肺转移灶中内皮细胞的分子重编程 为了研究转移定居过程中内皮细胞的分子变化，我们从静脉注射MDA231-LM2乳腺癌细胞(MDA-MB-231 (MDA231)细胞的高转移衍生物)的小鼠肺中分离出内皮细胞 10 。从具有不同阶段转移的肺中纯化ECs用于转录组研究(扩展数据图。 1a、b ).在癌细胞注射后第1、2或3周对转移结节中内皮标记CD31的分析揭示，尽管早期结节(第1或2周)在血管附近生长，但转移结节中血管的存在主要是在较晚阶段(第3周)观察到的(图。 1a–c ).内皮细胞的数量也与肺中癌细胞的数量相关，表明在生长的转移灶中有活跃的内皮细胞增殖(图。 1d
图1:转录组分析鉴定了肺转移建群期间反应性ECs的特征性变化。 a 免疫荧光图像显示了在静脉注射MDA231-LM2乳腺癌细胞后的指定时间点，小鼠肺中肺ECs (CD31)与转移性乳腺癌细胞(GFP)的关联。比例尺，50 μm。虚线表示转移灶的边缘。 b ，来自的转移结节的量化 a 具有模块内ECs n = 72个结节(第1周)， n = 76个结节(第2周)和 n =对于每个时间点，分析来自四只小鼠的83个结节(第3周)。数据以平均值±标准差表示 c 在第1-3周，MDA231-LM2衍生的肺转移结节的大小。每个肺至少分析16个结节； n =每组4只小鼠。 d ，MDA231-LM2癌细胞(左)和ECs(右)。数据显示意味着标准差； n =每个时间点4只小鼠。 P 用单向方差分析和Dunnett多重比较检验确定数值。 e ，在MDA231-LM2衍生的转移的不同阶段从小鼠肺中分离EC的实验设置，随后进行转录组分析。 f PC分析从健康肺(对照)或具有不同转移阶段的肺(如 e ). g 使用增殖或炎症相关信号对分离的内皮细胞进行GSEA。带标称的签名 P < 0.05 and FDR < 0.25 were considered significant. h ,i ，小提琴情节显示 z 肿瘤血管生成和尖端细胞信号的评分分析 11 ,12 h )或患者不良结果基因簇 13 ,14 i )，根据在指定时间点从转移性肺中分离的内皮细胞的转录谱计算。 P 使用平均值确定数值 z -未配对双尾的每个签名的分数 t -测试； n =每组3个生物重复。 j 显示癌细胞注射后第3周肺ECs中上调的58种分泌蛋白(GSP58)基因表达的热图。截止日志 2 (折叠变化(FC)) > 0.75， P < 0.05, FDRq < 0.25. k ，GSEA图显示了根据无肺转移存活率排序的乳腺癌人肺转移样品中GSP58的富集。NES，标准化浓缩分数。FDR由下式确定 P 通过随机排列测试计算的值。
源数据
为了从有转移的肺中纯化ECs，我们使用荧光激活细胞分选(FACS)来排除表达造血、上皮、成纤维细胞或癌细胞标记物(CD45、CD11b、EpCAM、CD140a/b和绿色荧光蛋白(GFP))的细胞，并选择表达内皮标记物CD31的细胞(图。 1e 和扩展数据图。 1c ).通过表达额外的内皮标记或其他基质细胞的独特标记来确定所选群体的纯度(扩展数据图。 1d ).使用微阵列对分离的内皮细胞进行转录组分析。主成分分析(PCA)揭示了不同时间点基因表达变化的显著模式。在第1周和第2周发生了某些变化，但是在两个时间点之间没有观察到显著的差异；然而，最显著的变化发生在第3周，将这个时间点与其他时间点区分开来(图。 1f ).进一步的分析，如基因集合富集分析(GSEA)、基因本体(GO)术语分析或 z -评分分析显示，在第3周，与细胞增殖或炎症相关的基因信号显著诱导(图。 第一代 扩展数据图。 1e–g 和补充表格 1 ).与这些发现一致的是，血管生成活动 11 ,12 在第3周的ECs中得到促进，并且也观察到了与通透性增加(REACTOME)相关的血管变化(图。 1h 和扩展数据图。 1h ).根据内皮细胞增殖和炎症的变化，这些过程中涉及的转录因子或途径的特定靶标在第3周上调(扩展数据图。 1i 和补充表格 2 ).为了说明这些内皮细胞功能在人类转移瘤中的重要性，我们组装了与增殖或炎症相关的基因，这些基因在转移瘤的内皮细胞中特别上调(补充表 3 和 4 ).我们将这些特异性转移相关的EC信号应用于来自解剖的人类转移瘤的转录组数据集，观察到这两种信号都与伴有肺转移的乳腺癌患者的不良预后相关(扩展数据图。 1j ).此外，基因标记与不良临床结果相关 13 ,14 在第3周在内皮细胞中被诱导，表明内皮细胞活化与转移进展相关(图。 1i ).着眼于细胞间通讯的介质，我们分析了细胞外蛋白( GO:0005576 )在转移相关的ECs中。我们发现分泌蛋白(GSP58)的58个基因发生了显著变化，这些基因在第3周的ECs中被特别诱导(图。 1j 和补充表格 5 ).值得注意的是，GSEA或卡普兰-迈耶分析表明，GSP58在转移瘤中的高表达与乳腺癌患者的低无肺转移生存率相关，这意味着肺内皮细胞可能通过这些分泌因子中的一些促进转移(图。 1k 和扩展数据图。 1k，l
