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ASCL1通过重塑前列腺癌染色质景观激活神经元干细胞样谱系编程

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发表时间:2022-04-28 11:36作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

用雄激素受体途径抑制剂(ARPIs)治疗前列腺癌导致出现耐药性肿瘤,其特征是谱系可塑性和向神经内分泌谱系的分化。在这里,我们发现ARPIs诱导了由大规模染色质重塑介导的快速表观遗传改变,以支持干细胞/神经元转录程序的激活。我们发现前神经元转录因子ASCL1基序富含在超可及区域。ASCL1作为谱系可塑性神经元转录程序的驱动因子,支持治疗抗性和神经内分泌表型。靶向ASCL1将神经内分泌谱系切换回腔上皮状态。这种效应通过UHRF1/AMPK轴破坏多梳抑制复合物-2来调节,并改变染色质结构以有利于腔表型。我们的研究提供了对由ASCL1控制的arpi诱导的表观遗传改变的见解,提供了靶向ASCL1以逆转神经内分泌表型、支持腔转化和arpi再成瘾的原理的证明。

介绍

有效的雄激素受体(AR)途径抑制剂(ARPIs),如恩扎卢他胺(ENZ)和阿比特龙(Abi),增加了晚期前列腺癌患者的存活率;1,2然而,阻力最终还是会产生。特别是,一部分肿瘤摆脱了它们的腔特性和对规范ar信号的依赖。这些变体表现出谱系可塑性和神经内分泌分化3,4,5,6,7,8并且被称为治疗诱导的神经内分泌前列腺癌(t-NEPC)。而从头NEPC是罕见的9,10治疗诱导的NEPC的发展占晚期难治性去势抵抗性前列腺癌的20%(CRPC)3,5,11。NEPC的特征是典型AR信号传导的缺失和神经元谱系标记的表达,如嗜铬粒蛋白(CHGA)和突触素(SYP),独特的小细胞形态4,7,12,以及干细胞转录程序13。除了与谱系可塑性表型相关的RB1和TP53的改变14,CRPC和NEPC分享相对相似的基因组景观15,16。CRPC到NEPC的进化伴随着广泛的转录重编程12,15,表明神经内分泌表型的出现可能主要由表观遗传失调驱动。前列腺癌的异质性17,18在当前治疗策略的压力下,为谱系的转变提供了多种驱动因素的可能性。从机制上讲,肿瘤如何控制对治疗反应的变异以及它们如何定义ARPI后的替代细胞命运仍不清楚。

在这项工作中,我们通过描绘全球染色质可及性来研究ENZ治疗后CRPC的表观遗传学景观,以揭示驱动细胞可塑性和神经内分泌谱系承诺的最早因素。我们发现神经元谱系指导转录因子ASCL1的DNA结合基序在ENZ治疗后变得高度可及,并且ASCL1是ENZ诱导的谱系可塑性所必需的。ASCL1表达缺失通过破坏多梳抑制复合物2 (PRC2)和减少支持谱系逆转为腔AR驱动状态的EZH2染色质来改变t-NEPC的表观遗传程序。这种效应归因于p-EZH2-T311通过UHRF1/AMPK轴的增加。

结果

表观遗传可塑性是对激素治疗的反应

尽管有相似的遗传特征,从CRPC到NEPC的转变伴随着广泛的转录重组12,15。这表明染色质景观的重新编程可能在这种谱系可塑性中起着重要作用。为了探索这一前提,我们通过测序(ATACseq)对转座酶可及的染色质进行分析,研究了ENZ治疗后CRPC细胞染色质景观的变化(图。1a).我们观察到,急性ENZ处理(3天)导致2595个区域的染色质可及性改变(图。1b区域II)与10天和未治疗的CRPC相比,在治疗后3天获得可及性。到治疗后10天,在25,538个新的超可及区域中观察到染色质可及性的广泛变化(图。1b区域III ),而2,694个可达到的区域(图1b区域I)仅在未处理的CRPC中可达到(图。1b,c).观察到ENZ处理后,启动子区域的可及性略有增加(图。1d).为了进一步研究受ENZ治疗影响的区域的重要性(对ENZ的反应是开放或关闭的),我们将ATACseq与匹配治疗的RNAseq整合。我们将激活定义为响应ENZ的新可及和表达的基因(描述为到可及峰中心50 kb的距离,表达log2倍变化> 1,<-1)。而在ENZ治疗后失去可及性和表达的基因被定义为被抑制的。我们发现ENZ将染色质可及性从CRPC典型的“AR驱动”转录程序重定向到与细胞可塑性相关的正调控途径。重要的是,我们观察到,与治疗后3天的神经元途径相比,干细胞中涉及的途径高度富集,而在治疗后10天,神经元途径变得更加富集。正如预期的那样,在第3天观察到规范AR转录程序的抑制,在处理后第10天进一步抑制(图。1e和补充图。1a、b).

