用于低氧肿瘤光活性治疗的锇-过氧化物络合物

对缺氧和难治性实体肿瘤的有限治疗效果阻碍了光动力疗法的实际应用。在此，我们报告了我们对锇-过氧化物络合物(Os2)，它在黑暗中不活跃，但能释放一个过氧配体O₂^•−即使在没有氧气的情况下，在光照射下也会转化成细胞毒性锇络合物(Os1). Os1在低氧肿瘤中存在或不存在辐射时具有细胞毒性，表现为化疗药物。同时，光激活的Os2诱导活癌细胞内源性1，4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光催化氧化，导致铁下垂，由谷胱甘肽降解、脂质过氧化物积累和谷胱甘肽过氧化物酶4下调介导。体内研究已经证实Os2能有效抑制小鼠实体缺氧肿瘤的生长。提出了用金属基药物治疗低氧肿瘤的有前途的策略。

由细胞异常增殖和血管化引起的实体肿瘤缺氧微环境会极大地损害传统光动力疗法(PDT)的治疗效果¹，这通常需要O₂为了在光敏剂的光活化下产生活性氧(ROS)^{2,3,4,5,6,7,8,9}。最近已经引入了许多创新的方法来解决肿瘤缺氧的问题。一些添加剂，如全氟化碳、人造红细胞和共价有机框架^10,11,12，进位O₂其他的利用肿瘤微环境独特的原位特征来产生O₂。其中就有曹₂和石墨相-氮化碳(gC₃N₄)碳化^13,14或者高H₂O₂MnO在肿瘤细胞中的浓度₂或者H₂O₂分解^15,16或者甚至是由光合细菌产生的光催化氧气¹⁷。然而，这些纳米材料药物仍然不理想，并且有许多可能的副作用¹⁸。此外，体内研究表明，O₂促进恶性细胞的增殖并抑制其凋亡，这些结果不利于PDT¹⁹。因此，提高对低氧肿瘤的光疗效果是必要的。

据报道，一些金属配合物对低氧肿瘤表现出优异的PDT效应^{20,21,22,23,24,25,26}。它们中的大多数不通过传统的用于PDT的II型机制依赖于氧。例如，Sadler等人研究了铱(III)光氧化还原催化可以提供不依赖于氧的作用机制来对抗低氧肿瘤。铱(III)配合物光催化氧化活细胞中重要的辅酶1，4-二肼屈烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH ),产生具有高转换频率的NAD自由基，并在缺氧条件下协同光还原细胞色素C²⁰。Chao等人设计了一种铱(III)配合物，该配合物在缺氧条件下照射后产生游离碳自由基²⁶。此外，光活性化疗(PACT)有可能克服缺氧带来的限制。在PACT中，金属络合物可以以受控的方式被光活化以产生细胞毒性物质。有毒气体，如NO²⁷和一氧化碳²⁸或以配体为中心的细胞毒性物质总是可以通过光活化来释放^29,30,31,32。超氧自由基(O₂^•−)是毒性最大的ROS之一，并且已经被确定为用于癌症治疗的最有用的氧化剂和协同化疗中的佐剂^33,34。在细胞内超氧化物歧化酶的作用下₂^•−可以形成H₂O₂还有O_2.累积的H₂O₂进一步转化为羟基自由基(OH ),具有增强的毒性和反应性，加剧癌细胞的氧化损伤，提高抗癌效果³⁵。不依赖于O的光活性化合物的设计₂但光控释放活性氧在低氧肿瘤治疗中有重要的应用前景。