内皮细胞中GSP58的表达在很大程度上不依赖于VEGF信号 考虑到VEGF是内皮细胞生物学和血管生成的关键调节因子，我们研究了转移相关内皮细胞的基因表达变化是否依赖于VEGF。我们用抗VEGF抗体(B20.4.1.1)治疗转移小鼠 15 或同种型IgG和分离的肺ECs用于转录组分析(图。 2a ).肺内皮细胞中特定的VEGF靶基因被抑制，转移肺中的血管生长显著减少，表明VEGF信号传导受到强烈抑制(扩展数据图。 2a，b ).值得注意的是，基因标记与细胞增殖和血管生成有关 16 ,17 在抗VEGF治疗小鼠的肺内皮细胞中也受到抑制(图。 2b–f 和扩展数据图。 2c–e ).然而，尽管VEGF信号和内皮细胞增殖受到抑制，与患者不良预后相关的基因簇并没有受到抗VEGF治疗的影响(图。 2g ).重要的是，炎症反应和GSP58通常也不受抗VEGF的影响，表明这是一种VEGF非依赖性调节(图。 2h，我 ).当我们分析用靶向VEGF受体2的抗体(抗VEGFR2，DC101)治疗的小鼠的肺ECs时，观察到一致的结果(扩展数据图。 2f ).尽管抗VEGFR2治疗抑制了肺ECs中VEGF靶基因的表达以及增殖和血管生成信号，但炎症和不良结果基因簇或GSP58没有受到显著影响(扩展数据图。 2g–m ).这些结果表明，尽管抗VEGF治疗有效地抑制了转移结节内的血管形成，但它并不抑制由脉管系统分泌的与患者不良预后相关的58种因子中的大多数的表达。
图2:在转移相关的内皮细胞中，抗VEGF治疗抑制增殖，但不抑制炎症反应或GSP58信号的诱导。 a ，抗VEGF治疗转移性肺结节小鼠的实验纲要。将MDA231-LM2细胞静脉注射入NSG小鼠，然后用抗VEGF抗体B20.4.1.1 (B20)或对照IgG重复治疗3周。在第3周分离肺内皮细胞，并进行转录组分析。选择通过体内生物发光成像测量的具有相当的肺转移负荷的小鼠进行分析。 b ，抗VEGF治疗抑制转移相关内皮细胞的细胞功能信号(反应蛋白)概述。FDR < 0.05的签名包含在百分比计算中。 c 基因簇的GSEA:细胞周期有丝分裂(反应组)、DNA复制(反应组)、发芽血管生成(MSigDB中的C5收集)和tip细胞标记 12 B20处理后肺内皮细胞与对照IgG的比较。FDR由下式确定 P 通过随机排列测试计算的值。 d ,e ，小提琴情节显示 z -来自与转移相关的肺EC增殖标记的基因分数(补充表 3 ) (d )和肿瘤血管生成起簇 16 e )在来自对照(ctrl)或转移(met)的纯化肺ECs中表达。)-具有指定治疗的小鼠。 f 基于GSEA，与IgG对照相比，B20处理的转移相关内皮细胞中基因标记下调。显示FDR < 0.25的签名。蓝色，与扩散相关的签名；红色，VEGF靶基因的标记；灰色，其他。 g –i 间质不良结局聚类的小提琴图分析 13 g 左)和与预后不良相关的血管生成基因 14 g ，对)；与转移相关的肺EC炎症信号(补充表 4 ) (h )和GSP58( i )在所示条件下以来自小鼠肺的ECs表达。在…里 d ,e 和 g –i , P 数值由平均值确定 z -用Dunnett多重比较试验通过单向ANOVA对签名内的基因评分； n =每组3只小鼠。NS，不显著。
源数据
内皮细胞表达促进转移的分泌因子的基因 为了从GSP58中鉴别出与其他基质细胞相比ECs作为主要细胞来源的候选基因，我们研究了那些在信号中诱导程度最高的基因。选择GSP58中诱导3.5倍或更多的所有VEGF非依赖性基因进行进一步分析，并在从小鼠肺转移瘤中分离的四种不同基质细胞类型中测定它们的表达(图。 3a 和扩展数据图。 3a ).在肺内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞和上皮细胞中的表达分析显示，四个基因——即抑制素亚基βB( Inhbb )，层粘连蛋白亚单位α1( Lama1 )，分泌珠蛋白家族3A成员1( Scgb3a1 )和TNF受体超家族成员11b，也称为骨保护素( 氧基聚明胶 )—与其他细胞类型相比，在ECs中明显表达(图。 3a 和扩展数据图。 3b
图3:反应性内皮细胞产生的分泌因子促进肺转移。 a ，分析从转移性肺分离的不同基质细胞中的内皮小生境候选基因。热图用对数总结了基因的表达 2 FC > 3.5。 Z 从每组三或四只小鼠中分离的不同基质细胞的qPCR分析计算得分。在内皮细胞中高表达的基因用红色标记。BMDC，骨髓来源细胞；纤维。，成纤维细胞；肾上腺素。，上皮细胞。 b 四个内皮小生境候选基因在分离自具有不同乳腺癌细胞系转移的指示小鼠品系的肺内皮细胞中的表达。热图由qPCR分析生成，并 P 由不成对的单尾计算的值 t -测试。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; n =每组3–4只小鼠。 c 四个候选基因表达的相关性分析 CDH5 在乳腺癌患者的转移病灶中(GSE14020)。皮尔逊相关线性回归( r )和双尾 P 显示值； n = 65. d 乳腺癌患者肺转移样品中CD31、SCGB3A1和LAMA1表达的免疫组织化学分析；显示了来自11名患者的分析的两个转移的代表性例子。箭头表示阳性染色的内皮细胞。比例尺，100微米(患者1)和60微米(患者2)。 e ，表达SCGB3A1或LAMA1的肺转移样本的比例。 f –h 肺的转移集群( f )被SUM159乳腺癌细胞( g )和MDA231细胞( h )过表达内皮小生境因子或对照载体。 g ,h 静脉注射SUM159后42天的生物发光图像(左)和标准化光子通量(右) g )和MDA231( h )乳腺癌细胞。S3A1，SCGB3A1。方框用上下四分位数描绘中间值。数据点显示生物复制的值，触须显示最小值和最大值。 g , P 数值通过单尾Mann-Whitney检验进行计算。