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急性髓性白血病中琥珀酰脱氢酶复合物的抑制导致乳酸引起的呼吸代谢脆弱

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发表时间:2022-04-26 14:54作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

急性髓细胞性白血病(AML)不同基因亚型的代谢程序可能有很大差异。这些程序不是静态的实体,而是可以随着细胞外的变化或对通路抑制药物的反应而迅速改变。在这里,我们发现急性髓细胞白血病患者FLT3内部串联复制(FLT3ITD+)的特征在于琥珀酸CoA连接酶的高表达和线粒体电子传递链(ETC)复合物II的高活性,从而驱动与Krebs循环相关的高线粒体呼吸活性。而抑制ETC复合物II可增强细胞凋亡FLT3ITD+AML细胞也通过从细胞外微环境输入乳酸盐来快速适应。13C3-标记的乳酸盐代谢流分析显示,AML细胞使用乳酸盐作为线粒体呼吸的燃料。在体外和体内,通过阻断单羧酸转运蛋白1 (MCT1)来抑制乳酸转运可显著增强对ETC复合物II抑制的敏感性。我们的研究强调了癌细胞的代谢适应性,这可以在治疗上加以利用。

介绍

急性髓性白血病(AML)是一种干细胞疾病,主要发生在成人骨髓中造血干/祖细胞(HSPCs)的异常转化。遗传变异是白血病的核心,大多数已经被确认1,2。这些和其他研究揭示了该疾病的异质性,由此导致AML的组合突变在患者之间可能有很大差异,甚至在患者内部,遗传上不同的克隆可以共存3,4,5,6,7。由于不同的突变谱,AML患者呈现出异质的转录组、表观组和蛋白质组景观,这导致了各种转录网络、细胞生物学特性和药物敏感性7,8。AML复杂多样的突变结构也随着时间的推移或治疗的结果而演变,这是AML治疗中最大的挑战之一。

代谢已经成为一种靶向实体,可能为癌症治疗提供替代手段。AML母细胞可高度糖酵解,这与不良预后相关,糖酵解的抑制增强了阿糖胞苷(Ara-C)的细胞毒性9,10。几种糖酵解酶的缺失延缓了白血病的进展11。相反,最近的论文也表明,在某些AML亚型中,白血病干细胞(LSC)实际上可能对OXPHOS抑制特别敏感12,13,14,15。抑制线粒体电子传递链(ETC)复合物I损害急性髓系白血病的增殖并诱导凋亡16,特别是在那些高度依赖有机磷农药的AML中16.

这些研究表明,AML的异质性也延伸到他们的代谢特征。需要彻底了解驱动特定转录程序的突变可能是代谢差异的基础。遗传异常,包括内部串联重复或酪氨酸激酶域突变。FLT3受体基因(FLT3-ITD,FLT3-TKD)发生在约30%的AML患者中,并且与不良预后和对化疗的不良反应相关17,18. FLT3-ITD突变驱动不同的基因表达特征19, FLT3ITD+急性髓系白血病的特征是活性氧水平增加,导致DNA双链断裂增加20和抑制FLT3-ITD特别依赖谷氨酰胺分解21.

在这项研究中,我们评估了一大群AML患者的代谢特征FLT3-ITD将定量蛋白质组分析与功能代谢方法相结合。我们将电子传递链(ETC)复合物II确定为AML ox phos状态的特异性靶向决定因子。我们发现,在稳态条件下,细胞已经可以利用乳酸作为碳源来驱动TCA循环,阻断ETC复合物II使细胞对MCT1介导的乳酸与环境交换的抑制更敏感。对AML特定基因亚型内代谢程序的详细了解不仅会改善AML的风险分层并允许定制的代谢治疗方法,而且还会增加我们对治疗干预的代谢适应性的理解。

结果

FLT3-ITD突变AMLs显示出不同的OXPHOS驱动的代谢信号FLT3-重量AMLs

以前,我们发现AML的不同亚型之间存在相当大的代谢异质性,因此FLT3丙酮酸脱氢酶激酶1 (PDK1)高表达的野生型AMLs表现出更多的糖酵解表型FLT3-itd AML更多的是由OXPHOS驱动的22。为了揭示磷代谢的分子机制FLT3-我们首先描述的itd·阿姆尔斯FLT3-通过分析富含干细胞/祖细胞的CD34的无标记定量蛋白质组数据集,获得ITD特异性蛋白质表达谱+的一部分FLT3-wt患者(n= 26)和FLT3ITD+患者(n= 15)(补充图。1a和补充数据12)7。基因本体论(GO)分析显示,在人类基因组中上调的蛋白质FLT3ITD+AML明显富含各种代谢相关的GO术语,特别是与呼吸电子传递链、三羧酸(TCA)循环和脂质代谢相关的术语(补充图。1b).CD34中一些过度表达的蛋白质+来自急性髓细胞白血病患者的原始细胞FLT3-ITD与GO术语NADH再生/氧化和呼吸电子传递链相关联(补充图。1c).其中包括琥珀酸辅酶a连接酶(SUCLG1/2)和其他几种参与NADH再生、调节线粒体呼吸依赖性能量产生、控制ETC活性和TCA循环的酶(图。1a和补充数据2).

