转移性小细胞肺癌和患者衍生模型中神经内分泌转录状态的异质性

最近在细胞系和有限数量的原发性肿瘤中提出了由关键转录调节因子的表达定义的小细胞肺癌(SCLC)的分子亚型。转移性小细胞肺癌中神经内分泌(ne)亚型的临床和生物学意义，以及它们在患者肿瘤内部和之间以及在患者衍生模型中的变化程度尚不清楚。我们综合了一系列转移部位的小细胞肺癌的组织学、转录组、外显子组和治疗结果，揭示了肿瘤内和肿瘤间NE分化的复杂异质性。转录组分析证实了先前描述的亚型，基于ASCL1, NEUROD1, POU2F3, YAP1，以及ATOH1表达，并揭示了一种具有混合NE和非NE表型的临床亚型，以化疗耐药和极差的结果为标志。新肿瘤更有可能RB1, 等级，和染色质修饰基因突变，上调DNA损伤反应基因，并更有可能对复制应激靶向治疗作出反应。相比之下，如果患者的肿瘤是非NE型，则患者优先受益于免疫疗法。在患者衍生的模型系统中，转录表型强烈偏向NE状态，这一观察结果在配对的患者匹配肿瘤和异种移植物中得到证实。我们提供了一个统一转移性小细胞肺癌转录组和基因组维度的框架。患者肿瘤和模型系统之间转录多样性的显著差异可能对新型治疗药物的开发有影响。

形态相似的癌症通常具有明显不同的临床特征，对治疗的反应也各不相同，并有一系列的结果。肿瘤基因组图谱已导致以前未识别的癌症亚型的识别，反映了癌症的生物学和发育起源。基于分子亚型的治疗大大改变了一些癌症患者的护理，特别是包括死亡率显著下降的非小细胞肺癌(NSCLC)¹。然而，在其他癌症如小细胞肺癌(SCLC)中，分子亚型的识别仍然是一个难以实现的目标。SCLC是一种非常致命的恶性肿瘤，仅在美国就占所有肺癌的13%,每年新发病例超过30，000例^1,2。在缺乏临床相关分子亚群的情况下，小细胞肺癌缺乏有效的靶向治疗，并被视为一种同质疾病，采用一刀切的方法。

对临床小细胞肺癌样本中分子亚型的有限了解与几十年来在小细胞肺癌模型中已经认识到的相当大的肿瘤间形态学和免疫组织化学异质性形成对比³。最近提出了这种异质性的一致分子解释，根据谱系决定转录因子的相对表达将SCLC分为高和低神经内分泌亚型⁴。虽然一致的命名法为SCLC的分类提供了一个重要的起点，但仍然存在几个关键问题。一个主要的未回答的问题是所提出的亚型——使用人类和鼠SCLC细胞系和有限数量的原发肿瘤样本定义——是否能够对代表大多数SCLC病例的转移性肿瘤进行稳健分类。这很重要，因为大多数小细胞肺癌在诊断时已经转移到胸腔外⁵并且只有大约5%的病例在早期被诊断并接受切除⁶。其他悬而未决的问题包括分子亚型和临床特征之间的关系，肿瘤间和肿瘤内异质性的程度，亚型之间的可塑性，以及亚型是否产生特定的治疗脆弱性。此外，我们对患者衍生模型准确概括患者亚型分布的程度了解有限。对提出的亚型进行临床验证的一个主要障碍是用于全面分子分析的高质量肿瘤的有限可用性。小细胞肺癌通常使用细针穿刺进行诊断，复发时的活检并不标准。由于快速的癌症进展和患者共病，研究活检很难获得。突显这一挑战的是，尽管小细胞肺癌是一种预后极差的难治性癌症，但它没有出现在大规模测序工作中，如癌症基因组图谱(TCGA)。

在这里，我们评估了一系列转移部位的小细胞肺癌活检，并试图确定分子特征对小细胞肺癌表型的影响，提供了100个小细胞肿瘤的基础资源，整合了组织学、转录组、外显子组、治疗反应和结果。我们的分析提供了转移性小细胞肺癌分子亚类的一致描述，揭示了肿瘤内和肿瘤间的异质性，并确定了一个以化疗耐药为特征的亚型，具有临床意义。我们还确定了ne分化暴露出的潜在治疗弱点，这些弱点可用于临床评估，以优化患者结果，并使前瞻性亚型特异性临床试验合理化。

病人

我们通过匹配正常DNA的全外显子组测序(WES)、RNA测序(RNA-seq)和免疫组织化学(IHC)评估了72例患者(包括62例小细胞肺癌患者和10例肺外小细胞癌患者)活检获得的100例小细胞神经内分泌癌(SCNC)(补充表1，图。1a和补充图。1).EP sccs——侵袭性神经内分泌肿瘤，在靶向治疗的选择性压力下重新出现或由于谱系可塑性而出现⁷–包含在聚合的转录和表观遗传程序中^8,9，以及与小细胞肺癌组织学和临床课程的相似性¹⁰。肿瘤样本——88例小细胞肺癌和12例食管上皮癌——接受了中心组织病理学检查，证实了小细胞癌和神经内分泌标记物的表达(补充表2).

