋白家族29,30,31,32。已发现HDLBP及其酵母直系同源物SCP160对许多生物学过程有贡献33比如翻译34,35或者蛋白质聚集36,并与致癌作用有关37,38。最近,高密度脂蛋白被证明是ZIKV黄病毒和登革病毒复制所必需的,很可能是通过增加病毒蛋白质在内质网的翻译效率24。HDLBP也是心血管研究的一个有希望的靶点,因为它促进极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌,并在动脉粥样硬化倾向的Ldlr中敲除肝脏HDLBP后导致较少的动脉粥样硬化斑块−/−老鼠35。有人提出HDLBP与编码分泌蛋白的mRNAs亚组中含有CHHC或CHYC (H = A/C/U和Y = C/U)的区域结合,并增强其翻译。然而,高密度脂蛋白结合RNA的功能和翻译过程中的机械事件仍然不确定。

在这里,我们通过PAR-CLIP在转录组范围内分析了HDLBP结合位点,并发现了它们作为er结合mRNAs选择性序列决定子的潜在功能。HDLBP与超过80%的内质网定位的mrna直接特异地相互作用,主要与它们的CDS中富含铜的长基序结合,这是一个独特的特征,与胞质mrna相比,在膜结合的mrna中更常见。生物化学、转录组学和蛋白质组学方法被用于评估高密度脂蛋白缺乏对内质网翻译效率、蛋白质合成和分泌的功能性影响,并强调其对这些生物学过程的要求。最后,我们将我们的发现扩展到体内系统,并评估缺乏高密度脂蛋白对肿瘤形成能力的影响。

结果

HDLBP直接与ER靶向mRNAs相互作用

为了从功能上描述HDLBP与定位转录组的相互作用,我们定量了HEK293细胞中胞质和膜结合的mRNAs。使用亚细胞化学分级方法39,我们获得了胞质溶胶和膜组分,这可以通过存在或不存在区室特异性蛋白标记来证明(补充图。1a).为了获得定位的mRNA图谱,我们接下来对全细胞、胞质溶胶和膜组分进行了mRNA测序(补充图。1b),导致高度可再现的mRNA丰度定量(补充图。1c).由于膜-细胞质富集的双峰分布(图。1a),我们能够根据它们在胞质溶胶和膜之间的分配对7000多种mRNAs进行分类(补充数据1).为了验证这一结果,我们比较了编码或缺乏共翻译靶向信号的mRNAs之间的富集值。正如预期的那样,我们发现,与编码翻译后靶向尾锚定蛋白或核DNA编码的线粒体蛋白的mrna相比,线粒体DNA编码的蛋白以及信号肽(SP)和跨膜螺旋(TM)编码的mrna具有更高的膜富集度(图。1b),验证我们的方法。

图1: HDLBP与ER靶向mRNAs结合。
figure 1

a通过测序量化HEK293细胞中膜和胞质mRNA的定位。log2转化的膜富集的直方图(膜和胞质读数之间的比率,两次重复的平均值)。选择0.5和1.5的截止值(灰线)来分类膜结合(n= 1157)、胞质(n= 6139)和未定义本地化的mRNAs(n= 193).TPM至少为10的mRNAs被包括在该分析中。bmRNA序列衍生定位的质量控制。在根据编码的靶向信号(TS)的存在分类的mRNAs组之间比较Log2转化的膜富集:没有靶向信号的胞质溶胶定位的mRNAs(n= 5142),编码线粒体蛋白的mrna,不包括mtDNA编码的mrna(n= 739),编码翻译后靶向尾锚定跨膜蛋白(n= 102),线粒体DNA表达编码线粒体蛋白的mRNAs(n= 13),没有已知TS的膜定位mRNAs(n= 107),编码信号肽(SignalP)的mRNAs包含蛋白质(n= 214)或跨膜螺旋(n= 724)或两者(n= 282).TPM至少为10的mRNAs被包括在该分析中。箱形图的上下铰链分别对应于第25和第75个百分点。上须和下须从铰链延伸到最大值或最小值,分别不超过离铰链1.5×四分位范围。箱线图的中线描绘了中值。c在HEK293细胞中通过PAR-CLIP检测到的HDLBP交联(T-C转换)在整个转录组中的分布。dCDS中标准化HDLBP交联信号对未分级细胞中mRNA表达水平的散点图。根据mRNAs在(a).上面的插图显示了HDLBP交联信号的密度分布。eHDLBP结合和未结合mRNAs的定位。显示了总HEK293胞质和膜结合mrna中HDLBP结合mrna的绝对数量和百分比。f不同mRNA类别的HDLBP部分片段结合富集(两个生物重复的平均值);不含TS的细胞质定位的mRNAs(n= 1578),编码线粒体蛋白的mrna,不包括mtDNA表达的mrna(n= 251),编码翻译后靶向尾锚定跨膜蛋白(n= 30),没有已知TS的膜定位mRNAs(n= 74)、编码信号肽(SignalP)的mRNAs含有蛋白质(n= 138)或跨膜螺旋(n= 492)或两者(n= 219).箱形图的上下铰链分别对应于第25和第75个百分点。上须和下须从铰链延伸到最大值或最小值,分别不超过离铰链1.5×四分位范围。箱线图的中线描绘了中值。af源数据作为源数据文件提供。