在这项工作中，我们研究了锇-过氧配合物(Os2)，它的结构在黑暗中很稳定。然而，在用465 nm光进行光活化时，Os2释放O₂^•−即使在严重缺氧的条件下(1% O₂)，并转化为细胞毒性Os1在Cl中⁻含有PBS溶剂(图。1a)，从而在缺氧状态下保持有用的光活化功效。Os1在光和暗下都显示毒性，有助于化疗和PACT的协同作用Os2在光照下。我们还发现辐射Os2诱导由GSH降解、脂质过氧化物积累和GPX4下调介导的明显的铁下垂。此外，Os2可以光催化氧化活癌细胞中的内源性NADH，引发睑下垂。体内研究证实Os2有效抑制小鼠实体缺氧肿瘤的生长。因此，这项工作正在开发一种释放氧气的方法₂^•−用于通过铁下垂机制治疗缺氧肿瘤细胞。

a光介导示意图Os2O的释放₂^•−和Os1. b的紫外-可见吸收光谱Os2(100微米)在PBS溶液(pH = 7.4，1% DMSO)中，光照(465 nm，13 mW/cm²)在298 K。c高效液相色谱法分析Os2(10微米)在PBS溶液(1% DMSO)中，在黑暗中或照射60分钟后。流动相是CH₃CN和水(体积比1:1)。

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光活化性能

锇-过氧配合物的合成Os2是基于我们之前报道的方法³⁶，表征数据可以在支持信息中找到(SI，实验部分和补充图。1–3). Os2在室温(rt)下的黑暗中，在pH = 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中高度稳定(补充图。4).然而，在465 nm光照射下，溶液Os2经历从棕色到浅粉色的渐变(图。1binsets)，这让我们对这种转换进行了详细的研究。对光解产物进行了高分辨率质谱(HRMS)测量，并在以下位置观察到一个主峰m/z= 1175.2351(补充图5).这个离子的质量和同位素分布与Os1。的形成Os1被HPLC分析进一步证实。如图所示。1c新峰的保留时间与独立合成的保留时间一致Os1(补充图6–10，表格S1–S2。关于的合成和表征也可参见SIOs1).此外，辐照60分钟后，转化率为77.45%Os2到Os1证明了Os1是主要的光产物(图。1c)，转化率为0.46 μm ol·L⁻¹部⁻¹基于以下物质在459纳米处的吸光度变化Os2(图。1b和补充图。11).

溶液中的活性氧检测

由于氧的离解₂从金属中心的单位Os2在光照下，我们试图验证O₂单位以超氧阴离子(O₂^•−).我们首先试图检测O₂^•−通过使用非荧光二氢罗丹明123 (DHR123)探针²⁴，它能与O反应₂^•−并在526 nm附近发射强绿色荧光。如图所示。2a，当在465纳米(13毫瓦/厘米²)，的解决方案Os2显示出不断增加的排放，表明O₂^•−。我们还模拟了芬顿反应过程³⁷。当...的时候Os2(15微米)和少量超氧化物歧化酶(SOD)加入到含有铁的PBS溶液中²⁺亚甲蓝(MB)探针(MB，5 μg/mL)在665 nm处的吸光度下降，降解率为70.26%(补充图。12).相反，在对照实验中只使用Os2和Os2+ SOD时，MB的特征紫外-可见吸收带没有发生变化。基于这些发现和已发表的数据，我们提出的机制在图。2f。在SOD酶的作用下，O₂^•−不成比例地产生H₂O₂还有O₂。OH由H产生₂O₂在Fe的作用下²⁺，然后与MB反应，从而减少其吸收。这些发现证实了Os2能产生O₂^•−在光照下。

a监测O的发射光谱₂^•−生成者Os2(10微米)使用DHR123探头(10微米，λ_不包括= 488纳米)。b氧的ESR信号₂^•−在常氧中光照后被DMPO (18 mM)捕获。c的ESR信号¹O₂在常氧光照后被TEMP (8 mM)捕获。dABDA (100微米)的紫外-可见吸收光谱用于监测¹O₂由...产生Os2(20微米)在常氧光照下。e的情节₀-ABDA在378 nm处的λ与照射时间的关系Os1或者Os2在缺氧或常氧状态下(n= 3个独立实验)。误差线代表平均值的标准差。f生成O的示意图₂^•−, ¹O₂哦，通过光激活Os2。光照:465纳米，13毫瓦/厘米²；实验温度:298K；超氧化物歧化酶。