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001,✝ P = 0.069.控制， n = 20;INHBB， n = 6;LAMA1， n = 8;SCGB3A1， n = 5;OPG， n = 5. h ，控制， n = 19;INHBB， n = 10;LAMA1， n = 4;SCGB3A1， n = 10;OPG； n = 9;四个基因， n = 5. i 以人波形蛋白在小鼠肺中的表达为标志的转移瘤的组织学实例 h 。所示为至少四个独立样本的代表。比例尺，200 μm j ，Kaplan–Meier对er已编译数据集的分析 – 乳腺癌(KM绘图仪)检测四种内皮小生境因子与无复发生存率的关系( n = 347名患者)和总存活率( n = 79名患者)。 P 数值由对数秩检验确定。HR，危险比。
源数据
INHBB是TGF-β家族成员中激活素和抑制素的蛋白质亚单位，其中激活素已被证明可调节伤口愈合、纤维化和癌症 18 LAMA1 编码层粘连蛋白三聚体LN111和LN121的α链，在胚胎发育过程中广泛表达，但在成人组织中更受限制 19 。值得注意的是，LN111是某些基底膜的成分。SCGB3A1是小分泌分子分泌珠蛋白家族的成员，在正常肺中表达，但其功能知之甚少 20 。OPG是TNF受体超家族的一员，通常被认为具有多效性功能，但其最典型的作用是充当TRAIL或RANKL的诱饵受体 21
我们观察到一致的诱导 Inhbb , Lama1 , Scgb3a1 和 氧基聚明胶 在来自两个异种移植模型(MDA231-LM2/SUM159-LM1)和两个肺转移的同系小鼠模型(4T1/E0771)的肺ECs中，证实了ECs中的表达不受抗VEGF治疗的影响(图。 3b 和扩展数据图。 3c，d ).与来自具有肺转移的小鼠的肺ECs相比，这四种候选物在4T1或E0771癌细胞中不显著表达(扩展数据图。 3e ).为了在完整转移过程的背景下研究这些基因，我们分析了来自乳腺自发性转移小鼠肺的内皮细胞，并观察到所有四个候选基因的上调(扩展数据图。 3f，g ).这种上调与转移瘤的生长相关，并且在早期时间点无法检测到，即使原发性肿瘤明显生长。值得注意的是，转移相关内皮细胞因子的诱导不受原发肿瘤切除的影响。 3f，g ).为了检测小生境候选物的蛋白质水平，我们对来自转移性肺的分选的内皮细胞进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶免疫测定(EIA ),并揭示了所有四种蛋白质的显著上调(扩展数据图。 4a、b ).为了确定这些候选小生境与人类转移的相关性，我们分析了乳腺癌患者肺转移的样本。在这些样本中，四个候选基因的表达与内皮标记显著相关 CDH5 (VE-钙粘蛋白)(图。 3c ).我们还使用免疫组织化学在来自11个人转移样本的组织切片上分析了SCGB3A1和LAMA1的表达，并观察到8/11个样本(73%)中SCGB3A1的EC表达和11/11个样本(100%)中LAMA1的EC表达(图。 3d，e 和补充表格 6 ).这鼓励我们研究四个候选基因在转移中的功能，因此我们异位表达了它们 INHBB , LAMA1 , SCGB3A1和OPG 分别注射到人类乳腺癌细胞中，然后通过静脉注射到NSG小鼠体内。我们在SUM159和MDA231癌细胞(分别是SUM159-LM1和MDA231-LM2的亲代细胞系)中表达了这些基因，并观察到所有四个候选基因都单独促进了肺的转移定殖(图。3f–I 和扩展数据图。 4c–e ).此外，四种基因在MDA231癌细胞中的联合表达显示了肺转移生长的附加诱导(图。 3h，我 INHBB , LAMA1 , SCGB3A1 和 氧基聚明胶 确实可以促进转移定殖，且这四种基因共表达可以为癌细胞提供进一步的优势。结果表明，由这四个基因编码的蛋白质是促转移血管小生境的功能成分。
被诊断为转移性复发的乳腺癌患者经常出现能够相互播散的多发性转移，并且已经在肺和肝之间观察到这种器官间播散 22 。这激发了我们分析晚期肺转移小鼠潜在肝转移的兴趣。具有肺转移的小鼠的生物发光分析揭示了肝脏的定居(扩展数据图。 4f ).我们从具有高生物发光的肝脏区域中分离出内皮细胞，并观察到 Inhbb , Lama1 , Scgb3a1 和 氧基聚明胶 在与肝转移相关的内皮细胞中高表达。 第四代移动通信技术 ).重要的是，血管小生境因子的异位表达促进了肝脏的转移。 4h ).这表明这四种小生境成分的功能作用超出了肺转移和其他转移部位，如肝脏。
最后，为了解决血管小生境与临床结果的潜在联系，我们使用雌激素受体(er)阴性乳腺癌样本中四种血管小生境成分的表达进行了Kaplan-Meier分析，并研究了与生存率的潜在联系。在这些样本中，血管小生境因子的表达与不良无复发和总生存率显著相关，表明其在乳腺癌中的潜在作用(图。 3j