mRNA定位的成功定量促使我们通过PAR-CLIP确定HEK293细胞中的全细胞HDLBP结合转录组(补充图。1d,e).作为T-C转换检测到的大多数FLAG/HA-HDLBP交联信号存在于编码序列(CDS)和mRNAs的3’非翻译区(3’UTRs )(补充数据2, 3),以及rRNA和trna(图。1c).表达水平标准化后(补充图。1f,g),膜结合mRNA的PAR-CLIP T-C信号呈正态分布,没有mRNA丰度偏差(图。1d),表明高密度脂蛋白相互作用对这些mRNAs具有高度特异性。有趣的是,在膜定位的mRNAs中高HDLBP PAR-CLIP富集主要是由于高CDS相互作用,而不是3’UTR结合(补充图。1h).我们估计总膜结合mRNA库的80%以上被HDLBP结合(图。1e).未结合的膜定位的mRNAs包括13个线粒体DNA编码的基因(补充图。1i),由于HDLBP不局限于线粒体,因此不被认为是HDLBP的靶标25。相应地,高密度脂蛋白结合的mrna高度富集SP和TM螺旋编码转录物,而对于胞质mrna和那些编码线粒体蛋白的mrna,观察到明显较弱的结合(图。1f).此外,我们发现编码尾锚定膜蛋白的mrna没有富集,这证实了HDLBP以高特异性结合内质网(ER)靶向的mrna。

HDLBP与膜结合和胞质mRNAs转录区的差异结合

为了确定高密度脂蛋白-RNA相互作用的分子特征,我们首先检测了mRNA转录区域内高密度脂蛋白交联位置的相对分布。观察到T-C位置计数的高再现性(补充图。2a),使我们能够构建高分辨率的高密度脂蛋白交联图谱。我们观察到HDLBP与CDS和3’UTR区域的相互结合依赖于mRNA的定位。HDLBP主要与膜结合mrna的CDS相互作用,而对于胞质mrna,这种结合在3’UTR更突出(图。2a).为了解决CDS、3’UTR结合和mRNA定位之间的关系,我们计算了CDS和3’UTR中检测到的长度标准化T-C转换之间的比率,发现膜定位的mRNA比胞质转录物具有更高的比率(图。2b).此外,对总T-C交联信号的贡献主要来源于膜结合mRNAs的高CDS结合(图。2c).比较膜结合mrna IGF2R和COL2A1,以及细胞质HNRNPUL1和FTL转录物的T-C转换模式(图。2d和补充图。2b),支持转录组分析的结论。总之,HDLBP靶mrna主要定位于膜并结合在CDS中,而在胞质mrna中,HDLBP结合在CDS和3’UTR之间平均相等。

图HDLBP与ER靶向和胞质转录物的差异结合。
figure 2

a胞质和膜结合mRNAs的HDLBP交联信号的元转录本分析。每个核苷酸的T-C转换信号根据文库大小(每百万T-C)进行标准化。每百万中至少有5个T-C的转录本被包括在这个分析中。百万分之T-C换算成每个转录本的最大T-C信号。在每个位置,绘制了平均比例T-C信号。bCDS中的HDLBP交联与3’UTR的比率相对于胞质和膜结合mRNA的每个mRNA的总交联的散点图。c根据每个mRNA的总HDLBP交联分为三组(n= 16: TC <0.3,膜,n= 65: 0.3 < TC <1.39,膜,n= 35:,TC >1.39,膜,n= 279: TC <0.3,胞质,n= 379: 0.3 < TC <1.39,胞质,n= 144: TC >1.39,胞质),并绘制了CDS的分布与HDLBP交联的3’UTR比的关系。箱形图的上下铰链分别对应于第25和第75个百分点。上须和下须从铰链延伸到最大值或最小值,分别不超过离铰链1.5×四分位范围。箱线图的中线描绘了中值。dIGF2R(膜结合)和HNRNPUL1(胞质)mRNAs中PAR-CLIP阅读覆盖和T-C转换的浏览器表示。读数被映射到人类mRNA序列。显示了5’UTR、CDS和3’UTR区域。显示了抄本id。ad源数据作为源数据文件提供。

HDLBP结合的RNA识别元件在膜结合的mrna中更常见

我们接下来研究了强调HDLBP对膜结合mRNAs特异性的主要序列特征。我们根据每个转录本的交联信号中值对交联的七聚体进行排序(补充图。3a)和T-C交联位置相对于所有交联七聚体的频率(图。3a).这两个指标在定位于膜或胞质溶胶的mRNAs的CDS和3’UTR之间进行了比较。我们发现HDLBP最常与含铜的七聚体交联,其UUC/UC/CUU/CU重复序列的数量可变,位于膜结合mRNAs的CDS中(图。3a,b和补充图。3a).