图OXPHOS状态与AML中SDH和SUCLG蛋白的高表达以及ETC复合物II活性相关。
figure 1

aCD34中SUCLG1和SUCLG2的蛋白表达水平(log10)+ FLT3ITD+ (n= 15),FLT3-wt(n= 26) AML患者和健康外周血中动员的干细胞(PBSC)(n= 6)(平均值+/-SEM)。b用于多变量分析的森林图脱氢酶, 琥珀酸脱氢酶B, SUCLG1,SUCLG2作为AML患者总生存期的独立预测因子。使用来自PRECOG数据库的基因表达信号的连续值的总体存活率的Cox风险比例模型。风险比(HR) > 1表示连续变量或分类变量的第一个因子的值越大,结果越差。HR和它们各自的95%置信区间分别用蓝圈和线表示。公共数据集由基因系列表达(GSE)的标题或先前研究的代码描述(TCGA:n= 121;GSE1427:n= 137;GSE10358n= 182;GSE12417n= 79;布凌格:n= 163).c线粒体驱动的能量流通过TCA循环和ETC复合体FLT3ITD+AMLs。功能上更活跃的代谢途径用绿色突出显示。dCD34的基础OCR水平+-已分类FLT3ITD+ (n= 6)和FLT3-wt(n= 13) AML原始样本。每个点代表一个独立的患者样本,即一式四份技术样本的平均值。eSUCLG2和SDHB蛋白表达(log10)与CD34中最大OCR的相关性+AML原始样本。fCD34中的ETC复合物II酶活性水平+-已分类FLT3ITD+ (n= 7)和FLT3-wt(n= 6) AML和健康的PBMSCs(n= 2).每个点代表一个单独的样品(技术复制品的平均值)(平均值+/SEM)。g酶促ETC复合物II活性与CD34中SDHA、SDHB和SUCLG2蛋白表达(log10)的相关性+AML原始样本(n= 5).h不同蛋白量的ETC复合物II活性和(i)在240 μg蛋白输入的AML细胞中。技术副本中独立副本的平均值+/-SEM。j(240 μg蛋白质)AML细胞中的ETC复合物I活性(n= 1或2)。kETC亚单位的蛋白质印迹分析;AML细胞中的复合物I (NDUFB8,18 kD)、II (SDHB,29 kD)、III (UQCRC2,48 kD)、IV (COX II,22 kD)和V (ATP5A,54 kD)。每个细胞系装载等量的蛋白质和肌动蛋白作为装载对照,图像代表独立的一式三份。e, g线性回归分析(a, d)学生的t测试(双面)或(f, i)单向,(h)进行多重比较的双向ANOVA。

SUCLG和SDH(琥珀酸脱氢酶,ETC的复合物II)蛋白功能性连接,从而在三羧酸循环中SUCLG蛋白产生琥珀酸,琥珀酸反过来被SDH代谢产生FADH 2,从而减少泛醌。CD34+AML细胞来源于FLT3ITD+患者表达的SUCLG1和2水平明显较高,尽管也有一部分患者FLT3-wt患者表达高水平的ETC复合物II蛋白(图。1a).我们注意到FLT3具有高水平SUCLG2的-wt亚组在遗传上不同于FLT3-具有低水平SUCLG2的wt组。在我们的蛋白质组中,我们观察到NPMcyt和inv16 AML亚型存在于FLT3-重量/蔗糖2高的组(补充图1d).皮尔逊系数是使用定量蛋白质组计算的FLT3-重量/蔗糖2高的与...分组FLT3-重量/蔗糖2低的组,排名名单用于GSEA,这表明显着富集NPM1mut签名、inv16签名和MLL重排反洗钱签名(补充图。1e).接下来,我们使用MILE AML转录组数据集(GSE13159)和健康hspc(GSE 42519)独立证实了这些数据,并观察到与其他AML亚组相比,inv16和MLL重排AML亚型确实表达显著更高水平的SUCLG2(补充图。1f).最后,我们将糖酵解、TCA循环和谷氨酰胺分解相关基因的表达与总生存率相关联。使用从PRECOG数据库中检索到的基因表达特征的连续值的总生存率的cox风险比例模型23和用于多变量分析的森林图脱氢酶, 琥珀酸脱氢酶B, SUCLG1,SUCLG2如图所示。1b,表明它们是AML患者总生存率的独立预测因子(参见补充数据1).

OXPHOS状态与AML中SDH和SUCLG蛋白的高表达以及ETC复合物II活性相关

线粒体代谢调节途径可能涉及FLT3ITD+我们希望进一步详细研究的AML在图中用绿色突出显示。1c。海马对原代AML细胞的耗氧率(OCR)进行了功能性评估,表明OCR在原代AML细胞中明显较高FLT3ITD+AMLs与FLT3-wt AMLs(图1d),这与SUCLG2或SDHB表达相关(图。1e).这些数据与我们之前的观察结果一致FLT3ITD+与相比,细胞系显示更高的OCRFLT3-wt细胞系22。我们转导了健康的CB CD34+慢载体过度表达的细胞FLT3-ITD或MLL-AF9,观察到OCR在两种情况下都增加,而ECAR水平在FLT3-ITD转导的细胞,在MLL-AF9转导的细胞中略有增加(补充图。2a).SUCLG2和SDHA的mRNA表达在FLT3-ITD转导的CB细胞,但在MLL-AF9转导的细胞中没有(补充图。2b).CD34+干细胞/祖细胞来自FLT3ITD+AML患者表现出更高的ETC复合物II活性FLT3-wt AMLs(图1f),这与SDHA、SDHB和SUCLG2蛋白表达相关(图。第一代).OXPHOS驱动的细胞系MOLM13和MV411显示出比FLT3-wt糖酵解系HL60和FLT3-wt K562细胞(图。1h,i).在ETC复合物I活性中观察到类似的趋势,尽管这没有达到显著性(图。1j).有趣的是,MLL-AF9驱动的OXPHOS细胞系THP1显示了与HL60相当的ETC复合物I/II活性水平(图。1h–I).在蛋白质表达水平上,检测到较高水平的ETC复合物I、II和IV。FLT3ITD+AML细胞系与FLT3-wt细胞系(图。1k).这些数据与我们之前对单个患者的观察非常吻合FLT3ITD+FLT3-wt亚克隆有望被鉴定和分离7,由此FLT3ITD+亚克隆也表达较高水平的ETC复合物I、II和IV22。慢病毒过度表达FLT3-ITD在FLT3-wt AML细胞系HL60或TF1足以增加ETC复合物II活性(补充图。2c).总的来说,这些数据表明较高的OXPHOS状态与SDH和SUCLG蛋白的高表达相关,这与中所见的较高的OCR和ETC复合物II活性相一致FLT3ITD+AMLs。