图1:激素治疗引发表观遗传可塑性。
figure 1

a研究大纲的示意图。b指示16D可达性的热图前列腺癌用恩扎卢他胺(ENZ)治疗0、3或10天(n= 3个生物学上独立的样本)。c来自unique 16D的ATACseq峰值(顶部)平均信号曲线的数量前列腺癌10天ENZ处理区域(底部)。d所有可及峰的基因组注释表示为所有峰的百分比。e基因集合富集分析(GSEA)显示对ENZ处理的转录反应与16D中的获得/损失可及性相关前列腺癌细胞表现为:早期被压抑;后期压抑;提前激活;后期激活。虚线表示错误发现率(FDR)为0.05,p < 0.05, statistical analysis was performed using a hypergeometric test. See also Supplementary Fig. 1. f转录因子(TF)结合基序围绕独特与共享区域中可及染色质,基于差异排序p-价值。每个点代表一个主题。使用累积超几何检验进行统计分析。g16D中定位于ASCL1基序的基因的基因组注释前列腺癌10天ENZ处理,以所有峰的百分比表示。参见补充图。1. h与16D中定位于ASCL1基序的基因相关的途径前列腺癌ENZ治疗10天。虚线表示FDR = 0.05,p < 0.05, statistical analysis was performed using a hypergeometric test. See also Supplementary Fig. 1。源数据作为源数据文件提供。

为了确定响应ARPI的大规模表观遗传重编程的潜在调节因子,我们在ATACseq峰周围的50 bp窗口内进行了转录因子(TF)基序分析,发现雄激素反应元件和糖皮质激素反应元件都是16D中最富集的基序前列腺癌,而神经元谱系TF的共有结合序列(ASCL1、Olig2、NeuroD1和NeuroG2)在ENZ处理的CRPC中富集(图。1f).通过p值排列基序,我们发现ENZ处理后,前神经TF ASCL1的DNA结合基序不成比例地富集在高度可及的染色质区域(图。1f,补充数据2).具体来说,ASCL1是最有利的TF,因为他们的排名从126泰国(Thailand)放置在未处理的细胞中至8泰国(Thailand)3天和4天之后泰国(Thailand)经过10天的ENZ治疗。ASCL1基序在类氖态GEM模型中是高度可及的14与腺癌相比(补充图。1c).在10天ENZ处理的CRPC的独特可及区域中ASCL1基序的基因组分布分析(补充图。1d和补充数据3),揭示了对增强子区域(内含子和基因间)的偏好(图)。第一代和补充图。1e).特别是,与ASCL1的DNA结合基序相关的区域富含与干细胞和神经元谱系编程相关的基因(图。1h和补充图。1f).这些数据表明,ENZ诱导了一个组织良好的染色质动力学,其功能是解锁谱系可塑性,这可能支持治疗抗性。

Enzalutamide介导的染色质重塑支持神经内分泌分化

为了描述ENZ治疗介导的染色质景观的改变是否支持神经元表型,我们比较了ENZ治疗的CRPC (10天)和t-NEPC模型(42天)的染色质可及性分布(ATACseq)ENZR)和从头NEPC细胞系(NCI-H660)。我们发现在ENZ处理的CRPC (10天)中可获得的许多基因组座位在NEPC细胞系中仍然可获得;约75%与42D重叠ENZR而NCI H660(I区)的含量约为40%(图。2a和补充图。2a).这种ENZ诱导的CRPC染色质重塑被发现在NEPC细胞系中是可及的。例如,分析神经内分泌基因的基因组位点CHGANCAM1和干细胞基因SOX2揭示了在ENZ处理后的CRPC细胞和NEPC细胞系中这些基因启动子区域的可及性(补充图。2b).此外,我们观察到NEPC细胞系中染色质的进一步开放,具有明显的可及区域(NEPC细胞系之间共有约28,800个峰)(区域II)(图。2a和补充图。2a).与干细胞和神经元转录网络相关的基因在16D内富集前列腺癌ENZ治疗10天,第42天ENZR和NCI-H660共享区域和NEPC细胞系(图。2b和补充图。2c)具有围绕可及峰富集的ASCL1结合基序(图。2c和补充数据4).