INHBB和SCGB3A1诱导乳腺癌细胞的干细胞特性 已经认识到血管龛产生支持某些恶性肿瘤如脑肿瘤的干细胞特性的分泌因子 23 。为了在转移性乳腺癌的背景下解决这一问题，我们研究了来自ECs的条件培养基(CM)刺激癌细胞在超低粘附平板上形成球体的潜力，这是一种促进干细胞属性的方法 24 ,25 。EC-CM显著增强了乳腺癌细胞的球体形成(图。 4a 4b ).考虑到这些结果，我们用重组激活素INHBB的同型二聚体)或重组SCGB3A1刺激SUM159-LM1乳腺癌细胞，这也诱导癌细胞形成球体(图。 4c ).此外，从用短发夹状RNA转导的肺内皮细胞获得的CM INHBB 与对照CM相比，显示出刺激六钩蚴的可能性降低(扩展数据图。 4i，j ).该结果表明INHBB和SCGB3A1在乳腺癌细胞中促进干细胞特性的推定作用。为了进一步探索这种联系，我们对用激活素B或SCGB3A1处理的SUM159乳腺癌细胞进行了转录组分析，并揭示了它们各自的反应特征(图。 4d，e 和补充表格 7 和 8 ).值得注意的是，在激活素B信号中，DNA结合和细胞分化(ID)蛋白抑制因子家族的三个成员(ID1、ID2和ID3)是最高的诱导基因(图。 4d ).这些蛋白质被认为能促进干细胞自我更新和多能性，以前被证明能促进乳腺癌细胞的转移定居 26 ,27
图INHBB同型二聚体、激活素B和SCGB3A1促进乳腺癌细胞的干细胞特性。 a 用来自ST1.6R人肺ECs的CM培养的SUM159-LM1乳腺癌细胞的六球蚴形成。厘米 – , n = 9;厘米 + , n =来自3个独立实验的9个技术重复。比例尺，250 μm b ，分析用含有血管小生境指示因子的HEK293衍生的CM刺激的SUM159-LM1乳腺癌细胞中的六球蚴形成。控制， n = 24;INHBB， n = 12;LAMA1， n = 12;SCGB3A1， n = 12;OPG， n =来自4个独立实验的12个技术重复。 c 用重组激活素B (ActB，50 ng ml)刺激SUM159-LM1中的六钩蚴形成 –1 )或SCGB3A1 (S3A1，1 μg ml –1 ).肌动蛋白 – , n = 8;肌动蛋白 + , n = 8;S3A1 – , n = 9;S3A1 + , n =来自4个(ActB)或3个(S3A1)独立实验的9个技术重复。 a –c , P 数值由比率配对、双尾 t -来自生物学独立实验的测试。方框用上四分位数和下四分位数表示中值，触须表示最小值和最大值。 d ,e 、响应ActB的最高上调基因的热图( d )或S3A1( e ). f ，GSEA装置的示意图，用于分析根据ActB或S3A1信号(ActB-S或S3A1-S)的表达分层的乳腺癌患者的数据集。 g ,h 干细胞相关基因集合在代谢( g )或者，GSE14018( h )数据集。干细胞标记如下所示:A，Lim _乳腺干细胞up；b、Lee _神经嵴干细胞up；c、Oswald _造血干细胞在胶原凝胶中凝固；d、山下_肝癌干细胞up；e，Ivanova _造血干细胞(全部来自C2 MSI gdb保藏中心)。代谢发现中来自三阴性乳腺癌样本的数据集(上限和下限， n = 66)和GSE14018中乳腺癌的肺转移(上限和下限， n = 8)进行了分析。FDR由下式确定 P 通过随机排列测试计算的值。*FDR < 0.25，**FDR < 0.05。 i Kaplan-Meier分析er的无复发生存率 – 根据ActB-S或S3A1-S的表达分层的乳腺癌患者； n = 347名患者。 P 数值由对数秩检验确定。 j 总结了INHBB和SCGB3A1在乳腺癌转移中的作用的发现。
源数据
为了研究临床样本中与激活素B或SCGB3A1信号相关的潜在干细胞表型，我们根据激活素B或SCGB3A1信号的表达对乳腺癌患者(代谢或肺转移样本)的基因表达数据集进行了分层(图。 4f 和补充表格 7 和 8 ).GSEA揭示，具有高活化素B或SCGB3A1介导的基因反应的患者表现出多种干细胞特征的富集(图。 4g，h ).重要的是，Kaplan–Meier分析显示激活素B和SCGB3A1信号都与乳腺癌患者的不良临床结果相关(图。 4i ).总之，这些结果表明INHBB和SCGBA1促进乳腺癌细胞的干细胞特性和侵袭性(图。 4j
OPG和LAMA1支持转移性乳腺癌细胞的生存力 在OPG潜在的TRAIL诱饵受体的作用下 21 我们分析了它在肺转移中的作用。TRAIL在肺微环境中高度表达(图。 5a )并且是转移期间肺中细胞凋亡的重要调节剂 28 。我们通过在OPG水平增加的情况下切割caspase 3的表达，分析了TRAIL诱导的MDA231-LM2乳腺癌细胞凋亡，并观察了OPG介导的对TRAIL的保护作用(图。 5b ).这表明，在转移相关的内皮细胞中诱导的OPG可能保护侵袭性癌细胞免受TRAIL诱导的凋亡。事实上，我们在小鼠中观察到过度表达OPG的转移瘤与对照转移瘤相比凋亡减少(图。 5c ).TRAIL诱导的凋亡由死亡受体4和5 (DR4/5)介导 29 ,30 。为了说明这些受体对肺转移定居的重要性，我们在MDA231乳腺癌细胞中诱导shRNA介导的DR4/5敲低(扩展数据图。 4k )并通过静脉注射到NSG小鼠体内。DR4/5敲除增强了肺的转移定殖(图。 5d )并且在肺结节中观察到较少的凋亡(图。 5e )，表明这种机制在保护肺免受转移定植中起作用。