线粒体琥珀酰脱氢酶复合体的抑制是FLT3ITD+阵列机语言

为了根据不同的OXPHOS信号进一步改善AML的个体化治疗策略,我们评估了ETC I(鱼藤酮)和几种ETC II抑制剂(噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)和3-硝基丙酸(3-NPA))在AML中的疗效FLT3ITD+对抗FLT3-野生型AML和健康的CB来源的CD34+细胞。在24小时内,可以看到凋亡的强烈增加FLT3ITD+AML细胞系MV4–11和MOLM13在与ETC复合物I/II抑制剂一起孵育后,在FLT3-wt THP1和HL60细胞(图。2a).CB来源的CD34+细胞对ETC复合物II抑制也不敏感,尽管在ETC复合物I抑制时观察到细胞凋亡轻微增加(图。2b).在原始CD34中+AML细胞对ETC复合物II抑制的反应是不均匀的(图。2c),由此FLT3ITD+AML属于最敏感的一组(图。2d).这些数据与先前的观察结果一致,表明FLT3-wt/PDK1高的原发性AML样本对复合物II抑制不太敏感22。用PDK1抑制剂DAP处理24小时,将细胞从糖酵解状态驱动到氧磷状态,没有显著降低细胞的生存力。FLT3ITD+AMLs与ETC复合物II抑制作用的比较(补充图。2d),再次与先前公布的数据一致22。一组独立的非恶性CD34细胞的细胞活力+正常骨髓细胞(NBM)(n= 1)、PBSC(n= 5),而CB(n= 5)不受TTFA的影响(图。2e).为了从功能上证明TTFA抑制ETC复合物II的活性,我们用FLT3-ITDs。ETC复合物ⅱ的活性增强FLT3ITD+MOLM13细胞和HL60细胞中过表达FLT3TTFA可以减少ITDs(图。2f和补充图。2e).我们还测试了ETC复合物II抑制剂联合FLT3-ITD抑制剂AC-220(奎扎替尼)在MOLM13细胞中的作用,并显示在共抑制后凋亡显著进一步增强(补充图。2f).

图2:线粒体琥珀酰脱氢酶复合体的抑制是心肌细胞的弱点。FLT3ITD+AML。
figure 2

a(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+AML细胞(n= 2FLT3ITD+, n= 2FLT3-wt)对ETC复合物II抑制剂(噻吩甲酰三氟丙酮200微米,作为TTFA,和3-硝基丙酸2 mM,作为3-NPA)和复合物I抑制剂鱼藤酮处理(20微米)24小时。数据显示为三次技术复制中测量的独立测量值(每个点)的+/-SEM。FC =与对照组相比凋亡的倍数变化。有关门控策略,请参见源数据。b(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+健康CD34+经ETC复合物II抑制剂(TTFA 200微米,3-NPA 2 mM)和复合物I抑制剂鱼藤酮处理(20微米)(24小时)的CB细胞。数据表示为三次技术测量中三次独立测量(每个点)的平均值+/-SEM。c(%) DAPI活CD34+在MS5基质共培养物上进行100次微米TTFA (48小时)后的AML原发患者细胞。每个点代表从每个独立的主要患者样本中测量的技术复制的平均值+/-SEM。d(%) DAPI活CD34+AML原始患者细胞(n= 10FLT3ITD+, n= 8FLT3在MS5基质共培养物上进行100次微米TTFA处理(48小时)后。每个点代表一个独立的患者样本,以技术上的一式三份进行测量(平均值+/-SEM)。e(%) DAPI活CD34+分类健康NBM(n= 1)、CB(n= 5),而PBSC(n= 5)经过100次微米TTFA处理(48小时)后的细胞。每个点代表NBM的技术复制,以及CB和PBSC的独立原始样本的平均值。将每组中的数据标准化为对照组的数据(平均值+/-SEM)。fAML细胞中比色ETC复合物II活性测量(n= 2)在存在和不存在200微米TTFA的情况下持续24小时。将数据标准化为蛋白质量。每个柱代表在两个技术复制中测量的两个生物复制的平均值+/-SEM。g, hMOLM13的累积细胞生长(g)和HL60(h)用shluc,sh转导的细胞SUCLG1第一名,嘘SUCGL1#2,嘘SUCLG2第一名,嘘SUCLG2#2. i, j(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+什卢克,嘘SUCLG1第一名,嘘SUCGL1#2,嘘SUCLG2第一名,嘘SUCLG2#2 MOLM13(i)和MV411(j)存在和不存在TTFA处理的细胞。a, c, d, f学生的t测试(双面)或(g, h, i, j)进行多重比较的双向ANOVA。

作为评估SUCLG1和SUCLG2在AML亚型中活性的独立验证,我们使用sucl G1和sucl G2导向的shRNAs下调它们在AML亚型中的表达。FLT3-wt (HL60和K562)和FLT3ITD+AMLs (MOLM13和MV411)(补充图。2g).SUCLG1或SUCLG2的下调显著降低了肿瘤细胞的生长。FLT3ITD+MOLM13和MV411细胞(图。2g和补充图。2h,分别),而增殖的FLT3-wt HL60和K562细胞未受影响(图。2h和补充图。2i,分别为)。在敲除SUCLG1/2 s后,TTFA诱导的细胞凋亡水平显著降低FLT3ITD+AML细胞(图。2i,j).