图2:恩扎鲁胺诱导的表观遗传可塑性导致神经元分化。
figure 2

a显示染色质可及性比较的热图16D前列腺癌10天ENZ治疗的神经内分泌前列腺癌的独特可及区域(NEPC)(左)平均信号分布图(右)。b可访问共享区域中的GSEA(顶部)和可访问NEPC(底部)。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。参见补充图。2. cTF结合基序围绕共享可及区域中的可及染色质(左)NEPC的可及性(右)与16D的独特性前列腺癌10天ENZ治疗,基于差异排名p-价值。每个点代表一个主题。使用累积超几何检验进行统计分析。dASCL1 mRNA表达标准化为GAPDH(n= 2个生物学上独立的样本)。eASCL1分数报告为log2FPKM平均值±SD。(16D前列腺癌 n= 3,16D前列腺癌3d ENZn= 1,16D前列腺癌10d ENZn= 1,42DENZR和NCI H660n= 3个生物学上独立的样本。42DENZR和NCI H660p < 0.0001; two-tailed p-值)。fASCL1表达表现为初治和新辅助雄激素剥夺治疗(ADT)/TAX治疗的前列腺肿瘤系列切片中的标准化读数21。每个点代表一个病人。数据显示为平均值±SD,使用双尾不成对t检验评估显著性。p= 0.0135.gASCL1在腺癌和NEPC中的表达报告为log2TPM12, 15同伴。Violin图显示了中位数(中间的实线)、虚线表示的四分位数和四分位数间范围,每个点代表一名患者,使用双尾不成对t检验评估其显著性。(贝尔特兰等人,阿德诺n= 30和NEPCn= 19;和Labrecque等人n= 76和NEPCn= 22名患者)(左)。火山图显示了在Beltran和Labrecque队列中ASCL1的表达和活性12, 15。每个点代表一个基因,突出显示“ASCL1签名”(蓝色)和“ASCL1”(红色)。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析(右)。源数据作为源数据文件提供。

与染色质结构的变化相一致,ASCL1表达在ENZ处理的腺癌细胞系中以时间依赖的方式迅速增加(图。2d),在雄激素剥夺后的LNCaP细胞系中(补充图。2e),以及去势后患者来源的异种移植物(PDX)模型19(补充图2f).ASCL1的表达在NEPC细胞系42D中得以保持ENZR和NCI H660(图2d)并与其结合神经元基因的增加相关(补充图。2g)和转录活性,通过使用ASCL1评分20(图。2e).与ENZ治疗相似,siRNA介导的CRPC AR沉默增加了ASCL1的表达(补充图。2h).证明人类相关性,接受4-6个月新辅助激素治疗的患者21与治疗前组相比,ASCL1表现出高表达(图。2f),这与SYP的高表达相关(补充图。2i)支持我们的体外数据,即ASCL1上调是前列腺癌中AR信号抑制后的早期事件。此外,发现ASCL1表达在NEPC患者肿瘤中增加12,15(图。2g)和在神经内分泌LuCaP PDX模型中与腺癌相比12(补充图2j).在GEM模型中也观察到ASCL1表达和活性的增加14前列腺特异性缺失后RB1TP53从腺癌发展成NE样状态(补充图。2k).基于这些结果,ASCL1可能是在前列腺癌中建立NE谱系身份的重要因素。我们的结果与先前的研究一致,表明诱导多能干细胞(iPS)通过异位ASCL1表达直接重编程为功能神经元22,23.

ASCL1是建立神经元和干细胞样谱系所必需的

为了进一步探索这种转录因子的生物学功能,ASCL1在16D过度表达前列腺癌和RNAseq,首先我们验证了ASCL1表达和活性的上调(补充图。3a)并发现ASCL1诱导干细胞和神经元程序(图。3a).重要的是,ASCL1足以增加NE和CSC标记物(图。3b左图),其用ENZ处理增强(补充图。3c),在肺腺癌中观察到类似的结果(补充图。三维(three dimension的缩写)).ASCL1诱导NCAM1和CD44杂交细胞群和醛脱氢酶(ALDH)活性(图。3b右侧面板)。这些数据表明,ASCL1本身足以诱导细胞可塑性和神经内分泌表型。为了确定ASCL1是否是神经元和干细胞样表型发育所必需的,在16D敲除ASCL1前列腺癌阻止了ENZ诱导的CSC和NE标记的上调(图。3c)以及神经元样形态(补充图。3e),并阻止ENZ介导的NCAM1和CD44的上调(补充图。3f).在C4-2细胞系中观察到类似的结果(补充图。3g).这些数据表明,ASCL1是神经元和干细胞分化所必需的,其功能是使细胞命运偏向神经元和干细胞样谱系,类似于先前在周细胞至神经元重编程中报道的24.