图5: OPG和LAMA1调节乳腺癌细胞存活。 a 从NSG小鼠分离的不同器官组织中的TRAIL信使RNA水平； n =每组3只小鼠。通过qPCR测定表达。数据是s.e.m .的平均值。 b 左，用TRAIL (50 ng ml)处理的MDA231-LM2细胞中裂解的胱天蛋白酶3表达的免疫印迹分析 –1 )和指定浓度的OPG。正确，定量基于裂解和未裂解的胱天蛋白酶3之间的比率。显示了来自三个独立实验的平均值。采用单向方差分析和Dunnett多重比较检验进行统计分析。 c 对注射了表达OPG的MDA231癌细胞的小鼠的肺转移中裂解的胱天蛋白酶3表达的免疫荧光分析。顶，有代表性的例子；细胞核用DAPI染色。比例尺，100 μm。底部，定量； n = 5(控制)和 n = 3 (OPG)。值是平均值，带有标准误差单位。 P 数值由单尾Mann-Whitney检验确定。 d 用shRNA对照(shControl)或针对死亡受体4和5的shRNA(shdr 4/5，两个独立的发夹)转导的MDA231癌细胞的肺定殖。显示了静脉注射后21天的代表性生物发光图像(顶部)和标准化光子通量(底部); n =每组5只小鼠。方框显示上四分位数和下四分位数的中间值，触须表示最大值和最小值。 P 数值通过单尾Mann-Whitney检验进行计算。 e 切割胱天蛋白酶3分析肺转移 d 。顶，有代表性的例子；DAPI染色的细胞核。比例尺，100 μm。底部，定量； n = 5只小鼠(对照和1号shDR4/5)和 n = 3只小鼠(2号shDR4.5)。数据是s.e.m .的平均值。 P 数值由单尾Mann-Whitney检验确定。 f 在LN111或LN121上接种的乳腺癌细胞中桩蛋白表达的免疫荧光分析。DAPI被用来给细胞核染色。箭头表示粘连处的致密桩蛋白； n = 3.比例尺，20 μm g 分析涂布在LN111或LN121上的乳腺癌细胞的扩散。显示的是在三个独立实验中检测的所有细胞的相对细胞面积，平均值和标准差 h 切割的胱天蛋白酶3在铺在LN111或LN121基质上的乳腺癌细胞中的表达。数据是三个独立实验的平均值。比例尺，100 μm i ,j 整合素β1在层粘连蛋白诱导的细胞铺展和存活中的作用。相对小区面积( i )和裂解的胱天蛋白酶3表达( j )在铺在LN111或LN121基质上的细胞中进行分析，所述基质具有或不具有针对整联蛋白β1的中和抗体(抗int。β1).显示的是所有受检细胞的相对细胞面积的平均值±标准差( i )或与s.e.m .( j )来自三个独立的实验。 P 用Dunnett的单因素方差分析确定数值( g ,h )或Tukey的( i ,j )来自三个独立实验的多重比较测试。** P < 0.01, ***P < 0.001. k 示意图总结了OPG和LAMA1在乳腺癌转移中的功能。
源数据
为了分析LAMA1的功能作用，我们将乳腺癌细胞铺在涂有LN111或LN121的表面上，ln 111或ln 121是唯一含有LAMA1转录的α链的层粘连蛋白三聚体。这导致了病灶粘附的增强，这是基于桩蛋白的表达增加和间断定位，细胞扩散增加(图。 5f，g ).此外，对血清饥饿条件下乳腺癌细胞中裂解的胱天蛋白酶3表达的分析显示，LN111和LN121可以抑制凋亡(图。 5h ).值得注意的是，LN111和LN121诱导的扩散和抗凋亡依赖于乳腺癌细胞表达的粘附受体整合素β1(图。 5i，j ).总之，关于OPG和LAMA1功能的结果表明，它们分别促进保护乳腺癌细胞免受TRAIL诱导的凋亡和粘附介导的存活(图。 5k
血管小生境由转移肺中的巨噬细胞调节 为了确定乳腺癌细胞是否直接诱导血管小生境成分，我们用来自MDA231-LM2癌细胞的CM处理肺内皮细胞，并分析小生境基因的表达。然而，来自癌细胞的CM不诱导ECs中的生态位因子(扩展数据图)。 5a )，表明诱导可能需要另一种细胞类型。鉴于此，我们使用GSEA分析根据GSP58分层的肺转移样本的特性(图。 6a )并观察到表达高GSP58的样品显示出先天免疫细胞的基因标记的富集(图。 6b ).因此，我们检测这些细胞是否可能是血管小生境的诱导物，并选择中性粒细胞和巨噬细胞进行进一步分析。来自活化的巨噬细胞系(RAW264.7)而非中性粒细胞系(HL60)的CM促进了肺ECs中小生境成分的表达(图。 6c 和扩展数据图。 5b ).这表明巨噬细胞可能是转移诱导的内皮细胞变化的中间体。我们对肺转移结节中的F4/80巨噬细胞标志物进行了免疫荧光分析，观察到大量的浸润性巨噬细胞经常位于血管中(图。 6d，e 和扩展数据图。 5c ).为了分析这种巨噬细胞群的身份，我们使用流式细胞术并测定了CD170和CD11b的表达，它们可以区分局部肺泡巨噬细胞(CD170 + CD11b – )和骨髓来源的间质巨噬细胞(CD170 – CD11b + ).我们分析了通过MDA231-LM2(在NSG小鼠中)或4T1(在BALB/c小鼠中)从健康小鼠肺或转移肺中分选的巨噬细胞。这些实验表明，间质巨噬细胞，而不是肺泡巨噬细胞，在转移过程中增加(图。 6f，g 和扩展数据图。 5d，e ).VEGFR1的表达，结合F4/80，也被证明是间质巨噬细胞的标志 31 对转移结节中的VEGFR1、F4/80和CD31的免疫荧光分析表明，在CD31附近发现了VEGFR1和F4/80双阳性巨噬细胞 + 扩展数据图。 5f ).这表明间质巨噬细胞可能是血管周围生态位的诱导物。