图3:膜结合mRNAs的HDLBP特异性。
figure 3

a位于膜结合和胞质mRNAs的3’UTR或CDS中的前十个高密度脂蛋白交联七聚体的频率。b根据在所有检测到的交联七聚体中的频率排列的前五个HDLBP交联七聚体的序列标志。c的分布z-根据膜结合和胞质CDS和3’UTR序列中所有可能的k-mers的频率差异计算的得分。对于每个k-mer长度,对前40个HDLBP交联k-mer组(左)和所有其他k-mer组(右)进行了该分析。d p两两Wilcoxon秩和检验的值z-前40个结合型高密度脂蛋白k-mer的得分,如(c). e交联位点周围+40/40 nt区域的HDLBP多价分析。为了评估T-C结合亲和力作为HDLBP结合位点多价的函数,我们将40-nt区域内前十个富集的四聚体的多价分数分成五类(组大小从最高到最低分数组,n= 994,n= 973,n= 673,n= 1036,n= 1308).然后,针对所有五个类别绘制+40/40 nt区域的总归一化T-C转换信号。箱形图的上下铰链分别对应于第25和第75个百分点。上须和下须从铰链延伸到最大值或最小值,分别不超过离铰链1.5×四分位范围。箱线图的中线描绘了中值。f针对每个多价结合分析+40/40 nt区域内每个核苷酸位置的总T-C转换百分比。显示了具有最高多价分数的两个仓并对应于(e). g比较CDS中差异定位的mRNAs之间的平均多价分数。一个阳性组(由前十个高密度脂蛋白交联四聚体组成的四聚体组,UUCU)和一个阴性组(AAGU ),无高密度脂蛋白富集。这些四聚体组的出现在30-nt滑动窗口中计数,并计算每个转录本的平均得分。然后通过Wilcoxon秩和检验比较不同局部CD之间的平均分布。h重组GST-HDLBP片段(构建体A至D)和全长蛋白(FL)的表观解离常数,示意性显示,用于不同的RNA寡核苷酸,通过荧光各向异性结合试验测定。测量到但无法确定的离解常数用“n.d .”表示,未测量到的相互作用用“—”表示。i具有不同数目的HDLBP结合四聚体的RNA寡核苷酸的荧光各向异性结合分析(左,H40-44)。将GST-HDLBP构建体B (KH5-9)与FAM标记的RNA寡核苷酸一起孵育,测量各向异性并进行KD由结合曲线确定(中间图)。对于每种寡核苷酸,三个独立的Kd值已确定。在以下方面的显著差异Kd使用双侧评估值t-测试,并用星号(*P < 0.01, *P < 0.05). Data were presented as mean values ±  SD. ai源数据作为源数据文件提供。

我们询问HDLBP结合是否由胞质和膜结合mRNAs的不同序列组成决定。为此,我们确定了全部3’UTR和CDS序列中所有可能的七聚体的频率,并将其与高密度脂蛋白交联七聚体的频率进行比较。虽然最高的HDLBP交联七聚体不是转录组中最常见的七聚体,但它们显示出显著更高的出现率(P= 2.7e-07),与胞质mRNAs相比(补充图。3b).

因为HDLBP由15千赫的域组成26,33接下来,我们讨论了它识别更长rre的可能性40。因此,对于长度在4和12个核苷酸之间的40个高度交联的k-聚体,计算了膜结合和胞质mRNAs之间的频率差异。交联的k-mers通常在膜结合mrna序列中比在胞质mrna序列中更常见(图。3c).此外,在最长的k-mers(10–12个核苷酸)中观察到膜结合和胞质mRNAs之间的最大差异(图。3c).因此,与胞质mrna相比,膜结合的mrna含有数量显著更高的更长的高亲和力结合HDLBP的RREs(图。三维(three dimension的缩写)).另一方面,交联k-mers的出现在CDS和胞质mRNAs的3’UTR之间是可比较的(补充图。3c,d),并且对应于这两个转录物区域之间的HDLBP交联的均等分布(图。2c).总之,HDLBP与膜结合mrna的CDS的特异性结合至少部分可以用膜结合mrna和胞质mrna的k-mer组成的差异来解释。

高亲和力的多价HDLBP相互作用在膜结合的mRNAs中更频繁地形成

由于大量的KH结构域,我们接下来推断HDLBP可以识别与未结合的核苷酸间隔的RREs,产生多价相互作用。通过计算所有检测到的交联位置周围40 nt区域中最频繁交联的四聚体的频率(补充图。3f),我们发现具有最高四聚体频率的区域也显示了这些区域内的最高交联值(图。3e).因此,高度多价的HDLBP结合位点也导致了高亲和力的相互作用。此外,具有最高多价的区域内的平均位置交联信号显示,交联的上游(13个核苷酸)和下游(+16个核苷酸和+20个核苷酸)的几个位置发生了特异性交联(图。3f).因此,高亲和力的HDLBP位点包含3-4个RNA元件,相隔几个核苷酸,产生长度约为40 nt的结合位点。值得注意的是,多价相互作用分别导致膜结合和胞质mRNAs的CDS和3’UTR的高亲和力相互作用(补充图。3e).

为了探索膜结合和胞质mRNA与HDLBP形成多价相互作用的潜力,我们接下来计算了mRNA序列的30-nt滑动窗口内四聚体的出现率。我们观察到膜结合的CDS中高密度脂蛋白交联四聚体的局部频率显著高于胞质mRNAs(图。3g).这种效应在一组未结合的四聚体中不存在,证实了膜结合的CDS含有高密度的局部HDLBP识别元件,这些元件引起多价相互作用。