图3: ASCL1是前列腺癌中神经元干细胞样表型的有效调节剂。
figure 3

a16D年的GSEA前列腺癌细胞过度表达(OE) ASCL1。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验(16D)进行统计分析前列腺癌细胞毒性T淋巴细胞n= 3和ASCL1 OEn= 1个生物学上独立的样本)。b神经元和可塑性基因mRNA表达以GAPDH标准化的重复平均值报告(n= 2个生物学上独立的样品)(左)NCAM1和CD44表达报告为重复平均值(n= 2个生物学上独立的样品)(右上)ALDH活性报告为过量表达ASCL1的CRPC中重复(n = 2个生物学上独立的样品)(右下)的平均值。参见补充图。3. c16D前列腺癌用ENZ处理的shASCL1报告为重复平均值(n= 2个生物学上独立的样本)(左)神经元样形态报告为平均值±标准差,在终点评估显著性,(n= 3个生物学上独立的样本;双尾不成对t检验)(右)。d42D中的GSEAENZRshASCL1和NCI-H660 siASCL1。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。e神经元和可塑性基因mRNA表达标准化为GAPDH(左)NCAM1和CD44表达(右上)ALDH活性(右下)NEPC shASCL1报告为平均SD (42DENZR p-ASCL1的值< 0.000001,CHGA = 0.000009,SYP = 0.006,NSE = 0.007,NCAM1 = 0.001,SOX2 = 0.000003,NANOG = 0.00001,OCT4 = 0.00004和NCI-H660p-ASCL1的值< 0.000001,CHGA = 0.000002,SYP = 0.001,NSE < 0.000001,NCAM1 = 0.000004,SOX2 = 0.000006,NANOG = 0.006,OCT4 = 0.01双尾不成对t-测试;n= 3个生物学上独立的样本)。参见补充图。3. f细胞周期阶段比较42DENZRshASCL1与shCTL的百分比平均值(p-G0/G1值= 0.04,S = 0.006,G2/M = 0.3;双尾不成对t检验,n = 3个生物学上独立的样本)。g42D的增殖ENZR(左)shASCL1之后的NCI-H660(右)报告为平均值±标准差,在终点评估显著性(p-42D的值ENZR= 0.003,NCI-H660 = 0.019;双尾不成对t-测试,n = 3个生物学上独立的样本)。参见补充图。3. h42DENZR以克(gr)报告的肿瘤大小(左)肿瘤摄取显示为注射后小鼠发展为肿瘤的百分比(右)以shASCL1对shCTL报告为平均SEM,在终点评估显著性,p= 0.0056,shASCL1n= 5和shControln= 6生物独立动物;双尾不成对t-测试。参见补充图。3。源数据作为源数据文件提供。

为了评估ASCL1在维持神经元表型和可塑性状态中的重要性,ASCL1在42D中沉默ENZR和NCI-H660细胞系。基因组富集分析显示ASCL1表达的缺失抑制了与增殖、干细胞和神经元发育相关的途径(图。三维(three dimension的缩写)).具体来说,ASCL1敲除下调了使用shRNA沉默ASCL1后CSC和NE基因的表达(图。3e),siRNA或者42D的CRISPRENZR和NCI H660(补充图。3h)、表面标记物NCAM1和CD44、ALDH活性(图3e)以及三维(three dimension的缩写)球状体作为干细胞功能特性的一种度量(补充图。3i).这些观察结果通过蛋白质印迹进一步验证(补充图。3j).此外,ASCL1在42D中被敲除ENZR导致G0/G1数量增加约6%(图。3f),以及NEPC细胞系42D的体外细胞增殖能力降低ENZR和使用shRNA的NCI-H660(图3g),CRISPR(补充图。3k),或siRNA(补充图。3l).这些数据与图1中的GSEA一致。三维(three dimension的缩写)显示出“梦靶”和“E2F靶”途径的减少。这种增殖率的降低不是由于凋亡的增加(补充图。3m).减少的增殖在体内转化,其中42DENZR与对照组相比,ASCL1基因敲除的异种移植物生长速度较慢。此外,我们发现ASCL1是肿瘤启动所必需的,通过肿瘤摄取率来测量(图。3h).与对照组相比,在ASCL1敲低的肿瘤中NE基因的表达显著降低(补充图。3n).