a总结患者和活检特征的饼图。b10基因的热图¹⁶(上图)，50基因¹⁵(中图)和70基因(下图)¹⁷神经内分泌信号。50个基因信号来自匹配的正常肾上腺皮质和髓质之间的差异表达基因，25个基因分别与神经内分泌分化正相关和负相关。70基因和10基因信号来自具有小细胞或神经内分泌特征的耐药性前列腺癌。热图上方显示了从50个基因签名和组织学中得出的神经内分泌评分和亚型(ne或非NE)。c三种神经内分泌信号之间的皮尔逊相关性。r平方值和P-显示值(P < 2.2e-16). dBalanis等人将100个SCNC肿瘤投影到PCA上。⁸，以评估神经内分泌分化的程度(箭头所示的轨迹)。eNE和非NE亚型的H&E染色小细胞肺癌的代表性显微照片。黑条代表50微米(独立重复观察两次)。fINSM1的IHC染色的代表性图像(独立重复观察两次)。gINSM1 mRNA水平与INSM1 H评分之间的Spearman相关性(n= 20个肿瘤)。h50基因神经内分泌信号评分与INSM1 H评分之间的Spearman相关性(n= 20个肿瘤)。所有的测试都是双尾的。缩写:NE神经内分泌分化；小细胞肺癌；肺外小细胞癌；M值的TMM修整平均值；绘制的每百万个片段中每千个外显子碱基的FPKM片段；苏木精和曙红；NEPC神经内分泌前列腺癌；CRPC去势抵抗性前列腺癌；PRAD前列腺腺癌；LUAD肺腺癌；PCA主成分分析；NA未评估。

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诊断时患者的平均年龄为62岁(范围:29-86岁)。54名(75%)患者被诊断为广泛期疾病。所有患者均接受一线铂类化疗，并且在大多数情况下(44/72，61.1%)肿瘤对铂类耐药，即一线化疗后90天内复发。大多数患者参加了免疫疗法和DNA损伤反应靶向药物的临床试验(64/72，88.9%)^11,12,13,14复发时。从诊断到肿瘤取样的中位时间为8个月(范围:0-47)，之前接受了两种全身治疗的中位时间(范围:1-6)。大多数肿瘤在复发时获得(82/100)，15个肿瘤在诊断时获得，2个在尸检时获得，包括91个转移瘤和9个原发瘤。48例(66.7%)患者有单一肿瘤，11例(15.3%)患者有连续肿瘤，活检间隔的中位时间为41天(范围:3-645天)。8名(11.1%)患者在同一时间点采集了多个肿瘤样本。肿瘤部位包括肝脏(29%)、淋巴结(24%)和肺(16%)。补充表中提供了详细的患者临床特征3.

干细胞间神经内分泌分化的异质性

虽然小细胞肺癌是由神经内分泌分化定义的，但小细胞肺癌的一个子集的特征是神经内分泌标记物的表达减少或缺乏³。使用以前发表的神经内分泌活动的基因标记(补充表4)^15,16,17，SCNCs分布在神经内分泌基因表达的连续体中，主要有两类；一个较大的组由神经内分泌基因(ne)的高表达定义，一个较小的组由NE基因(非NE)的低表达定义(图。1b).值得注意的是，尽管基因组之间几乎没有重叠(补充图。2)，不同签名的表达彼此强烈相关(图。1c).我们使用50个基因签名，并应用单一样本基因集合富集分析(ssGSEA)将每个肿瘤标注为ne或非ne。分数范围从1到1，正分数和负分数分别表示神经内分泌分化和非神经内分泌分化——较低的负分数提供了神经内分泌分化缺乏的更多信心¹⁵。使用这种方法，大多数肿瘤被分类为NE (65/100，65%)，包括67% (59/88)的小细胞肺癌和50% (6/12)的食管鳞癌。在全球水平上，将RNA-seq数据投影到无监督的主成分分析(PCA)上⁸揭示了NE和非NE肿瘤之间的明显聚类(图。1d).ne肿瘤强烈趋向于神经内分泌前列腺癌，而非NE肿瘤在从腺癌到小细胞癌的转分化轨迹上接近肺腺癌。SCLC和EPSCC聚集在一起，强调了肿瘤类型之间的相似性(补充图。3).

NE和非NE肿瘤表现出的形态学特征使人想起分别具有经典和变异特征的SCLC细胞系¹⁸。NE肿瘤主要由核质比高的小细胞、分布于整个细胞核的细颗粒染色质和不明显的核仁组成。非NE肿瘤具有相对较大的细胞，中等数量的嗜酸性细胞质，一个或多个明显的核仁，以及核仁周围清晰的开放染色质构型(图。1e).INSM1的核表达，一种调节全球神经内分泌基因表达的超级增强子相关转录因子¹⁹，与正相关INSM1基因表达和神经内分泌评分(图。1f–h).神经内分泌分化的膜糖蛋白标志&突触素和嗜铬粒素²⁰，也更频繁地在NE肿瘤中表达(补充图。4).这些发现共同揭示了不同的神经内分泌信号将SCNCs分类为不同的ne和非NE表型的稳健性，肿瘤之间的神经内分泌特征具有显著的异质性。

SCNC神经内分泌分化的瘤内异质性

尽管SCLC模型显示了转录异质性NE和非NE细胞群的证据^21,22,23,24由于缺少活检标本，转移性小细胞肺癌患者肿瘤内异质性的程度知之甚少。我们试图量化个体肿瘤中神经内分泌细胞的丰度。总体而言，CIBERSORT预测的神经内分泌细胞的相对比例²⁵与由50个基因签名确定的分组一致¹⁵(图。2a).然而，在NE和非NE肿瘤中，NE和非NE细胞在每个肿瘤中的预测比例存在显著差异，分别为45-100%和48-100%。在一些病例中，在具有典型特征的细胞背景中，变异样肿瘤细胞的形态学异质性是明显的(图。2b).当SCLC亚型特异性基因标记^26,27在每个肿瘤中记录不同的亚型比例(补充图。5).