ETC复合物II抑制导致线粒体呼吸减少,这可以通过添加外源性乳酸盐来挽救

研究24小时ETC复合物II抑制后的代谢结果(图。3a),我们首先用海马测定了线粒体呼吸和糖酵解活性。OCR在2005年显著降低FLT3ITD+AML细胞系MOLM13和MV4–11在24小时TTFA处理后,但在FLT3-wt电池(图3b).在更早的时间点,用100微米进行6小时TTFA处理已经足以降低OCR水平,而在该浓度下仍未观察到凋亡(补充图。2j).经TTFA治疗后,ECAR也有所降低(图。3c).

图3:抑制ETC复合物II导致呼吸降低和乳酸流出减少FLT3ITD+AML细胞。
figure 3

a线粒体能量流代谢结果的示意图FLT3ITD+TTFA之后的AMLs。功能上更活跃的代谢途径以绿色突出显示(平均值+/-SEM)。bTTFA (100微米,24小时)对AML细胞系和AML原发患者耗氧率(OCR)的影响。对照标准化的数据(细胞系的三次生物复制的平均值+/-SEM和n= 1份AML原始样本(显示了技术三份副本)。cTTFA (100微米,24小时)对AML细胞系细胞外消耗率(ECAR)的影响(平均值+/-SEM)。d, eOCR级别(d)和ECAR水平(e)在shluc,shSUCLG1第一名,嘘SUCGL1#2,嘘SUCLG2第一名,嘘SUCLG2#2 MOLM13和MV411电池。f分光光度实时测量经处理/未经处理(TTFA 100微米,32小时)的MOLM13细胞的培养基中的乳酸盐、谷氨酰胺和葡萄糖浓度。数据代表四次技术复制中三次生物复制的平均值+/-SEM。g分泌到培养基中的乳酸流量,通过细胞和孵育时间进行校正,在10、24和32小时时,在使用ETC复合物II抑制剂(TTFA 100微米)的MOLM13和HL60细胞中进行测量(平均值+/-SEM,在四个技术复制中测量四个生物复制(每个点))。h(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+AML细胞(n= 2FLT3ITD+, n= 2FLT3-wt)在培养基中添加/不添加2 mM乳酸盐的TTFA (200微米)上(24小时)。每个柱代表四个生物重复的平均值+/-SEM(以技术上的三次重复测量)。凋亡细胞群的百分比差异显示在柱状图上方。i(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+在AML中FLT3ITD+CD34+在培养基中加入/不加入2 mM乳酸盐的TTFA (200微米)上培养24小时的细胞。每个柱代表技术上一式三份的平均值+/-SEM。j在培养基中添加/不添加2 mM乳酸盐或2 mM丙酮酸盐的TTFA (200微米)上,DAPI存活的AML细胞系的倍数变化(24小时)(平均值+/-SEM,每个点显示独立的生物复制)。k在MOLM13细胞中,在有/没有增加MCT1抑制剂CHC(α-氰基-4-羟基肉桂酸400,800微米)和AZD3965 (25,50,100,200 nM)浓度的情况下,24小时的细胞外乳酸浓度。各组之间的细胞活力相当。b, e, f, g, i, h, j, k学生的t测试(双面,曼恩-惠特尼),(c)单向ANOVA Kruskal–Wallis检验或(d)进行多重比较的双向ANOVA。

下调SUCLG1/2 inFLT3ITD+AML细胞系MOLM13和MV4–11也导致显著较低的OCR水平(图。三维(three dimension的缩写)),但不在shSUCLG1/2转导中FLT3-野生型K562细胞(补充图。2k).值得注意的是,在SUCLG1/2敲除后,细胞外酸化率(ECAR)也降低了(图。3e).ECAR活性水平在2005年被敲除1/2次后没有受到影响FLT3-野生型K562细胞(补充图。2k).

接下来,我们测量了葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸盐在培养基中的浓度FLT3ITD+在ETC复合物II抑制后10、24和32小时的MOLM13 AML细胞。这些研究表明,尽管谷氨酰胺消耗在ETC复合物II抑制32小时后仅轻微减少,但葡萄糖消耗几乎完全消失,对应于乳酸排泄的强烈减少(图。3f).这不仅仅是由于细胞活力或增殖的降低,因为考虑到细胞数量和时间计算的乳酸盐分泌的比流量相对降低(图。3g).当ETC复合物II活性在HL60细胞中被抑制时,没有观察到细胞外乳酸盐的减少(图。3g).

乳酸盐被证明是氧化癌细胞的燃料,而不是作为废物输出24。然后我们想知道FLT3ITD+细胞也可能消耗乳酸。可能的是,在对ETC复合物II抑制的应答中,细胞可能重新连接它们的代谢并消耗(更多)乳酸作为非截短的TCA循环分支中的替代碳源。我们首先质疑外源性添加乳酸是否能挽救由ETC复合物II抑制诱导的凋亡表型。事实上,当向MOLM13或MV4–11细胞提供2 mM额外的乳酸盐时,观察到TTFA诱导的凋亡显著减少(图。3h).这在THP1 (MLL-AF9)、HL60或健康的CB CD34中没有观察到+本质上对TTFA处理也不太敏感的细胞(图。3h).TTFA诱导的凋亡在原代CD34细胞中也减少了+ FLT3ITD+存在2 mM外源性乳酸盐时的AML细胞(图。3i).我们还测试了丙酮酸是否可以作为替代能量底物来驱动TCA循环活动,与乳酸相似,在MOLM13或MV4–11细胞中加入外源性丙酮酸后,存活率增加,但在HL60细胞中不增加(图。3j).乳酸可以通过单羧酸转运蛋白1 (MCT1,编码为SLC16A1)在质膜和线粒体膜上均有表达,主要促进乳酸盐流入,为TCA循环提供能量25。我们评估了两种独立的MCT1抑制剂(α-氰基-4-羟基肉桂酸酯(CHC)和AZD3965),MOLM13细胞暴露于这些抑制剂导致细胞外乳酸水平升高,确实表明MOLM13细胞可以主动消耗乳酸(图。3k).MCT1、COX(细胞色素氧化酶等复合物IV)和LDH(乳酸脱氢酶)共同定位在线粒体膜中形成线粒体乳酸氧化复合物26。乳酸脱氢酶B (LDHB)亚型在利用乳酸作为氧化代谢燃料的细胞中将乳酸还原为丙酮酸27。我们在小学观察到FLT3ITD+来自AML患者的原始细胞表明MCT1和LDHB的蛋白水平显著正相关,与在FLT3-重量AMLs(补充图2l).