ASCL1顺反子富含干细胞和神经元靶标

为了开始解读ASCL1在谱系规划中的作用,我们在NEPC细胞系中使用染色质免疫沉淀测序(ChIPseq)绘制了ASCL1的全基因组占据图。我们在42D中鉴定了18,659和36,031个ASCL1结合的区域ENZR和NCI-H660细胞系(图。4a).正如预期的那样,ASCL1结合主要集中在其典型的E盒结合基序上(图。4b).ASCL1结合区域很大程度上对应于增强子(内含子和基因间)区域(图。4c),与以前在胶质母细胞瘤和正常神经元中的报道一致25,26。我们鉴定了这两种细胞系共有的3205个ASCL1结合基因,正如预期的,途径分析鉴定了ASCL1结合基因参与NEPC细胞系的干细胞和神经元编程(图。4d).ChIPseq基因组基因座的可视化证明了两种CSC基因的直接调控,包括SOX2(据报道在小细胞肺癌(SCLC)中受ASCL1调节27), 纳米格八月四日(用POU5F1编码);和NE基因,包括CHGA, 一氧化氮 (NSE), NCAM1, DLL1(已知ASCL1目标28)(图。4e).进一步支持ASCL1对CSC和NE基因的直接调控,ASCL1敲除后这些基因的表达下调(图。3e补充图。3h和4a).因此,我们试图研究独特的ASCL1顺反子及其与NEPC程序的联系。我们整合了ASCL1顺反子数据和匹配的RNAseq。我们鉴定了与ASCL1结合的增强子区域,在ASCL1敲除后,它们失去了相应的基因表达,随后的途径分析揭示了在这些NEPC增强子区域内ASCL1敲除后干细胞和神经元编程的丧失(图。4f).值得注意的是,这些增强子在16D ascl 1过表达后上调前列腺癌(补充图4b).这些发现表明ASCL1顺反子可能具有解锁谱系可塑性的功能,并进一步证实ASCL1与干细胞和神经元表型发育之间的联系。

图4:针对PRC2靶富集ASCL1顺反子。
figure 4

aNEPC ascl 1结合强度的热图显示为输入的倍数变化,每条水平线代表一个3 kb基因座。在42D中调用了18,659和36,031个峰值ENZR和NCI-H660。bNEPC ascl 1芯片序列中的基序富集。使用累积超几何检验进行统计分析。cNEPC ascl 1结合位置的基因组注释表示为总峰的百分比。d维恩图显示42D中重叠的基因ENZR和NCI-H660(上图)的ASCL1结合基因的GSEA在42DENZR和NCI H660。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。e使用IGV可视化NE和CSC标记的基因组位点,显示ASCL1对输入的相对占用率。f显示42D中增强子区域(定义为基因间和内含子)ASCL1峰百分比的饼图ENZR和NCI-H660细胞系(左)柱状图,显示了ASCL1敲除中增强子注释的上调或下调基因的百分比(右)。g42D中与下调增强子相关的通路ENZRshASCL1和NCI-H660 siASCL1。虚线表示FDR = 0.05,p < 0.05, statistical analysis was performed using a hypergeometric test. See also Supplementary Fig. 4。源数据作为源数据文件提供。

EZH2顺反子重编程需要ASCL1

我们观察到ASCL1在NEPC的表达是异质性的,分为两类(ASCL1高表达和ASCL1低表达)(图。2g).比较ASCL1高表达与ASCL1低表达的途径分析显示,ASCL1高表达的NEPC患者富含调节可塑性和EZH2活性的途径(图。5a).ASCL1和EZH2表达之间的强正相关支持了这些数据(补充图。5a)和活动(图。5b和补充图。5b,c)(R2在Beltran数据集中= 0.375615和R2在Labrecque数据集中= 0.524012, p-值< 0.05)。ENZ在CRPC诱导ASCL1表达,伴随着EZH2活性增加(补充图。5c,d).有趣的是,ASCL1顺反子富含PRC2靶标(图。4d)和ASCL1的缺失降低了NEPC细胞系中的EZH2活性(图。4f,g)。相反,ASCL1在CRPC的过表达导致EZH2活性增加,这是通过组蛋白3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)相关途径的富集来衡量的,这是EZH2活性的替代指标(图。5c和补充图。5e).这些数据在蛋白质水平得到了进一步验证,表明ASCL1过表达增加了H3K27me3,相反,ASCL1的敲除消除了这种组蛋白标记(图。5c;补充图5f).ASCL1对EZH2活性的这种改变并不是前列腺癌独有的,但似乎是ASCL1在肺腺癌中观察到的常见效应(补充图。5c)和SCLC(补充图。5h).EZH2或PRC2亚基SUZ12和EED的表达没有因ASCL1过表达或敲除而改变(图。5c),表明ASCL1改变了EZH2的活性。ASCL1和H3K27me3 ChIPseq重叠显示了40%的重叠,在ASCL1敲除后丢失(图。5d),H3K27me3峰的数量从对照组的43,622个增加到敲除ASCL1的10,336个(补充图。5i).ASCL1和H3K27me3共同结合的区域富含ASCL1基序(补充图。5j).值得注意的是,在同一区域内,TF OCT的DNA结合基序被富集。该区域富含PRC2靶标以及基础/腔表型(图。5g).基因组位点的可视化TMPRSS2ALDH1A3前列腺癌中与腔表型相关的基因29,30,显示ASCL1和H3k27me3在启动子和基因体上共占(补充图。5k).