为了更详细地确定RNA底物特异性,我们表达并纯化了含有不同KH结构域的重组全长HDLBP (FL)和蛋白变体(A–D )(图。3h和补充图。3i).使用荧光各向异性分析,我们确定了各自蛋白质RNA底物组合的表观解离常数(Kd ),总结于图。3h。全长的HDLBP与TFRC mRNA的区域(TFRC_1和_2)具有高亲和力,这些区域是根据我们的PAR-CLIP数据选择的。一个TFRC位点(TFRC_1_mut)的突变降低了结合。使用人工序列,我们可以显示HDLBP与CCU-和CUU-寡聚物强烈相互作用,而与CAA寡聚物的亲和力降低了约10倍。此外,HDLBP虽然亲和力降低,但仍与18 S rRNA的ES6区结合。有趣的是,包含KH结构域5至9的HDLBP构建体B与测试的mRNA和18S rRNA序列的亲和力与全长蛋白几乎相似,这表明HDLBP的中心部分对于识别和与不同RNA底物的相互作用很重要。与全长HDLBP相比,5 C-末端KH结构域HDLBP显示出与TFRC mRNA区域的结合减少。对于N-末端HDLBP片段A (KH0-KH4 ),我们无法识别高亲和力RNA底物。

为了了解多价相互作用对HDLBP结合亲和力的影响,我们接下来使用在一个较长的(34 nt)序列中具有不同数量的结合四聚体基序的RNA分子进行了体外HDLBP结合分析(图。3i).我们确定含有三个HDLBP结合的四聚体(CUUC或UCUU)的合成RNA分子的Kd值明显低于仅含有两个HDL BP结合的四聚体的合成RNA分子。因此,HDLBP (KH5-9)对具有更高多价潜力的RNA具有约3-5倍的亲和力。这些发现有力地支持了我们从PAR-CLIP分析中得出的结论,并证实了HDLBP通过多价相互作用以高亲和力与长RNA区域结合。

HDLBP与翻译装置相互作用

由于HDLBP显示了与膜结合mrna的CDS的特异性相互作用,我们接下来探索了它在ER靶向mrna的翻译调控中发挥作用的可能性。HDLBP PAR-CLIP显示与18S rRNA结合,两个主要结合位点位于扩增片段6SB和螺旋16(图。4a).这些位点可能在翻译起始和延伸中起调节作用41,42因为它们接近真核起始和延伸因子(EIF4A、EIF4G1和EEF2)的结合位点(补充图。4a).接下来,我们研究了HDLBP与信号识别颗粒(SRP)的7SL RNA成分的结合,SRP是新生多肽相关复合物协同翻译靶向内质网膜所需的RNP。在7SL RNA中,我们观察到与其他RBP(ire 1、SSB和MOV10)的结合模式不同的HDLBP接触(图。S4B).HDLBP交联位于大(S)结构域的螺旋(5d–f,6,8a)和小Alu区域的不成对尿苷处(补充图。4c).SRP占总T-C交联的百分比与其他已知或预期的7SL RNA相互作用剂(IRE1和SSB)相当,比MOV10高约10倍,mov 10不强烈结合7SL RNA(补充图。4d).总之,HDLBP与核糖体的40S亚单位在靠近SRP接触位点的位置相互作用(图。4b).

图4: HDLBP与翻译装置相互作用。
figure 4

a在rRNA前区域检测到PAR-CLIP覆盖和交联。为了比较,包括了IRE1 PAR-CLIP的结果。扩展段位置用绿色表示。b将人类80S核糖体(PDB: 4V6X)和SRP-核糖体复合物(PDB: 3JAJ)的结构并列,并绘制了HDLBP rRNA和7SL RNA交联核苷酸的图谱(用红色表示)。c用FLAG/HA-HDLBP作为诱饵进行RNA免疫沉淀。通过qRT-PCR检测共沉淀的RNA。计算四次重复的平均富集倍数(抗-FLAG对IgG对照),误差棒表示标准偏差。显示了7SL RNA、IGF2R、YWHAZ、CD46和ATP1A1的结果,以及作为阴性对照的mtDNA编码的mRNA (MT-CO1)。dBirA-FLAG-HDLBP附近蛋白质的BioID分析。根据平均LFQ(Dox样品的三个重复)对前60个富集的蛋白质(LFQ(Dox)对LFQ(noDox) >3)进行排序。圆点的大小对应于加浓值。e249个富集BioID蛋白的基因本体富集分析。调整过的p显示了前五个丰富类别的值。fFLAG/HA-HDLBP与抗FLAG或IgG抗体共免疫沉淀。输入裂解物(0.25%)和洗脱物(19%)的Western分析按指示用抗体进行。af源数据作为源数据文件提供。

为了确保这些接触来自稳定的相互作用,我们通过RNA免疫沉淀(RIP)实验证实了各种HDLBP RNA靶标(图。4c).结果与PAR-CLIP实验的结论一致,7SL RNA显示中度富集,而几种膜结合mRNA(yw HAZ,ATP1A1,CD46和IGF2R)显示高度富集,而mtDNA编码的mRNA (MT-CO1)没有显示富集。这些结果支持了HDLBP与PAR-CLIP鉴定的RNA种类形成稳定相互作用的结论。