aCIBERSORT分析²⁵在按ne亚型分组的100个肿瘤中的50个基因特征中(左堆积条形图)。SCNC NE亚型中NE和非NE细胞的相对比例(右方框图) (n= 100个肿瘤；数据表示为平均值SEM)。双尾学生-t测试，****P= 2.07e-20。b具有异质性形态特征的NE亚型H&E染色小细胞癌的代表性显微照片图像(观察独立重复两次)。c基于CIBERSORT去卷积，来自当前队列和先前描述的81个早期肿瘤队列的84个复发和转移肿瘤的瘤内NE细胞比例³⁰，32 PDX，120 CDX^22,28模型和39个永生化细胞系^33,34。kruskal-Wallis检验，随后是Dunn多重比较检验和BH校正，****P < 0.0001 (ranging from P= 2.13e-26至2.08e-07)，*P= 0.023.dCIBERSORT分析²⁵在六个患者匹配的肿瘤活检(T)和异种移植肿瘤(P)中的50个基因签名。e基于CIBERSORT去卷积法的6例PDX和相应供体患者肿瘤中NE细胞的比例。成对的t-测试，P= 0.048 (f)方框图显示了四种转录因子在NE和非NE肿瘤中的mRNA水平。双尾Mann-Whitney U检验，****P < 0.0001 (ranging from P= 2.53e-09至4.56e-05)，**P= 0.00103，ns，不显著(n= 72名患者)。g72名患者中四种转录因子的无监督等级聚类生成的热图。热图上方显示了来自50个基因签名的神经内分泌评分和ne状态，以及来自聚类和组织学的分子亚型。h使用四种转录因子表达的监督PCA。每个点代表一个按转录组分类着色的患者。所有的测试都是双尾的。所有箱线图表明四分位数范围(IQR)，中间线对应于中位数，上下须代表1.5*IQR (Q3 + 1.5*IQR或Q1-1.5 * IQR)范围内的观察值。缩写:NE神经内分泌分化；M值的TMM修整平均值；绘制的每百万个片段中每千个外显子碱基的FPKM片段；主成分分析。PDX病人提供的异种移植物；CDX CTC衍生的异种移植物。

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SCLC组织标本的缺乏导致来自活检和循环肿瘤细胞(CTC)的细胞系和小鼠模型被用于研究SCLC生物学^21,22,28,29。据报道，活检和CTC衍生的异种移植物(PDX和CDX)模型捕捉了患者肿瘤的突变景观和功能特征，但这些模型是否概括了患者肿瘤的瘤内异质性尚不清楚。我们试图了解我们队列中异质性的大小，并比较患者肿瘤和模型系统的肿瘤内异质性。与早期未接受治疗的小细胞肺癌相比，我们队列中转移性和复发性肿瘤的NE细胞比例相对较低³⁰(NE细胞比例中位数:分别为58.0%和64.8%；图。2c，补充图。S6a)，表明随着肿瘤进展神经内分泌分化降低³¹和化疗³²。相反，pdx、cdx^22,28、和细胞系^33,34具有明显高于患者肿瘤的NE细胞比例(CDX、PDX/CDX细胞系中NE成分的中值比例:94.5%对93.0%对89.0%；图。2c，补充图。6a).因此，患者肿瘤的神经内分泌评分显著低于模型系统的评分(补充图。6b)，富含NE肿瘤(补充图。6c).为了进一步研究PDX模型和患者肿瘤之间神经内分泌分化的异质性，我们从复发时接受肿瘤活检的小细胞肺癌患者中建立了PDX模型，并在第一次传代时对患者匹配的肿瘤活检和异种移植肿瘤进行了RNA-seq(补充表5).值得注意的是，PDX肿瘤显示出较高比例的NE细胞(图。2d，e)和神经内分泌评分(补充图。6d)，与相应的患者肿瘤进行比较。值得注意的是，肿瘤纯度与神经内分泌评分呈正相关，这表明肿瘤微环境(TME)的缺乏可能是在PDX肿瘤中观察到的神经内分泌评分高于患者肿瘤的部分原因(补充图。7a，b).

在治疗过程中的多个时间点获得的同一肿瘤和纵向肿瘤的切片具有相似的神经内分泌评分和ne/非NE细胞的估计比例(补充图。7c–e)，表明肿瘤内表型的整体稳定性。不同活检部位的肿瘤差异最明显，表明肿瘤间的异质性。值得注意的是，该队列中的连续活检样本大部分是以紧密的间隔获得的，只有4/11的病例是间隔超过2个月获得的。这些发现共同揭示了个体肿瘤内神经内分泌特征的显著异质性，以及患者肿瘤和模型系统之间转录多样性的显著差异。

神经内分泌异质性和转录调节因子的表达

最近提出的共识命名法根据谱系定义转录因子ASCL1、NEUROD1、POU2F3和YAP1(分别为SCLC-A、-N、-P和-Y)的表达对SCLC进行分类⁴。我们发现更高表达的ASCL1和NEUROD1在分类为NE的肿瘤中，与这些转录因子在调节神经元和神经内分泌分化中的重要作用一致³⁵(图。2f).的表达YAP1在非NE分化的肿瘤中，由Hippo信号通路调节的转录因子更高³⁶，类似于Hippo通路的其他组成部分(补充图。8a). POU2F3簇细胞身份的主要调节者³⁷在一名患者的两个非NE肿瘤中上调，并表达多簇细胞谱系标记，包括艾薇儿和IGF1R(补充图8a).