图5: ASCL1敲低现象复制EZH2抑制。
figure 5

a在Beltran和Labrecque数据集中,ASCL1表达报告为log2TPM平均值±SD12, 15(左)GSEA在ascl 1-高vs ascl 1-低NEPC。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析(右)。bEZH2和ASCL1分数的相关性以z分数表示,每个点代表一个患者肿瘤,p < 0.05, two-tailed unpaired t-test. See also Supplementary Fig. 5. c16D中的路径增益/损失前列腺癌过表达ASCL1。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。dWestern blot显示多梳抑制复合物2 (PRC2)成员的表达及其活性,如在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中H3K27me3表达所测量的,过度表达ASCL1(左)和敲除ASCL1 (shASCL1)后的NEPC(右),肌动蛋白和H3表达用作加载对照(n= 3个生物学上独立的样本)。eChIPseq显示ASCL1和H3K27me3结合强度,报告为输入的倍数变化。f与ASCL1-H3K27me3共结合区相关的通路。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。参见补充图。5. gChIPseq显示EZH2结合强度,报告为输入的倍数变化。h蛋白质印迹显示H3K27me3在42D中ENZRshASCL1和EZH2抑制(EZH2i),肌动蛋白和H3表达用作加载对照(n = 3个生物学上独立的样品)。i在42D中通过免疫共沉淀测量PRC2复合物ENZRshCTL和shASCL1(n= 3个生物学上独立的样本)。j对照中EZH2的核定位与shASCL1或EZH2抑制中的细胞质定位的可视化(EZH2i)、“EZH2”(绿色)、“DAPI”(紫色),比例尺=10微米(n= 3个生物学上独立的样本)。kUHRF1表达和pAMPK-T172在CRPC过度表达ASCL1(左)NEPC shASCL1(右),肌动蛋白用作加载对照(n= 3个生物学上独立的样本)。l前列腺癌和小细胞肺癌细胞系中UHRF1和ASCL1表达的相关性。数据记录为log2FPKM,每个点代表一个细胞系。mUHRF1在前列腺癌患者中的表达报告为log2FPKM平均值±SD,Adenon= 155和NEPC n = 5患者,p < 0.0001; two-tailed unpaired t-test. Source data are provided as a Source Data file.

为了评估ASCL1的缺失如何调节EZH2顺反子,我们在42D中对EZH2进行了ChIPseqENZRASCL1敲除后的细胞系。出乎意料的是,对照和ASCL1沉默条件之间的比较分析揭示了EZH2与染色质结合的显著损失(对照中有36,139个峰,而ASCL1敲除中有293个峰)(图。5h).我们发现ASCL1敲除将H3K27me3降低至与使用GSK126靶向EZH2 (EZH2i)酶活性相当的水平(图。5i).这种H3K27me3的丢失是由于PRC2的破坏,在ASCL1沉默后,与对照组相比,EED以相当低的速率下降(图。5j)类似于用GSK126抑制EZH231。ASCL1敲除诱导EZH2在细胞质中积累(图。5k)及其在苏氨酸311上的磷酸化(pEZH2-T311)(图。5k),已知在EZH2功能和本地化中起重要作用32。据报道T311上的EZH2磷酸化受AMPK调节,我们发现ASCL1敲除增加了AMPK的活性,通过其在T172上的磷酸化来测量(图。5k).有趣的是,最近发现AMPK的活性受核因子UHRF1(一种关键的表观遗传调节因子,连接DNA甲基化和染色质修饰)的控制33)在不同的细胞模型中34。我们发现ASCL1正向调节UHRF1表达(图。5k和补充图。5l)通过在前列腺中结合其启动子的上游35和小细胞肺癌20(补充图5n).NEPC患者中UHRF1和ASCL1的表达显著相关12,在前列腺和小细胞肺癌细胞系以及GEM模型中14(图。5l和补充图。5m).与腺癌相比,UHRF1在NEPC肿瘤中的表达明显更高16(图。5m).我们共同确定了ASCL1调节AMPK的看门人UHRF1来调节EZH2甲基转移酶活性的途径。