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为了更深入地了解ROS的本质，我们使用5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和(2，2，6，6-四甲基哌啶)氧基作为自旋陷阱进行了电子自旋共振(ESR)测量。具体来说，DMPO被用来诱捕O₂^•−由...产生Os2在465纳米光照射下^37,38,39。在含有DMPO和Os2暴露于光照射下，DMPO-OOH的几个信号峰出现在3480–3540G(图2b)，这就解释了O的产生₂^•−。为了研究Os2生产¹O₂在光照下，我们用温度来测量¹O₂产生^40,41。如图所示。2c，在3480和3530 G之间观察到强度为1:1:1的三线信号Os2将混合溶液在光照下升温。在存在下观察到类似的信号Os1(光的产物Os2).这些ESR结果表明Os2可以产生O₂^•−和¹O₂在光照下。

此外，9，10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)进一步用于检测¹O₂量子产率Os1和Os2在光照下。如图所示。2d和补充图。13随着辐照时间的增加，ABDA在378 nm附近的特征吸收峰逐渐减小。这¹O₂量子产率Os1和Os2通过与Ru(bpy)比较，分别计算为0.039和0.04₃²⁺(补充图13和桌子S3)⁴².

以上实验均在有氧条件下进行。接下来，我们研究了缺氧(缺氧，氮气脱气)条件下ROS的产生。如补充图所示。14，发射光谱显示在存在下增强绿色荧光Os2和DHR123探针。这个结果证明了Os2也会产生O₂^•−缺氧状态下。我们进一步测量了¹O₂缺氧状态下的世代。如补充图所示。15，ABDA在两者面前的吸收Os1和Os2缺氧条件下未能发生明显变化，证实了no¹O₂在缺氧条件下产生。然而，ABDA的吸收率在以下情况下会降低Os2+ SOD。这是由于Os2生产O₂^•−在缺氧的情况下₂^•−不成比例地产生H₂O₂还有O₂在SOD酶的作用下，O₂可用于¹O₂光产物的产生Os1(图。2f).然而，Os1在缺氧条件下不能产生ROS(补充图。15).

我们之前的研究表明Os2在相对苛刻的条件下(80 ℃, K₂哥伦比亚₃纯氧气氛)，并根据实验和理论结果提出了协同双氢转移机理，但催化反应在室温下几乎不进行³⁷。我们进一步验证了Os2在细胞实验之前的细胞环境中。结果表明，在298 K的黑暗中，它在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)细胞培养基中或在具有不同pH值的PBS溶液中高度稳定(补充图。16和17).此外，治疗Os2还原剂(NADH、GSH和Cys)或细胞氧化剂(如H₂O₂过氧化物酶、细胞色素p450)不会导致紫外-可见吸收光谱发生显著变化(补充图。18).补充图19和20进一步证明了Os2不与活性氧反应，例如¹O₂。这些结果表明Os2在黑暗的细胞环境中是稳定的。

辐照下细胞活性氧的产生

我们研究了光诱导活性氧产生的能力Os2在活的HeLa细胞中。使用二氢乙锭(DHE)、羟苯基荧光素(HPF)和单线态氧传感器绿(SOSG)作为探针来监测氧的产生₂^•−，哦还有¹O₂，分别为^37,38。这些探针对各种自由基的检测机制如图所示。3a。共聚焦显微镜显示，当Os2-孵育的HeLa细胞在常氧(20% O₂465纳米，13毫瓦/厘米²1 h)，DHE染色细胞中的荧光信号显著增强(图。3b，c)。这证实了Os2释放O₂^•−在光照下的细胞中。缺氧状态下(1% O₂)，光照后的荧光强度与常氧下获得的相似，表明O₂^•−从...产生Os2与O无关₂。这与O的机理不同₂依赖I型光动力机制。