基于四种亚型定义转录因子表达的无监督等级聚类(图。2g，补充图。8b)确定了三大类，分别对应于SCNC-A(类1)、SCNC-N(类2)和SCNC-Y/-P(类3)。通过转录因子表达进行的肿瘤分类与基于神经内分泌信号的分类密切相关(88.9%与Cohen的kappa值0.73一致)。此外，19/24 (79%)来自同一患者的活检被分配到同一组(补充图。8b，c).少数有差异的病例要么四个基因的表达相当，要么四个基因共表达。ASCL1和YAP1如前所述³⁸。考虑到50个基因的信号可能对噪声更强，当聚类与ne亚型不一致时，使用表征具有最大相对总体表达的亚型的转录因子的表达对肿瘤进行重新分类。因此，大多数肿瘤被归类为SCNC-A型(n= 30，41.7%)，其次是SCNC-Y(n= 21，29.2%)，SCNC-N(n= 20，27.8%)和SCNC-P(n= 1, 1.4%).ASCL1经常与NEUROD1，而的表情POU2F3如前所述，与其他转录因子相互排斥^4,22,38。四个基因表达的监督PCA揭示了与不同分子亚型相关的三个簇，进一步支持了将SCNCs分型到这些分子类别中(图。2h，补充图。8d).分类为SCNC-N和Y的三种肿瘤显示出高表达ATOH1和它的下游目标POU4F3(补充图9a).差异表达的基因ATOH1-高肿瘤富含与毛细胞和机械感受器分化相关的途径^22,39(补充图9b，c).

为了进一步表征亚型的不同转录特征，我们评估了SCNC-A、-N和-Y肿瘤中前2000个差异表达的基因。监督的五氯苯甲醚显示了与每个分子亚型相关的三个不同的簇(补充图。10a).我们从第一和第二主成分(补充数据)的前500个贡献者中创建了三个亚型特异性基因签名1).有趣的是，NEUROD1和ASCL1是影响PC2的主要基因之一。YAP1预计不会对PC1产生如此大的影响。然而，Hippo信号通路的另一个核心部分，LATS2激酶，直接磷酸化YAP1，和TGFBR2，其下游信号显示与Hippo信号通路相互作用^40,41，是PC1的前10大负面因素之一。亚型特异性基因列表的无监督分析揭示了三个主要的簇，与三个转录因子的表达一致(补充图。10b).我们还观察到了与先前发表的基因组的重叠^27,31,35,42，进一步支持亚型定义的转录特征。总的来说，这些结果证明了通过谱系限定转录因子的表达对转移性SCNCs进行了强有力的分层。

与神经内分泌分化相关的转录程序

转录因子作为分子开关调节细胞类型或谱系特异性靶基因的表达。我们研究了亚型决定转录因子的表达是否与特定的转录谱相关，这有助于肿瘤间和肿瘤内的异质性。真菌学旁系同源物在小细胞肺癌中经常被激活，单个旁系同源物以相互排斥的方式过度表达³⁰。作为…的目标ASCL1，MYCL在SCLC-A中高度表达，并且是其发育所必需的³⁵. 真菌学另一方面是一个目标NEUROD1并驱动非NE表型^22,35,43。我们发现MYCL在SCNC-A的NE肿瘤中表达上调，而高水平的真菌学在SCNC-Y的非NE肿瘤中观察到。3a，b).在以下方面没有区别MYCNNE和非NE肿瘤之间的表达，但在SCNC-N肿瘤中表达明显升高。

a, b, e, f箱线图显示NE和非NE肿瘤或SCNC分子亚型中的mRNA水平，用于(a, b)的真菌学基因家族和(e, f)Notch信号通路。双尾曼恩-惠特尼U-测试，****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05, ns, not significant (n= 72名患者)。cCIBERSORT分析²⁵在MYC驱动的肿瘤向非ne表型转变的不同时间点产生的基因标记中³¹，在按分子亚型分组的72名患者中。d每个SCNC分子亚型中早期、中期/晚期和晚期肿瘤表型的相对比例的箱线图。双尾曼恩-惠特尼U-使用BH调整进行测试，****P < 0.0001, *P < 0.05 (n= 72名患者)。g50个基因签名评分与ssGSEA确定的上皮间质转化(EMT)评分之间的Pearson相关性⁴⁹。皮尔逊的R值和P-显示值。h与SCNC转录组亚型、MYC和Notch信号相关的12个选定基因的基因表达数据的监督PCA。每个点代表一个按转录组分类着色的患者。灰色箭头对应五氯苯甲醚的负载量。所有的测试都是双尾的。所有箱线图表明四分位数范围(IQR)，中间线对应于中位数，上下须代表1.5*IQR (Q3 + 1.5*IQR或Q1-1.5 * IQR)范围内的观察值。缩写:NE神经内分泌分化；M值的TMM修整平均值；绘制的每百万个片段中每千个外显子碱基的FPKM片段；PCA主成分分析；上皮间质转化；单一样本基因集合富集分析。