图6:肺转移瘤中血管周围巨噬细胞调节内皮小生境。 a ，用于分析根据GSP58分级的人类转移样本的数据集的GSEA设置的示意图。所有肺转移患者(16名患者)均选自GSE14018。 b 表达GSP58的人肺转移瘤细胞功能丰富。细胞功能是基于NES进行排名的。FDR由下式确定 P 通过随机排列测试计算的值。 c ，在用来自原始或活化的巨噬细胞系RAW264.7的CM处理的ECs中的生态位因子的表达 SCGB3A1 )或者五个( INHBB , LAMA1 和 氧基聚明胶 )显示独立实验。统计分析采用比率配对，双尾 t -测试。 d 小鼠肺转移结节中内皮细胞(CD31，白色)、巨噬细胞(F4/80，红色)和MDA231-LM2 (GFP，绿色)的免疫荧光分析。显示的是来自四个独立样本的代表性图像。箭头表示巨噬细胞在血管周围的定位。比例尺，50 μm e 具有浸润的巨噬细胞的结节的定量(百分比)( mac。)或与血管相关的巨噬细胞。 f ,g 通过流式细胞术分析健康小鼠或患有肺转移的小鼠肺中的巨噬细胞亚群。在MDA231-LM2-( f )和4T1介导的( g 3)分别在NSG或BALB/c小鼠中的肺转移； n = 3(控制)， n = 5(转移， f )和 n = 4(转移， g ).显示了带有s.e.m .的含义。 h ，氯膦酸盐的实验装置(clod。)-介导的肺转移小鼠巨噬细胞耗竭，随后对肺ECs进行转录分析。 i 火山图显示巨噬细胞耗竭后肺ECs中基因的差异表达(GSP58以红色突出显示)。 j ，Violin图显示了巨噬细胞去除后，来自转移小鼠肺的ECs中GSP58的表达。 P 用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验确定数值； n =每组3个。 k 在纯化的肺内皮细胞中表达内皮小生境因子 h –j 。用qPCR测定mRNA水平； n = 3只老鼠。图中显示的是平均值和 P 采用Holm–Sidak多重比较测试，通过单向ANOVA计算数值。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ✝ P = 0.086. l 在氯膦酸盐-脂质体处理后，MDA231-LM2细胞在小鼠中的肺定殖。第14天的代表性生物发光(左)和标准化光子通量(右)； n = 5只小鼠(载体和PBS脂质体)和 n = 3只小鼠(氯膦酸盐-脂质体)。方框显示具有上下四分位数的中间值，而触须代表最小值和最大值。 P 数值通过单尾Mann-Whitney检验进行计算。
源数据
为了研究巨噬细胞在内皮细胞活化和转移定居中的功能作用，我们使用氯膦酸盐脂质体(图。 6小时 和扩展数据图。 5g，h ).我们从小鼠中分离出肺内皮细胞，进行转录组分析，并观察到巨噬细胞去除抑制了内皮细胞中GSP58内许多基因的表达，包括 Inhbb , Lama1 , Scgb3a1 和 氧基聚明胶 (图。 6i–k ).有趣的是，尽管EC增殖基因的表达不受巨噬细胞耗竭的影响，但EC炎症反应却被显著抑制(扩展数据图。 5i–m ).这些结果表明，转移相关的巨噬细胞诱导了肺内皮细胞的炎症反应。与异种移植小鼠模型的发现一致，在完全免疫活性的4T1小鼠乳腺肿瘤模型中消除巨噬细胞也抑制了四种小生境基因的表达，表明巨噬细胞是完整免疫系统中血管小生境因子的关键调节因子(扩展数据图。 6a–c ).此外，与体外结果一致，在4T1模型中消除嗜中性粒细胞后，没有观察到小生境因子表达的变化(扩展数据图。 6d–f ).最后，巨噬细胞的减少显著抑制了MDA231-LM2癌细胞在肺中的转移定居(图。 6l ).总之，这些结果表明，在肺转移过程中，血管周围巨噬细胞起着血管生态位的调节作用。
TNC-TLR4激活的巨噬细胞诱导内皮小生境 细胞外基质越来越被认为是癌症进展和转移的重要调节剂 32 ,33 ,34 。TNC是由乳腺癌细胞表达的基质糖蛋白，是肺转移的关键小生境成分和促进剂 35 。在乳腺癌细胞中，TNC表达与基础亚型和间充质表型都相关(扩展数据图。 6克，高 和补充表格 9 ).我们使用免疫荧光分析来探索TNC相对于转移相关巨噬细胞和内皮细胞的定位，并观察到TNC与转移结节中的两种细胞类型共定位(图。 7a ).此外，在乳腺癌患者的转移瘤中，TNC表达——或来自活化巨噬细胞的基因标记的表达 36 —患者样本中GSP58表达相互重叠，表达水平相互关联(图。 7b，c 和扩展数据图。 6i ).这表明TNC、转移相关巨噬细胞和人类转移瘤中血管小生境的激活之间存在联系。有趣的是，以前的研究表明，TNC可以结合并激活不同细胞类型中的TLR4，导致关节炎小鼠模型中的炎症信号 37 。根据这些发现，我们观察到用重组TNC处理的巨噬细胞诱导表达。 Tnf , Il1b、Il6 和 Nos2 作为激活标记物，这被TLR4抑制剂(TLR4i)逆转(图。 7d ).然而，尽管重组TNC可以影响内皮细胞的粘附特性，但它不能直接诱导血管小生境成分的表达(扩展数据图。 6j，k ).此外，乳腺癌细胞中的TNC表达不受EC-CM或重组血管小生境因子治疗的影响(扩展数据图。 6l ).考虑到巨噬细胞对血管生态位的调节，我们假设血管周TNC可能参与了巨噬细胞的激活，从而诱导了转移中的血管生态位成分。为了在体内解决这个问题，我们给NSG小鼠静脉注射了对照或TNC敲除的MDA231-LM2癌细胞(图。 7e 顶部和扩展数据图。 6m ).与之前的研究一致 35 ,38 ，TNC缺乏抑制了乳腺癌细胞的转移定居(图。 7f ).我们使用FACS从具有对照或TNC敲除转移的小鼠中分离出内皮细胞，并通过微阵列测定GSP58的表达(扩展数据图。 6n ).大多数GSP58基因在TNC敲除转移中被抑制(扩展数据图。 60便士 ).此外，从小鼠分离的ECs的定量PCR (qPCR)分析证实，四种小生境因子的表达在转移中以TNC依赖的方式被诱导(图。 7g ).为了进一步研究TNC对巨噬细胞的直接作用和随后内皮细胞生态位的激活，我们将内皮细胞与TNC处理的RAW264.7巨噬细胞共培养，并分析了四种生态位组分的表达。