然后,我们希望在使用海马和Oroboros的实时耗氧量测量中进一步解决这个问题。正如预期的那样,抑制ETC复合物II的活性导致OCR的减少。FLT3ITD+MV4–11和MOLM13细胞(图。4a)而这在FLT3-wt HL60细胞(补充图。3a)当TTFA被单独注射时。增加外源性乳酸盐的浓度后,OCR可以恢复,但当MCT1转运蛋白被抑制时则不能(图。4a).在糖酵解HL60细胞中,这种对OCR的影响程度较低(补充图。3a).类似的观察是在两个主要的小组中进行的FLT3ITD+AML样本(图4b).然后在Oroboros测量中独立地证实了这些海马数据,其中乳酸通过完整的细胞质膜转运,其中我们最初渗透质膜以证明在MOLM13细胞中乳酸通过线粒体膜转运(图。4c).首先,注射ADP、苹果酸和乳酸以研究对线粒体氧消耗的影响,之后连续加入TTFA和MCT1抑制剂以评估它们对线粒体呼吸的影响。最后,加入ETC解偶联剂FCCP以诱导最大呼吸。在没有乳酸盐的情况下,注射TTFA降低了呼吸,并且当在有乳酸盐的情况下单独抑制MCT1时,呼吸也降低了(图。4c参见补充图。3b对于实时数据)。当乳酸盐也存在时,TTFA诱导的呼吸减少不太明显,而当乳酸盐内流被MCT1抑制剂CHC或AZD3965阻断时,情况并非如此,导致线粒体耗氧量进一步显著减少(图。4c).当TTFA存在时,乳酸盐的添加或CHC或AZD3965的存在没有显示出对HL60细胞的线粒体耗氧量的显著影响(补充图。3c, d对于代表性的实时数据)。我们还比较了ADP、苹果酸和乳酸对渗透CD34细胞线粒体耗氧率的影响+-对AML患者样本进行分类,并显示FLT3ITD+细胞具有较高的基础和ADP刺激的线粒体呼吸FLT3-重量(补充图4e). FLT3-wt细胞表现出较低的呼吸作用,与TTFA对ITD的影响相比,其受后者的影响较小+细胞(补充图。3e).这些数据共同表明,在抑制琥珀酰脱氢酶复合物后,当乳酸通过MCT1转运蛋白时,AML细胞具有恢复线粒体呼吸的能力。

图4:乳酸盐流入TCA循环并恢复呼吸活性FLT3ITD+AMLs。
figure 4

aMV411和MOLM13细胞中的相对实时OCR。在测量开始时注射600微米TTFA或600微米TTFA和600微米CHC,然后每25分钟连续注射2 mM乳酸钠。数据在100处标准化为初始OCR。数据显示四个生物重复的平均值,一式四份(平均值+/-SEM)。b类似于图。4a,实时OCR一分为二FLT3ITD+CD34后的AML原始样本+分选后进行24小时MS5培养。数据显示两个独立的生物重复,一式四份(平均值+/-SEM)。c在MOLM13 (2.5 × 10)中存在/不存在顺序注射毛地黄黄酮(2.5 μg/ml)、苹果酸盐(2 mM)、含/不含乳酸盐(8 mM)、ADP (1 mM)、TTFA (200微米)、CHC (400微米)、或AZD3965 (100 nM)、FCCP (1.5微米)的情况下,对MOLM13细胞进行实时高分辨率呼吸测定6细胞/毫升)。洋地黄毒苷、苹果酸和ADP在开始时使用,FFCP在所有测量结束时使用,作为主要的呼吸底物。条形图下方显示了其他进样条件。呼吸稳定后,每隔3-5分钟注射一次。柱状图展示了根据以下所示的每种条件组合注射FCCP后的终点呼吸水平x轴(n= 3次生物复制,平均值+/-SEM)。有关实时代表性数据,请参见补充图。3b. dMOLM13中TCA循环相关代谢物的内部相对丰度。细胞在有/无200微米TTFA和有/无8 mM和20 mM(高)标记的[U-13C3]乳酸盐(6小时)。将每种代谢物的离子计数标准化为内部回收率标准和细胞沉淀的蛋白质含量(独立三次重复的平均值+/-SEM)。e(%)等值线分布(13c每种碳数的富集)的TCA循环相关代谢物。细胞在有/没有200微米TTFA的情况下生长,并且在8 mM和20 mM(高)的情况下用[U-13C3]乳酸6 h。f(%)从与[U-孵育获得的总标记分子(σm)13C3]代谢物中的乳酸盐显示在(e). g来自[U-的m + 2个苹果酸和天冬氨酸库13C3MOLM13细胞中的乳酸。数据为平均值/+SEM,n= 3次重复。ag学生的t测试(双面)或(a)进行多重比较的双向ANOVA。