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鉴于最近发现MYC在驱动SCLC从NE到非NE命运的时间演变中的作用^31,44我们试图根据MYC驱动的肿瘤进展来评估肿瘤内的异质性。使用在ne到非NE肿瘤转变过程中表达的基因标记³¹，预测肿瘤具有处于MYC驱动进展的不同阶段的细胞(图。3c).SCNC-A和SCNC-N亚型具有显著更高比例的NE高早期时间点特征，而非NE晚期时间点特征在MYC高SCNC-Y亚型中显著富集(图。三维（three dimension的缩写）).对连续切片的分析揭示了肿瘤间相似的时间进程基因表达特征，表明在给定时间肿瘤内的同质性。连续活组织检查和不同部位的活组织检查显示，转化中的细胞比例存在更多差异(补充图。10c).有趣的是，与早期未经治疗的小细胞肺癌相比³⁰该群组中的转移性和复发性肿瘤具有较低比例的中晚期时间点标记和显著较高比例的晚期时间点标记(补充图。10d).

Notch信号的激活促进了MYC驱动的SCLC从NE到非NE状态的时间转移^24,31。几个被鉴定为MYC靶的Notch通路基因被差异调节，与肿瘤中的MYC表达一致³¹(补充图11a).在NE亚型中，NOTCH转录物(NOTCH1，2，3)和NOTCH靶RE1沉默转录因子(REST)下调(图。3e、f).相反，NOTCH抑制配体DLL1和DLL3在SCNC-A亚型的NE肿瘤中显著上调，这与它们是ASCL1的靶点一致^24,45。与Notch信号促进上皮间质转化(EMT)一致⁴⁶，非NE肿瘤表现出间质标记物波形蛋白(VIM)和转化生长因子β(TGF-β)的高表达，后者是EMT的诱导物和神经内分泌肿瘤的负性调节因子ASCL1^47,48。相比之下，上皮标记E-钙粘蛋白(CDH2)和EpCAM在NE肿瘤中上调(补充图。11b)，以及更高的EMT签名分数⁴⁹与较低的神经内分泌评分相关(图。3g).值得注意的是，我们观察到两种癌症相关成纤维细胞(CAF)亚群特异性信号的富集⁵⁰(炎性，iCAFs和肌纤维母细胞，myCAFs)，与CAFs在癌细胞中促进EMT的作用一致⁵¹(补充图11c).

为了进一步证实小细胞肺癌分子亚型与ne和非NE肿瘤间显著差异表达的每个基因之间的联系，我们进行了PCA分析(图。3h).与我们之前的结果一致，PCA显示了ASCL1随着MYCL，DLL1，-3, CDH2和分子, NEUROD1随着MYCN，以及YAP1/POU2F3随着MYC，NOTCH1，-2, -3, 休息, 精力，以及TGFB1。总之，这些分析证明了单个肿瘤内的异质性，每个肿瘤包含一种以上SCLC亚型和不同发育阶段的细胞，同时由显性转录程序驱动。

与神经内分泌分化相关的生物学特征

接下来，我们试图了解小细胞肺癌亚型的关键生物学特征，这可能反过来揭示亚型特异性的脆弱性。DNA复制应激被认为是小细胞肺癌的标志，几乎所有小细胞肺癌的活性化疗药物都是DNA损伤剂⁵²。与非NE肿瘤相比，NE肿瘤表现出癌细胞应对增加的复制速率所必需的基因的显著上调(TOP2A, MCM3)，并防止复制应激诱导的DNA损伤，包括那些与DNA损伤相关的反应(CHEK1，-2，TP53BP1，TOPBP1)、细胞周期进程(CDC25A，-B，-C，CDK1，-2，AURKA，-B，CDK1，-2，PLK1，CCNB1，-2，CCNA2)，以及DNA修复(PARP1, -2, PRKDC rad 51的BRCA1)(图。4a，S11d)。因此，复制应激反应的信号⁵³和细胞周期⁵⁴，与神经内分泌评分呈正相关(图。4b，补充图。12a). EZH2其编码组蛋白甲基转移酶，促进染色质浓缩和转录沉默，在ne肿瘤中高度表达。先前的研究已经注意到EZH2通过以下途径获得对化疗的耐药性SLFN11噪声抑制^55,56。我们发现在以下方面没有区别SLFN11NE和非NE肿瘤之间的表达(补充图。11d).

a100个肿瘤中25个DDR和14个免疫基因的热图。从50个基因信号中得出的神经内分泌评分和ne状态显示在顶部。b, c50个基因签名分数和(b)复制应激反应分数⁵³或者(c)抗原加工和呈递机制(APM)签名分数⁶³。皮尔逊的R值和P-显示数值。NE和非NE肿瘤之间的特征分数分布的方框图显示在每个图的右侧。双尾曼恩-惠特尼U-测试，****P= 3.79e-07，* * * *P= 0.0004 (n= 72名患者)。d热图与NE和非NE肿瘤之间差异调节的前1000条通路的Pearson相关性和平均连锁聚类。与NEv2相关的通路在热图上用紫色方块突出显示(e2)神经内分泌评分和来自BioCarta、Hallmark、KEGG、PID和Reactome的选定途径基因组之间的相关性分布。fNEv2样肿瘤和其他肿瘤中四种异生素代谢和药物转运途径的NES箱线图。双尾曼恩-惠特尼U-测试，****P < 0.0001 (ranging from P= 1.72e-07至1.43e-06)(n= 72名患者)。所有的测试都是双尾的。所有箱线图表明四分位数范围(IQR)，中间线对应于中位数，上下须代表1.5*IQR (Q3 + 1.5*IQR或Q1-1.5 * IQR)范围内的观察值。缩写:NE神经内分泌分化；M值的TMM修整平均值；绘制的每百万个片段中每千个外显子碱基的FPKM片段；DDR DNA损伤反应；单样本基因组富集分析；NES标准化浓缩分数。