因为我们知道O₂^•−在细胞内超氧化物歧化酶和铁的存在下能产生·OH²⁺离子³⁷，我们通过HPF染色进一步研究了细胞中OH的产生。共焦成像显示Os2能在常氧或缺氧条件下在HeLa细胞中产生OH(图。3b，c)。此外，我们还比较了¹O₂的产生Os2和光产物Os1通过使用SOSG探测器，发现在缺氧的情况下，Os2在生产上更有优势¹O₂比Os1。结果表明，绿色荧光在Os2经处理的细胞在常氧和低氧下都是强壮的。然而，荧光在Os1低氧条件下处理的细胞比常氧条件下观察到的细胞弱得多(补充图。21).这些结果与图2中的结果一致。2f，表明Os2首先诱导O的释放₂^•−和生产Os1，伴随着O的形成₂(作为氧气来源Os1)和OH通过芬顿反应。最后，¹O₂是由光产物产生的Os1，但很难确定是否Os2也可以生产¹O₂由于其转换为Os1在465纳米的光照下。这些数据都表明Os2可用作低氧肿瘤细胞光活化治疗的有效药物。

体外光毒性

的暗细胞和光细胞毒性Os2和Os1用MTT法测定抗HeLa细胞活性^40,41。如图所示。4和桌子1, Os2在常氧和缺氧条件下具有低暗细胞毒性和高光细胞毒性(图。4a，c)。集成电路₅₀)_黑暗仅用黑暗培养测定的值分别为89.2和> 100微米(表1).集成电路₅₀)_光的值Os2在常氧或低氧条件下通过光照射测定的，分别为1.23和5.86微米。缺氧条件下的光细胞毒性可以用氧的释放来解释₂^•−经过Os2和光照射，接着产生O₂，可由轻质产品使用Os1来产生¹O₂和OH，通过芬顿反应产生更强的毒性。相反，轻质产品(Os1)在常氧和缺氧条件下显示出高的暗细胞毒性和光细胞毒性(图。4b，d)。集成电路₅₀)_黑暗的值Os1在常氧和低氧条件下分别为8.12和9.95微米₅₀)_光常氧和低氧条件下的值分别为1.31和7.51微米(表1).这个结果表明Os1具有高的光细胞毒性和暗细胞毒性，可被视为化疗药物。然而，在缺氧的情况下，由于缺氧，Os1没有显示出明显的光动力效应。的圆周率值Os2(> 18)远高于缺氧下的Os1 (1.3).

不同浓度硝酸甘油处理的HeLa细胞的存活率Os2或者Os1常氧下(20% O₂, a, b)或缺氧(1% O₂, c, d)在黑暗中或光照下。所有细胞生存力数据都是一式四份(n= 4个生物学上独立的样本)。误差线代表平均值的标准差。用双尾Student’s方法计算统计显著性t测试(*p < 0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).培养温度:310 K。光照:465纳米，13毫瓦/厘米²，1 h。

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顺铂和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)用作对照(表1).非常低的暗毒性和光毒性(两者(IC₅₀)_黑暗和(集成电路₅₀)_光> 50微米)在5-ALA药物暴露8小时和40小时恢复(与相同的条件Os2).顺铂具有一定的暗毒性(IC₅₀)_黑暗= 33.22微米)，其光毒性与暗毒性相比不明显。我们进一步测量了细胞摄取Os2或顺铂对HeLa癌细胞的作用(补充图22).结果表明，积累的Os2在细胞中的浓度低于顺铂。这导致较低的暗毒性Os2比顺铂，因此Os2是一种可行的药物，在黑暗中比顺铂能减少毒副作用。然而，光毒性的Os2比顺铂在辐射下的高得多(表1).

钙黄绿素乙酰氧基甲酯(钙黄绿素-AM)或碘化丙锭(PI)染色也用于区分活细胞(绿色)和死细胞(红色)。如补充图所示。23，黑暗集团的Os2在常氧和缺氧时显示强烈的绿色荧光(活细胞)而没有红色荧光(死细胞)，而对照组在黑暗或光照下也没有显示死细胞。相比之下，轻组的Os2显示微弱的绿色荧光和强烈的红色荧光，表明Os2导致光照下细胞大量死亡。