为了通过正交方法验证与翻译装置的相互作用,我们接下来使用BioID分析了HDLBP近端蛋白43在表达与混杂生物素连接酶BirA*融合的HDLBP的HEK293细胞中进行的接近标记试验(补充图。1d).我们通过RIP证实BirA*-FLAG-HDLBP也与我们先前检测到的由FLAG/HA标记的HDLBP结合的几个转录物结合(补充图。4f).高密度脂蛋白近端蛋白的可重复性鉴定(补充图。4e,g和补充数据4)与之前发表的BioID实验重叠约50 %(补充图。4h)44(图。4d,e).我们发现顶部富集的蛋白质参与翻译,包括翻译起始因子(EIF4G1、EIF4B、EIF5和EIF4E2)(图。4d,e和补充图。4i)、伴侣蛋白和伴侣蛋白(HSPA1A、HSPA8和CCT8)、小亚基(SSU)的SRP成分(SRP68)和核糖体蛋白(RPS3A和RPS10)。我们通过正交抗FLAG免疫共沉淀实验验证了潜在的SSU相互作用,并发现免疫共沉淀物含有RPS6的SSU成分,但含有非常少量的RPL7(图。4f).这一发现与通过PAR-CLIP和HDLBP结合18S rRNA序列检测到的特异性18S rRNA交联一致,如图所示。3h。总之,这些结果表明HDLBP与包括SRP在内的翻译装置相互作用,并位于核糖体相关因子附近。

高密度脂蛋白促进内质网膜的翻译

基于以前的发现45,46,47,48,49以及在我们的研究中观察到的HDLBP与膜结合mRNAs的CDS和核糖体的特异性相互作用,我们接下来研究HDLBP在ER相关翻译中的功能。因此,我们通过产生两个CRISPR/Cas9 HDLBP敲除(KO)细胞系,测量了HDLBP存在和不存在时的主动翻译过程(图。5a).HEK293 HDLBP敲除细胞没有显示明显的生长缺陷,并且ER的电子显微镜成像显示没有形态学变化(数据未显示)。为了量化KO和野生型(WT)条件下的翻译效率,我们生成了核糖体图谱数据集,其显示了高阅读周期和CDS中占优势的框内P-位点覆盖(补充图。5a、b).由于这个数据集是从未分离的细胞中获得的,我们询问我们的实验是否充分地捕获了内质网结合的mRNAs上的核糖体足迹。正如预期的那样,我们在起始密码子下游区域观察到含SP和TM的mRNAs的低足迹密度,直到来自核糖体的两种靶向信号出现(补充图。5c),证实该数据以接近核苷酸的分辨率恢复了ER结合的核糖体复合物。

图5: HDLBP促进ER翻译和分泌及跨膜蛋白的合成。
figure 5

aHEK293亲代和HDLBP KO细胞中核糖体图谱实验的示意图。Western分析显示KO细胞中缺乏HDLBP。b膜结合的HDLBP靶mRNAs根据它们在CDS中的交联信号分成三个相似大小的组(在括号中表示)。比较各组间翻译效率的差异(HDLBP KO对WT)。使用双侧Wilcoxon秩和检验来检验显著性。cHEK293亲代和HDLBP KO细胞中新合成蛋白质的pSILAC分析。SILAC重对中比率(H/M)反映了HDLBP KO后蛋白质合成的变化,并在膜组分中定量。基于蛋白质在CDS中的交联信号(在括号中表示),蛋白质被分成三个大小相似的组。使用双侧Wilcoxon秩和检验比较各组之间的SILAC比率。d基于蛋白的PAR-CLIP信号和膜定位(在括号中表示),蛋白被分成三个大小相似的组。使用双侧Wilcoxon秩和检验比较各组之间的SILAC比率。e亲代和HDLBP KO细胞用分泌的高斯亚荧光素酶(Gluc)构建体。在培养基中对Gluc活性进行定量,并标准化为细胞内萤火虫荧光素酶(Fluc)活性。四个重复实验(R1-R4)中的每一个都进行了五次技术重复。数据以平均值±标准差表示。f亲代和HDLBP KO细胞被转染分泌型碱性磷酸酶(SEAP)构建体。在培养基中定量SEAP信号,并标准化为细胞内萤火虫荧光素酶(Fluc)活性。每个实验进行五次技术复制。数据以平均值±标准差表示。g稳定转染过表达高密度脂蛋白(OE)构建体的A549细胞的Western分析。h在具有不同HDLBP蛋白水平(KO敲除,WT野生型,HDLBP/OE过表达)的HEK293和A549细胞中测量了相对于Fluc的SEAP活性。实验进行五次,至少五次技术重复。数据以平均值±标准差表示。i在HEK293 HDLBP敲除(KO)与亲代(WT)细胞之间,比较了靶向信号(信号肽和跨膜螺旋)周围的核糖体P-位点覆盖率。p-位点的覆盖率与每个mRNA密码子20-40的覆盖率成比例。使用5 nt的滚动平均值来平滑轮廓。给出了分析的mRNAs的绝对数量,中间信号肽和第一次跨膜螺旋长度用垂直虚线表示。ai源数据作为源数据文件提供。

为了解决HDLBP KO翻译效率的差异,我们比较了多组膜结合mRNAs(补充数据5),根据CDS中高密度脂蛋白交联键的数量进行分类。在CDS中具有最大数量的HDLBP交联的mrna中观察到翻译效率的最高下降,这表明HDLBP与膜结合mrna的相互作用促进了翻译(图。5b)但不影响ER mRNA的定位(补充图。5d).我们通过在细胞培养中使用氨基酸脉冲稳定同位素标记(pSILAC)来量化蛋白质合成,从而验证了这些发现50结合亚细胞分级分离(补充数据6).缺乏HDLBP通常导致由膜结合mRNAs编码的蛋白质合成减少(图。5c)并且降低的程度依赖于HDLBP交联信号的水平(图。5d和补充图。5e).因此,HDLBP对于其靶mRNAs的有效蛋白质合成是必需的。由于内质网膜是分泌蛋白翻译的主要场所,我们接下来询问HDLBP是否影响它们的分泌。为此,我们表达了分泌型高斯亚荧光素酶(Gluc)和碱性磷酸酶(SEAP ),并对培养基中的酶活性进行定量。Gluc和SEAP活性在HDLBP KO后显著降低了20-40 %,表明HDLBP缺失减少了两种报告蛋白的分泌(图。5e,f和补充图。5f).