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免疫检查点抑制剂(ICI)现在是小细胞肺癌患者标准治疗的一部分，在一小部分患者中观察到益处^57,58,59。对免疫环境的评估确定了几种免疫相关基因在非ne肿瘤中的较高表达，包括与抗原呈递相关的基因(B2M, 水平线性排列（同horizontal linear ray）基因)、IFN-γ信号传导(IFIT1, -2, -3, 跨膜蛋白)、细胞毒性T细胞活性和适应性免疫抗性(CD8A，-B, CD4，CD274)(图。4a，补充图。S11e).相应地，与免疫细胞浸润相关的基因标记^60,61，IFN-γ信号⁶²和抗原呈递⁶³与神经内分泌评分呈负相关(图。4c，补充图。12a).基于ssGSEA的肿瘤浸润免疫细胞综合分析⁶⁰和CIBERSORT^25,64相对于ne肿瘤，在非NE肿瘤中显示了几种免疫细胞群的富集²⁵，包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、T细胞和树突细胞(补充图。12a–c)，与之前的研究一致^65,66。CD3 IHC染色证实了较高的T细胞浸润(补充图。12d).

为了深入了解神经内分泌亚型潜在的生物学途径，我们检测了ne和非NE SCNC之间不同富集的基因组(图。4d).与细胞周期、增殖和DNA修复相关的基因在ne肿瘤中富集，表明这些肿瘤具有复制应激表型，而免疫反应、代谢和细胞粘附基因组在非NE肿瘤中富集(图。4e).基因本体论(GO)对亚型特异性转录信号的分析一致地揭示了SCNC-N肿瘤中DNA破坏反应和细胞周期相关基因的富集，以及SCNC-Y肿瘤中炎症和免疫反应相关基因的富集(补充数据2).非NE肿瘤中最显著丰富的代谢途径包括脂质代谢、烟酸盐和烟酰胺代谢(补充数据3).最近报道了KEGG精氨酸和脯氨酸代谢途径，其在MYC驱动的SCLC中的作用⁶⁷，在非NE肿瘤中也显著富集(补充图。12e).MYC也显示调节小细胞肺癌中嘌呤生物合成和核糖体生物合成^68,69然而，相关的KEGG途径在两种肿瘤亚型中同样丰富。

该分析还揭示了一组具有混合NE和非NE表型的肿瘤(11/72，15.3%)，显著富集了异生素代谢和药物转运基因(图。4d，f)，使人想起在SCLC细胞系中描述的神经内分泌变体(NEv2，也称为SCLC-A2)亚型⁴²。NEv2样肿瘤更可能来源于肝转移(9/11，81.8%)，与其他活检部位相比，肝转移的NEv2样评分明显更高(补充图。12f).为了排除活检部位可能的混杂影响，我们比较了肝活检和其他转移部位的肿瘤。在肝源性肿瘤中特异性上调的90条通路中，没有一条与NEv2样通路重叠(补充表6).总的来说，这些分析定义了东北和非东北SCNC特有的生物过程。NE和非NE基因混合表达的NEv2样肿瘤亚群可能代表一种过渡性的高可塑性细胞状态⁷⁰，这可能预示着耐药性和预后不良。

与神经内分泌分化相关的基因组改变

我们接下来试图评估NE和非NE肿瘤的基因组改变。对34例小细胞肺癌(包括27例小细胞肺癌和7例食管鳞癌)进行WES补充图1).肿瘤突变负荷(TMB)在NE肿瘤中显著较高(图。5a).与烟草诱变在小细胞肺癌中的主要作用一致，大多数肿瘤具有吸烟特征(SB4，5和29)⁷¹。NE和非NE肿瘤之间的突变特征没有显著差异(图。5b).体细胞改变和/或拷贝数丢失TP53和RB1经常被观察到(TP53 27/34, 79.4%; RB126/34，76.5%)(图。5c)，频率较高的有RB1NE肿瘤与非NE肿瘤相比的变化(20/22，90.9%对6/12，50.3%，P= 0.013，如前所述³⁶。符合失去等级促进神经内分泌分化的功能，NOTCH1仅在NE肿瘤中观察到突变(4/22，18.2% NE对0/12，0%非NE)。与非NE肿瘤相比，NE肿瘤中染色质修饰基因的改变更为频繁(分别为14/22，63.6%对1/12，8.3%，NE对非NE肿瘤，P费希尔精确检验= 0.003)。的增益或放大MYCL在NE肿瘤中也更常见(13/22，54.5%对1/12，8.3%，P费希尔精确检验= 0.0011)。这些分析共同揭示了神经内分泌亚型之间的相对基因组同质性，但有明显的例外RB1, 等级, MYCL和染色质修饰剂。