为了正式证明乳酸盐可以用作碳源,并详细追踪它如何被白血病细胞代谢,我们进行了13C3-标记的乳酸盐追踪研究。MOLM13细胞在8 mM或20 mM均匀稳定同位素标记的乳酸盐(U-13C3乳酸盐)处理6小时,之后提取代谢物用于气相色谱-质谱(GC-MS)分析(补充数据3用于代谢物列表)。我们首先分析了在无标记乳酸盐生长的对照细胞中的总细胞内代谢物浓度,并将其与有U-乳酸盐生长的细胞进行比较13C3乳酸盐(8 mM),单独用TTFA,用TTFA + U-13C3乳酸盐(8 mM),或与TTFA + U-13C3高乳酸盐(20 mM)。虽然在不存在ETC复合物II抑制剂的情况下,添加标记的乳酸盐不会导致细胞内乳酸盐增加,但是当不添加外源标记的乳酸盐时,添加TTFA会导致细胞内乳酸盐显著减少(图。4d).此外,我们观察到TTFA处理后琥珀酸库明显变大,证实了TTFA对ETC复合物II活性的抑制作用,导致细胞内琥珀酸积累(图。4d).而主要的TCA循环代谢物柠檬酸盐、谷氨酸盐、α-酮戊二酸盐(图。4d),以及其他(补充图。3f)不受TTFA的影响,我们还注意到,在ETC复合物II抑制作用下,天冬氨酸、富马酸和苹果酸显著增加(图。4d).然而,有趣的是,当进一步添加外源标记的乳酸盐时,TTFA对琥珀酸盐积累的影响进一步显著,而对天冬氨酸盐和延胡索酸盐则观察到相反的情况,这表明乳酸盐加工能够克服由ETC复合物II抑制诱导的延胡索酸盐和天冬氨酸盐的增加(图。4d).

接下来,我们研究了各种TCA循环中间产物中的标记掺入,证实了乳酸确实可以作为碳源,在未处理和处理条件下,柠檬酸及其下游代谢产物中的标记掺入最高(图。4e,f).当抑制ETC复合物II活性时,细胞内的13在琥珀酸中观察到c标记,这与在TTFA处理的细胞和孵育的细胞中观察到的琥珀酸水平的三倍增加一致13C3乳酸盐(图。4e,f).来自的标记碳结合总量13C3当添加更高浓度(20 mM)的外源性乳酸盐时,TCA循环中间产物中的乳酸盐显著增加。我们的质量同素异构体分布分析显示,乳酸被转化为丙酮酸,之后通过PDH(丙酮酸脱氢酶,在补充图中用紫色表示的标记掺入)被进一步代谢。4)和PC(丙酮酸羧化酶,标记掺入在补充图中以绿色表示。4)生成柠檬酸盐,柠檬酸盐可以输出到线粒体外,导致细胞质中的m + 3和m + 5标记(补充图。4a).在线粒体内部,柠檬酸可以通过线粒体IDH(异柠檬酸脱氢酶)的氧化代谢途径进行代谢,生成α-酮戊二酸(α-KG)和连续的琥珀酸(导致m + 2和m + 4标记,补充图。4a).然而,这种α-千克也可以通过还原代谢途径进行代谢(补充图。4b),导致在柠檬酸盐的m + 2和m + 4位掺入标记。然后,这种m + 2/m + 4标记的柠檬酸盐可以通过逆时针还原羧化反应转化为草酰乙酸盐(m + 2)和苹果酸盐、天冬氨酸盐和富马酸盐(补充图。4b).根据m + 2(已代谢)或m + 3(未代谢)标记的细胞溶质柠檬酸盐,这种逆时针反应将在天冬氨酸盐、苹果酸盐和延胡索酸盐中产生不同的标记模式(补充图。4).在这点上,尽管来自U-的代谢物的总碳(例如,m + 1、m + 2、m + 3、m + 4和m + 5)标记13C3对照细胞和处理细胞之间的乳酸盐是可比较的(补充数据3),抑制ETC复合物II活性后,苹果酸和天冬氨酸的m + 2同位素总库显著富集(分别约为18%和22%)(图。第四代移动通信技术),表明这种机制在ETC复合物II抑制的细胞中是有利的。虽然需要进一步的研究来获得全面详细的认识,但这表明在ETC复合物II抑制后,乳酸主要通过胞质还原羧化途径而不是直接通过Krebs循环进入TCA循环(补充图。4b).先前从标记的谷氨酰胺和葡萄糖中鉴定了胞质还原性羧化重路由28,29当SDH被截短时,并且在SDH缺乏时也通过基于计算机建模的模拟来预测30。综上所述,我们表明AML细胞在稳定状态下可以利用乳酸作为碳源(补充图。4)导致广泛掺入均匀标记的13C340–60%的主要TCA循环中间产物中含有-乳酸,即使培养基中含有足够量的葡萄糖和谷氨酰胺。当ETC复合物II被抑制时,增加的外源性乳酸库能够拯救呼吸FLT3ITD+AML细胞继续积极地代谢和掺入乳酸,现在更多地朝向截短的TCA循环的还原性胞质分支(补充图。4b).