睑下垂机制

据报道，ROS产生的光化学过程可导致癌细胞的铁下垂^6,43,44。这让我们考虑是否Os2会诱发睑下垂。谷胱甘肽与睑下垂密切相关^45,46我们首先发现了Os2来消耗谷胱甘肽。如图所示。5一，b随着光照时间的增加，412 nm处的吸收降低，表明Os2当受到辐射时，会消耗谷胱甘肽。我们测定了细胞中的谷胱甘肽水平Os2，发现辐照组的GSH水平明显低于非辐照组(图。5c).因此，我们得出结论Os2在辐射条件下可以消耗细胞GSH。

a与辐照时间相关的谷胱甘肽(200微米)损耗Os2(20微米)在298 K的蓝光照射下b随着照射时间的增加，412 nm处的吸收降低。c不同处理后细胞内的谷胱甘肽水平。所有实验都是一式三份重复进行(n= 3个生物学上独立的样本，p价值观(p):10微米-0.000025，20微米-0.00065)。dC11-BODIPY探针(30微米，310 K，0.5 h)检测的处理细胞中脂质过氧化物的荧光图像。C11-BODIPY: λ_不包括= 488纳米，λ_全身长的= 570±50纳米。e从中的图像计算的平均荧光强度d。该实验独立重复三次，结果相似，p= 0.000024.f蛋白印迹分析GPX4在HeLa细胞中的作用Os2(20微米，310 K，8 h)进行或不进行光处理。RSL3是阳性对照组。gGPX4的相对表达水平计算自f所有实验都是一式三份重复进行(n= 3个生物学上独立的样本，p= 0.000025).误差线代表平均值的标准差。用双尾Student’s方法计算统计显著性t测试(*p < 0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).h这种光活性抗肿瘤疗法中的铁下垂过程。光照:465纳米，13毫瓦/厘米²。GSH谷胱甘肽，Fer-1铁抑制素-1，GPX4谷胱甘肽过氧化物酶4。

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铁下垂是一种由过度脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡。睑下垂的主要特征是细胞抗氧化能力失活后，含有多不饱和脂肪酸的磷脂在细胞膜上被过氧化，破坏细胞膜，导致睑下垂^47,48,49。抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)以谷胱甘肽依赖的方式特异性催化脂质过氧化物中氧化活性的丧失^50,51，随后对GPX4的抑制诱导了睑下垂症。GSH的消耗可以间接抑制GPX4的表达。我们推测Os2可以进一步抑制GPX4的表达，我们通过对GPX4的western blot分析验证了这一假设。如图所示。5f–g，Os2在黑暗中不能减少GPX4的表达。然而，在光照下，Os2显著降低GPX4的表达，ROS引起的GSH消耗和对GPX4的抑制会进一步导致脂质过氧化物的积累，诱发睑下垂。我们使用C11-BODIPY作为脂质过氧化物探针，用于监测脂质过氧化物的细胞内积累(图。5d，e)。共聚焦显微镜显示，用Os2在暴露于光后显著增强，表明脂质过氧化物的显著积累，这可以被铁抑制素-1(一种铁下垂抑制剂Fer-1)有效抑制。所有上述结果证实Os2诱发睑下垂，如图。5h.

NADH光催化氧化

作为一种辅因子，1，4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)调节细胞线粒体的氧化还原平衡，在调节能量产生中起重要作用。如果NADH被氧化成NAD⁺，它可以破坏整个呼吸链，杀死细胞^19,52,53。我们研究了NADH是否能被Os2在光照射下，可以提供光催化氧化途径来杀死癌细胞。的光催化效率Os2(20微米)向NADH (175微米)的迁移首先由紫外-可见吸收光谱测定。如图所示。6a随着照射时间的增加，339 nm处的吸光度逐渐减小，259 nm处的吸光度逐渐增大。相比之下，非照明的吸收Os2组无明显变化(补充图。24).这表明Os2在光照下能降低NADH的酶活性。我们还计算了NADH氧化转化数(吨)Os2以评估其光催化效率。NADH氧化的TON值Os2在光照射下为3.888，比未照射组高30倍(吨_黑暗= 0.137)(图。6b).同样的，Os1也显示了对NADH类似的光催化氧化作用(补充图。25).