ASCL1的缺失启动了从神经元到腔细胞的谱系转换

42D中的ASCL1敲除ENZR导致了与16D中观察到的相似的转录组的变化前列腺癌(图。6a)随着42D中腔基因表达的增加ENZR和敲除ASCL1后的NCI-H660(图。6b).值得注意的是,这些腔基因由ASCL1和EZH2共同结合,并且在42D中启动子区域甲基化ENZR细胞系(补充图。6a).这些数据支持ASCL1敲除重新激活管腔谱系和谱系转化为AR依赖状态的观点。这些数据得到了使用ATACseq的染色质景观分析的支持,其中在42D中ASCL1缺失后观察到广泛的染色质重塑ENZR(对照组有73,603个峰,ASCL1敲除组有24,016个峰)(图。6c,d)。一致的是,染色质浓缩的定量显示在42D敲除ASCL1后染色质致密化增加ENZR(补充图6b).42D之间可达性的比较分析ENZR对照和ASCL1敲除表明ASCL1敲除改变了与CRPC的相似性。在支持中,可访问区域在42DENZR对照,ASCL1敲除和16D前列腺癌(图。6c区域II)在42D中明显更难接近ENZRASCL1敲除和CRPC(图。6c,d)。42D特有的区域ENZR(图。6c区域I)在ENZ处理的CRPC中稍微更容易接近(补充图。6c).模体富集分析确定了包括ASCL1在内的神经元TF的许多DNA结合模体的可及性丧失,而KLF TF是ASCL1沉默后高度可及的TF之一(图。6g).有趣的是,失去可达性的区域(图。6c区域I)与调节干细胞和神经元编程的增强子区域相关,而相反,保持可接近的区域(在42DENZR对照和ASCL1敲除)(图。6c区域II)同样被定位于富含各种生物功能如持家、增殖和规范AR信号传导的启动子和增强子区域(图。6f和g)。这些数据支持ASCL1对维持干细胞/神经元表型所需的染色质结构至关重要。重要的是,来自匹配细胞系的H3K27me3 ChIPseq仅在42D中鉴定出携带H3K27me3组蛋白标记的共有区域ENZR而在16D缺席前列腺癌和42DENZRASCL1敲除(补充图。6d),对应于42D中H3K27me3蛋白水平的增加ENZR与16D相比前列腺癌(补充图6e).有趣的是,我们在这些区域观察到不同的组蛋白甲基化模式(补充图。6f).ASCL1表型拷贝EZH2抑制的敲低导致NE通路的减少和规范AR信号通路的重新激活(图。6小时).这种谱系逆转通过AR结合增加来衡量KLK3(编码前列腺特异性抗原(PSA))增强子,导致PSA的再表达(图。6i和补充图。6g)伴随着NE标记的表达缺失(补充图。6小时),类似于EZH2抑制31。总之,我们已经证明,在t-NEPC中诱导的大规模染色质重塑在ASCL1敲除后丢失,导致谱系向腔型转变,并支持ENZ诱导的神经元表型可以通过靶向ASCL1逆转的观点,至少在谱系可塑性状态下。

图ASCL1的缺失重新激活了管腔谱系。
figure 6

a显示为主成分分析(PCA)的指定细胞系的全局转录组分布图(n= 3个生物学上独立的样本)。bASCL1敲除后NEPC腔标记物的表达报告为对照的倍数变化(数据报告为重复的平均值。42DENZRshCTL和shASCL1n= 3和NCI-H660 CTL和siASCL1n= 1).c42D中可访问区域的热图ENZR对照,shASCL1和16D前列腺癌表示为峰中心周围的3 kb窗口。参见补充图。6. d在42D中确定了73,603个无障碍区域ENZRshASCL1中的控制vs 24,016(左)报告为平均可访问性信号曲线(右)。e对shASCL1中仍然可及的区域与shControl特有的区域进行排序的转录因子基序比较,基于差异进行排序p-价值。使用超几何检验进行统计分析。f基因组注释显示为所有峰的百分比。g与共享可及启动子相关的途径(顶部)独特的丢失增强子(底部)。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。h42D中上调或下调通路的GSEAENZRshASCL1或EZH2抑制(EZH2i)。虚线代表p= 0.05,使用超几何检验进行统计分析。参见补充图。6. i雄激素受体(AR)芯片-PCR显示AR结合到前列腺特异性抗原(PSA)增强子区域(n= 2个生物学上独立的样品)(右)根据GAPDH标准化的PSA mRNA表达(n= 2个生物学上独立的样品) (中间),蛋白质印迹显示PSA的蛋白表达,肌动蛋白作为加载对照(右边)(n= 3个生物学上独立的样本)。源数据作为源数据文件提供。