TNC处理的巨噬细胞在共培养的内皮细胞中诱导了小生境因子(扩展数据图。 7a ).鉴于此，我们旨在揭示TNC激活的巨噬细胞的哪些因子负责诱导血管小生境。我们用TNC单独或与TLR4i联合刺激巨噬细胞，并进行转录组分析。五氯苯甲醚显示了TNC诱导的主要变化，TLR4i联合治疗逆转了这些变化(扩展数据图。 7b ).GSEA表明，Toll样受体信号(KEGG)在TNC刺激的巨噬细胞中富集，当包括TLR4i时表现不明显(扩展数据图。 7c ).此外，violin图分析显示了转移相关的巨噬细胞信号的诱导 39 由TNC以依赖于TLR4的方式(扩展数据图。 7d ).与巨噬细胞表型相关的基因特征的进一步研究 40 ,41 表明TNC可以诱导与不同表型相关的变化，如经典炎症巨噬细胞表型(M1)、选择性活化巨噬细胞(M2)和伤口愈合表型(扩展数据图)。 7e–g ).为了解决TNC刺激的巨噬细胞的潜在旁分泌效应，我们分析了分泌蛋白的基因，观察到75种由TNC诱导，其中54种依赖于TLR4(扩展数据图。 7h，我 和补充表格 10 ).为了确定巨噬细胞的TNC诱导因子是否能促进内皮细胞中的小生境成分，我们研究了一组20种这样的细胞因子 Nos2 以TLR4依赖的方式被TNC诱导(图。 7d )，我们还包括了一种NO诱导NONOate作为兴奋剂。在这些因素中，只有非基因上调 INHBB 和 SCGB3A1 而壬二酸和TNF-α都诱导 LAMA1 和 氧基聚明胶 (扩展数据图。 7j ).重要的是，来自小鼠转移结节的ECs显示出对TNF和NO的高反应性(扩展数据图)。 7k，l ).这些结果表明，巨噬细胞产生的NO和TNF可以激活血管小生境。
图7:TNC-TLR4轴促进血管周围巨噬细胞的活化，随后在肺中形成促转移内皮小生境。 a 小鼠肺转移瘤MDA231-LM2中TNC(紫色)、巨噬细胞(F4/80，绿色)和ECs (CD31，蓝色)的免疫荧光分析。箭头表示TNC和巨噬细胞在血管周围共存。虚线表示转移的边缘。显示的是来自四个独立样本的代表性图像。比例尺，50 μm b 根据GSP58的表达，对65例人乳腺癌转移瘤(GSE14020)进行分级聚类。TNC-或经典活化的巨噬细胞标记(CAM-S)-阳性转移用红条表示。 c 乳腺癌患者65个转移样本中指示参数的相关性分析。皮尔逊线性回归 r 双尾的 P 显示值。 d 用重组TNC或TNC和TLR4i (TAK-242)的组合处理6小时的巨噬细胞中指定标记物的表达； n = 3 ( Nos2 )或者 n = 4 ( Tnf , Il1b 和 Il6 )独立实验。显示的是带s.e.m .的平均值 e 的实验大纲，显示了用shRNA对照(shControl)或针对TNC的shRNA(shTNC)转导的MDA231-LM2癌细胞，静脉注射(i.v .)到小鼠中(上图)或MDA231-LM2细胞静脉注射到小鼠中，随后用TLR4i处理(下图)。 f 在注射了shControl或shTNC(两种独立的发夹)转导的乳腺癌细胞的小鼠中，基于生物发光的肺转移； n =每组6只小鼠。 P 通过单尾Mann-Whitney检验计算的值。 g 血管周围生态位因子在肺转移内皮细胞中的表达 f ; n = 4只老鼠。数据是平均值，与s.e.m P 采用Holm–Sidak的多重比较测试，通过单向ANOVA确定数值。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. h 对具有转移灶并用TLR4i治疗的小鼠肺进行生物发光分析。对于MDA231-LM2和对照， n = 10只小鼠；TLR4i， n = 8只小鼠；4T1和控制， n = 8只小鼠；TLR4i， n = 9只老鼠。 P 数值通过单尾Mann-Whitney检验进行计算。 i 在从具有MDA231-LM2转移的肺中分离的内皮细胞中，指示基因的表达 h ; n = 4只小鼠(用载体治疗的对照和转移)和 n = 3只小鼠(用TLR4i治疗的转移)。数据是平均值，与s.e.m P 采用Holm–Sidak的多重比较测试，通过单向ANOVA确定数值。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. j ，原位模型中自发性肺转移的实验概要。将MDA231-LM2癌细胞移植到第四个乳房脂肪垫，并跟踪其生长24天，然后手术切除肿瘤。从第25天开始用TLR4i治疗小鼠。 k 小鼠肺转移 j 。左，离体生物发光；右，转移的量化； n = 6(车辆)和 n = 3 (TLR4i)。 P 数值由单尾Mann-Whitney检验确定。 l 四种小生境因子在从具有转移的小鼠中分离的EC肺中的表达，并且用载体或TLR4i处理，如 j ,k 。数据是从以下来源获得的平均值 n = 6只小鼠(载体)和 n = 3只小鼠(TLR4i)。 P 数值由单尾Mann-Whitney检验确定。* P < 0.05. d ,g ,i ,l 通过qPCR确定表达。 m ,n 拯救实验，其中在TNC敲除的情况下，小生境因子在转移性乳腺癌细胞中异位表达( m )或TLR4i治疗( n )在肺部定植期间； n =每组6只小鼠。 P 数值由单尾Mann-Whitney检验确定。 f ,h ,k ,m ,n ，方框显示具有上下四分位数的中值，触须表示最大值和最小值。
源数据