由于HDLBP的减少减少了分泌,我们接下来测试了HDLBP过度表达的影响。为此,我们将FLAG/HA-HDBLP瞬时转染入HEK293和HEK293 HDLBP KO细胞。我们还使用携带HDLBP的piggybac转座子在A549细胞中稳定过表达HDLBP(图。5g).

为了测试对分泌的影响,我们将SEAP报道基因构建体转染到具有不同HDLBP表达水平的HEK293和A549细胞中(图。5h).正如预期的那样,在HEK293和A549细胞中高密度脂蛋白的敲除减少了SEAP的分泌,而在高密度脂蛋白敲除细胞中高密度脂蛋白的过表达挽救了SEAP的分泌,使其恢复到野生型细胞中观察到的水平。有趣的是,将HDLBP重新导入HEK293和A459细胞,分别导致分泌增加约1.15倍和2倍(图。5h)证实了HDLBP表达水平直接影响SEAP分泌的程度。

接下来,我们研究了高密度脂蛋白的缺失是否会影响核糖体在膜结合mRNAs上的位置。为此,我们展示了已知目标信号周围的覆盖范围(图。5i和补充图。5g)并发现缺乏HDLBP导致编码SPs或第一个TM结构域的区域下游的核糖体密度较低。这表明HDLBP有助于核糖体伸长停滞,这是共翻译靶向和新生肽有效易位所必需的。

HDLBP与mRNAs和tRNAs中含CU/UU的密码子交联,解码这些密码子

我们接下来研究了我们的核糖体图谱数据集,以量化野生型和KO型条件下每个密码子的核糖体占用率。虽然我们发现在HDLBP KO后,几个密码子(包括UUC/Phe、UUU/Phe、CUC/Leu和CUU/Leu)平均被核糖体和P-位点和E-位点占据的稍多,但这种增加没有统计学意义。因此,在KO条件下,全球核糖体停滞可能是可测量的,但可能是HDLBP耗竭的间接效应。密码子中标准化HDLBP PAR-CLIP信号的分析(补充图。6a),确定了相同的密码子(UUC/Phe、CUC/Leu和CUU/Leu)是结合度最高的。

此外,我们通过PAR-CLIP富集分析了HDLBP与tRNA的结合,以及每个tRNA交联位置的T-C转换特异性(补充数据7)并观察到4个亮氨酸同型trna在HDLBP结合库的前15个富集trna中(图。6b).它们的交联位点位于可变和D环(图。6c和补充图。6b)并对应于HDLBP mRNA结合基序(UCUUC)。有趣的是,由这些tRNAs解码的密码子在HDLBP缺失的细胞中更容易被占据(图。6a),表明HDLBP tRNA结合可能通过促进tRNA再循环或减少tRNA从核糖体扩散来实现更有效的tRNA解码,如前所述34.

图6: HDLBP与tRNAs交联,解码含CU/UU的密码子。
figure 6

aHDLBP KO与WT中P-位点(顶部)和E-位点密码子(底部)的密码子频率差异。计算四次重复的平均密码子偏移(显示了平均标准偏差)。btRNAs在HDLBP PAR-CLIP中的富集及其结合位点。tRNA中的T-C转换被标准化为总tRNA丰度,并从最高值到最低值排序(从左到右)。对于每个T-C转换,我们显示了其转换特异性(T-C转换与总阅读覆盖率)。描绘了两个PAR-CLIP生物重复SD的平均值。还显示了总log2转化的tRNA丰度和密码子使用(顶部)。c(左)与tRNA Leu-UAG比对的浏览器表示。D-loop和V-region中的T-C转换针对HDLBP PAR-CLIP数据集。第二个轨迹显示总RNA样品的覆盖范围。(右)HDLBP交联尿苷表示二级tRNA结构。

缺乏HDLBP导致较低的增殖和肿瘤形成能力

HDLBP在ER翻译和分泌中的功能可以影响有丝分裂原、生长因子、受体和细胞外基质的产生,从而极大地影响细胞增殖、分化、迁移和侵袭。为了测试这一点,我们在肺腺癌(LUAD)衍生的细胞系A549中建立了CRISPR/Cas9诱导的HDLBP KO。在2D培养的A549细胞中,HDLBP缺失显著降低了粘附生长(40-50 %)(图。7a).同样地,HDLBP KO干扰A549细胞的2D迁移,如划痕迁移分析中伤口闭合严重减少所示(图。7b).由HDLBP结合的TFRC mRNA编码的跨膜糖蛋白CD71的表面表达(图。3h)在HDLBP KO时减少(图。7c和补充图。7a,b).相反,A549细胞中高密度脂蛋白的过度表达导致伤口加速愈合(图。7d).总的来说,这些发现表明HDLBP实质上影响肿瘤细胞的致癌特性。为了在体内测试这一点,用iRFP(红外荧光蛋白)稳定转导亲代和HDLBP KO A549细胞,并且将活细胞皮下(皮下)注射入胸腺(FOXN1女/女)裸鼠来监测肿瘤的起始和生长(图。7e).注射后立即进行iRFP的非侵入性近红外成像,验证了两种细胞群的同质皮下应用(补充图。7c注射后0天)。引人注目的是,高密度脂蛋白缺失严重降低了肿瘤的发生和生长(图。7e和补充图。7c).与在所有八只分析动物中形成肿瘤的亲代细胞相反,HDLBP KO细胞仅在八只动物中的三只中形成可触知的肿瘤(补充图。7c).因此,高密度脂蛋白缺失显著降低了肿瘤体积和最终肿瘤质量(图。7f),说明HDLBP本质上参与了肿瘤的启动和生长。