NE的基因组特征(n= 22)和非NE(n= 12)肿瘤。a34例患者的TMB柱状图。双尾曼恩-惠特尼U-测试，**P= 0.0021.b突变签名比例⁷¹. c神经内分泌状态(ne对非NE)、50基因签名分数、组织学(SCLC对EPSCC)和吸烟状态(以前/现在对从不)。顶部热图显示基因突变TP53, RB1, 等级旁系同源词和染色质修饰词⁹⁰。热图右侧的条形图显示了NE肿瘤与非NE肿瘤的突变频率。底部热图显示副本数量变更TP53, RB1和MYC旁系同源基因。箱线图表示四分位数范围(IQR)，中间线对应于中位数，上下须代表1.5*IQR (Q3 + 1.5*IQR或Q1-1.5 * IQR)范围内的观察值。缩写:NE神经内分泌分化；TMB总突变负担；癌症中体细胞突变的目录；小细胞肺癌；肺外小细胞癌。

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NE亚型的治疗反应和生存率

尽管一些研究表明SCLC亚型可能具有独特的治疗弱点，但这些研究主要基于临床前模型，并研究了对单一基因、途径或药物的依赖性^{37,43,67,68,72,73,74}。我们利用转录组数据和详细的临床注释来研究潜在的亚型特异性治疗漏洞。所有患者接受以铂类为基础的化疗作为他们的一线治疗。我们队列中的大多数患者(64/72，88.9%)在复发时接受ICI单一疗法或联合多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的治疗^12,14、或共济失调毛细血管扩张和rad3相关(ATR)抑制剂加拓扑替康^11,13。五名患者依次接受两种组合。只有在研究治疗前进行组织取样的患者(60/72，83.3%)被纳入亚组分析。

临床特征无显著差异(补充表1)或NE和非NE肿瘤患者之间的生存期(中位OS，13.7比14.3个月；HR，1.28；95%置信区间，0.75–2.17)(图。6a).接受ICI治疗的患者的PFS明显短于接受ATR抑制剂治疗的患者(中位PFS，1.7比2.8个月；HR，1.85；95%置信区间，1.06–3.23，对数秩p-值= 0.03)(补充图。13a，b).在接受ICI治疗的患者中，与NE肿瘤患者相比，非NE肿瘤患者获得了更大的临床益处(30.8%比7.1%；卡方检验，P= 0.046)(图。6b).与最近观察到的Notch激活、非NE分化和肿瘤免疫的联系一致¹⁴，从免疫治疗中获得临床益处的患者的肿瘤往往比那些没有临床益处的患者具有更高的Notch途径基因表达(补充图。13c).与免疫疗法相比，接受ATR抑制剂治疗的NE肿瘤患者具有更高的总体反应和临床获益(ORR: 33.3%比7.1%；卡方检验，P= 0.027，临床受益率:46.7%对7.1%；卡方检验，P= 0.0024)(图。6b，补充图。13d).与ATR抑制相比，接受免疫治疗的NE肿瘤患者的PFS明显更短，OS也有缩短的趋势(中位PFS，1.5比2.8个月；HR，2.37；95%可信区间为1.19–4.70；对数秩p-值= 0.012，图6c；中位OS，2.9个月对6.2个月；HR，1.65；95%置信区间，0.85–3.23；对数秩p-值= 0.14，补充图13e).多变量分析显示，研究治疗是唯一与PFS显著相关的变量(图。6d).在对年龄、性别、吸烟、诊断阶段、铂敏感性和全身治疗次数进行调整后，NE肿瘤患者在免疫治疗方面比ATR抑制更有可能取得进展(HR，2.87；95%置信区间，1.1–7.5；P= 0.031).

aNE和非NE表型肿瘤患者自诊断之日起OS的Kaplan-Meier曲线。b根据NE亚型分类，从ATR抑制和免疫治疗中获得临床益处的患者比例。双尾卡方检验，**P= 0.0024, *P= 0.0464.c用ATR抑制剂和免疫疗法治疗的患者的PFS Kaplan-Meier曲线(按亚型分类)。dNE肿瘤患者PFS的单变量和多变量Cox比例风险回归分析。eNEv2样亚型和其他类型患者自诊断之日起OS的Kaplan-Meier曲线。人力资源和p-显示通过对数秩检验得出的值。P-用粗体标记的值表示统计显著性。缩写:NE神经内分泌分化；OS总体存活率；HR危险比；CI置信区间；心房共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关抑制剂；ICI免疫检查点抑制剂；无进展生存期。

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重要的是，与队列中的其他患者相比，NEv2样肿瘤患者的OS明显较差(9.8个月对15.0个月；HR，2.45；95%可信区间为1.25–4.79；对数秩p-值= 0.0072)(图。6e).在调整了包括诊断时的年龄和阶段、性别和铂敏感性(HR，2.32；95%可信区间为1.16–4.65；P= 0.018)(补充图。13f).与其他亚型相比，NEv2样亚型更有可能具有较高比例的铂类耐药肿瘤(9/11，81.8%对35/61，57.4%)和肝转移(11/11，100%对16/61，26.2%)，这是小细胞肺癌预后不良的独立预测因子(补充图)。13g，高).此外，患有NEv2样亚型肿瘤的五名患者中没有一名对ATR抑制有反应(补充图。13i)，这些患者的PFS较短(2.3个月对3.8个月；HR，2.69；95%可信区间为1.77–9.39；补充图13j)和显著更短的OS (2.7比9.6个月；HR，3.62；95%可信区间为1.02–12.78；对数秩p-值= 0.033；补充图13k)比接受ATR抑制治疗的其他亚型患者的死亡率高。这些发现表明SCNC亚型的不同治疗反应，并保证在明确定义的队列中进行前瞻性测试。