a的反应Os2(20微米)和NADH (175微米)在PBS溶液中，在蓝光照射下，通过298 K下的紫外-可见吸收光谱监测b一吨Os2在黑暗或辐射条件下(n= 3个独立实验，p= 0.0000016).cNADH (3.5 mM)的光催化氧化Os2(0.25毫米)在黑暗或辐射条件下，由以下人员监控¹298 K时的核磁共振波谱。与蓝色三角形相关的峰代表NADH，那些带有红色正方形的峰代表NAD⁺. d经处理的HeLa细胞中的NADH浓度。Os2: 20微米，310 K，8小时。所有的实验都是一式三份重复进行(n= 3个生物学上独立的样本，p= 0.000039).误差线代表平均值的标准差。用双尾Student’s方法计算统计显著性t测试(*p < 0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).e光催化氧化NADH的示意图Os2随后是诱导性睑下垂。光照:465纳米，13毫瓦/厘米²。吨周转数、NADH 1，4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、GSH谷胱甘肽；GSSG氧化型谷胱甘肽，GPX4谷胱甘肽过氧化物酶4，GR谷胱甘肽还原酶。

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NADH的光催化氧化也通过¹核磁共振氢谱₂O/CD₃298 K时的外径(1/3，v/v)。6c，在Os2和NADH照亮的基团，来自NAD的烟酰胺环上的氢的新峰⁺在6.13、8.31、8.55、8.99、9.36和9.58处观察到，但没有新的NAD⁺在未照射组或未照射组中观察到峰值Os2团体。直觉上，这表明Os2可以在光照下氧化NADH，将其转化为NAD⁺。随后，我们使用NAD/NADH-Glo在细胞水平上测量了NADH光催化氧化率^铥方法，这是一种用于检测NAD的生物发光方法⁺还有NADH。如图所示。6d，化学发光强度Os2——轻组被证明低于其他组。这些结果表明Os2可以通过光照射在细胞水平上有效氧化NADH，从而杀死癌细胞。从图中可以看出。6e，NADH不仅可以转化为NAD⁺通过与Os1交互^*(的兴奋状态Os1)，但也可被氧化成NAD⁺由O₂^•−从...发布Os2。NADH的下调间接有助于谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原为谷胱甘肽⁵⁴，导致脂质过氧化物的积累，最终实现协同诱导睑下垂。

体内光活性抗肿瘤疗法

我们通过Os2研究了体内光活化治疗的可行性。由于Os2是一种小分子，并且没有特定的靶向基团，因此可以通过肿瘤内给药(图。7a).如图所示。7b，与其他三组相比，用Os2-light处理的小鼠的肿瘤生长受到抑制。Os2-光组的肿瘤大小在四组中最小(图。7d)，并且Os2-光组的平均肿瘤重量显著低于其他组(图。7c).收集最终治疗后的肿瘤组织用于组织学评估。苏木精-伊红(H&E)染色显示在Os2-光组中肿瘤组织明显破坏，而在其他三组中肿瘤组织未受影响(图。7e).

a体内(荷HeLa肿瘤的Balb/c小鼠)治疗方案示意图。用光(465纳米，13毫瓦/厘米²)静脉注射25 μL含500微米Os2的PBS后60分钟。b治疗后肿瘤生长曲线。误差棒是基于每组五只小鼠的标准误差(SD)。用双尾Student’s方法计算统计显著性t测试，p= 0.0004 (*p < 0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).c各种治疗后第16天小鼠的肿瘤重量。误差棒是基于每组五只小鼠的标准误差(SD)。用双尾Student’s方法计算统计显著性t测试，p= 0.00042 (*p < 0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).d各种处理后代表性小鼠的数码照片。e不同处理后小鼠HeLa肿瘤组织的H&E染色图像。这个实验独立地重复了三次，结果相似。

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为了评价Os2的生物安全性，我们首先分析了静脉注射三倍治疗剂量(2.69毫克/千克)的健康小鼠的主要器官的H&E染色切片⁻¹).结果显示在这些切片中没有明显的组织损伤(补充图。26).我们还使用斑马鱼来测试Os2的生物安全性(补充图。27)与通常用作生物标记的绿色荧光蛋白(GFP)一起将生理过程可视化。在与Os2孵育5天后，斑马鱼的血管明显没有受损，显示出良好的体内生物相容性。