讨论

下一代雄激素受体途径抑制剂如阿比特龙和恩扎卢胺的应用增加了转移性去势抵抗性前列腺癌患者的存活率1,2。这些药物保持钝化AR信号的能力。然而,长期的AR途径抑制可以改变疾病的原型病程,导致组织学去分化和细胞谱系的改变,包括侵略性治疗诱导的神经内分泌表型3,15,36。重要的是,这些疗法现在被更早地用于患有侵袭性局限性前列腺癌的患者的临床管理37,38。虽然对这些试验的随访仍然有限,但有理由推测,使用强效ARPIs可能会导致治疗诱发的NEPC事件增加。因此,对以谱系可塑性和神经内分泌分化为目标的新疗法的需求是至关重要的。

在这项研究中,我们解剖了早期表观遗传和转录事件调节CRPC到NEPC的反式分化,以响应ARPIs。ENZ治疗后,对CRPC转录组和染色质结构的分析揭示了一个急性的管腔到神经内分泌谱系的转换。特别是,规范AR信号的抑制伴随着干细胞和神经元谱系程序的同步激活。我们确定ASCL1是继ARPIs之后CRPC中最丰富的基序之一,这也在NEPC细胞、GEM模型中观察到MycN上下文中的过度表达PTEN和RB1删除39在转化为神经内分泌的管腔前列腺细胞中真菌学, akita television 秋田电视Bcl2在…情况下RB1TP53删除40。这些数据表明,在CRPC向NEPC进化的早期,替代细胞命运的决定是在染色质水平上决定的,并强调了ARPIs在驱动这一过程中的作用。

我们在此报道ARPIs对染色质的重塑与ASCL1表达和活性的增加相关。在NEPC患者亚组中观察到高水平的ASCL1(图。2f,g;和补充图。2i,j)41,SCLC42和GBM43。ascl 1-低NEPC可以由其他神经元转录因子驱动,如NeuroD1、YAP1或POU2F3,类似于在SCLC中观察到的情况39,44,45,46基于ASCL1在正常神经元发育期间诱导快速神经发生的观察47,48胶质母细胞瘤干细胞中神经元分化25和肺癌中的神经内分泌分化49并诱导前列腺癌中的NE标记50,51,我们发现ASCL1通过直接调节神经元和干细胞程序诱导神经内分泌表型。值得注意的是,我们发现ASCL1结合PRC2靶点并调节EZH2活性。从机制上来说,ASCL1通过直接转录调节AMPK看门人UHRF1,独立于AMPK上游激酶模型介导AMPK失活34。UHRF1直接结合AMPK并募集磷酸酶PP2A复合物来触发AMPK T172去磷酸化34;因此,稳定PRC2复合物并增加H3K27三甲基化。相反,ASCL1敲低抑制EZH2活性。这些导致染色质景观转变回CRPC样状态,并允许神经内分泌转化为腔谱系。这些数据表明ASCL1和EZH2可能代表了一个有助于谱系可塑性和治疗抗性的分子通道。为了支持这一概念,NEPC报告了高水平的EZH214,52它的表达是ARPIs后获得谱系可塑性和神经内分泌分化所必需的31.

ASCL1在促进和维持神经元干细胞命运中起着核心作用。我们发现ASCL1的缺失通过调节全基因组染色质重塑将细胞谱系转变为腔状态。近年来,许多临床研究集中于靶向前列腺癌中的表观遗传因子,包括EZH2,结合激素治疗53。我们的工作为靶向谱系可塑性神经内分泌样肿瘤中的转录因子ASCL1提供了基础,以诱导与靶向EZH2所设想的相似的下游效应,并提供了在临床中见到的高度可塑性ar阳性t-NEPC中的原理证明3患者可能受益于靶向ASCL1或EZH2,以将神经内分泌表型逆转为替代谱系,并使肿瘤重新依赖ARPIs。

最后,我们报告了前神经元转录因子ASCL1在调节染色质动力学中的作用,通过编制早期染色质事件和决定神经元干细胞样谱系定型的调节网络来支持可塑性谱系。在治疗抗性中,ASCL1的高可塑性状态抑制逆转了向上皮-腔的谱系转换,提供了靶向这些高侵袭性肿瘤的潜力。类似于NEPC,胶质母细胞瘤和小细胞肺癌的一个子集被定义为ASCL1的高表达。这项工作提供了对ASCL1功能和依赖性的迫切需要的见解,共同提名ASCL1作为真正的临床靶点。


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