小细胞肺癌是一种非常致命的恶性肿瘤，迄今为止，它被视为一种同质疾病，对所有患者采用相同的治疗方法。虽然已经在人类原发性肿瘤和细胞系中描述了由神经内分泌分化定义的SCLC分子亚型，但转移性SCLC的生物学特征或治疗脆弱性尚不清楚。在这里，我们提出了一个组织学，表达谱，遗传改变和转移性小细胞肺癌结果的综合分析，代表了神经内分泌分化的范围。我们在迄今为止最大的此类队列中的发现:(1)证实了转移性和复发性小细胞肺癌中由神经内分泌分化驱动的转录亚型，(2)揭示了转移性小细胞肺癌中神经内分泌分化的显著瘤内异质性，值得注意的是在患者衍生的模型系统中没有重现，(3)确定了一种具有由耐药性和特别差的预后定义的混合ne和非ne表型的临床亚型，以及(4)揭示了分别在NE和非NE肿瘤中与高复制应激和Notch驱动的免疫激活相关的潜在亚型特异性脆弱性。这些发现(图。7)对合理的靶向治疗方法有影响，并可能最终有助于改善这种历史上难治性癌症患者的临床结果。

显示了亚型特异性上调基因、IHC标记、信号通路、基因组改变、治疗脆弱性和耐药性。

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我们队列中的转移性肿瘤几乎在所有病例中都表现出不同水平的NE和非NE基因程序的共表达，与早期肿瘤和临床前模型相比，有更高比例的肿瘤表现出ASCL1和NEUROD1的共表达^4,30。临床前模型和复发小细胞肺癌样本的研究显示，转录灵活性导致更晚期和治疗耐药肿瘤中更高的非NE分化^31,32。在我们的转移和复发肿瘤队列中观察到的非NE肿瘤的发生率高于先前报道的早期、治疗初发肿瘤^4,27,38支持治疗选择和促进小细胞肺癌向更非NE表型的动态演变的观点^21,27,31,32。然而，SCNC-P亚型的非NE肿瘤不太常见，可能是因为它们的预后极差²⁷。YAP1作为亚型定义标志的作用仍不清楚。虽然我们的结果与最近报道的YAP1在小细胞肺癌中的表达一致⁷⁵其他研究表明YAP1没有定义一个独特的亚群^27,38。需要在治疗过程中对更大的队列进行连续取样，并使用单细胞RNA-seq (scRNA-seq)进一步解剖肿瘤内的异质性，以阐明亚型之间的可塑性。

我们还在基因组水平上观察到灭活的肿瘤间异质性NOTCH1和RB1突变，以及MYCL在NE亚型肿瘤中以更高的频率发生扩增^31,36。重要的是，NE肿瘤明显更可能包含染色质修饰基因的突变，支持表观遗传失调在NE特征发展中的作用。

虽然pdx被证明在很大程度上概括了人类肿瘤的多基因组结构^29,76患者肿瘤和模型系统之间的分子特征的直接比较是有限的。我们发现患者来源的模型比人类SCLC的NE程序更丰富，这一观察结果在一个独立的患者匹配肿瘤和pdx队列中得到证实。模型系统中SCLC转录多样性的缺乏可能是由于实验条件下显性转录因子的克隆选择，或者代表了缺乏TME成分时的肿瘤进化。肿瘤纯度和神经内分泌评分之间的正相关支持了最后一个假设。这些发现对PDX治疗反应的临床翻译有潜在的影响⁷⁷.

神经内分泌亚型分类的预后和预测意义尚不明确。在以前的报告中，由INSM1表达缺乏定义的非NE SCLC与化疗耐药性增加和患者生存期缩短的趋势相关³⁶。我们发现SCLC亚型之间的总生存率没有显著差异。然而，探索神经内分泌亚型分类对研究治疗的预测意义表明，ne肿瘤优先响应复制应激靶向治疗，而ICI治疗的非NE肿瘤患者比NE肿瘤患者获益更大。这里假设的亚型特异性易感性需要在前瞻性临床试验中进行检验。最后，我们确定了一个SCNCs的子集，其特征是异生素和药物转运途径的富集，以及对治疗和存活的异常差的反应。有趣的是，NEv2样亚型在肝活检中更常见。先前的研究表明，肝转移是小细胞肺癌生存率低的独立预测因素^78,79,80，符合NEv2样亚型的高侵袭性。需要进一步的研究来评估这种耐药亚型的核心生物学特征和治疗靶点。

我们的研究有几个局限性。首先，由于有限的组织可用性，通过ssGSEA和CIBERSORT解卷积大量RNA-seq数据计算推断肿瘤内异质性、TME组成和EMT。虽然我们的结果通常与来自scRNA-seq的发现一致^31,66和SCLC细胞系³³，缺乏TME，他们仍然需要通过公正的方法进行验证。其次，ICI治疗组的结果可能受到PARP抑制剂联合治疗的影响，但是多项研究表明PARP抑制剂与ICI联合治疗没有额外的益处^12,77。最后，亚型特异性治疗的脆弱性将需要在一项前瞻性研究中进一步验证。