为了阐明TLR4作为血管小生境调节因子的功能作用，我们用TLR4i和分离的内皮细胞治疗转移小鼠进行分析(图。 7e ，底部)。尽管TLR4i治疗不影响巨噬细胞的募集，但它显著降低了活化(扩展数据图。 8a、b ).重要的是，TLR4的抑制导致了血管小生境成分的下调，并阻碍了肺的转移定居(图。 7h ，左和 7i ).考虑到先天免疫和获得性免疫之间的相互影响，我们研究了TLR4在具有免疫活性的4T1乳腺肿瘤模型中的功能作用。与异种移植模型的结果一致，TLR4i治疗抑制了4T1模型中的转移定居(图。 7h 右)，这些结果在自发性肺转移的原位小鼠模型中得到了关键的再现(扩展数据图。 8c ).尽管TLR4抑制作用没有显著影响乳腺肿瘤的生长，但TLR4i降低了转移结节的大小和数量(扩展数据图。 8d，e ).值得注意的是，原位小鼠模型中的肝脏分析显示TLR4i治疗后显著减少了肝转移(扩展数据图。 8f ).为了从模拟临床环境的模型中提供证据，我们分析了转移进展和四种小生境成分在小鼠内皮细胞中的表达，这些小鼠的原发性肿瘤在转移分析前已经手术切除。在原发性肿瘤切除后，在TNC敲除或TLR4i治疗的转移的情况下进行实验(图。 7j 和扩展数据图。 8g ).TNC敲除和TLR4i治疗都降低了肺转移负担，并抑制了肺ECs中四种小生境成分的表达(图。 7k，l 和扩展数据图。 8h，我 ).最后，我们研究了在没有TNC或TLR4功能的情况下，这四种小生境因子的过度表达是否可以避免巨噬细胞的激活并恢复减少的转移灶。事实上，四种小生境成分的异位表达拯救了肿瘤转移小鼠的TNC敲除和TLR4抑制(图。 7m，n ).总之，这些结果表明了转移中的基质相互作用，其中癌细胞产生激活巨噬细胞的TNC，从而促进促转移血管龛的形成。
联合抑制TLR4和血管内皮生长因子阻止肺转移 我们的发现表明了由VEGF调节的EC基因和由活化的巨噬细胞调节的EC基因之间的区别。为了进一步解决这一问题，我们分析了从转移肺中分离的内皮细胞的转录组变化，并将其与用抗VEGF抗体治疗的小鼠内皮细胞的表达变化进行了比较。来自GSEA的结果表明，巨噬细胞依赖的EC基因诱导与炎症反应和GSP58特别相关，而VEGF依赖的诱导导致刺激增殖(图。 8a 8b ).结果显示，与单一治疗相比，联合抑制TLR4和VEGF提供了更好的抑制转移的功效(图。 8c，d ).考虑到联合治疗对肿瘤诱导的免疫反应的潜在影响，我们分析了T细胞衰竭标记物和调节性T细胞(Tregs)、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和中性粒细胞的存在——在同系小鼠转移模型(4T1模型)中，小鼠用TLR4i和抗VEGF抗体治疗。尽管我们观察到转移瘤中所有这些标记物的诱导，但联合治疗并不影响反应(扩展数据图。 9a–e ).然而，在联合治疗后，我们观察到转移癌细胞的凋亡增加，增殖减少(图。 8e 和扩展数据图。 10a ).我们在原位环境中用TLR4i和抗VEGF抗体治疗小鼠，其中在植入后第22天手术切除乳腺脂肪垫肿瘤，并在第23天开始治疗(扩展数据图。 10b ).联合TLR4i和抗VEGF治疗显著抑制肺转移(扩展数据图。 10c ).值得注意的是，来自代谢研究的发现数据集的分析揭示了VEGF和TLR4信号的表达 42 ,43 在患者样本中与较差的总存活率相关(扩展数据图。 10d ).总之，我们的结果描述了不同的内皮激活特性，其中巨噬细胞介导的炎症诱导血管小生境蛋白的产生，VEGF信号促进内皮细胞增殖(图。 8f ).这些结果为探索TLR4i联合抗VEGF治疗抑制转移瘤血管功能提供了理论基础。
图8: TLR4抑制和抗VEGF治疗针对不同的血管功能，联合治疗进一步阻止肺转移。 a GSP58的GSEA，在来自患有巨噬细胞耗竭的肺转移瘤(氯膦酸盐-脂质体)或用抗VEGF疗法治疗的转移瘤(B20)的小鼠的ECs中表达的炎症或增殖相关信号。 b –d 在具有肺转移的小鼠中抑制TLR4和VEGF。 b 的实验大纲，其中小鼠静脉注射指定的乳腺癌细胞并用TLR4i或B20作为单一治疗或一起作为组合治疗进行治疗。 c ,d 在注射MDA231-LM2的小鼠中肺转移集群的生物发光分析( c )或4T1( d )癌细胞，并按照中所述进行处理 b 。左，代表性的生物发光图像；对，基于生物发光信号的肺转移的量化。MDA231-LM2， n = 11只小鼠；4T1， n = 5只小鼠(单次TLR4i或B20处理)和 n = 4只小鼠(对照或双重治疗)。 P 数值通过单尾Mann-Whitney检验进行计算。 e 通过用TLR4i、B20或两者的组合治疗的转移结节中裂解的胱天蛋白酶3的表达进行凋亡的免疫荧光分析； n =每组5只小鼠。比例尺，50 μm P 数值由单尾Mann-Whitney检验确定。 c –e ，方框显示具有上下四分位数的中值，触须表示最大值和最小值。 f 描述了血管活化的两个调节臂的模型，其中VEGF促进了受TNC-TLR4信号刺激的内皮细胞和巨噬细胞的增殖，促进了内皮细胞的炎症反应和癌细胞利用的血管小生境的促转移因子的分泌。显示了乳腺癌细胞和巨噬细胞之间通过TNC-TLR4轴的相互作用，这导致巨噬细胞活化，随后通过NO和TNF诱导血管周围小生境，产生促转移因子，包括INHBB、OPG、LAMA1和SCGB3A1。INHBB和SCGB3A1在乳腺癌细胞中诱导干细胞特性，而OPG和LAMA1促进癌细胞在转移部位的存活。
源数据