图7: HDLBP是肿瘤异种移植物生长和形成所必需的。
figure 7

aA549亲代或HDLBP KO细胞的相对融合、生存力和DNA含量。显示了代表性的汇流面罩(左图)。不成双的t-检验用于检验显著性(***p < 0.001). bWT或HDLBP KO细胞的伤口愈合。损伤后对伤口愈合情况监测20小时(右图)。损伤后20小时计算伤口密度(中图)。显示了代表性的汇流面罩(左图)。不成双的t-检验(左)和双向ANOVA(右)用于检验显著性(均***p < 0.001). cWT或HDLBP KO细胞的CD71表面表达。通过流式细胞仪实验测定CD71的平均荧光强度(MFI)。d用强力霉素诱导的HDLBP过表达稳定转染的A549细胞的伤口愈合(见图。5g).损伤后20小时计算伤口密度(右图)。显示了代表性的汇流面罩(左图)。不成双的t-检验用于检验显著性(***p < 0.001). e小鼠注射实验示意图。将WT或HDLBO KO A549细胞注射到无胸腺裸鼠的右侧和左侧。在注射后的21天内,跟踪八只小鼠的肿瘤形成。f肿瘤体积(毫米3)在注射后7、14和21天进行定量(左图)。显示了由KO或WT细胞形成的log2转化的肿瘤体积的箱线图。不成对的双面t-测试用于比较。括号中给出了每组可触及肿瘤的数量。注射后21天对肿瘤重量进行定量(右图)。显示了由KO或WT细胞形成的肿瘤重量(以mg计)的箱线图。不成对的双面t-测试用于比较。在没有肿瘤的情况下,重量标为0。箱形图的上下铰链分别对应于第25和第75个百分点。上须和下须从铰链延伸到最大值或最小值,分别不超过离铰链1.5×四分位范围。箱线图的中线描绘了中值。gHDLBP KO细胞肿瘤中下调和上调mRNAs的基因本体富集分析。调整过的p显示了前六个丰富类别的值。h如HEK293 RNA-seq分级实验中所确定的,比较了膜结合和胞质mrna之间的倍数变化差异(HDLBP KO与WT肿瘤)。使用双侧Wilcoxon秩和检验来检验显著性。ad数据以平均值±标准差表示。ah源数据作为源数据文件提供。

为了确定HDLBP KO如何影响基因表达,在最终肿瘤中通过RNA测序监测RNA丰度(补充图。7d).在缺乏HDLBP的情况下,大量的mRNAs被发现上调(n= 1039)和下调(n= 700),表明HDLBP对基因表达有很大的影响,这可能是由于细胞信号传导和肿瘤-基质串扰显著受损(补充图。7e和补充数据8).引人注目的是,被HDLBP KO减少的mRNAs蛋白产物富含分泌蛋白(如胶原蛋白和基质金属蛋白酶,MMP2),这些蛋白在生物过程中起作用,如“细胞外基质组织”、“细胞粘附”和“组织发育”(图。7g).这些发现支持了这样的观点,即HDLBP影响蛋白质输出、表达和/或转录本编码因子的更新,这些因子主要参与调节肿瘤-基质景观的组成和相互作用。为了评估HDLBP对去调控mrna的直接控制,我们比较了HEK293细胞中根据PAR-CLIP信号分类的mrna亚组在WT和KO异种移植肿瘤之间的倍数变化。我们发现HDLBP的mRNA表达的变化靶向mRNA(补充图。7f)和膜结合mRNAs(图。7h)在缺乏HDLBP的异种移植物中比在非靶或胞质mRNAs中显著降低。虽然HDLBP是否通过调节er相关的翻译来影响mRNA的更新还有待研究,但这些发现表明,除了间接调节基因表达外,HDLBP还可能通过调节ER相关的mRNA翻译来直接影响mRNA的丰度。总之,目前的发现提供了强有力的证据,证明HDLBP是肿瘤进展的重要调节剂,影响分泌因子、受体和细胞外基质成分的表达,参与调节肿瘤的起始和进展。

讨论

在这篇文章中,我们描述了HDLBP在ER翻译环境中的功能。而约80%的膜结合mRNAs被发现是HDLBP的高亲和力底物(图。1e),它们也显示了CDS中的主要结合(图。1c,2b).相比之下,只有约40%的所有胞质mRNAs含有HDLBP结合位点,但显示出明显较低的亲和力,并且更随机地分布在CDS和3’UTRs之间(图。2b).对ER靶向的和细胞溶质的mrna的一级序列的研究显示,HDLBP结合的含铜基序在膜结合的mrna中更常见(图。3a),这也显示了疏水性氨基酸的高密码子频率,例如通常存在于信号肽和跨膜螺旋中的Leu (CUC和CUU)、Ile (AUC)、Phe (UUC)和Val (GUC)51.