MCT1转运蛋白和ETC复合物II的双重抑制提高了体外和体内的治疗效果

因为抑制ETC复合物II的活性FLT3ITD+AML导致乳酸驱动的OCR增加,我们希望通过抑制ETC复合物II(使用3-NPA或TTFA)和MCT1转运蛋白来阻止乳酸输入,从而在治疗上利用这一点(图。5a).抑制MCT1(使用CHC)与ETC复合物II一起导致强烈的细胞凋亡诱导FLT3ITD+细胞系,这在FLT3-wt细胞系(图。5b).我们通过在MOLM13细胞中将ETC复合物II抑制与第二种MCT1抑制剂AZD3965组合,独立地证实了治疗效果,并观察到在共抑制时更高的凋亡(图。5c).此外,当原发性AML样品在骨髓基质细胞上生长时,对其进行评估,在原发性AML中观察到SDH和MCT1共抑制后细胞活力的最强下降FLT3ITD+AMLs,其中健康对照来自CB的CD34+细胞对这种抑制剂组合不敏感(图。5d).在小学FLT3ITD+AMLs中,细胞外乳酸水平在TTFA治疗后下降,这在AMLs中没有观察到FLT3-野生AMLs或健康的CB和PB样本(图。5e和补充图。5a).最后,我们还希望证实ETC复合物II抑制糖酵解的功效(图。5f–I)和OXPHOS依赖型(图。5j–n)白血病,我们还在体内测试了ETC复合物II和乳酸转运蛋白抑制的组合FLT3ITD+AML(图5j).我们移植了荧光素酶转导的FLT3ITD+OXPHOS驱动的MV4–11细胞(图。1我,k)并在确认移植后(补充图。5b)将小鼠随机分配到四个治疗组:赋形剂、3-NPA、CHC或两者的组合。抑制ETC复合物II不影响糖酵解的白血病发展FLT3-wt HL60细胞(图。5g–I).尽管在HL60和MV4–11移植小鼠中,3-NPA治疗后的BM AML嵌合体与对照组相当,但相比之下,3-NPA治疗降低了外周血的疾病负担,并导致OXPHOS依赖型小鼠的脾脏体积减小FLT3ITD+MV4–11电池(图。5k–m).

图5:联合抑制ETC复合物II和乳酸转运蛋白损害了ITD的白血病发生+体外和体内AMLs。
figure 5

a截断的TCA循环和OXPHOS的示意图FLT3ITD+ETC复合物II和MCT1转运蛋白抑制后的AMLs。b(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+使用ETC复合物II抑制剂(TTFA 200微米,3-NPA 2 mM)的AML细胞,含/不含800微米CHC,持续24小时(三个生物复制物(每个点)的平均值+/-SEM)。c(%)膜联蛋白V+苯基吲哚+含/不含50 nM AZD3965的ETC复合物II抑制剂(TTFA 100微米和3-NPA 2 mM)作用下的MOLM13细胞24小时(三个生物复制品的平均值+ /- SEM)。d% DAPI-CD34+AML患者细胞(n= 6FLT3ITD+, n= 10FLT3-wt)和CD34中+脐带血细胞(n= 3)用TTFA 100微米加/不加800微米CHC处理48小时。数据标准化为对照。每个点=独立患者,以技术三份测量(平均值+/-SEM)。e在(d);CD34+AML患者细胞(n= 4 FLT3-ITD+, n= 7 FLT3-wt)和健康CD34+脐带血细胞(n= 3)和用TTFA 100微米处理的外周血动员干细胞(PBSC ),含/不含800微米CHC (48小时)(平均值+/-SEM)。(f) FLT3-wt HL60移植的小鼠每天用3-NPA (10毫克/千克)进行腹膜内处理(n= 5),或者车辆(n= 5).g(%)人类CD45+外周血(PB)中的细胞和(h)在脾和(i)治疗28天后处死时的脾脏重量(平均值+/-SEM)(n= 5).j FLT3ITD+用赋形剂、3-NPA (40 mg/kg)、CHC (100 mg/kg)或两者(n=每组5个)。k(%)人类CD45+在治疗的第14天外周血(PB)中的细胞和(l)在脾和(m)处死时的脾脏重量(平均值+/-SEM)(n= 5).nKaplan-Meier曲线显示了移植了用指定疗法治疗的MV411细胞的小鼠的存活率。平均存活天数显示在图的底部。P数值(通过对数秩检验)表明3-NPA + CHC处理小鼠与对照小鼠(赋形剂)的比较具有统计学意义。ae, gi学生的t测试(双面)或(km)用于多重比较的单向ANOVA Kruskal–Wallis检验。

在HL60和MV411移植小鼠中通过荧光素酶强度测量确认移植后,我们评估了来自外周血的人mtDNA(线粒体DNA)含量。事实上,小鼠外周血人类mtDNA水平与荧光素酶强度呈显著正相关(补充图。5c).在可比的移植时期,FLT3ITD+与HL60移植的小鼠相比,MV411移植的小鼠在外周血中显示出显著更高的mtDNA水平(补充图。5d).3-NPA和CHC的共同治疗显著降低了处死时骨髓中人mtDNA的含量,证实了MV411移植小鼠中肿瘤负荷的降低(补充图。5e).与赋形剂组相比,联合治疗后第10天的平均荧光素酶强度也较不明显(补充图。5f).3-NPA和CHC治疗的组合显著降低了PB中的AML嵌合体(图。5k),在脾脏(图。5l)和脾脏重量减轻(图。5m),以及血液白细胞计数(补充图。5g)和每根股骨的白血病细胞计数(补充图。5h).虽然单一疗法已经稍微延缓了接受移植的小鼠的白血病发展FLT3ITD+与赋形剂组相比,MV4–11、乳酸盐输入的共抑制和ETC复合物II显著进一步延迟了白血病的发病(图。5n).