虽然先前报道的CHHC/CHYC结合基序35与我们的发现相匹配,我们进一步发现证据表明,在er结合的mRNAs中,长度达12 nt的较长HDLBP结合基序的频率高于较短基序的频率(图。3c,d).因此,HDLBP可能通过利用其不同的序列组成进化为特异性识别膜结合mRNAs。多个KH结构域可能允许HDLBP通过其与长的异质RREs和/或多部分基序的相互作用识别ER结合的mRNA,产生多价的高亲和力结合区域,如对其他RBP所观察到的28,52,53,54。因此,我们对高多价高密度脂蛋白位点进行了定量,发现它们与高结合亲和力相关,长度约为40 nt,平均含有3-4个含UC/CU的四聚体,位置相隔几个核苷酸。这可能反映了HDLBP蛋白结构中的3-4个功能域模块与多个RREs的结合。使用体外结合试验(图。3i),我们证实了这些观察结果,并得出结论,多价相互作用确实导致了高密度脂蛋白对长RNA结合区域的更高亲和力。进一步的研究将提供关于哪些结构域或它们的组合负责长多价位点的识别和含HDLBP的mRNPs的形成的见解。最近鉴定的含C/U重复的分泌基序17支持酵母mRNA中长功能序列的存在,这是分泌编码蛋白所必需的,并且很可能代表HDLBP酵母直系同源物Scp160p的RNA结合位点。

此外,我们报道了HDLBP与ER相关的mRNAs相互作用,并促进它们的翻译,导致合成蛋白的分泌增加(图。5),这与之前的发现一致34,35。因为我们不仅在ER靶向mrna中,而且在没有已知或预测靶向信号的膜定位mrna中发现了高亲和力的HDLBP结合位点(图。1d),HDLBP可能对SRP依赖性和非依赖性mRNAs的有效翻译都有显著贡献8,9,10,11,12。哺乳动物细胞中SRP依赖性和非依赖性mRNAs的分析将有助于未来的研究。

此外,我们发现缺乏HDLBP导致靶向信号周围核糖体延伸停滞减少(图。5g).这一过程是新生肽有效靶向和转运到内质网腔,以及防止错误折叠、聚集和内质网相关降解所必需的55。因此,高密度脂蛋白介导的局部核糖体减速可能促进由高密度脂蛋白结合区编码的蛋白质结构域的靶向、移位和精确折叠。这种可能性得到了检测到的h16和ES6SB 40S HDLBP相互作用的有力支持,它们靠近EEF2和EIF4G2结合位点41并且可以影响核糖体延伸停滞。此外,在7SL RNA区域检测到低亲和力的HDLBP接触,这是延长停滞期间GTP水解延迟和膜靶向活性所必需的56也支持这个观点。最后,我们确定了与HDLBP密切相关的关键伴侣蛋白和伴侣蛋白,支持其在蛋白质折叠中的作用,正如先前对其酵母直系同源物的建议36.

从机制上讲,我们认为HDLBP通过与mRNA和小核糖体亚单位以及其他核糖体相关因子结合而与翻译装置相互作用。高亲和力的mRNA结合有助于伸长停滞的胞质RNC的形成,允许它们有效定位于内质网膜,跨位点转移,和/或使新生肽能够正确折叠。由于HDLBP最有可能与延伸核糖体下游的mRNA结合,它可能通过核糖体碰撞与mRNA隔离,可能通过tRNA和/或核糖体ES6SB依赖机制,这仍有待阐明。我们推测HDLBP仅在最初的翻译过程中与mRNA结合,然后被去除。这一步骤可以使mRNA分子定位于内质网,在内质网折叠机制和聚集质量控制的存在下,可以进行额外的翻译。将来,在翻译的不同阶段,高密度脂蛋白与mRNA、rRNA和tRNA结合的序列应该被阐明。

在缺乏HDLBP的情况下,我们也检测到P-和E-位点的核糖体占用率增加。由于这种增加是适度的,没有统计学意义,这可能是HDLBP KO间接效应的结果。然而,一些研究表明E-位点可能作为核糖体延伸动力学的传感器57E位点的占据可能直接影响翻译的保真度和核糖体的转位58,59这可能是HDLBP促进翻译延伸的另一种可能机制。

总的来说,我们的结果指出了HDLBP在ER翻译中的一般功能。虽然这对每个细胞都很重要,但我们预计这种表型在特化分泌细胞类型(如成纤维细胞、胰腺和免疫细胞)中最为突出。为了支持这一观点,HDLBP mRNA表达,以及可能的HDLBP蛋白水平在分泌细胞中显著升高(补充图。7g),最突出的是成纤维细胞,成纤维细胞是通过产生和重塑细胞外基质来协调细胞外景观的关键。此外,HDLBP失调会引起深远的后果和疾病表型的调节,如病毒复制受损24动脉粥样硬化斑块形成35和自闭症60。最后,本研究的结果强调了在肿瘤发展过程中高密度脂蛋白与肺部肿瘤细胞的显著关系,并表明针对高密度脂蛋白的治疗干预可能代表了一种以前未被认识到的抑制肺部肿瘤生长或其他恶性肿瘤的策略。在未来,HDLBP对肿瘤生物学调节作用的进一步含义需要探索。


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