讨论

琥珀酰辅酶a连接酶(SUCLGs)和琥珀酸脱氢酶(SDH,电子传递链(ETC)复合物II)是参与细胞线粒体能量产生的功能性连接蛋白。SUCLGs调节琥珀酸的生成,作为TCA循环的一部分,SDH将琥珀酸氧化成延胡索酸,完成电子转移到ETC中的末端受体泛醌31,32。已经在包括家族性副神经节瘤/嗜铬细胞瘤在内的各种实体癌类型中鉴定了SDH的突变,其中SDH的失活导致表观遗传和代谢改变,从而导致TCA循环中间产物的积累33。在AML中,SUCLG或SDH的突变并不常见,尽管在一例慢性淋巴细胞白血病中发现了SDHB突变34。在我们目前的工作中,我们发现琥珀酰连接酶是上调的,而且ETC复合物II在OXPHOS驱动的AML中是高度活跃的。FLT3ITD+,可用于治疗。

除了琥珀酰连接酶的上调,我们发现了其他可能进一步支持OXPHOS状态的因素FLT3ITD+AMLs。这包括CD36(补充图。1a),据报道它在化疗耐药细胞中上调,从而驱动脂肪酸氧化35,36。通过在功能确定的白血病起始细胞群中进行蛋白质组研究,显示FLT3ITD+LSC富含OXPHOS信号37作者还鉴定了SUCLG1和SUCLG2在LSC亚区室中的表达高于blast群体和健康的HSPC群体。Baccelli等人已经表明AML的代谢景观是异质的16,符合我们的研究结果(当前工作和22),由此FLT3ITD+AML被归类为OXPHOS高的。Sriskanthadevan等人的研究表明,特别是ETC复合物II的活性在一组11例原发性AML样本中比在健康样本中增强了38。还表明用venetoclax和阿扎胞苷一起治疗破坏了ETC复合物II驱动的能量代谢并根除了持续的ROS低的角膜缘干细胞39。线粒体肽酶NLN是一种控制急性髓细胞白血病患者氧化磷酸化的重要蛋白,在急性髓细胞白血病患者中表达上调FLT3ITD+近似移动最小二乘40。此外,在我们的蛋白质组数据集中,我们发现NLN在FLT3ITD+补充数据2).有人提出,NLN与呼吸链超级复合体的形成增加有关40,虽然这需要进一步的研究,有趣的是假设FLT3-ITD也可能通过类似的机制影响线粒体活性。抑制线粒体蛋白酶CLPP通过抑制氧化磷酸化和线粒体代谢选择性杀死AML细胞41我们发现CLPP在FLT3ITD+补充数据2).总之,这些数据表明,下游的信号网络FLT3-ITDs在多个水平上重组新陈代谢,所有这些都促进了高氧化磷状态。我们认为像STAT5这样的因子可能起着重要的作用,但是哪些转录因子的下游FLT3-ITDs参与这些信号网络目前正在研究中,也是在一个更大的AML患者队列中,通过进行转录组和染色质可及性研究,在亚克隆水平,与我们以前的工作一致7。然而,我们并不认为OXPHOS驱动的代谢只适用于FLT3ITD+AMLs。例如,MLL-AF9+THP1 AML细胞显示OXPHOS活性高达FLT3ITD+细胞22,也在一群FLT3-wt原发性AML患者有少数显示高OXPHOS。这些数据再次强调了AML的异质性,未来的挑战在于详细描述(epi)基因改变的特定组合如何影响代谢组。

单一药物治疗策略经常遇到的一个潜在陷阱是耐药性。通过抑制特定的途径,肿瘤细胞可以迅速重新布线信号,代谢依赖性也可以很容易地被重新路由。在这里,我们发现AML细胞可以转变为乳酸供能呼吸,特别是当ETC复合物II活性被抑制时。这为联合治疗策略提供了一种有吸引力的可能性,我们确实表明,在异种移植小鼠模型的体外和体内,抑制乳酸输入者MCT1大大增强了对ETC复合物II抑制的敏感性。这些观察结果有些类似于在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤肿瘤中显示的结果,在这些肿瘤中,SDH丢失诱导了对LDH和丙酮酸羧化酶抑制的脆弱性42。在AML中,也有人认为抑制乳酸代谢可能是一种有吸引力的策略43。同样,Cardaci等人表明丙酮酸羧化是SDH缺陷型肾细胞存活的适应性机制,他们的示踪研究表明,在SDH缺陷型细胞中丙酮酸消耗更高28。与我们的观察相似,琥珀酸在没有SDH的情况下积累,作者表明细胞外丙酮酸消耗的增加将葡萄糖衍生的碳转移到天冬氨酸生物合成中,从而维持细胞生长28。在一项平行研究中,Lussey-Lepoutre等人还表明,SDH活性的丧失增加了细胞对丙酮酸羧化的依赖性,从而产生天冬氨酸并驱动细胞合成代谢29.

总的来说,我们的结果与以前在不同细胞类型中的观察结果一致,因此当ETC复合物II活性缺乏或低时,丙酮酸和乳酸似乎能够在支持TCA循环中发挥重要作用。虽然我们还没有广泛研究细胞外丙酮酸盐是否也能拯救ETC复合物II抑制剂诱导的表型,正如我们在补充乳酸盐时所看到的那样,但我们的示踪研究清楚地表明乳酸盐转化为丙酮酸盐和连续的下游TCA中间产物。与上述功能性观察相似,Zielinski等人基于计算机的精密模拟也预测了ETC复合物II缺陷型细胞需要最大的NADH和增加的乳酸氧化来穿过线粒体内膜以支持TCA循环活性,并且丙酮酸逐渐由乳酸产生30。这背后的机制实际上是由增加的丙酮酸羧化和由天冬氨酸产生的苹果酸产生草酰乙酸。在同一研究中提出的另一个机制是在SDH缺陷中还原性羧化适应性代谢增加30。我们追踪研究的结果表明,在ETC复合物II抑制作用下,乳酸氧化驱动苹果酸-天冬氨酸-延胡索酸和草酰乙酸中活跃的胞质还原羧化活性。除了促进AML细胞的线粒体呼吸外,这些乳酸驱动的间歇性途径如何有益仍然未知,需要进一步研究。总之,我们确定了细胞如何响应ETC复合物II的抑制而改变其代谢路线,并确定乳酸供能呼吸是AML的一个靶向弱点。


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